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Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es festzustellen (im Rahmen einer Doppelblindstudie mit 32 Patienten), ob der Einsatz des neu entwickelten Kontrastmittels Gd-EOB-DTPA in der MRT-Diagnostik im Vergleich zum herkömmlichen Gd-BOPTA gleichwertige Ergebnisse hervorbringt in Bezug auf Detektion und Charakterisierung von fokalen Leberläsionen und in der Gefäß- und Leberparenchymdarstellung. Gd-EOB-DTPA zeigte eine sehr gute Verträglichkeit, die sich in der vorliegenden Studie als gleichwertig zu Gd-BOPTA erwies. Einen Vorteil gegenüber Gd-BOPTA bietet Gd-EOB-DTPA durch eine frühere leberspezifische Phase; auf diese Weise lassen sich dynamische Sequenzen und hepatospezifische Untersuchungen in einem einzigen Untersuchungsdurchgang vornehmen. Insgesamt kann Gd-EOB-DTPA als hochwertiges, Gd-BOPTA gleichgestelltes hepatospezifisches MRT-Kontrastmittel betrachtet werden und ist sicherlich für den breiten klinischen Einsatz gut geeignet.
Nach Implantation einer Totalendoprothese kommt es zu einer veränderten Krafteinleitung in das Femur und zu Knochenumbauprozessen ( Bone Remodeling ). Viele Faktoren, wie z. B: Geschlecht, Alter, Gewicht, Knochenqualität, Design beeinflussen die Menge des Remodelings. Hauptursache des postoperativen Knochendichteverlustes ist jedoch das sogenannte Stress Shielding. Aufgrund der veränderten Krafteinleitung kann es zu proximaler Atrophie und zu distaler Hypertrophie kommen. Dank ihrer hohen Präzision und Reproduzierbarkeit bietet sich die DEXA Technik an, um periprothetische Knochendichteänderungen zu untersuchen. In der vorliegenden Studie wurden osteodensitometrische Untersuchungen des proximalen Femurs nach Implantation einer zementfreien anatomischen CTX-Prothese gemacht. Die Studie umfasste 34 zufällig ausgewählte PatientInnen. Die CTX-Prothese ist aus einer Titanlegierung gefertigt und zeichnet sich durch ihre Antetorsion und ihre relativ kurze Länge aus. Sie ist zu 85 % Hydroxyapatit beschichtet, wobei die Spitze frei ist. Die periprothetische Knochendichtemessungen begannen in der ersten Woche postoperativ und erfolgten dann im Abstand von je 2 Monaten im ersten halben Jahr. Die Abschlussuntersuchung erfolgte 1 Jahr nach der Operation. Die BMD wurde in 7 ROI´s ( Region of interest ) nach Gruen gemessen. Es wurden Doppelmessungen durchgeführt und das arithmetische Mittel für die Statistik verwendet. Postoperativ und nach einem Jahr wurden ebenfalls die LWS und die kontralaterale Hüfte mitgemessen. Während des ersten Jahres nach der Implantaion der CTX-Prothese kam es vor allem im proximalen Teil zu Knochenatrophie, welche sich hauptsächlich im Calcarbereich zeigte ( - 22.3 % nach einem Jahr ). Im mittleren Teil der Prothese wurde nur lateral eine Atrophie von bis zu – 2,7 % gefunden. Medial war während des ganzen Jahres keine statistisch Signifikante Änderung zu beobachten. Im distalen Drittel kam es zu einer leichten Hypertrohie von bis zu + 1,70 %. Die gesamte periprothetische Dichte zeigte jedoch keine Veränderung, so dass man annahmen kann, dass sich proximale Atrophie und distale Hypertrophie kompensieren. Als Ursache des proximalen Verlustes ist das sogenannte Stress shielding aufgrund der fehlenden Krafteinleitung und der postoperativen Entlastungsphase zu nennen. Die distale Zunahme lässt sich mit ungünstiger Krafteinleitung erklären. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen dem T-Score der Lendenwirbelsäule, als Mass der systemischen Mineralisierung, bzw. dem T-Score der kontralateralen Hüfte, als Mass für den peripheren Mineralisierungsgrad, und der periprothetischen Knochendichteänderung. Die Korrelation bestand hauptsächlich in ROI 7, das auch die grösste Abnahme erfuhr. Die anderen Korrelationskoeffizienten waren insgesamt schwächer ausgebildet oder sogar negativ. Patienten mit einem T-Score > 0 an der Wirbelsäule zeigten einen geringeren periprothetischen Dichteverlust als Patienten mit einem T-Score < 0: - 14,3 % im Gegensatz zu – 24,6 % in ROI 7. Bei Patienten mit Werten < - 2,5 SD war der Verlust sogar noch grösser: bis zu – 40 % der ursprünglichen Knochendichte. Daraus lässt sich schliessen, dass fester Knochen wesentlich stabiler und ausgeglichener auf eine Prothesenimplantation reagiert als osteopenischer Knochen. Der Vergleich mit Daten nach implantierter Geradschaftprothese (PPF) zeigte praktisch keinen Unterschied des periprothteischen Knochenverlustes in den verschiedenen ROI´s. Es zeigt sich lediglich eine geringere distale Hypertrophie während des ersten postoperativen Jahres. Somit weist ein anatomisch-adaptierter CTX-Schaft weder Schutz vor Verlust der Knochendichte auf noch kommt es zu einer Verhinderung des „stess shieldings“. Über den Langzeitverlauf der CTX-Prothese lässt sich zum jetzigen Zeitpunkt noch keine Aussage machen. Ebenso bleibt abzuwarten welchen Stellenwert die Bisphosphonate in der Therapie der Hüftendoprothetik haben werden.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Langzeitergebnissen nach der Versorgung von Humerusschaftfrakturen mit unaufgebohrten, verriegelbaren Marknägeln, sowie den Komplikationen, die bei einem solchen Verfahren auftreten können. Da die Outcomeparameter nach Humerusnagelung derzeit hauptsächlich mit Scores, wie dem Constant-Score, Neer-Score und DASH-Score bestimmt werden, prüft diese Studie die isometrische und isokinetische Kraftmessung als eine Möglichkeit, weitgehend objektiv das Outcome des Patienten zu bestimmen und die erhaltenen Daten mit den gängigen Scores (Neer-Score, DASH-Score) zu korrelieren. Dazu wurden im Universitätsklinikum Frankfurt am Main 33 Patienten, die zwischen Mai 2000 und Januar 2004 einen Humerusmarknagel erhalten hatten, erfasst und in Hinblick auf die Fragestellung ausgewertet. Hierzu wurden die OP-Berichte, Patientenakten und Röntgenbilder herangezogen, sowie nach einem halben Jahr der Neer- und DASH-Score erhoben, die Bewegungseinschränkung nach Blum ermittelt, sowie die knöcherne Konsolidierung der Fraktur anhand der Röntgenbilder beurteilt. Die isometrische und isokinetische Kraftmessung wurde als neuer, objektiver Parameter herangezogen, wobei folgende Faktoren gemessen wurden: Maximales Drehmoment, Zeit bis zum maximalen Drehmoment, Winkel beim maximalen Drehmoment, Variationskoeffizient, geleistete Arbeit bei bester Wiederholung, geleistete Gesamtarbeit, Ermüdungsindex, Leistung, Beschleunigung, Verzögerung und durchschnittliches maximales Drehmoment. Bei 28 Patienten konnte der Heilungsverlauf bis zur knöchernen Konsolidierung oder bis zum Auftreten einer Komplikation verfolgt werden, ein Patient starb, bevor die Heilung abgeschlossen war. 21 dieser 28 Patienten konnten klinisch nachuntersucht werden, wobei wiederum 15 Personen dieser Gruppe außerdem die Kraftmessung durchführten. 17 Frakturen heilten innerhalb von 6 Monaten aus, 3 heilten verzögert, bei 6 Frakturen bildete sich eine Pseudarthrose aus, in einem Fall kam es zur Sinterung der Fraktur und ein Patient musste intraoperativ einem Verfahrenswechsel unterzogen werden. Intraoperative Komplikationen traten in 7 Fällen auf. Wichtige Faktoren, die nach unseren Daten Einfluss auf den Heilungsverlauf nehmen, sind vor allem das Alter der Patienten, da der Heilungserfolg bei jungen Patienten signifikant höher war, die Art der Reposition, wobei die offene Reposition eine deutlich schlechtere Heilungsquote aufwies, als die geschlossene, sowie die korrekte anatomische Reposition der Frakturenden, da Patienten, die eine starke Dehiszenz der Frakturteile zeigten, ein schlechteres Endergebnis erreichten. Ein weiterer Parameter, der sich negativ auf die Frakturheilung auswirkt, ist das Auftreten von intraoperativen Komplikationen, die bei unserem Patientengut z.T. den Heilungsverlauf bis hin zum Verfahrenswechsel beeinträchtigten. Ebenfalls relevant für den Heilungsverlauf ist die Beteiligung des dominanten Armes, da Patienten mit einer Fraktur des dominanten Armes schlechtere Ergebnisse erzielten. Dagegen weisen polytraumatisierte Patienten im Vergleich zu monotraumatisierten Patienten keine signifikant schlechteren Endergebnisse bei der Heilung auf.. Des weiteren bestätigen unsere Ergebnisse, dass die antegrade Nagelung vor allem durch Schädigung der Rotatorenmanschette zur Bewegungseinschränkung im Schultergelenk führt. Die retrograde Nagelung geht hingegen nach unseren Daten mit keiner erhöhten Bewegungseinschränkungen im Ellenbogengelenk einher. Bei der Auswertung der Scores zeigten 10 von 21 Patienten ein unbefriedigendes Ergebnis und auch bei der Kraftmessung verzeichnete knapp die Hälfte ausgeprägte Defizite. Der Neer-Score und der DASH-Score korrelieren gut miteinander, wobei sich beide vor allem dadurch unterscheiden, dass der DASH-Score mehr auf die Bewältigung des Alltagsleben und den Allgemeinzustand des Patienten abzielt, während der Neer-Score sich stärker auf den Arm als solches konzentriert und mehr objektive Kriterien berücksichtigt. Die Kraftmessung zeigt, dass fast die Hälfte der untersuchten Patienten ein signifikantes Kraftdefizit im verletzten Arm aufweist, wobei vor allem die Innenrotation betroffen ist. Zusätzlich zu diesem Ergebnis ließ sich noch beobachten, dass die Patienten mit Pseudarthrose oder sehr schlechten Armfunktion gar nicht in der Lage waren, diese Kraftmessung durchzuführen. Berücksichtigt man bei der Gesamtbetrachtung noch diesen Punkt, so zeigt sich, dass Patienten mit einem Marknagel zum Großteil nicht mehr annähernd ihre Funktion vor der Fraktur erreichen. Die Kraftmessungswerte zeigen eine mäßige Korrelation mit den beiden Scores, wobei der Neer-Score insgesamt besser korreliert. In unserem Patientengut konnte eine hohe Komplikationsrate beobachtet werden. Bei der vorliegenden kleinen Fallzahl kann hieraus keine verbindliche Aussage getroffen werden, Indikationen und Technik müssen jedoch kritisch diskutiert werden. Die Kraftmessung mit dem Kraftmessungsgerät „System 3“ hat sich im Laufe der Studie als problematisch herausgestellt, da ein hoher Zeitaufwand notwendig ist, um diese Untersuchung durchzuführen (mind. 45 min) und vor allem die Messung nur bei solchen Patienten möglich ist, die schon einen Teil ihrer Kraft im Arm wiedererlangt haben, da ein relativ hoher Kraftaufwand nötig ist, um das Gerät zu bewegen. Außerdem zeigte sich, dass sich für die älteren Patienten keine therapeutischen Konsequenzen aufgrund der gemessenen Werte ergaben. Aus diesen Gründen ist eine routinemäßige Anwendung der Kraftmessung als Outcomeparameter nicht zu empfehlen.
Entwicklung redoxaktiver para-Hydrochinonliganden und deren Anwendung in der Koordinationschemie
(2006)
Niedrigdimensionale Spinsysteme sind hinsichtlich ihrer magnetischen und elektronischen Eigenschaften von großem Interesse. Einen Zugang zu derartigen Systemen bieten Koordinationspolymere aus paramagnetischen CuII-Ionen (S = ½) und verbrückenden para-Hydrochinon-Liganden. CuII-Ionen eignen sich als Spinträger unter anderem deshalb, weil sie stabile quadratisch-planare Komplexe auszubilden vermögen, wodurch die Entstehung niedrigdimensionaler Strukturen begünstigt wird. Die Attraktivität para-Hydrochinon-basierter Brückenliganden beruht auf deren Redoxaktivität und der Tatsache, dass sie wegen ihrer starren π-konjugierten Struktur in der Lage sind antiferromagnetische Wechselwirkungen zwischen zwei paramagnetischen Metallzentren zu vermitteln. Darüber hinaus sind para-Hydrochinonderivate meist auch in der radikalischen Semichinonform stabil. Hieraus ergibt sich die Möglichkeit in para-Hydrochinon-verbrückte Koordinationspolymere durch elektrochemische Dotierung gezielt zusätzliche ungepaarte Spins zu injizieren. ...
In einer Vielzahl maligner Zellen übt Par-4 eine proapoptotische Wirkung aus, indem es diese Zellen gegenüber Apoptose-induzierenden Substanzen wie Chemotherapeutika und Todesrezeptoragonisten durch die Herunterregulation der Expression von antiapoptotischem Bcl-2 sensibilisiert. Unter Berücksichtigung der Bedeutung von Bcl-2 in der Entwicklung einer Medikamentenresistenz bei der akuten myeloischen Leukämie wurde das Potential von Par-4, in den Zelllinien K562 und HEL Bcl-2 herunterzuregulieren und Apoptose zu induzieren, untersucht. Um die Hypothese zu unterstützen, dass Par-4 auch maligne myeloische Zelllinien gegenüber Apoptose-induzierenden Substanzen sensibilisiert, wurden K562- und HEL-Zellen stabil mit einem Par-4-Expressionsvektor und dem entsprechenden Par-4-negativen Kontrollvektor transfiziert. Die transfizierten Klone wurden mit konventionellen Chemotherapeutika (Bendamustin, Doxorubicin, Mitoxantron, Cladribin und AraC) und neuen Substanzen (STI571, LAQ824 und TSA) sowie mit Todesrezeptoragonisten (Fas-L und TRAIL) behandelt. In K562-Zellen führt die Überexpression von Par-4 zu einer Hochregulation der Konzentrationen von Bcl-2 und Daxx. Unter der Behandlung mit konventionellen Zytostatika und Todesrezeptoragonisten zeigten die Par-4-positiven Klone im Vergleich zu den Par-4-negativen Klonen keinen Anstieg der Apoptoserate. Der molekulare Mechanismus dieser Resistenz ist möglicherweise in dem Versagen von Par-4, Bcl-2 und Daxx herunterzuregulieren, begründet. Unter Inkubation mit STI571 und LAQ824 wurde der Apoptose-induzierende Effekt von Par-4 wiederhergestellt, ohne die Expression von Bcl-2 zu beeinflussen. Das Par-4-induzierte Ansprechen auf HDAC-Inhibitoren und STI571 ist assoziiert mit einer verstärkten Caspasenaktivierung, vermehrten Spaltung von cIAP-1 und -2 sowie einer verstärkten Herunterregulation von Daxx. Dies impliziert eine mögliche funktionelle Interaktion zwischen Par-4 und Daxx auf einem neuartigen Apoptoseweg, der durch STI571 und LAQ824 verstärkt wird, zumal dieser Effekt unter Behandlung mit Bendamustin nicht auftrat. In der erythroleukämischen Zelllinie HEL ist Par-4 nicht in der Lage, diese gegenüber konventionellen Chemotherapeutika und Todesrezeptoragonisten als auch STI571 und TSA zu sensibilisieren. Die Expression von Par-4 führte in HEL-Zellen zu einer Hochregulation von Bcl-2. Das Unvermögen von Par-4, Bcl-2 herunterzuregulieren, ist zumindest teilweise verantwortlich für die fehlende Sensibilisierung der Par-4-positiven HELKlone. Diese Hypothese wird durch die erhöhte Apoptoserate in den Par-4-negativen Klonen unter TSA unterstützt, was mit einer weiteren Herunterregulation von Bcl-2 assoziiert war. Darüber hinaus zeigten die Par-4-positiven im Vergleich zu den Par-4-negativen HEL-Zellen verminderte Konzentrationen des proapoptotischen Bax. Zusätzlich verstärkte Par-4 die Expression von Daxx und der Procaspasen-8, -9 und 10, wohingegen die Expression der Procaspasen-3 und -7 unverändert blieb. Par-4-positive Zellen waren nicht in der Lage, Daxx herunterzuregulieren, was mit einer verstärkten Sensibilisierung gegenüber Chemotherapeutika assoziiert war. Dies unterstützt die Schlussfolgerung, dass die Hochregulation von Daxx in Par-4-positiven HEL-Zellen dazu beiträgt, dass Par-4 keine Apoptose-sensibilisierende Funktion aufweist. Aufgrund der fehlenden Sensibilisierung gegenüber einer Vielzahl Apoptose-induzierender Substanzen kann angenommen werden, dass HEL-Zellen generell gegenüber dem Apoptose-induzierenden Effekt von Par-4 resistent sind. Die Rolle von Daxx - insbesondere seine Fähigkeit, Apoptose zu fördern oder zu hemmen - wird immer noch kontrovers diskutiert. Ein Interaktionspartner von Par-4 ist Daxx. Über Interaktionen von Par-4 und Daxx innerhalb des Zellkerns in PODs über die ZIP-Kinase wird ein neuer Apoptoseweg beschritten. Des Weiteren zeigen Par-4 und Daxx eine gleichgerichtete Herunterregulation unter Behandlung mit synergistischen Kombinationen von zytostatischen Substanzen. Um die funktionelle Bedeutung von Daxx in malignen Myelound Lymphozyten zu beleuchten, wurden HEL- und Jurkat-Zelllinien stabil mit einem Daxxexprimierenden Vektor und dem entsprechenden Kontrollvektor transfiziert. Durch Untersuchung einer ektopen Daxx-Expression auf molekularer Ebene in HEL-Zellen konnte gezeigt werden, dass Daxx zu einer Herunterregulation von p53 führt. Daxxüberexprimierende Myelozyten regulieren darüber hinaus Bax, ein proapoptotisches Bcl-2-Familienmitglied herunter, während die Expression von antiapoptotischem Bcl-2 unverändert bleibt. Des Weiteren vermindert Daxx die Expression der Initiatorcaspasen-8 und -10 und der Exekutionscaspase-7, wohingegen die Expression der Procaspasen-6, -7 und -9 unverändert bleibt. Die veränderten Proteinkonzentrationen der Caspasen in Daxx-überexprimierenden HEL-Klonen werden begleitet von einer verminderten Expression von cIAP-1, -2 und survivin. Trotz der gezeigten Auswirkungen einer Daxx-Expression auf wichtige Moleküle der Apoptosekaskade, hatte die Daxx-Expression in HEL-Zellen keine Auswirkungen auf die Proliferationsrate - eine Wirkung, die sehr wahrscheinlich mit der Unfähigkeit, die molekularen Veränderungen unter Serumentzug aufrechtzuerhalten, zusammenhängt. Unter einem proapoptotischen Stimulus ist Daxx nicht mehr in der Lage, die Expression von p53, Bax und der Procaspasen-8, -10 und -7 herunterzuregulieren. In der Daxx-transfizierten Zelllinie Jurkat erhöhte Daxx unter Inkubation mit Todesrezeptoragonisten wie Fas-L und TRAIL sowie unter Inkubation mit Doxorubicin die Apoptoserate. Die Veränderungen auf molekularer Ebene während des extrinsischen und intrinsischen Apoptosewegs zeigen, dass der Anstieg der Apoptoserate durch die Daxx-Überexpression über verschiedene Mechanismen hervorgerufen wird. Hauptunterschiede zwischen Fas-L-/TRAIL- induzierter und Doxorubicin-induzierter Apoptose bestehen im Expressionsmuster von XIAP, p53, Bid, ZIP-Kinase und Par-4. Die erhöhte Sensibilität war in beiden Apoptosewegen von der Aktivierung von Caspasen abhängig. Daxx verstärkt in Abhängigkeit vom apoptotischen Stimulus die Aktivierung von Caspasen auf unterschiedliche Art. In Daxx-positiven Klonen, die mit Fas-L oder TRAIL behandelt wurden, wurde die ZIP-Kinase hochreguliert, die Expression von Par-4 und Daxx verminderte sich proportional zur Apoptoserate, das heißt, je höher die Apoptoserate desto höher ist die Herunterregulation/Degradation von Par-4 und Daxx. Die Kombination von Doxorubicin mit einem Fas-blockierenden Antikörper führte in Daxx-positiven Jurkat-Klonen zu einer zweifachen Amplifizierung der Apoptoserate und der Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials.
Meliolaceae aus Panama
(2006)
Die Meliolaceae (Meliolales, Ascomycota), die auch „Schwarze Mehltaupilze“ (dark oder black mildews) genannt werden, umfassen weltweit ca. 1583 bekannte Arten in 20 Gattungen. Meliolaceae-Arten kommen hauptsächlich in den Tropen vor. Es handelt sich um obligate Parasiten auf Pflanzen, die über 330 verschiedenen Pflanzenfamilien angehören. Von August 2002 bis September 2005 wurden Meliolaceae-Arten mit ihren Wirtspflanzen in Panama hauptsächlich im Westen des Landes gesammelt. Die Wirtspflanzen wurden bestimmt. In Rahmen dieser Arbeit wurden 90 Belege von schwarzen Pilzen auf Blättern lichtmikroskopisch untersucht. Von diesen stellten sich 69 Belege als mit Meliolaceae-Arten parasitierte Blätter heraus. 55 der Belege mit Meliolaceae-Arten wurden bis zur Art bestimmt. Die restlichen 14 Belege waren problematisch zu bestimmen, weil die Meliolaceae von Hyperparasiten befallen waren. Die 55 Belege repräsentieren 42 verschiedene Meliolaceae-Arten, nämlich vier Appendiculella-Arten, sechs Asteridiella-Arten, fünf Irenopsis-Arten und 27 Meliola-Arten. Fünf neue Meliolaceae-Arten wurden im Rahmen dieser Arbeit entdeckt, drei Appendiculella-Arten, eine auf Lozanella enantiophylla (Ulmaceae/Cannabaceae), eine auf Cupania guatemalensis (Sapindaceae) bzw. eine auf Monstera deliciosa (Araceae), eine Asteridiella Art auf Buddleja nitida (Buddlejaceae), eine Irenopsis-Art auf Chrysophyllum sp. (Sapotaceae). Außerdem werden 21 Meliolaceae-Arten zum ersten Mal für Panama nachgewiesen: Appendiculella calostroma, Asteridiella formosensis, A. hymenaeicola, A. solanacearum, A. vegabajensis, Irenopsis miconiicola, Meliola anacardii, M. byrsonimicola, M. cf. cucurbitacearum, M. crescentiae, M. dissotidis, M. gesneriae, M. indica, M. lanosa, M. lundiae, M. mammeae, M. nigra, M. ocoteicola, M. cf. orchidacearum, M. pisoniae und M. ripogoni. Nur 16 der 42 gesammelten Meliolaceae-Arten sind schon für Panama bekannt. Die vorherige Anzahl der bekannten Meliolaceae-Arten für Panama lag bei 105 Arten. Nach dieser Untersuchung liegt diese Anzahl bei 131 Arten. Für das Nachbarland Costa Rica liegt diese Anzahl bei 84 Arten, und beide Ländern teilen nur 25 bekannte Meliolaceae-Arten. Die untersuchten Meliolaceae-Arten parasitieren Arten aus 36 verschiedenen Gattungen der Pflanzen, die zu 30 verschiedenen Pflanzenfamilien gehören. Für bekannte Meliolaceae-Arten werden 31 Wirtspflanzen-Arten zum ersten Mal für Panama nachgewiesen. Von diesen gehören vier zu Gattungen, von denen bisher keine Wirtsarten für Meliolaceae bekannt waren, nämlich Attalea (Arecaceae) für Meliola melanococcae, Crucea (Rubiaceae) für Asteridiella vegabajensis, Phinaea (Gesneriaceae) für M. gesneriae und Rytidostylis (Cucurbitaceae) für M. cf. cucurbitacearum. Im Vergleich zu Indien mit der größten Anzahl bekannter Meliolaceae-Arten (461) gibt es andere tropische Länder, in denen die Anzahl der bekannten Meliolaceae bisher null ist, weil diese Gruppe dort noch nicht erforscht worden ist. Durch die vorliegende Arbeit wird deutlich, dass die Meliolaceae in den Tropen höchst divers und bisher nur ansatzweise erforscht worden sind.
Zielsetzung Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse der Hirndruckpulsamplitude (ICPAmpl.) als neuen Parameter zur Bestimmung einer für den cerebralen Perfusionsdruck optimalen Oberkörperlagerung. Unter normalen klinischen Konditionen bleiben die die ICPAmpl. bestimmenden Faktoren – Compliance und Herzschlagvolumen – konstant. Daher ist es durch die Untersuchung der ICPAmpl. möglich, Rückschlüsse auf den cerebrovaskulären Gefäßwiderstand (CVR) und damit den cerebralen Perfusionsdruck (CPP) zu ziehen. Methoden Bei 40 neurochirurgischen Patienten wurden prospektiv Alter, Geschlecht, Erkrankung, Glasgow-Coma-Scale, Ort der Hirndrucksonde und die Beatmungsparameter untersucht. Die Veränderungen des intrakraniellen Drucks (ICP), des cerebralen Perfusionsdrucks (CPP), des mittleren arteriellen Drucks (MAP) sowie der Hirndruckpulsamplitude (ICPAmpl.) wurden bei Oberkörperlagerungen von 0°, 30°, 60°, 30°, 0° gemessen und analysiert. Ergebnisse Insgesamt 36 Probanden erfüllten die Studienbedingungen (n=36), aufgeteilt in 21 Frauen und 15 Männer. Das mittlere Alter betrug 55,5 Jahre (± 2,58). Der Glasgow-Coma-Scale-Wert betrug bei allen eingeschlossenen Patienten 3. Bei dem Vergleich der Messwerte von 0°- und 60°-Oberkörperlagerung zeigte sich eine signifikante Verbesserung des ICP (p<0,001), eine Zunahme der ICPAmpl. (p<0,001), eine Verschlechterung des CPP (p<0,001) sowie eine Reduktion des MAP (p<0,001). Schlussfolgerung Die aus den gemessenen Daten einer liegenden Hirndrucksonde relativ einfach bestimmbare ICPAmpl. lässt wichtige Rückschlüsse auf den cerebralen Vasomotorentonus zu. Bisher war jedoch unklar, ob es einen Zusammenhang zwischen der ICPAmpl. und dem CPP gibt, der für die klinische Routine einer Intensivstation nutzbar ist. Diese signifikante Beziehung der beiden Parameter konnten wir finden und darstellen. Unter der Kenntnis der negativen Korrelation zwischen ICPAmpl. und CPP und da sich die ICPAmpl. bei erhaltenem Vasomotorentonus der cerebralen Arteriolen im Vergleich zu den anderen Parametern (ICP, CPP, MAP) gegensätzlich verhält, sollte sie bei der für den CPP optimalen Oberkörperlagerung möglichst gering sein. Wir konnten in Gegenüberstellung der einzelnen Messwerte bei Lagerung von 0°, 30°, 60°, 30°, 0° den kleinsten Mittelwert der ICPAmpl. bei jeweils 30° finden. Somit scheint uns unter den gemessenen Positionen diese Oberkörperlagerung ein guter Kompromiss zwischen einerseits hohem CPP bei erhaltener cerebraler Autoregulation und andererseits niedrigerem ICP zu sein. Da wir wissen, dass zur Vermeidung von sekundären Hirnschäden eine Konstanthaltung des cerebralen Blutflusses (CBF) von Bedeutung ist, bedingt dies eine erhaltene cerebrale Autoregulation. Bei erschöpftem cerebralen Vasomotorentonus kann eine Erhöhung des CPP unter anderem eine Hyperämie, ein vasogenes Ödem und damit eine sekundäre ICP-Anhebung – mit allen daraus resultierenden Komplikationen – triggern. Deshalb wird die regelmäßige, patientenspezifische Suche nach der Grenze zwischen adäquatem und nicht mehr adäquatem CPP gefordert. Die Position der Oberkörperlagerung ist ein denkbar einfach durchzuführender, kostenneutraler und trotzdem bedeutsamer Therapieaspekt in der neurochirurgischen Intensivmedizin. Auf der Suche nach der optimalen, patientenspezifischen Lagerung könnte sich daher in der klinischen Routine eine einfache, komplikationsarme Messung etablieren. Da wir zeigen konnten, dass eine zunehmende ICPAmpl. mit einem abnehmenden CPP verknüpft ist, könnte die im Vergleich der einzelnen Werte niedrigste ICPAmpl. somit einen wichtigen Beitrag zur optimalen, individuellen Oberkörperlagerung leisten.
Spontaneous carotid artery dissection-associated medial changes in a selected autopsy population
(2006)
Spontaneous carotid artery dissection (SCAD) is a major cause of stroke in young adults, yet its pathogenesis remains unclear. Hereditary connective tissue diseases, hormonal influences, sympathomimetic drugs or upper respiratory tract infections may predispose to dissection. Mechanical stress or minimal trauma may also act as a trigger. Various lesions of the arterial wall have been described in association with SCAD, but no prospective autopsy study to evaluate the presence of these lesions in normal controls was found. We performed a histologic evaluation of the carotid bifurcation and the aortic arch in an autopsy series to establish a baseline anatomy of the bifurcation and to determine whether similar lesions could be observed. In seven of 54 (12.96%) selected cases we observed isolated changes closely resembling those described for medionecrosis, fibromuscular dysplasia, mucoid degeneration and elastinolysis; and in one case, prior carotid artery dissection and coiling with a patent false lumen. Generally, vascular microanatomy in the carotid bifurcation can be highly variable. Lesions similar to those associated with spontaneous dissection are present in controls and appear non-specific for spontaneous dissection. They can be explained as reactive changes of smooth muscle cells (SMC) and the vascular wall in response to various stressors. Recent advances in vascular physiology are discussed to illustrate the concept of SMC phenotypic modulation. Forensic pathology can provide a large control population for extensive vascular analyses and further the understanding of normal and pathological vascular wall changes to help elucidate spontaneous arterial dissection.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Wiederaufbau der Stadt Frankfurt in den Jahren 1945 bis 1965. Die wichtigsten Stationen dieser Nachkriegsjahre werden mit der Architektengemeinschaft Alois Giefer und Hermann Mäckler verknüpft. Giefer und Mäckler haben in dieser Stadt viele Bauaufgaben vom Wohnungsbau über den Kirchenbau bis zum Ausbau des Frankfurter Flughafens übernommen. Mit der erstmaligen Präsentation des Gesamtwerkes dieser Architektengemeinschaft soll das Interesse für die Architekten und darüber hinaus auch für die Frankfurter Nachkriegsmoderne geweckt werden. Dieses Anliegen scheint besonders in der heutigen Zeit notwendig zu sein, da diese Architekturepoche in Frankfurt durch Abriß bedroht ist. ...
Ubiquitylation is a three-step process, which results in the attachment of the small protein ubiquitin (Ub) to lysine residues on a substrate protein. SUMO proteins are ubiquitin (Ub)-related modifiers implicated in the regulation of gene transcription, cell cycle, DNA repair and protein localization. The molecular mechanisms by which the sumoylation of target proteins regulates diverse cellular functions remain poorly understood. During my PhD I isolated and characterized SUMO1 and SUMO2 binding motifs. Using Yeast Two Hybrid system, bioinformatics and NMR spectroscopy we defined a common SUMO-interacting motif (SIM) and map its binding surfaces on SUMO1 and SUMO2. This motif forms a β-strand that could bind in parallel or anti-parallel orientation to the β2-strand of SUMO due to the environment of the hydrophobic core. A negative charge imposed by a stretch of neighboring acidic amino acids and/or phosphorylated serine residues determines its specificity in binding to distinct SUMO paralogues and can modulate the spatial orientation of SUMO-SIM interactions. Mutation of the SUMO interacting motif of TTRAP (TRAFS and TNF receptor associated protein) influences both its localization and dynamic behaviour in living cells. Ubiquitin (Ub)-binding domains (UBDs) are key elements in conveying Ub-based cellular signals. UBD-containing proteins interact with ubiquitylated targets and control numerous biological processes including receptor trafficking, DNA repair, virus budding and gene transcription. They themselves undergo UBD-dependent monoubiquitylation, which promotes intramolecular binding of the UBD to the attached Ub and consequently leads to their functional inhibition. During the second part of my PhD I could show that, in contrast to the established ubiquitylation pathway, the presence of UBDs allows the monoubiquitylation of host protein independently of classical E3 ligases. UBDs of different types including UBA, UIM, UBM, NFZ and UBZ, can directly cooperate with E2 Ub-conjugating enzymes to promote monoubiquitylation of their host proteins. Using FRET technology I verified that the E2 enzyme and the substrate directly interact in cells. Moreover, UBD-containing proteins Stam2 and Sts2 promote self-ubiquitylation and not ubiquitylation of other targets or form polyUb chains from free Ub. Our study revealed a yet unappreciated role of E2 enzymes in ubiquitylation reactions of UBD containing proteins.
Evaluation der Effektivität der kombinierten TACE von Bletilla striata (mit und ohne Ligatur) im Vergleich zur TACE ohne Bletilla striata als Therapie des hepatozellulären Karzinoms HCC im tierexperimentellen Modell an der ACI-Ratte. Material und Methoden: Insgesamt wurden 30 ACI-Ratten in drei Gruppen eingeteilt: In Gruppe A (Kontrollgruppe) dienten 10 ACI-Ratten als Kontrolltiere. In Gruppe G und H (Therapiegruppen) wurden jeweils 10 ACI-Ratten als Versuchstiere untersucht. Den Tieren wurde dazu zu Beginn des Versuches ein Tumor implantiert (2mm ³), der aus einem Tier (Spendertumor) außerhal b des eigentlichen Versuches entnommen wurde. Jedem Tier der Therapie- und Kontrollgruppe wurde dieser zwei Kubikmillimeter große Tumor unter die Lebe rkapsel des Lobus sinistra eingepflanzt (Intrahepatische Tumorimplantation, IHTI). Diese Tumorstücke wurden aus dem Spendertumor, der aus Tumorzellen des Morris- Hepatoms 3924A innerhalb von vierzehn Tagen im Spendertier heranwuchs, zugeschnitten. Dreizehn Tage nach der
Tumorimplantation erfolgte eine erste Kernspinuntersuchung (MRT1). Einen Tag später wurde bei den Tieren, durch eine retrograd e Injektion in die A. gastroduodenalis, die
Therapie mit Bletilla striata (BS) begonne n. Es wurde den Ratten mit Sandwichtechnik über einen Zeitraum von 20 Minuten Mitomy cin (0,1 mg) + Lipiodol (0,1 ml) + BS appliziert. In Therapiegruppe G wurde diese Therapie mit und in Gruppe H ohne
Ligatur der A. hepatica propria durchgeführt. In der Kontrollgruppe A wurde die TACE ohne BS und ohne Ligatur angewandt. Es wurden von jedem Tier zwei Kernspinaufnahmen gemacht (MRT 1 und MRT2). Vor der Applikation wurde die erste
(MRT1) und 13 Tage nach der Opera tion wurde eine zweite (MRT 2) der Tiere erstellt. Von jedem Tier wurden anschließend die Kernspinaufnahmen miteinander verglichen und die Volumenzunahmen festgestellt (MRT1 / MRT2 = V1 / V2).
Das Maßgebliche Tumorvolumen vor Applikation (V 1) war in Gruppe G 0,0374 cm 3, in Gruppe H 0,0573 cm 3 und in Kontrollgruppe A 0,0380 cm 3. Nach Applikation (V 2) war das Maßgebliche Tumorvolumen in Gruppe G 0,0355 cm 3 (BS mit Ligatur), in Gruppe H 0,2248 cm 3 (nur BS) und in Kontrollgruppe A 0,3674 cm 3. Das Maßgebliche Verhältnis (V 2 / V 1) war in Gruppe G 1,5324, in Gruppe H 6,2791 und in Kontrollgruppe A 9,1382. Nach Analyse der Daten durch den Dunnett ́s Test (1)(ANOVA), konnte für Therapiegruppe G eine signifikante Eindämmung des Tumorwachstums (P < 0,01) und für Gruppe H keine Eindämmung (P > 0,05) nachgewiesen werden. Nach Student-New man-Keuls Test gab es signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen G und A (P < 0,05). Die besten therapeutischen Ergebnisse konnten In Gruppe G erzielt werd en. Keines der Tiere starb während der Implantation bzw. der postoperativen Ph ase, es ließ sich jedoch die Bildung von intrahepatischen Metastasen bei zwei Tieren der Kontrollgruppe feststellen. Schlussfolgerung: Die Effektivität der TACE im tierexperimentellen Modell wird durch die kombinierte Applikation mit Bletilla striata und Ligatur der A.hepaticapropria im Vergleich zur klassischen Anwendung der TACE ohne Modifikation deutlich gesteigert. Bletilla striata ist in der Anwendung für die Chemoembolisation ein wirkungsvolles und verlässliches Embolisat . Es stellt sich nun die Aufgabe, experimentell und klinisch zu verifizieren, in welchem Maße der Einsatz einer Ligatur zum tragen kommt.
Since the discovery of the ozone hole [Farman et al., 1985], the dynamics of the stratosphere and the transport of anthropogenic trace gases from the surface to the higher atmosphere has come into the focus of interest. In the tropics, air rises high into the stratosphere and is transported poleward. Trace gases like the CFCs1, photochemically stable in the troposphere, are thus transported into regions where they are photolyzed. The products of the photolysis reactions (eg. Cl, Br) interact in the catalytic ozone cycles and lead to enhanced ozone depletion. Regarding the transport of trace gases, the so-called lowermost stratosphere (LMS) is a very interesting region, where the troposphere and the stratosphere directly interact and air masses out of both regions are mixed. It is the lowest part of the stratosphere between the tropopause and the 380 K isentrope. Tropospheric air can enter this region directly via isentropic transport across the extra-tropical tropopause whereas stratospheric air descends across the 380 K isentrope via the mean meridional circulation. Stratosphere-troposphere exchange (STE) controls the chemical composition of the LMS as well as of the tropopause region and thus has an important effect on the radiative and chemical balance of these regions and the climate system. STE exhibits a strong seasonality [Holton et al., 1995]. While downwelling of stratospheric air across the 380 K isentrope is the dominant process in winter, troposphere-to-stratosphere transport (TST) gains importance in summer, when the downwelling from the stratosphere is only weak. Isentropic transport across the extra-tropical tropopause occurs in regions where the tropopause is strongly disturbed and is connected to tropopause folds, streamer events, frontal zones, polar and subtropical jets, warm conveyor belts and cut-off low systems. A short introduction into STE, the LMS region, and methods to study atmospheric transport is given in Chapter 1. One useful tool to analyse the motions of air and transport processes are longlived trace gases. Since the lifetimes of these tracers are longer than the time scale of the transport processes they are involved in, the distribution of tracers in the atmosphere is mostly determined by dynamics. In the context of this thesis, measurements of such long-lived tracers were performed and used to study transport into the LMS region in the northern hemisphere. During the Vintersol/EuPLEx and ENVISAT validation campaigns in winter 2003, long-lived tracers such as N2O, CH4, CFC-12, CFC-11, H-1211, H2, SF6 and CO2 were measured with the High Altitude Gas Analyser (HAGAR), a two channel in-situ gas chromatograph combined with a CO2 instrument, based on nondispersive infrared absorption. Combined with measurements taken during campaigns in Forli/Italy (ENVISAT validation) in July and October 2002, tracer data were gathered from the tropopause up to altitudes around 20 km during 25 flights on board the Russian high-altitude aircraft M55 Geophysica. Thus, a substantial set of high quality tracer data has been obtained covering the polar vortex region as well as the mid latitudes of the northern hemisphere. Chapter 2 gives an overview of the HAGAR instrument and necessary improvements of the instrumental set up (implementing a CH4 channel) that were performed in the context of this thesis, and review data processing, the measurement campaigns. In order to study transport into the LMS it is assumed that air basically enters the LMS via three different pathways: a) quasi-isentropic transport from the troposphere, b) downward advection from the middle stratosphere through the 380 K surface and c) in the polar vortex region subsidence of air from of the polar vortex. Fractions of air originating in each of these source regions are determined with a simple mass balance calculation by using observations of a subset of the above species with distinct lifetimes (N2O, CH4, CFC-11, H-1211, H2 and O3) yielding complementary constraints on transport from each region. Details of the mass balance calculation and the results are presented in Chapter 3. During the mid-latitude measurement campaigns in Forlí the passing of a cut-off low system associated with an elongated streamer over Europe was observed. The impacts of this event on the trace gas mixing ratios in the LMS are examined in Chapter 4. Finally, a summary is given in Chapter 5.
IL-12-related cytokines produced by dendritic cells are considered to be major inducers of adaptive immune system activation upon innate antigen-sensing. IL-23 specifically is currently being discussed to support the differentiation of potentially auto-aggressive Th17 cells. Prostaglandins as bystander cell products are known to modulate the translation of this process. While previous studies focused therefore on IL-12, ignoring the existence of new IL-12-related cytokines IL-23 and IL-27, this study analysed effects of prostaglandin E2, D2 and 15d-PGJ2 on the secretion pattern of these subunits in the murine immature Langerhans cell line XS52 and the murine immature myeloid dendritic cell line JawsII under TLR4 (LPS) and TLR9 (CpG) stimulation as well as effects of prostaglandins on the murine Th1 cell line IF12 in coculture and upon Con A treatment. In serial semi-quantitative RT-PCR of the IL-12 related cytokines of the XS52 cell line and the JawsII cell line, the p40 subunit was upregulated in both DC cell lines upon TLR-stimulation, the IL-23p19 subunit constantly expressed in XS52 and upregulated in JawsII upon TLR-stimulation, while the IL-27p28 subunit was only weekly expressed under additional stimulating aCD40 Ab treatment. IL-12p35 could only be detected in the immature myeloid cell line. The protein expression of the p40 subunit was measured in Western blot assays following SDS-PAGE under reducing conditions in XS52. The Western blot-based antibody specification allowed the establishment of a p40-specific ELISPOT assays, where overadditive upregulation of the number of LPS-stimulated spot forming XS52 cells was observed under stimulation with PGE2 while PGD2 depressed the number of LPS-stimulated cytokine secreting cells. Contrary IL-12p40 could not be detected in supernatants of the JawsII cell line. Both DC cell lines were further tested for differential response towards different TLR stimulation described as a defining feature of DC subsets. While subunit expression on transcription level did not differ, only LPS-treatment led to constant IL-12p40 expression in supernatants of XS52. CpG-treatment of XS52 cells led to constantly high IL-12p40 levels under additional aCD40 Ab treatment. In IFN-g ELISPOT assays, prostaglandin effects were further analysed in IF12 Th1 cells upon Con A treatment or alternatively upon treatment in a coculture model with the syngeneic cell line XS52 and the T lymphocyte-specific protein ovalbumin. While PGE2 depressed the amount of activated Th1, PGD2 showed no effect. In conclusion, a coculture model has been generated that allows the analysis of DC and TC interactions. The importance of prostaglandins as differential regulators in time- and tissue-dependence in inflammatory processes has been demonstrated. These results accord with recent observations of an upregulation of IL-23 secretion upon PGE2 treatment.
Bei der Transplantation von hämatopoietischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSC/HPC) spielt das koordinierte “Homing“ dieser Zellen in ihr Zielorgan eine wichtige Rolle. Es wurde ein in vitro System der Interaktion von HPC mit Endothel unter Flussbedingungen etabliert. Die Selektin- und Integrinvermittelten Schritte des Homings transplantierter hämatopoietischer Vorläuferzellen wurden analysiert. Das Homing-Verhalten repopulierender Stammzellen wurde nach Knochenmarktransplantation im kompetitiven Repopulationsmodell untersucht. Überraschend wurde eine sehr weite Verteilung der repopulierenden Stammzellen über verschiedene Gewebe und Organe gemessen. P- und E-Selektin wurden als Schlüsselregulatoren für die Interaktion von AML-Blasten mit Endothelzellen identifiziert. Weiterhin zeigte sich, dass Plättchen-Mikropartikel (PMP) einen potenten Stimulus zur Verhinderung der Adhäsion von HPC an Endothel unter Flussbedingungen darstellen. Die Daten bilden die Grundlage für Studien zur Aufklärung von Signalwegen, die HSC bei ihrer Interaktion mit Endothelzellen während wichtiger Krankheitsprozesse spielen.
Ziel der Arbeit war die Verifizierung der MR-Thermometrie mit verschiedenen MR Sequenzen für die laserinduzierte Thermotherapie mittels fluoroptischer Temperaturmessung bei 0,2 und 1,5 Tesla, bei Temperaturen bis 80 Grad Celsius. Bei ex-vivo Schweineleber und Agarose-Phantomen wurde unter MR-Bildgebung eine laserinduzierte Thermotherapie (LITT) durchgeführt. Die Messungen erfolgten pro Tomograph mit zwei verschiedenen Empfangsspulen. Die Temperaturdarstellung basierte auf der Änderung der Protonenresonanzfrequenz (PRF) und der longitudinalen Relaxationszeit (T1). Die PRF wurde mit vier verschiedenen MR-Sequenzen gemessen: zwei Gradientenecho-Sequenzen (FLASH), einer TurboFLASH- und einer Multiecho-TRUFI-Sequenz. Bei der T1-Methode wurden ebenfalls vier verschiedene MR-Sequenzen eingesetzt: eine konventionelle Gradientenecho-Sequenz (FLASH), eine TrueFISP-Sequenz (TRUFI), eine Saturation Recovery Turbo-FLASH-Sequenz (SRTF) und eine Inversion Recovery Turbo-FLASH-Sequenz (IRTF). Die Temperatur wurde mit einem faseroptischen Thermometer kontrolliert und mit der MRT-Temperatur korreliert. Es wurde eine gute lineare Korrelation zwischen der am MRT geschätzten und der faseroptisch gemessenen Temperatur erreicht. Bei 1,5 Tesla unter Einsatz einer Kopfspule erwies sich bei Messungen an der Schweineleberprobe PRF-FLASH von Siemens mit einer mittleren Temperaturabweichung von 5,09°C als optimal. Mit einem Bodyarray ergab hier IRTF die präzisesten Temperaturbestimmungen mit einer mittleren Abweichung von 8,02°C. Die Genauigkeiten und die Linearitäten von SRTF und PRF-TFL unterschieden sich davon nur geringfügig, sie können also als gleichwertig betrachtet werden. Bei 0,2 Tesla mit einer Kopfspule ergab die Messung mit SRTF mit 6,4°C die geringste mittlere Temperaturabweichung, mit einer Multipurpose-Coil erwiesen sich TRUFI und FLASH als optimal mit einer mittleren Temperaturabweichung von 15,62°C. bzw. 14,48°C. Mit den erreichten Temperaturgenauigkeiten kann der Thermoeffekt der LITT in Echtzeitnähe kontrolliert werden. Bei 1,5 T sind PRF-FLASH oder TFL aufgrund der Exaktheit und der Gewebeunabhängigkeit vorzuziehen. PRF-TRUFI mit einer Akquisitionszeit von 1,09 s ist die schnellste implementierte Sequenz. Bei 0,2 T sind die T1-Sequenzen genauer.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Strahllagemonitor entwickelt, der nur aufgrund der Signale aus den HOM-Dämpfern einer Linearbeschleunigerstruktur die Strahllage mit hoher Genauigkeit bestimmen kann. Ein solcher Monitor hat gegenüber anderen Konzepten einige einzigartige Vorteile. Der HOM-Dämpfer-Strahllagemonitor benötigt keine zusätzlichen Einbauten im Strahlrohr oder der Beschleunigerstruktur. Daher wird keine zusätzliche Länge benötigt. Auch wird eine zusätzliche Emittanzerhöhung durch zusätzliche Impedanzen der Einbauten vermieden. Beide Punkte sind wichtig für den Betrieb eines linearen Kolliders. Ein zweiter Vorteil ist die Messung der Strahllage bezüglich der elektrischen Achse der verwendeten Dipolmode. Wenn als Dipolmode die höhere Mode mit dem störendsten Einfluß auf den Strahl verwendet wird, verfährt die Positionsregelung der Struktur diese automatisch auf die Position, an der der Einfluß dieser Mode minimal ist. Da die anderen Dipolmoden ähnliche Feldgeometrien haben, ist anzunehmen, das ihr Einfluß damit auch weitestgehend minimiert wird. Zur eindeutigen Bestimmung der Strahlposition in der Ebene wurde ein Verfahren entwickelt, daß die Amplituden und die Startphasendifferenz zwischen einer Dipolmode und einer höheren Monopolmode ausnutzt. Durch passende Wahl der Hohlleitergeometrie kann eine monopolartigen Mode in den Dämpferzellen etabliert werden, die das nötige Monopolsignal liefert und in der Frequenz mit der Dipolmode übereinstimmt. Diese Mode vereinfacht erheblich die entwickelte Signalverarbeitungsschaltung. Die Shuntimpedanz dieser Mode wird durch die Geometrie der Hohlleiter bestimmt und kann so eingestellt werden, daß sie für den Betrieb des Strahllagemonitors ausreicht, aber den Strahl noch nicht nennenswert beeinflußt. Durch die Verwendung einer strahlinduzierten Monopolmode als Phasenreferenz ist der Monitor unabhängig von externen Referenzsignalen und funktioniert ohne eingeschaltete Beschleunigungshochfrequenz oder bei falscher Phasenlage des Strahls. Dies ermöglicht es, die Beschleunigerstrukturen auch dann genau zu justieren, wenn der restlichte Beschleuniger noch nicht richtig eingestellt ist oder wenn zu Wartungszwecken einzelne Sektionen während des Betriebs nicht mit Hochfrequenz versorgt werden. Um die Eignung des vorhandenen SBLC-HOM-Dämpfers als Strahllagemonitor zu überprüfen wurden dreidimensionale numerische Feldberechnungen im Frequenz- und Zeitbereich und Messungen an der Dämpferzelle durchgeführt. Für die Messungen ohne Strahl wurde ein Strahlsimulator konstruiert und aufgebaut, der computergesteuerte Messungen mit variablen Ablagen des simulierten Strahls mit einer Auflösung von 1,23 μm erlaubt. Da die vollständige 6 m lange, 180-zellige Beschleunigerstruktur nicht für Messungen zur Verfügung stand und sich auch mit den verfügbaren Computern nicht dreidimensional simulieren ließ, wurde ein eindimensionales ersatzkreisbasiertes Modell des Vielzellers untersucht. Das Ersatzbild aus 879 konzentrierten Bauelementen berücksichtigt die Verstimmung von Zelle zu Zelle, die Zellenverluste, die Dämpferverluste und die Strahlanregung in Abhängigkeit von der Ablage. An dem Ersatzkreis lassen sich die gefangenen Moden und die Wirkung der Dämpfer beobachten. Es liefert bei der Simulation im Zeitbereich als Ergebnis Signale, die verwendet wurden, um die Funktion der Signalverarbeitungsschaltung an der vollständigen Beschleunigerstruktur zu untersuchen. Das eindimensionale Modell hat jedoch auch einige Einschränkungen. Es berücksichtigt nicht die Änderung der Randbedingungen in den Einzelzellen in Abhängigkeit vom Phasenvorschub. Auch beschränkt sich die Simulation auf einen kleinen Teil des durch den Strahl angeregten Frequenzbereiches. Es ist nicht auszuschließen, daß andere Frequenzen die Signalverarbeitungsschalung negativ beeinflussen. Ebenfalls unberücksichtigt bleibt der Einfluß der von Sendeklystron eingespeisten Hochfrequenzleistung. Um diese Einflüsse zu untersuchen wäre es erforderlich, Messungen am realen 180-Zeller mit Strahl und Klystron durchführen zu können. Die vorgenommenen Messungen am Einzeller zeigen, daß das Meßprinzip funktioniert, der vorhandene HOM-Dämpfer als Strahllagemonitor verwendbar ist und die entwickelte Signalverarbeitungsschaltung geeignet ist genaue Positionsinformationen zu liefern. Abgesehen von den ober angesprochenen Einschränkungen bestätigen die Simulationen des 180-Zellers die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf Vielzeller. Die Messungen und Simulationen lassen eine Auflösung des fertigen Strahllagemonitors am 180-Zeller in der Größenordnung 1–10 μm und eine relative Genauigkeit kleiner 6,2 % erwarten. Es hat sich gezeigt, daß zur Erzielung hohe Genauigkeit zwei Komponenten des Strahllagemonitors besondere Aufmerksamkeit zu schenken ist. Zum einen muß der HOM-Dämpfer mit den paarweisen Auskoppelstellen präzise, mit guter Symmetrie gefertigt sein. Zum anderen hat der 180°-Hybrid am Eingang der Signalverarbeitungsschaltung großen Einfluß auf die erzielbare Genauigkeit. Beide Komponenten sind wichtig, um die monopol- und dipolartigen Komponenten aus dem ausgekoppelten Signalgemisch sauber voneinander trennen zu können. Wie die Messungen zeigten, ist ein schmalbandiger, auf die verwendete Meßfrequenz spezialisierter, selbst gefertigter Ringhybrid für diese Aufgabe erheblich besser geeignet als ein kommerziell erhältlicher Breitbandhybrid. Bei dem Ringhybrid gibt es jedoch auch noch Verbesserungsmöglichkeiten. Der Ringhybrid wurde präzise gefertigt. Er hat jedoch keine Abgleichmöglichkeit. Eine Korrekturmöglichkeit der Amplitude und Phase an den Eingängen könnte die Auflösung und Genauigkeit noch etwas steigern. Wenn bei der Simulation ein idealer 180°-Hybrid angenommen wird verschwindet ein Großteil des Fehlers. Der nächste Schritt bei der Weiterentwicklung der Signalverarbeitung könnte darin bestehen, die zur Zeit noch getrennt aufgebauten Hochfrequenzkomponenten auf einer gemeinsamen Platine zu integrieren. Zusammen mit dem Mikroprozessorsystem auf einer zweiten Platine entsteht so ein kompaktes System, daß sich preisgünstig in der für einen linearen Kollider erforderlichen großen Stückzahl fertigen läßt.
Die vorliegende Untersuchung wurde im Rahmen des Verbundprojekts „BIOTA West Afrika“ durchgeführt und befasst sich mit der raum/zeitlichen Analyse der Landbedeckung und der räumlichen Modellierung von Mustern der Pflanzenvielfalt in drei Untersuchungsgebieten in Burkina Faso und Benin. Der erste Teil der Untersuchung beinhaltet die Dokumentation und Analyse der Landbedeckung und Landnutzung und ihrer raum/zeitlichen Veränderungen entlang eines Klimagradienten vom ariden Norden Burkina Fasos bis in den semiariden Norden Benins. Auf der Basis von multitemporalen LANDSAT - Satellitendaten und umfangreichen Geländedaten werden im sahelischen und den sudanischen Untersuchungsgebieten Karten der Landbedeckung mit hoher räumlicher und thematischer Auflösung erstellt. Je nach Untersuchungsgebiet können zwischen zehn und fünfzehn Landbedeckungsklassen differenziert werden. Die Gesamtklassifikationsgüte erreicht Werte zwischen 74% und 87%. In den sudanischen Untersuchungsgebieten werden Landnutzungsveränderungen mit Hilfe von LANDSAT - Satellitendaten, Luftbildern und Geländedaten über einen Zeitraum von ca. 15 Jahren (1986 – 2001) dokumentiert. Für beide Untersuchungsgebiete werden gravierende Landnutzungsveränderungen festgestellt. Der Anteil der ackerbaulich genutzten Fläche steigt für das nordsudanische Untersuchungsgebiet von 17% auf 41% und für das südsudanische Untersuchungsgebiet von 10% auf 14%. Im Mittelpunkt des zweiten Teils dieser Untersuchung steht die Frage nach den räumlichen Mustern der Pflanzenvielfalt und ihrer zeitlichen Veränderungen in den Untersuchungsgebieten der Sahel-, der Nord- und Südsudanzone. Zur Bearbeitung dieser Aufgabenstellungen kommt ein breites Methodenspektrum zur Anwendung. Kernstück der Untersuchung ist die Entwicklung eines verbesserten methodischen Ansatzes der Biodiversitätsmodellierung. Dazu werden bereits existierende räumliche Modellierungsansätze durch die Einbindung von Satellitendaten weiterentwickelt. Auf der Basis von georeferenzierten botanischen Daten (aktuell über 4500 pflanzensoziologische Aufnahmen mit insgesamt 104000 Datensätzen) werden für das sahelische, nord- und südsudanische Untersuchungsgebiet modellierte Verbreitungskarten von 138, 123 und 165 Pflanzenarten erstellt. Die Güte der Karten wird auf der Basis von unabhängigen Geländedaten überprüft. Die einzelnen Verbreitungskarten werden gebietsweise zusammengefasst, so dass im Ergebnis für jedes Untersuchungsgebiet eine hochauflösende Karte der Pflanzenvielfalt vorliegt. Im Rahmen einer Fallstudie werden die zeitlichen Veränderungen der Verbreitungsgebiete von Nutzbaumarten über einen Zeitraum von 13 Jahren untersucht. Es werden aktuelle und historische Verbreitungsgebiete der Nutzbaumarten auf der Basis von hochauflösenden Satellitendaten modelliert und die Veränderungen der Verbreitungsgebiete vor dem Hintergrund des Landnutzungswandels im Untersuchungsgebiet analysiert. Für 17 der 18 untersuchten Baumarten werden rückgängige Verbreitungsgebiete beobachtet.
Glycin ist ein wichtiger inhibitorischer Neurotransmitter im zentralen Nervensystem. Um die glycinerge Erregungsübertragung zu sichern, muss die Glycinkonzentration an Synapsen präzise reguliert werden. Hierfür sind die Glycintransporter, GlyT1 und GlyT2, verantwortlich. Der GlyT2 ist ein präsynaptisches Protein, das in glycinergen Nervenendigungen nahe der aktiven Zone lokalisiert ist. Das über den Transporter aus dem extrazellulären Raum aufgenommene Glycin steht anschließend für die Befüllung der synaptischen Vesikel durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT) zur Verfügung. Die GlyT2-Defizienz führt in Mäusen zu einem letalen Phänotyp und verdeutlicht die Notwendigkeit eines hochaffinen Glycinaufnahmesystems in glycinergen Neuronen. Um mögliche Mechanismen zu untersuchen, die zur präzisen Lokalisation des GlyT2 in der Präsynapse führen, wurde das PDZ-Domänenbindungsmotiv (PDZ-DBM) am extremen C-Terminus bzw. die lange N-terminale Domäne dieses Transporters deletiert. Durch biochemische und pharmakologische Analysen von transfizierten HEKT-Zellen konnte gezeigt werden, dass der Verlust des PDZ-DBM oder der N-terminalen Domäne die Proteinexpression, die Glykosylierung und die Transportaktivität des GlyT2 nicht beeinflussten. Längere Deletionen des N-Terminus (ΔAA1-184) setzten jedoch die Effizienz der Glycinaufnahme herab und ergaben im Vergleich zum wt-Protein einen um 60% reduzierten vmax-Wert, während die apparente Glycinaffinität (KM-Wert) unverändert blieb. Lokalisationsstudien und Oberflächenbiotinylierungen zeigten GlyT2 wt-Immunreaktivität an der Plasmamembran, die sich qualitativ und quantitativ nicht von denen der N- und C-terminalen Mutanten unterschied. Das PDZDBM und die N-terminale Domäne spielen folglich in der Prozessierung und der Transportfunktion des GlyT2 eine untergeordnete Rolle. Möglicherweise reduziert die fast vollständige Deletion der N-terminalen Domäne jedoch die Stabilität des GlyT2. In transfizierten hippocampalen Neuronen wurde der Einfluss des PDZ-DBM und der N-terminalen Domäne hinsichtlich der GlyT2 Lokalisation analysiert. Die transfizierten Mutantenproteine zeigten eine diffuse Verteilung mit partiellen Anreicherungen von GlyT2-Immunreaktiviät. Das wt-Protein kolokalisierte mit Synaptophysin, exzitatorischen synaptischen Markern wie PSD95 und mit den inhibitorischen Markern Gephyrin und VIAAT. Nach Deletion des PDZ-DBM hingegen zeigte der GlyT2 eine um ca. 50% verminderte Kolokalisation mit allen untersuchten synaptischen Markern. Damit konnte hier erstmals eine Funktion des PDZ-DBM für die Anreicherung von GlyT2 an Synapsen gezeigt werden. Mit N-terminalen Deletionsmutanten transfizierte hippocampale Neurone wiesen kolokalisierende GlyT2ΔN-PSD95-Puncta zumeist in MAP2-positiven Neuriten auf, während das wt-Protein zumeist in MAP2-negativen Neuriten kolokalisierte. MAP2 ist ein mikrotubuli-assoziertes Protein, das in Dendriten, aber nicht in Axonen, auftritt und somit eine Unterscheidung derselben ermöglicht. Aufgrund der Überexpression in transfizierten Neuronen war die GlyT2-Immunreaktivität aber sowohl in axonalen als auch dendritischen Neuriten zu beobachten. Zusätzlich zu der in größeren Clustern gefundenen synaptischen GlyT2ΔN-Immunreaktivität war eine Färbung hauptsächlich in sehr kleinen Strukturen (<= 1 μm) nachzuweisen, die Transportvesikeln entsprechen könnten. Dies ist mit einem längeren Verbleib der Deletionsmutanten in intrazellulären Strukturen erklärbar. Im Hippocampus wird GlyT2 endogen nur sehr schwach in einer Subpopulation von putativ glycinergen Neuronen exprimiert. Um die Lokalisation der N-terminalen GlyT2-Proteine in Zellen zu untersuchen, die eine hohe endogene GlyT2-Expression aufweisen, wie spinalen Neuronen, die sich aber nur schlecht transfizieren lassen und in Kultur keine adulte GlyT2-Lokalisation aufweisen, wurden BAC-transgene Mäuse generiert, die myc-markierte GlyT2ΔN-Proteine unter Kontrolle des GlyT2-Promotors exprimieren. Der Vorteil von BAC-transgenen Mauslinien ist, dass sie aufgrund der Verwendung des endogenen Promotors das Transgen nur schwach überexprimieren. Founder-Mäuse, in denen der jeweilige modifizierte BAC-Klon (mGlyT2 wt, ΔAA14-174 oder ΔAA14-184) integriert wurde, wurden identifiziert und mit C57BL/6J-Mäusen verpaart, um so transgene Mauslinien zu etablieren und die Lokalisation der mutierten GlyT2-Proteine zu analysieren. Zusätzlich wurde eine BAC-transgene Cre-Mauslinie generiert, die die Cre-Rekombinase in GlyT2-positiven Zellen exprimiert. Durch die Verpaarung mit konditionalen oder transgenen Mauslinien soll mit diesen GlyT2/Cre-Mäusen die Funktion einzelner Genprodukte in glycinergen Zellen untersucht werden. In dieser Arbeit wurden außerdem die Glycinrezeptor (GlyR) α-Untereinheiten (UE) in GlyT2-defizienten Mäusen untersucht. GlyT2 -/- Tiere sterben in der zweiten postnatalen Woche nach der Geburt und zeigen einen starken neuromotorischen Phänotyp. Da in demselben Zeitraum ein Austausch der embryonalen α2- durch die adulte α1-UE erfolgt, wurde die Entwicklung der α1- und der Gesamt-α- Immunreaktivität in Rückenmarksschnitten von wt und GlyT2 -/- Tieren analysiert und miteinander verglichen. Die Daten zeigen, dass der α-UE-Austausch in den GlyT2-defizienten Tieren ähnlich wie in wt Tieren erfolgt. In α1-GlyRs ist die Öffnungszeit des aktivierten Kanals kürzer als bei α2-GlyRs. Zusammen mit der geringeren Ausschüttung an Glycin aufgrund der GlyT2-Defizienz lässt sich so das Auftreten des Krampf-Phänotyps der GlyT2 -/- Mäuse nach erfolgtem UE-Austausch erklären.
Der zunehmende Emigrantenzustrom bedeutet auch eine Zunahme an fremden Drogen in unseren Breitengraden. Kath, eine Droge, welche mehrheitlich im vorderen Orient verzehrt wird, hat so den Weg zu uns gefunden. Kathkonsumenten mit auffälligem Fahrverhalten werden durch die Polizei gestoppt und es gibt Anfragen der Gerichte an die forensischtoxikologischen Sachverständigen zu dieser Droge, da Kath unter den im § 315, 316 StGB genannten Begriff der „anderen berauschenden Mitteln“ fällt und somit Klärungsbedarf bestand in wie weit Kath als Droge die Fahrtüchtigkeit beeinflusst oder einschränkt. Gerade zum Thema Fahren unter Katheinfluss gab es keine Literatur, so dass eine Pilotstudie konzipiert wurde, um mit Methoden aus dem Bereich des MPU-Verfahrens diese Problematik zu untersuchen. Zur Untersuchung des Einflusses von Kath auf den Menschen wurde eine Pilotstudie mit vier Probanden durchgeführt, diese mussten eine Stunde lang authentisches Kath kauen, danach über einen Tag verteilt verschiedene Tests absolvieren, sich Blut und Vitalparameter untersuchen lassen. Der Untersuchungsablauf erfolgte nach einem festgelegten Schema. Zu den Testsystemen zählte das Wiener Determinationsgerät, der d2-Durchstreichtest, sowie die Befindlichkeitsskala. Es wurde ein routineanalytisches Verfahren etabliert, womit die Alkaloide des Kath mittels Festphasenextraktion und nach Derivatisierung gaschromatographisch-massenspektrometrisch im Blut analysiert wurden, die Quantifizierung erfolgte nach Kalibration mit Referenzsubstanzen. Das Verfahren wurde validiert und es zeigte sich, dass keine Störungen durch Matrixbestandteile auftraten, so dass die Alkaloide eindeutig detektiert werden konnten. Weiterhin wurde eine Stabilitätsstudie durchgeführt, um die Lagerungsbedingungen zu optimieren, insbesondere für das instabile Cathinon. Um authentische Fälle besser interpretieren zu können, erfolgte die pharmakokinetische Auswertung der Alkaloide aus dem Blut der Probanden. Es zeigte sich, dass bei der Konsumform des Kauens mehr als 90% der Alkaloide aus dem Blattmaterial aufgenommen wurden. Bei den Plasmakonzentrationen wurden Norephedrin und Cathin über 54 Stunden im Blutserum nachgewiesen, Cathinon weniger als 12 Stunden. Maximale Plasmakonzentrationen wurden (tmax) im Durchschnitt nach 2,3h (Cathinon) erreicht, 2,6h (Cathin) und 2,8h (Norephedrin). Die pharmakokinetische Auswertung zeigte, dass die Verteilung und Elimination am besten durch ein Zwei-Kompartiment-Modell mit Zweisegmentabsorbation charakterisiert war, wobei im ersten Segment am meisten absorbiert wurde (über 77%), höchstwahrscheinlich über die mucösen Membranen der Mundschleimhaut. Die psychophysischen Leistungstests zeigten im Falle des WD und des d2-Tests eine marginale Zunahme der richtig bearbeiteten Zeichen, wahrscheinlich durch einen Lerneffekt bedingt. Der Befindlichkeitstest zeigte nach über 3 Stunden eine Befindlichkeitsverschlechterung an. Bei den Blutdruck- und Pulsmessungen kam es zu keinen deutlichen Abweichungen. Insgesamt wurden keine eindeutigen psychophysischen Veränderungen festgestellt, was auf die aus ethischen Gründen bei der Pilotstudie verwendete geringe Drogenmenge und die fehlende Kontrollgruppe zurückzuführen sein dürfte. In Ergänzung zur Probandenstudie wurden Befunde an Kathkonsumenten in 39 forensischen Fällen ausgewertet und hinsichtlich der angeblichen Aufnahmemenge der Droge, der Alkaloidkonzentrationen im Blutserum und den Polizei- und Dienstarztaussagen interpretiert. Eine Korrelation zwischen Alkaloidkonzentrationen im Blut und den psychophysischen Defiziten wurde nicht gefunden. Die Auswertung zeigte, dass bei 54% der Betroffenen Reaktionen, die an amphetamininduzierte Zustände erinnern, wie Tremor, Nervosität, vegetative Symptome (Pupillenveränderungen, trockener Mund), Apathie, Beeinträchtigungen beim Stehen und Laufen auftraten. Andererseits wurden bei, laut eigener Angaben, chronischem Kathabusus (35%) häufig keine oder nur geringe Ausfallserscheinungen festgestellt. Aufgrund der hier erhobenen Befunde muss man schlussfolgern, dass sich durch Kath drogeninduzierte Zustände hervorrufen lassen, die allerdings in der Probandenstudie aufgrund des Studiendesigns nicht produziert werden konnten. Die bei authentischen Konsumenten beobachteten erheblichen Ausfälle in der Leistungsfähigkeit belegen eindeutig, dass Kath als „berauschendes Mittel“ klassifiziert werden muss. Bei den Kath-Konsumenten handelte es sich ausnahmslos um Personen mit Emigrationshintergrund, welche Kath gewohnheitsgemäß chronisch anwenden und bei denen die Einsicht fehlt, auf diese Droge zu verzichten. Für die Widerherstellung der Fahreignung ist daher bei nachgewiesenem Kathabusus in Verbindung mit Verkehrsdelikten eine strenge Abstinenz gemäß den Leitlinien zur Fahreignungsbegutachtung zu fordern. Die Erkenntnisse dieser Arbeit wurden unter anderem für ein Gutachten für den Bundesgerichtshof zur Bestimmung der „nicht geringen Menge“ für Cathinon herangezogen und im Urteil vom 28.Oktober 2004 (BGH, Urteil vom 28.10.04-4 StR 59/04- LG Münster) gewürdigt.
Ausgangspunkt der Überlegungen war die Beobachtung, daß die Germanistik nach 1966/68 als „disziplinäre Einheit“ in die „Krise“ geriet. Erklärt werden kann dies mit dem Verlust ihrer bis dato unhinterfragten einheitsstiftenden Fundamente: Plötzlich wurden der Nationenbegriff, der bürgerliche Literaturbegriff und der Bildungsbegriff zur Zielscheibe der Kritik und Forderungen nach Aktualität oder gesellschaftlicher Relevanz bestimmten das Denken. Die „Dichtersterne“ und Geistesgrößen am „Bildungshimmel“, die die Götter abgelöst hatten, wurden entthront; die Hochsprache wurde als Machtinstrument enttarnt. Ob es sich bei der „Krise“ tatsächlich um eine „Krise“ handelt oder um einen „Segen“, hängt vom Betrachterstandpunkt ab. In dieser Hinsicht spaltete sich denn auch die disziplinäre Gemeinschaft in zwei Hälften. Lediglich die Lehrerbildung blieb als „Klammer“ für das Fach erhalten. Diese beiden „Hälften“ entfalteten in den letzten Jahrzehnten unterschiedliche Strategien, wie mit der Situation umzugehen sei: Stiegen die einen aus der Germanistik aus („Die Ratten verlassen das sinkende Schiff.“), versuchten die anderen das Schiff wieder flott zu bekommen, also der Germanistik wieder zu der gesellschaftlichen Bedeutung zu verhelfen, die ihr historisch und faktisch zusteht – als Wissenschaft von der deutschen Sprache, Literatur und Kultur – und dies gegen alle Widerstände. Zu diesen Widerständen gehört erstens ab Mitte der 60er Jahre die Szientifizierung1, die zwei Funktionen erfüllt: Sie verschafft wissenschaftliches Renommee (Professionalisierungsstrategie) für ein Fach bzw. dessen Teilfächer, die als soft sciences traditionell dem Vorwurf der Unwissenschaftlichkeit ausgesetzt sind – so v.a. die subjektiv operierende Literaturwissenschaft –, und sie demonstriert Distanz zur Politik bzw. Ideologiefreiheit. Zu diesen Widerständen gehört zweitens – wenn man den wissenschaftspolitischen Prognosen der Systemtheorie folgt – die subdisziplinäre Ausdifferenzierung, die quasi natürlich und unaufhaltsam von statten geht und zwei Folgen zeitigt: die Auflösung in Teildisziplinen und die Distanzierung von außerhalb des Wissenschaftssystems liegenden Funktionen und Leistungen. Auch das Nichtüberschreiten der (Wissenschafts-)Systemgrenze demonstriert Ideologiefreiheit. Gesellschaftliche Diskussionen („Zuwanderung“; „deutsche Leitkultur“ etc.) als außerhalb des Wissenschaftssystems liegend dürfen von der Germanistik nicht aufgegriffen werden – auch dies ist eine Frage des wissenschaftlichen Ansehens im Elfenbeinturme. Dabei verwandeln sich merkwürdigerweise Leistungen für das politische System (Sprachen-, Kultur- bzw. Bildungspolitik) zum schlechten, Leistungen für das ökonomische System oder das „Beschäftigungssystem“ zum guten Ton...
Erhöhte Faktorenaktivitäten der Gerinnungsfaktoren VIII und IX standen seit längerer Zeit in dem Verdacht, unabhängige thrombophile Risikofaktoren darzustellen. Die Studienlage hierzu ist bzgl. der Wahl der untersuchten Kollektive, der Messmethoden, sowie der berücksichtigten Einflussgrößen uneinheitlich. Daher wurde die vorliegende Studie durchgeführt, um zum einen in einem Normalkollektiv die die Faktorenaktivität möglicherweise beeinflussenden Störgrössen wie Body Mass Index (BMI) oder ein steigendes Lebensalter zu definieren, und um andererseits die Häufigkeit erhöhter Faktor VIII und IX Aktivitäten bei Patienten mit venösen Thrombosen unter Berücksichtigung dieser Störgrössen im Vergleich zum Normalkollektiv exakt zu analysieren. Es wurden 500 Blutspender konsekutiv als Normalkollektiv eingeschlossen. Diesem wurde ein Patientenkollektiv von 374 konsekutiven Patienten mit venösen Thrombosen gegenübergestellt. Beide Kollektive wurden an Hand eines einheitlichen, standardisierten Fragebogens bezüglich ihrer Eigen- und Familienanamnese befragt. Darüber hinaus erfolgte eine Blutentnahme unter standardisierten Bedingungen. Als Messmethode für die Faktorenaktivität von Faktor VIII und IX wurde ein Einstufengerinnungstest verwendet, hierbei wird die Aktivität eines einzelnen Gerinnungsfaktors gemessen. Alle zu untersuchenden Plasmen wurden auf Lupusantikoagulantien getestet, um Probanden und Patienten mit positiven Lupusantikoagulantien von den weiteren Berechnungen ausschließen zu können, da Lupusantikoagulantien die Faktorenmessergebnisse verfälschen können. Dies wurde in den bisherigen Veröffentlichungen nicht berücksichtigt. Mit Hilfe des Normalkollektives wurde die 90% Perzentile als Cut Off für erhöhte Faktorenwerte definiert (FVIII = 158%; FIX = 151%). Bei Analyse des Faktors VIII konnten mit Hilfe einer linearen Regressionsanalyse folgende Störgrössen als relevant für die Faktorenaktivität innerhalb des Normalkollektives beschrieben werden: Raucher wiesen signifikant niedrigere Faktor VIII – Aktivitäten als Nichtraucher auf, während ein steigender BMI und ein steigendes Lebensalter zu signifikant höheren Faktor VIII -Aktivitäten führten. Ein Einfluss des Geschlechtes, sowie ein signifikanter Einfluss oraler Kontrazeptiva auf die Faktor VIII - Aktivitäten konnte nicht nachgewiesen werden. Die Aktivitäten des Faktor IX zeigten im Normalkollektiv ebenfalls eine Abhängigkeit von steigendem Lebensalter, höheren BMI Werten sowie im Gegensatz zur Faktor VIII – Aktivität auch von der Einnahme oraler Kontrazeptiva, wobei alle diese Zustände zu signifikant höheren Faktor IX Aktivitäten führten. Ein Vergleich der Höhe der Faktor VIII – Aktivitäten der Patienten mit venösen Thrombosen zum Normalkollektiv konnte leider nicht durchgeführt werden, da festgestellt wurde, dass eine unterschiedlich lange Lagerzeit der tiefgefrorenen Plasmaproben der Patienten zu einem Absinken von erhöhten Faktor VIII – Aktivitäten führen kann. Dies wurde in der Literatur bisher nicht beschrieben und war daher zu Beginn der Studie nicht bekannt. Im Gegensatz hierzu blieben die erhöht gemessenen Faktor IX – Aktivitäten auch nach einer längeren Lagerzeit stabil, so dass hier eine Risikoberechnung für erhöhte Faktor IX – Aktivitäten in Bezug auf das Auftreten venöser Thrombosen mit einer korrigierten Odds – Ratio erfolgen konnte. Die für BMI, Alter und Geschlecht korrigierte Odds Ratio betrugt 3,98 mit einem 95% Konfidenzintervall von 2,5 – 6,3. Es ist somit von einem ca. 4 fach erhöhten relativen Risiko für venöse Thrombosen bei erhöhten Faktor IX – Aktivitäten auszugehen, so dass diese einen neuen thrombophilen Risikofaktor für venöse Thrombosen darstellen.
Modulation des Chemokin-Profils beim Prostatakarzinom : neue Ansätze in Diagnostik und Therapie
(2006)
Zahlreiche Studien postulieren einen Einfluss löslicher Chemokine und ihrer Liganden auf die Malignität des Prostatakarzinoms. Es gibt Hinweise, dass die CXC-Untergruppe der Chemokin Familie eine besondere Rolle bei der Progression und Metastasierung des Prostatakarzinoms spielt. Da wenig über das Expressionsprofil der CXC Chemokine (CXCL) und ihrer korrespondierenden Rezeptoren (CXCR) beim Prostatakarzinom bekannt ist, wurde in dieser Arbeit die Erstellung eines Chemokin-Profils angestrebt. An 50 Gewebsproben wurde die Expression der CXCR und CXCL an Karzinomgewebe analysiert und jeweils mit dem Muster im tumorfreien Probenmaterial verglichen. Mittels reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) wurde dabei die Genaktivität der Chemokine CXCL1, CXCL2, CXCL4, CXCL5, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL12, CXCL13 sowie ihrer Rezeptoren CXCR1-CXCR6 ermittelt. Des Weiteren wurde durch konfokale Laserscanmikroskopie die Verteilung der CXC Rezeptoren an Prostatatumorzellen (LNCaP) evaluiert. Im Vergleich zum Normalgewebe zeigte sich eine veränderte Expression von sowohl CXCL als auch CXCR im Tumorareal. Als bemerkenswert ist die deutlich reduzierte Expression von CXCL13 und CXCR5 mRNA im Tumorgewebe einzuordnen. Hervorzuheben sind ferner Unterschiede im Verhältnis einzelner Chemokine zueinander. Obwohl signifikante Differenzen am Tumormaterial hinreichend belegt werden konnten, trifft dies nicht in gleichem Maße zu, wenn die ermittelten Daten in Relation zum histopathologischen Grading, der Tumorinvasivität und Gleason Score gesetzt wurden. Insgesamt lässt sich ableiten, dass die Progression des Prostatatumors mit Alterationen verschiedener CXC Chemokine einhergeht. Die Modulation eines komplexen Chemokin-Profils ist dabei für die Tumormalignität von größerer Relevanz, als die Veränderung eines einzelnen Chemokins. Die biologische Bedeutung der veränderten Expression ist bislang unklar. Da aber das lokale Wachstum und die lokale Metastasierung des Prostatakarzinoms möglicherweise direkt über Veränderungen des Chemokin-Profils beeinflusst werden, erlaubt die Analyse der CXCL/CXCR-Achse wichtige Schlüsse zur Prognose der Erkrankung. Auch sind innovative Therapiekonzepte denkbar, die in die Regulation der Chemokine eingreifen und so einem progredienten Krankheitsverlauf entgegensteuern.
Ferrocenbasierte Polymere haben in den vergangenen Jahrzehnten reges Interesse hervorgerufen, welches in ihren einzigartigen optischen und elektronischen Eigenschaften begründet ist. Diese sind auf die Anwesenheit der redoxaktiven Eisenionen sowie auf kooperative Effekte entlang des Polymerstrangs zurück zu führen. Die substanzspezifischen Merkmale hängen dabei nicht nur von der Position der Ferroceneinheiten im Makromolekül ab, sondern auch von der chemischen Natur der verbrückenden Einheiten. Hier bewähren sich solche Atome und Gruppen, die in der Lage sind, Elektronendichte zu übertragen. Ein in dieser Hinsicht besonders viel versprechendes Element ist Bor, da es im sp2-hybridisierten Zustand ein leeres p-Orbital besitzt und dieses für die Übertragung von Ladungsdichte zur Verfügung stellen kann. Vor diesem Hintergrund galt es nun auf der Basis neuartiger Kondensationsreaktionen zunächst Diferrocenylborane zu synthetisieren und anhand ausgewählter Derivate Kenntnisse über charakteristische Eigenschaften dieser Substanzklasse zu gewinnen. Die kurzkettigen Moleküle dienten als Modellverbindungen für Poly(ferrocenylen)e, welche im Mittelpunkt des zweiten Teils dieser Arbeit standen. .... In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich das neuartige Polymer [-fc-B(Br)-]n (33) hervorragend als Edukt eignet, um vielfältige borverbrückte Poly(ferrocenylen)-Derivate sowohl mit trigonalen als auch mit tetragonalen Borzentren darzustellen. Die beschriebenen Systeme weisen eindeutige Merkmale von Eisen-Eisen-Wechselwirkungen entlang der Polymerhauptkette auf, wobei sich das Ausmaß dieser Interaktionen über die Wahl der Substituenten an den Boratomen gezielt beeinflussen lässt. Die dargestellten Materialien besitzen somit großes Potential für die Entwicklung „Molekularer Drähte“ auf der Nanoskala.
In der vorliegenden Dissertation werden mit einem chiralen SU(3)-Modell die thermodynamischen Eigenschaften von stark wechselwirkender hadronischer Materie und die mikroskopischen Medium-Eigenschaften von Hadronen bei hohen Temperaturen und hohen Baryonen-Dichten untersucht. Das verwendete chirale Modell ist ein erweitertes sigma-omega-Modell in Mittlerer-Feld-Näherung (Mean-Field) mit baryonischen und mesonischen effektiven Freiheitsgraden; es basiert auf spontan gebrochener chiraler Symmetrie und Skaleninvarianz. Das Phasenübergangsverhalten des chiralen Modells wird systematisch untersucht und dabei gezeigt, dass es signifikant von den Kopplungen zusätzlicher schwererer hadronischer Freiheitsgrade ('Resonanzen') abhängt. Durch entsprechende Ankopplung des niedrigsten baryonischen Dekupletts kann ein Phasendiagramm in qualitativer Übereinstimmung mit aktuellen Vorhersagen der Gitter-QCD erreicht werden. Alternativ wird die Ankopplung einer schweren baryonischen Test-Resonanz untersucht, welche effektiv für das Spektrum der schweren hadronischen Zustände steht. Hier ergibt sich für einen bestimmten Bereich der Kopplungen sogar eine quantitative Übereinstimmung zu den Gitter-QCD-Vorhersagen bei gleichzeitig guter Beschreibung der Grundzustandseigenschaften von Kernmaterie. Für diese Zustandsgleichung werden Vorhersagen (innerhalb der Modellannahmen) zu geplanten Experimenten gemacht -- konkret wird gezeigt, dass der Phasenübergangsbereich für das CBM Experiment des geplanten Beschleunigerzentrums FAIR an der GSI Darmstadt experimentell zugänglich ist. Weiter wird das chirale Modell auf die Beschreibung von experimentellen Teilchenzahlverhältnissen (Yield-Ratios) aus Schwerionen-Kollisionen von AGS, SPS und RHIC angewendet. Studiert werden Parametersätze mit stark unterschiedlichen Phasendiagrammen aufgrund unterschiedlicher Ankopplung des baryonischen Dekupletts sowie ein ideales Hadronengas. Bei den niedrigen und mittleren Kollisionsenergien zeigt sich eine verbesserte Beschreibung durch die chiralen Parametersätze im Vergleich zum idealen Hadronengas, besonders deutlich für Parametersätze mit Phasendiagramm ähnlich der Vorhersage aus der Gitter-QCD. Die Wechselwirkung im chiralen Modell führt zu Medium-Modifikationen der chemischen Potentiale und der Hadronenmassen. Die resultierenden Ausfrierparameter mu und T sind deshalb gegenüber dem nichtwechselwirkenden Fall signifikant verändert. An den Ausfrierpunkten zeigen sich deutliche Abweichungen der effektiven Massen von den Vakuummassen (5 bis 15 %) und des effektiven baryo-chemischen Potentials vom ursprünglichen Wert (bis zu 20 %). Ferner werden universelle Kriterien für das Ausfrieren diskutiert und isentrope Expansion zu den Ausfrierpunkten untersucht, wo sich eine starke Abhängigkeit der Trajektorien von der Zustandsgleichung ergibt. Schließlich wird der Einfluss des Dilaton-Felds (Gluonkondensat) auf das Phasenübergangsverhalten bei mu=0 studiert, indem das Gluonkondensat an die Dekuplett-Baryonen gekoppelt wird. Es zeigt sich, dass dadurch eine Restauration der Skaleninvarianz im Modell möglich wird, die gleichzeitig auch eine vollständige Restauration der chiralen Symmetrie bewirkt. Die Restauration der Skaleninvarianz erfolgt erst bei Temperaturen, die oberhalb der chiralen Restauration (im nichtseltsamen Sektor) liegen. Diese Modellerweiterung ermöglicht es, zukünftig das Phasenübergangsverhalten -- Restauration von chiraler Symmetrie und Skaleninvarianz -- auch bei nichtverschwindenden Baryonendichten zu untersuchen. Die Resultate dieser Arbeit zeigen die Wichtigkeit der schweren hadronischen Zustände, der Resonanzen, für das QCD-Phasendiagramm. Für die Zukunft ist eine Ankopplung des gesamten hadronischen Massenspektrums an das Modell erstrebenswert, wie sich sowohl aus der Untersuchung der Modellerweiterung um eine Test-Resonanz als auch aus der Anwendung auf experimentelle Teilchenzahlverhältnisse ergibt.
Die Tracheotomie langzeitbeatmeter Patienten hat sich als integraler Bestandteil der modernen Intensivtherapie etabliert. Die von Ciaglia et al. 1985 beschriebene perkutane Dilatationstracheotomie (PDT) erwies sich als sichere, komplikationsarme und wenig zeitaufwendige Alternative zum konventionellen, offenen Vorgehen. Ausgehend von der PDT wurden bis 2001 drei weitere perkutane Tracheotomietechniken im klinischen Alltag verwendet: 1990 die von Griggs vorgestellte Guide- Wire- Dilating- Forceps Technik (GWDF), 1997 die translaryngeale, retrograde Technik nach Fantoni (TLT) und 1999 die modifizierte single-step Technik nach Ciaglia mittels des speziellen Blue Rhino®– Dilatators (CBR). Ziel der vorliegenden klinischen Untersuchung war es, ob eine Lernkurve für die vier Verfahren besteht und sie hinsichtlich ihrer Komplikationen und Praktikabilität zu vergleichen. Bei insgesamt 200 Intensivpatienten wurde unter Beachtung der absoluten Kontraindikationen bettseitig eine elektive perkutane Tracheotomie unter fiberoptischer Kontrolle durchgeführt. Jede der vier Methoden (PDT, GWDF, TLT, CBR) kam bei jeweils 50 Patienten, die chronologisch in zwei Kohorten (Gruppe A: Patienten 1-25, Gruppe B: Patienten 26-50) aufgeteilt wurden, zur Anwendung. Erfasst wurden die Dauer des Eingriffs und alle perioperativen Komplikationen, beginnend unmittelbar vor dem Eingriff bis 48 Stunden danach. Die Komplikationen wurden zunächst den Kategorien intraoperativ und postoperativ zugeteilt, dann wiederum unterschieden in medizinische und technische und in die drei Schweregrade leicht, mittel und schwer eingeordnet. Alle Verfahren waren schnell durchführbar. Bezogen auf das Gesamtkollektiv erwies sich die CBR als schnellste durchführbare Methode, gefolgt von der GWDF, der PDT und der TLT. Die Eingriffsdauer verkürzte sich bei allen Methoden außer bei der CBR in der zweiten Kohorte im Vergleich zu ersten. Bei den 200 perkutanen Tracheotomien traten insgesamt 3 schwere Komplikationen auf (1,5%), alle medizinischer Natur, 13 mittelschwere Komplikationen (7,5%), etwa zur Hälfte technisch und zur Hälfte medizinisch, und 38 leichte Komplikationen (19%), auch in etwa zur Hälfte technisch und medizinisch. Kohortenabhängig ergab sich bei allen Verfahren bis auf die PDT ein Rückgang der Gesamtkomplikationen in den Gruppen B im Vergleich zu den Gruppen A. Aufgeschlüsselt nach medizinisch und technisch ging der Anteil der technischen Komplikationen im Vergleich zu dem Anteil der medizinischen Komplikationen stärker zurück. Als Schlußfolgerung ergibt sich, daß alle vier Methoden der perkutanen Tracheotomie schnell durchführbar sind und eine niedrige Komplikationsrate aufweisen. Die seltenen schweren Komplikationen sind offenbar nicht durch Übung und zunehmendes Beherrschen der Technik vermeidbar. Legt man als Kriterium für die Erlernbarkeit einer Tracheotomiemethode die Komplikationsrate und die Dauer des Eingriffs zugrunde, so legt diese Untersuchung nahe, dass jeweils für alle vier untersuchten Verfahren der perkutanen Tracheotomie eine Lernkurve existiert.
Es ist seit ein paar Jahren bekannt, dass es bei amblyopen Patienten neben Vi-susverlusten, einer exzentrischen oder unruhigen Fixation und einer ganzen Reihe weiterer Phänomene, zu einer gestörten Lokalisation (Verzerrung und Unsicher-heit) im amblyopen Auge kommt. Lokalisationsstörungen behindern die visuelle Wahrnehmung und die Visuomotorik der Betroffenen. Darüber hinaus gibt ihr ge-naues Studium Informationen über die Ausprägung der Amblyopie und erlaubt Überlegungen zur Amblyopieentstehung. Die Forschungseinheit „Sehstörungen des Kindesalters“ an der Augenklinik der Universität Frankfurt am Main, in der die-se Doktorarbeit durchgeführt wird, beschäftigt sich u. a. mit der visuellen Lokalisa-tion bei Kindern. Mit einer für diesen Zweck entwickelten Methode [Fronius et al. 1995] wird die visuelle Lokalisation bei normalsichtigen und amblyopen Kindern erfasst [Fronius et al. 2000, 2004]. Ziel dieser Arbeit ist die Ergänzung der vorhandenen Daten und die Auswertung nach neuen Gesichtspunkten. Die Studie untersucht Lokalisationsstörungen im Führungsauge und befasst sich erstmalig damit, ob und inwiefern solche Lokalisa-tionsstörungen auch bei der binokularen Lokalisation vorkommen. Sie präsentiert die Ergebnisse, die schielamblyope (n=32) sowie normalsichtige Kinder (n=35) im Alter von 4,5 bis 10 Jahren bei der vertikalen relativen Lokalisation monokular und binokular erzielen. Verwendet wird die durch Fronius und Mitarbeiter 1995 entwor-fene –aktive– Testmethode, die aus einer Kombination von zwei früheren Testver-fahren für Erwachsene [Bedell & Flom 1981, Fronius & Sireteanu 1989] hervorge-gangen ist. Darüber hinaus wird analysiert, inwieweit der Visus, Faktoren aus der klinischen Geschichte (Zeitpunkt der Brillenverordnung, Vorbehandlung durch Okklusionstherapie) und Begleitphänomene wie ein latenter Nystagmus eine Rolle spielen. Dabei ergibt sich, dass die Führungsaugen der hier untersuchten amblyopen Kin-der eine ähnlich genaue relative vertikale Lokalisation zeigen wie die normalsichti-ge Kontrollgruppe. Dagegen ist der Visus in den Führungsaugen signifikant niedri-ger als der der Kontrollkinder (Einzeloptotypenvisus: p=0,0007, Reihenvisus: p=0,005). Die Führungsaugen sind demnach keine „normalen“ Augen, was den Visus betrifft, zeigen jedoch keine messbar gestörte Positionswahrnehmung. Möglicherweise handelt es sich hier um zwei von einander unabhängige Phänomene – Lokalisationsstörungen und Visusminderung – , die im amblyopen Sehsystem an-zutreffen sind. Eventuell spielen aber auch die verwendete Testmethode und das junge Alter der Probanden eine Rolle. Laut Krieter [2000] machen Kinder in die-sem Test signifikant größere Fehler als Erwachsene, was das Herausstellen von eventuell vorhandenen Effekten erschweren könnte. Der Vergleich der monokularen und der binokularen Lokalisation ergibt unter den vorhandenen Untersuchungsbedingungen bei der normalsichtigen Kontrollgruppe keine signifikanten Unterschiede. Ein binokularer Summationseffekt liegt nicht vor. Auch bei den Schielamblyopen entspricht die monokulare der binokularen Lokali-sationsgenauigkeit. Allerdings ist die binokulare Lokalisation bei den Amblyopen wesentlich ungenauer als bei der Kontrollgruppe, die Unsicherheit ist bei ihnen signifikant (p=0,009) und die Verzerrung tendenziell (p=0,07) größer. Es werden also bei Mitgebrauch des amblyopen Auges, binokular, Unterschiede zwischen den amblyopen Kindern und der Kontrollgruppe deutlich. Dies spricht für eine leichte Störung durch das amblyope Auge bei der binokularen Lokalisation. Ein Vorteil ergibt sich nach den Ergebnissen dieser Arbeit für die Kinder mit Okklusionstherapie in der Vorgeschichte (n=7) betrachtet man den Visus im amblyopen und im Führungsauge. Ein Einfluss der Okklusionstherapie auf die Lo-kalisation stellt sich nicht heraus. Der Zeitpunkt der Brillenverordnung (Brille vor dem 2. Lebensjahr: n=10, Brille nach dem 2. Lebensjahr: n=20) beeinflusst nach unseren Ergebnissen weder den Visus noch die Lokalisationsergebnisse der un-tersuchten Kinder. Diese Arbeit erweitert das Wissen über die Leistungen von schielamblyopen und normalsichtigen Kindern bei Lokalisationsaufgaben und zeigt erstmals Daten der binokularen Lokalisation.
Einleitung: In der vorliegenden Studie wurde die laparoskopisch durchgeführte Thermoinzision der Ovarialoberfläche, eine operative Behandlungsmöglichkeit des polyzystischen Ovarsyndroms (PCOS), im Hinblick auf die Auswirkungen auf Zyklustempus und Fertilität untersucht.
Material und Methode: Zwischen März 1999 und April 2002 unterzogen sich 55 PCOS-Patientinnen, mittleres Alter 30,4 Jahre, im Zentrum für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Universitätsklinik Frankfurt am Main und in der Abteilung für gynäkologische Endokrinologie und Fertilitätschirurgie im Bürgerhospital Frankfurt am Main einer Thermoinzision der Ovarialoberfläche. Alle Patientinnen litten an unerfülltem Kinderwunsch, 20 von ihnen hatten zusätzlich einen unregelmäßigen Menstruationszyklus, 7 gaben eine vermehrte Behaarung. 16 Patientinnen hatten sowohl einen unregelmäßigen Menstruationszyklus als auch Hirsutismus. 37 Patientinnen hatten bereits vor der Operation frustrane Hormonbehandlungen hinter sich. Bei 18 Patientinnen wurde die Thermoinzision der Ovarialoberfläche als primärer Therapieansatz im Rahmen einer Laparoskopie zur Sterilitätsdiagnostik gewählt. Die Nachbeobachtung fand durch schriftliche Befragung und das Einsehen der Krankenblätter und der Operationsberichte statt. Der Fragebogen umfasste im Wesentlichen drei Punkte: 1) Die allgemeine Zufriedenheit mit der Behandlung 2) Den Behandlungserfolg zum Zeitpunkt der Befragung im Vergleich zu vor der Operation (Schwangerschaften, Zyklusregelmäßigkeit, Hirsutismus) 3) Die zusätzlich zur Thermoinzision der Ovarien in Anspruch genommenen Behandlungen (z.B. Medikamente) Die mittlere Nachbeobachtungszeit betrug 31 Monate.
Ergebnisse: Die Schwangerschaftsrate nach durchgeführter Thermoinzision betrug in dieser Studie 51%. Davon traten 90% innerhalb des ersten postoperativen Jahres auf. Der Anteil der Patientinnen mit regelmäßigem Zyklus stieg von 35% auf 58%. Damit war der Einfluss der Thermoinzision auf den Menstruationszyklus signifikant Bei 39% kam es zur Verbesserung des Hirsutismus. Die Abortrate nach Thermoinzision lag in dieser Studie bei 21%. Insgesamt waren 85% der operierten Patientinnen zufrieden bis sehr zufrieden mit dieser Behandlungsmethode. In der Gruppe der Patientinnen mit Nikotinkonsum sind 36% schwanger geworden, im Gegensatz zur Nichtrauchergruppe mit einer Schwangerschaftsrate von 57%. Zwischen Body Mass Index und postoperativer Zyklusregelmäßigkeit / Schwangerschaftsrate, sowie zwischen Alter und postoperativer Zyklusregelmäßigkeit / Schwangerschaftsrate bestand kein Zusammenhang.
Diskussion und Schlussfolgerung: Die Thermoinzision der Ovarialoberfläche ist eine effektive Methode zur Behandlung von Zyklusunregelmäßigkeiten und Sterilität bei PCOS-Patientinnen. Zudem zeigt sie auch Erfolg in der Behandlung des Hirsutismus bei diesen Patientinnen. Da es sich um einen operativen Therapieansatz handelt, sollte die Thermoinzision als Therapie der zweiten Wahl, nach versuchter medikamentöser Therapie, eingesetzt werden.
Hintergrund: Frequenzkontrolle ist die Therapie der ersten Wahl bei Patienten mit permanentem Vorhofflimmern. Jedoch es ist unklar, welche spezifischen Zielgrößen für die Optimierung einer medikamentösen Therapie herangezogen werden können. Spiroergometrie und 6-Minuten-Gehtest, die zusätzliche Informationen zur Belastbarkeit liefern können, wurden diesbezüglich bislang nur unzureichend untersucht. Methoden: In einer prospektiven Studie wurde bei konsekutiven Patienten mit permanentem Vorhofflimmern und tachyarrhythmischer Überleitung ohne Medikation eine Spiroergometrie, ein 24-h Langzeit-EKG und der 6-Minuten-Gehtest durchgeführt. Danach wurden die Patienten im „cross-over“ Design randomisiert und mit Bisoprolol (5 mg/Tag) sowie Verapamil (3x80 mg/Tag) zur Frequenzregularisierung über jeweils 14 Tage behandelt. Im Anschluss wurden die o.g. Untersuchungen wiederholt. Die Lebensqualität wurde bei allen Patienten vor und unter medikamentöser Therapie mittels SF-36 Fragebogens und der Symptomen-Checkliste evaluiert. Nach 3 bis 6 Monaten durchgehender frequenzregularisierender Therapie wurden alle Untersuchungen erneut durchgeführt. Ergebnisse: 22 Patienten schlossen das Untersuchungsprotokoll ab (Alter 64±7 Jahre; 59% männlich; mittlere EF 57±9%). Während der Kontrollphase lag die Ruheherzfrequenz bei 101±19 /min und mittlere Herzfrequenz im 24-h Langzeit-EKG bei 98±22 /min. Unter der Belastung zeigte sich ein Anstieg auf maximal 162±33 /min. Ohne frequenzregularisierende Medikation betrug die Gehstrecke im 6-Minuten-Gehtest 458±106 m und die maximale Sauerstoff-Aufnahme unter Belastung 16,6±4,1 ml/min*kg. Unter beiden Medikamenten reduzierte sich die mittlere Herzfrequenz im 24-h Langzeit-EKG signifikant um 15,2% unter Bisoprolol und 16,3% unter Verapamil. Auch die maximale Herzfrequenz im Langzeit-EKG verringerte sich signifikant um 15,1% und 14,2% unter Bisoprolol und Verapamil entsprechend. Weder Spiroergometrie noch 6-Minuten-Gehtest konnte eine Verbesserung der körperlichen Belastbarkeit unter der frequenzkontrollierenden Therapie zeigen. So veränderte sich zum Beispiel die maximal erreichte Leistung um 1,5% und -2,8% und Bisoprolol und Verapamil entsprechend. Auch die maximale Sauerstoff-Aufnahme lag mit 17,1±4,9 ml/min*kg (Bisoprolol) und 16,9±4,7 ml/min*kg (Verapamil) auf dem Niveau vor Frequenzkontrolle (p=ns). Keine der 8 Skalas des SF-36 Fragebogens konnte einen Einfluss der verwendeten Medikamente auf die Lebensqualität zeigen. Nach im Mittel 181 Tage durchgehender medikamentöser Therapie konnte eine anhaltende bradykardisierende Wirkung beobachtet werden. So war die mittlere Herzfrequenz im Langzeit-EKG um 20±12 /min niedriger als bei der Ausgangsuntersuchung. Auch nach 6 Monaten kam es zu keiner signifikanten Veränderung der körperlichen Belastbarkeit. Hier betrug die maximale Sauerstoff-Aufnahme 17,6±4,4 ml/min*kg und zurückgelegte Gehstrecke 451±112 m (p=ns). Die Untersuchung der Lebensqualität ergab lediglich eine signifikante Verbesserung der körperlichen Funktion (59±27 vs. 69±24, p < 0,05), summarischen körperlichen Gesundheit (40±11 vs. 45±12, p=0,05) und der Häufigkeit der mit Vorhofflimmern assoziierten Symptome (36±13 vs. 32±13, p < 0,05). Klinische Implikationen: 1. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigen, dass unter Therapie mit beiden Medikamenten (Bisoprolol 5 mg/die und Verapamil 3 x 80 mg/die) eine signifikante und vergleichbare Frequenzkontrolle erreicht werden kann. 2. Sowohl das Belastungs-EKG als auch das Langzeit-EKG können zur Überprüfung der erreichten Frequenzsenkung bei der Ersteinstellung der Patienten mit permanentem Vorhofflimmern mit gleichen Erfolgsaussichten angewendet werden. Das Belastungs-EKG hat den Vorteil einer gleichzeitigen Beurteilung der Leistungsfähigkeit und der Blutruckeinstellung, während das Langzeit-EKG bei Verdacht auf das Vorliegen nächtlicher Bradykardien vom Nutzen sein kann. Zur Verlaufskontrolle kann ein ambulant durchgeführtes Ruhe-EKG einen sinnvollen Ersatz von zeitaufwendigeren und teureren Methoden darstellen. 3. Der 6-Minuten Gehtest kann nicht zur Beurteilung der Herzfrequenzkontrolle bei Patienten mit Vorhofflimmern empfohlen werden. 4. Im Gegensatz zur Herzfrequenz kann die im Rahmen des 6-Minuten-Gehtests ermittelte Gehstrecke eine sinnvolle Information über funktionellen Status des kardio-pulmonalen Systems sowie körperliche Leistungsfähigkeit des Patienten liefern und somit die individuelle Optimierung der Herzfrequenzeinstellung erleichtern. 5. Eine Verbesserung der körperlichen Belastbarkeit bei Patienten mit permanentem Vorhofflimmern kann möglicherweise durch die pharmakologische Frequenzkontrolle nicht erreicht werden. 6. Unter der medikamentösen Frequenzkontrolle treten die Verbesserungen der Lebensqualität bei Patienten mit permanentem Vorhofflimmern erst verzögert auf.
Diese Dissertation versucht neue und andere Wege in der Diagnostik der fokalen Leberläsionen FNH und HCC zu beschreiten, indem unter anderem bislang in der Untersuchung der Leber selten genutzte Untersuchungstechniken wie die multiplanare Rekonstruktion einer Volume-interpolated-breath-hold T1-3d-GRE Sequenz zum Einsatz kommen. In dieser Arbeit ging es darum, die Anwendung von Resovist® in der MRT für die fokalen Leberläsionen FNH und HCC zu bewerten. Dazu wurden von 40 Patienten in der Screeningphase die 36 Patienten, die den Goldstandard erfüllten mittels folgender Sequenzen untersucht: T2-Haste, T2-TSE-FS und T1-GRE jeweils prä und post Kontrastmittelgabe und als dynamische Aufnahme T1-3DGRE als Volume-interpolated-breath-hold, die später multiplanar rekonstruiert wurde. 4 weitere Personen mußten, wegen durch Bewegungsartefakte nicht mehr zu bewertende Bilder, leider noch aus der Studie ausgeschlossen werden, so dass letztendlich noch 31 Personen in der Studie eingeschlossen waren (16 Patientinnen mit einer FNH und 15 Patienten mit einer HCC). Aus den mit Region -of -Interest (ROI) gemessenen Signalintensitäten wurden in Signal- intensity –Ratio (SIR) und Percentage –Signal- intensity –Loss (PSIL) für die Sequenzen T2-Haste, T2-TSE-FS und T1-GRE und in SIR, Percentage – Enhancement (PE) und Contrast- to- Noise- Ratio (CNR) für die T1-3D-GRE VIBE und MPR berechnet. Gemessen wurde die Signalintensität der jeweiligen Läsionen, des linken und rechten Leberlappens, je ein Wert aus dem oberen und unteren Milzviertel, die Aorta in Höhe der Leber, ebenso die Vena cava und die Vena porta. Die so erhaltenen Messwerte wurden mit Hilfe des t-Tests und des u-Tests auf ihre Signifikanz (p<0,05) überprüft. Des Weiteren wurden Spezifität und Sensitivität in der Diagnose der Läsion vor und nach Kontrastmittelapplikation bestimmt und ebenfalls auf ihre Signifikanz überprüft. Dabei läßt sich eine signifikante Steigerung beider Parameter durch die Anwendung des SPIO nachweisen. Als Erstes wurden die Werte der Strukturen auf ihre jeweiligen Änderungen nach bzw. im Verlauf der Kontrastaufnahme hin bewertet, danach erfolgte ein Abgleich, inwieweit die als Arbeitshypothesen aufgestellten Vermutungen, dass sich die Signalintensitäten der Milz, der Leberlappen und der Vena porta als zuführendes Gefäß der Leber im Mitteldruck bei Vorliegen einer Leberzirrhose (n=14) gegenüber dem Fehlen einer solchen (n=17) unterscheiden. Eine solche Veränderung konnte für die Leber bestätigt, musste für die Milz und die Vena porta jedoch abgelehnt werden. Für die VIBE und MPR erfolgte ein Vergleich der Werte auf signifikante Unterschiede, um zu überprüfen, inwieweit die Rekonstruktion, die optisch ansprechendere Bilder liefert als ihre Vorlage VIBE, diese auch in Punkto Validität der Signalmessungen zu ersetzen vermag. Wenn man eine generelle Signalerhöhung von ca. 20 akzeptiert, muss man diesen Versuch als gelungen ansehen. Für die grundsätzliche Unterscheidung zwischen HCC und FNH konnten die Literaturberichte bestätigt werden, dass die FNH auf Grund einer größeren Anzahl von kontrastmittelaufnehmenden Kupffer- Zellen und geringere Dysplasie sowie Fehlen von den Zellstoffwechsel beeinflussenden Atypien, ein dem normalen Lebergewebe ähnlichere, wenn auch weit geringere, Signalintensität und –änderung aufwiesen als die HCC. Dennoch waren die Unterschiede in den Signalintensitäten und ihren Veränderungen zwischen FNH und normalem Parenchym groß genug, um auch hier eine sichere Abgrenzung zu bieten. Insgesamt boten die HCC einen stärkeren Läsion-zu-Leber-Kontrast (CNR) als die FNH. Die FNH wurden nach ihrer Morphologie in FNH mit und ohne Nidus eingeteilt und auf Unterschiede innerhalb dieser beiden Gruppen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die SIR in allen Sequenzen für die FNH mit Nidus signifikant gegenüber den FNH ohne zentrale Narbe erhöht war, in der PSIL ließ sich dieser Trend ebenfalls als signifikant beweisen. In der dynamischen Bildgebung mittels VIBE und MPR konnte für SIR, PE und CNR eine Erhöhung der Werte ebenfalls für die FNH mit Nidus festgestellt werden. Auch zeigte sich, dass die gemessenen und errechneten Werte auch für das jeweils umgebende Lebergewebe analog zu den Läsionen erhöht war, allerdings nur soweit, dass immer noch eine genügend hohe CNR gemessen werden konnte. Innerhalb der Gruppe der HCC erfolgte eine Aufteilung in solitär gegen multifokal vorliegende HCC, diese beiden Einheiten wurden ebenfalls wie die FNH auf Unterschiede und Gemeinsamkeiten überprüft. Leider waren auf Grund der Aufteilung der HCC in solitär und multifokal keine Vergleiche mit bisherigen Arbeiten möglich, da diese Unterscheidung bisher noch nicht gewählt worden war.
5.1.1 Hintergrund und Ziele Zyklusunregelmäßigkeiten im Sinne von Hypermenorrhoen, Menorrhagien, Metrorrhagien oder Dysmenorrhoen bedeuten für viele Frauen eine deutliche Einschränkung der Lebensqualität. Derzeit kommen zur Therapie der Blutungsstörungen hauptsächlich drei im Ansatz unterschiedliche Methoden zum Einsatz. Dazu zählen medikamentöse Therapien, die seit langem praktizierte Hysterektomie und organerhaltende oder minimal-invasive Verfahren. Zu den organerhaltenden, minimal-invasiven Behandlungsmethoden zählt die Ballonablation des Endometriums, deren langfristige Effektivität und Akzeptanz in der vorliegenden Arbeit an 30 Patientinnen untersucht wurde. 5.1.2 Material und Methode Zwischen Januar 1999 und Dezember 2002 befanden sich die 30 in die Studie einbezogenen Patientinnen zur Durchführung einer Uterus-Ballon-Therapie im Zentrum für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Universitätsklinik Frankfurt am Main in stationärer Behandlung. In dieser retrospektiven Fallanalyse wurden die Patientinnen mit einem Fragebogen angeschrieben. Der Fragebogen umfasste im Wesentlichen drei Punkte: 1) Die allgemeine Zufriedenheit mit der Behandlung; 2) Den Behandlungserfolg zum Zeitpunkt der Befragung im Vergleich zu vor der Operation (Blutungsstärke, Blutungsregelmäßigkeit und Regelschmerzen) 3) Die zusätzlich zur Ballonablation in Anspruch genommenen Behandlungen (z.B. Medikamente, Kürettage) und deren Wirkung auf das Ergebnis. Die mittlere Nachbeobachtungszeit betrug 29,6 Monate (7 bis 65 Monate). 5.1.3 Ergebnisse Zum Beobachtungszeitpunkt waren 16 Patientinnen (53 %) mit der Behandlung insgesamt sehr zufrieden. 8 Patientinnen (27 %) zeigten sich zufrieden und 6 Patientinnen (20 %) waren mit der Behandlung insgesamt unzufrieden. In der vorliegenden Untersuchung lag der Anteil der Patientinnen mit postoperativer Amenorrhoe oder abgeschwächter Blutung bei 83 %, die Amenorrhoerate betrug 33 %. Die Verringerung des maximalen täglichen Verbrauchs von Binden/Tampons nach der Ballonablation war signifikant. Innerhalb der ersten 36 Monate nach der Koagulation des Endometriums kam es zu keiner signifikanten Verschlechterung des Behandlungserfolges. Die Uterus-Ballon-Therapie zeigte einen positiven Einfluss auf die Dysmenorrhoe und auf die Blutungsregelmäßigkeit. Medikamentöse Vorbehandlung oder eine Vorbehandlung mittels Kürettage vor der Ballonablation hatten keinen signifikanten Einfluss auf den Behandlungserfolg. 5.1.4 Diskussion und Schlussfolgerung Als Goldstandard der Endometriumablation wird derzeit die transzervikale Resektion des Endometriums in Kombination mit dem gezielten Einsatz des Rollerballs gesehen. Die Uterus-Ballon-Therapie stellt eine technisch einfache und schnell durchführbare Behandlungsalternative bei Menorrhagien dar. Bezüglich der Patientenzufriedenheit und der Reduktion verstärkter Menstruationsblutungen ist das Verfahren den Methoden der ersten Generation ebenbürtig.
Im Zeitraum von Januar 1993 bis Dezember 2003 wurden in der Klinik für Unfall- und Wiederherstellungschirurgie des Klinikums Darmstadt 62 Patienten bei metastatischem Befall der Wirbelsäule mit drohender oder manifester Instabilität im thorakalen und lumbalen Bereich unter palliativen Gesichts-punkten mit einem Fixateur interne dorsal stabilisiert. Insgesamt wurden 65 Segmente operativ versorgt. Bei den Patienten handelte es sich um 36 männliche (58%) und 26 weibliche (42%) Personen mit einem Durchschnittsalter von 64 Jah-ren (40-89 Jahre). Durchschnittlich 1,8 Jahre seit Diagnosestellung waren bis zur Operation vergangen, es handelte sich hauptsächlich um Primärtumoren der Mamma, des Bronchialsystems, der Prostata und Niere, sowie um Plasmozyto-me, welche alle zusammen für 70% der Primärdiagnosen verantwortlich waren. Bei 42 (67,74%) Patienten lag ein Stadium 3 nach Askin vor, bei 20 (32,26%) Patienten ein Stadium 4. Von den Patienten mit neurologischen Defiziten waren 2 (3,22%) paraplegisch mit minimaler motorischer Restfunkti-on, damit Frankel Stadium B zuzuordnen, 7 (11,29%) dem Stadium C mit motorischen Defiziten bei erhaltener Rest-funktion. 11 Patienten (17,74%) hatten lediglich sensible Defizite, waren jedoch alle mobil (Stadium D). Insgesamt hatten damit 20 Patienten (32,25%) präoperativ neurologische Defi-zite. Präoperativ betrug die geäußerte Schmerzintensität durchschnittlich 6,91 nach VAS. Intraoperativ kam es bei durchschnittlich 118,8 Minuten Ein-griffsdauer und im Mittel 913ml Blutverlust zu einer einzigen Komplikation, einer Duraverletzung. Postoperativ kam es bei 8 Patienten zu Komplikationen (12,9%). Eine Blasenlähmung mit Parästhesien nach Duralä-sion bildete sich vollständig zurück. Eine einzige Pedikelfehlplatzierung wurde erfolgreich revidiert, eine Dislokation einer Längsstange wurde nach 3 Monaten klinisch auffällig und gleichermaßen komplikationslos korrigiert. Ein postope-rativ aufgetretenes Serom war nach Revision saniert. Drei Patienten in reduziertem Allgemeinzustand verstarben innerhalb von 2 Wochen postoperativ an Herz-Kreislauf-Versagen, ein Patient überstand unter Intensivtherapie eine Sepsis bei reiz-losem Zugangsbereich. Die postoperative Schmerzintensität betrug durchschnittlich 0,30 Punkte nach VAS. Neurologisch kam es bei 10 der Patienten (50%) mit einem präoperativ be-stehenden neurologischen Defizit zu einer Verbesserung der Symptomatik. Bei 18 von 62 Patienten (29,03%) verblieben neurologische Defizite, wovon 14 sensorischer (22,58%) und 4 motorischer (6,45%) Qualität waren. 58 von 62 Patienten (93,55%) waren postoperativ wieder mobil. Die mittlere Überlebenszeit betrug 3,53 Jahre postoperativ.
Die Nutzung von Computern hat in unserer Gesellschaft während der letzten Jahre stark zugenommen und eine Umkehrung dieses Trends ist derzeit nicht denkbar. Auch in zunehmend mehr Feldern der Medizin wird Computertechnik genutzt, wobei nicht nur die im medizinischen Sektor Beschäftigten, sondern auch die Patienten immer häufiger mit dem Computer als diagnostischem Hilfsmittel konfrontiert werden. Es erscheint naheliegend, daß psychiatrisch kranke Menschen besonders sensibel hierauf reagieren könnten. Menschen richten ihr Handeln an individuellen Leitschienen aus, sie handeln auf der Grundlage von Einstellungen (englisch: attitude). Akzeptanz beschreibt hingegen einen kurzfristigen Prozeß, die Bereitschaft, etwas Neues anzunehmen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, welche Rolle die Einstellung zu Computern (‚computer attitude‘) und die Akzeptanz von Computeruntersuchungen bei deren Anwendung an psychiatrischer Patienten spielen. Sie untersucht, ob und wie sich Einstellung und Akzeptanz messen lassen und wodurch sie beeinflusst werden. 160 stationär behandelte psychiatrische Patienten der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie I der J.W. Goethe-Universität beantworteten einen Fragebogen zur Messung der Einstellung gegenüber Computern (GCAS). Ein Teil (N=78) dieser 160 Patienten absolvierte zusätzlich eine umfangreiche Test- und Fragebogenbatterie am Computer und mit herkömmlichen ‚Papierund-Bleistift‘-Verfahren, in deren Verlauf die Akzeptanz der Untersuchung erfaßt wurde. Die Untersuchungszeitpunkte lagen jeweils in enger zeitlicher Nähe zur Aufnahme und zur Entlassung aus der stationären Behandlung. Wiederum ein Teil (N=22) dieser 78 Patienten hatte zwischen Erst- und Zweituntersuchung Gelegenheit, den Computer in einer spielerisch gestalteten Weise als Freizeitinstrument zu nutzen. Die Auswertungen berücksichtigten die Zugehörigkeit zu drei diagnostischen Subgruppen (‚psychotische Störung‘, ‚affektive Störung‘ und ‚andere Störungen‘). Zunächst wurden die Testgütekriterien der selbst entwickelten Instrumente geprüft. Es zeigte sich eine generell positive Einstellung der untersuchten Patienten gegenüber dem Computer (GCAS-Score > 48 bei 76,9% der Patienten). Bezüglich der diagnostischen Subgruppen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Männliche (Z=2,4; p=0,02), jüngere (R=-0,22; p=0,002) und besser gebildete Patienten (R=0,34; p=0,00001) hatten jedoch eine bessere Einstellung gegenüber Computern. Es fanden sich Unterschiede in der Akzeptanz der Computeruntersuchung in Abhängigkeit von diagnostischer Subgruppe und Einstellung zu Computern. Die spielerische Kurzintervention erwies sich als nicht geeignet die Einstellung gegenüber Computern signifikant zu verändern. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, welchen Einfluß Einstellungen und Akzeptanz auf die Interaktion von Patient und Computer haben. Die Kenntnis dieses Einflusses ist für die Bewertung der am Computer erzielten Testergebnisse eine wesentliche Information.
Zentrale Konzepte der Tourismusforschung : unter besonderer Berücksichtigung des Sporttourismus
(2006)
Die Arbeit gliedert sich insgesamt in vier Teile: einen Einführungsteil, zwei Hauptteile und einen Abschlussteil: Der einführende Teil A erläutert die theoretischen Grundlagen des Tourismus. Hier wird der Tourismus als komplexes Phänomen in seinen verschiedenen Facetten beschrieben. Dazu werden definitorische und explikative Beschreibungen des Phänomens herangezogen, seine Besonderheiten und seine Entstehung in der zeitlichen Perspektive dargestellt und seine aktuelle ökonomische und gesellschaftliche Bedeutung aufgezeigt. Teil B bildet den ersten Schwerpunkt der Arbeit und beschreibt die fünf bereits genannten zentralen touristischen Konzepte aus psychologischer Perspektive: Die „Reisemotivation“, die „Reiseentscheidung“, die „Reisezufriedenheit“ sowie die „Urlaubertypologien“ und die „Reisebiographien“. Alle Konzepte werden in ihren Grundlagen und Anwendungen auf den Tourismus dargestellt und mit Hilfe grundlegender psychologischer Erkenntnisse erklärt. Teil C thematisiert den zweiten Schwerpunkt der Arbeit. Eine besondere Teildisziplin des Tourismus, der Sporttourismus, wird als eigenständiges Phänomen vorgestellt. Darüber hinaus werden psychologische Erklärungsansätze für vielfältiges sporttouristisches Verhalten aufgezeigt. Ergebnisse empirischer Untersuchungen zeigen die besondere Situation des Sporttourismus auf, sie orientieren sich dabei an den in Teil B vorgestellten Konzepten. Der vierte Teil D stellt eine abschließende Würdigung der vorliegenden Arbeit dar.
P2X receptors are ligand (ATP)-gated ion channels that open an intrinsic cation permeable pathway in response to extracellular ATP released from both neuronal and non-neuronal cells. P2X receptors are abundantly distributed and mediate a wide variety of physiological functions, ranging from fast synaptic transmission in the central, peripheral, and enteric nervous system, to proinflammatory cytokine release from immune cells. The primary aim of this work was to elucidate the pathway that leads to the finally assembled trimeric P2X receptors, including the assessment of a possible role of ER chaperones and folding factors in this process. Additionally, the study was conducted to investigate the various ER quality control processes involved in the selection of “properly folded and assembled” P2X receptors that are suitable for the surface expression.
Das Genom des anaeroben ε-Proteobakteriums Wolinella succinogenes codiert überraschenderweise für Enzymkomplexe, die typisch für die aerobe Atmung sind. Die entsprechenden Gene werd en unter bekannten Wachstumsbedingungen nicht
exprimiert. Darunter findet sich ein Operon ( sdhABE) für eine putative „Succinat-Dehydrogenase“, die hohe Sequenzhomol ogien zu sog. „nicht-klassischen“ archaealen Succinat-Dehydrogenasen zeigt. In der vorliegenden Arbeit sollte die „Succinat-Dehydro genase“ mit Hilfe des etablierten genetischen Systems zur Modifikation und Produktion der Chinol:Fumarat-Reduktase(QFR) homolog in W. succinogenes produziert und charakterisiert werden. Das genetische System besteht aus der QFR- Deletions-mutante ΔfrdCAB und dem Vektor pFrdcat2, der aufgrund seiner zentralen Bedeutung im Rahmen dieser Arbeit sequenziert wurde.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Insektenzellen /Baculovirus-System für die heterologe Expression der NTPDase6 etabliert. Nach der Herstellung und Selektion des NTPDase6-positiven Baculovirus wurden drei Insektenzelllinien hinsichtlich der optimalen Expressions-bedingungen für die NTPDase6 analysiert. In Sf9(+Serum)-, Sf9(-Serum)- und High FiveTM-Zellen wurde eine Expression und Sekretion des aktiven Enzyms nachgewiesen. Ferner konnte durch die Analyse mit PNGaseF eine partielle N-Glykosilierung experimentell gezeigt werden. Die Aktivität im Kulturüberstand übertraf generell die Aktivität in der löslichen Zellfraktion. Die höchste GDPase-Aktivität war mit 22,96 nmol Pi /(106 Zellen x min) nach 6 Tagen im Kulturüberstand der SF9(-Serum)-Zellen zu verzeichnen. Nachdem die Erntequelle sowie der Erntezeitpunkt feststanden, wurden in den folgenden Experimenten verschiedene chromatographische Verfahren für eine Reinigung der NTPDase6 analysiert. Eine Bindung der NTPDase6 konnte für die Chromatographie mit Con A-Sepharose 4B, Q Sepharose Fast Flow, Reactive Red 120-Agarose, Reactive Green 19-Agarose, Cibacron Blue 3GA-Agarose und die Reactive Brown 10-Agarose verzeichnet werden. Hingegen wurde eine nur partielle Bindung der NTPDase6 für die Reactive Yellow 86-Agarose, Reactive Blue 4-Agarose und die Ni2+-NTA-Agarose nachgewiesen. Nicht oder kaum NTPDase6-bindend waren die CM Cellulose, GDP-Agarose, Protino Ni-TED und BD TALON. Ebenfalls analysiert wurde die Größenausschluss-Chromatographie mit Sephacryl S-100 HR unter verschiedenen Bedingungen. Für das finale Reinigungsschema wurde die Con A-Sepharose 4B-Chromato-graphie aufgrund der geringen Kosten und des großen Volumens als erster Reinigungsschritt eingesetzt. Als zweite Phase der sequentiellen Reinigung wurde die Cibacron Blue 3GA-Agarose ausgewählt, da in der Pilotstudie über die Reaktivfarbstoffe mit diesem Material die höchste Elution der GDPase-Aktivität beobachtet werden konnte. Für den dritten Schritt wurde aufgrund der hohen Trennschärfe die Ni2+-NTA-Agarose verwendet. Insgesamt wurde mit diesen drei Schritten eine 180 fache, partielle Reinigung der NTPDase6 erreicht. Es erwies sich, dass die erhaltene Proteinmenge für die geplanten Röntgenstrukturanalyse und die Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie nicht ausreichte. Als weitere Möglichkeit für die Untersuchung des angereicherten Enzyms stand die MALDI-TOF-Analyse zur Verfügung. In diesen Untersuchungen wurde die Aminosäuresequenz zu 43,9 % verifiziert und es ergaben sich Hinweise darauf, dass die potenzielle N256-Glykosilierungssstelle bei der heterologen Expression in Insektenzellen nicht genutzt wird. Weiterhin wurden die potenziellen N-terminale Signalpeptide und Spaltstellen der NTPDase6 in silico mit Hilfe des SignalP 3.0-Algorithmus analysiert. Diese Untersuchungen ergaben putative Spaltstellen an den Aminosäurepositionen L25 und A40 mit einer Wahrscheinlichkeit von 37 % und 7 %. Mit Triton X-114-Separationen wurde ferner nachgewiesen, dass 60,7 % der NTPDase6 in der Zelle in löslicher Form und 39,3 % in membrangebundener Form vorliegen. Die hier erbrachten Nachweise einer putativen N-terminalen Spaltstelle und der intrazellulären Spaltung des hydrophoben Signalpeptides deuten darauf hin, dass es sich bei der Sekretion des Proteins um einen physiologischen Vorgang handelt. Es ist wahrscheinlich, dass die gleichzeitige Lokalisation des Enzyms im Golgi-Apparat und im Kulturüberstand einen physiologisch relevanten Mechanismus darstellt und das Enzym extra- sowie intra-zellulär für die Hydrolyse von 5’-Nukleosid-Diphosphaten verantwortlich ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Lokalisation der NTPDase6 in vivo untersucht. Dazu wurden NTPDase6-Antikörper hergestellt und mit Hilfe von Immunoblots sowie in der Immunzytologie charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die NTPDase6-Antikörper nur in der Immunzytologie verwendet werden können. Zur Untersuchung der zellspezifischen Expression der NTDPase6 wurden anschließend immunhistologische Analysen am adulten Rattengehirn durchgeführt. Markierte Zellen präsentierten sich z.B. im gesamten Kortex des Gehirns, im Gyrus dentatus des Hippokampus, im Corpus striatum und im Septum. Die markierten Zellen zeigten eine organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns, die eine Markierung von Golgi-Stapeln vermuten lässt. Nur in Zellen mit einem großen Nukleus, bei welchen es sich um große Nervenzellen handeln dürfte, konnte die beschriebene Fluoreszenz nachgewiesen werden. Diese Markierungen als NTPDase6-spezifisch zu beurteilen ist jedoch schwierig, da die Präimmunkontrollen eine schwache, organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns von Zellen mit einem großen Nukleus aufwiesen. Insgesammt liefern die Untersuchungen einen neuen Beitrag zum Verständnis der Struktur und der Prozessierung der NTPDase6 sowie ein Verfahren zur heterologen Expression und zur anschließenden partiellen Aufreinigung des Enzyms.
Summary and Outlook The aim of this work was the investigation of the Mn2+ binding sites in hammerhead and the Diels-Alder ribozymes. This project consists of three main topics. In the first part quantification and structural characterization of Mn2+ binding sites in the m- and the tsHHRz using Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy are described. The second part summarizes the newest results obtained for the cleavage activity of both mand tsHHRzs in the presence of different Mg2+ and Mn2+ and Na+ ion concentrations using the new method with fluorescent-labeled RNAs. Here the influence of neomycin B on the structure of Mn2+ binding pockets and on the catalytic activity of both HHRzs is discussed. In addition, a possible role of Mn2+ ions is suggested from correlation of the EPR data with the kinetic results. The last chapter is devoted to quantification and differentiation of Mn2+ binding sites of the Diels-Alder ribozyme using continuous wave (cw) EPR experiments in solution. In this work EPR spectroscopy was used to study the binding of Mn2+ ions to the cis tsHHRz and to compare it with the binding to the trans mHHRz and to the Diels-Alder ribozyme. Cw EPR measurements showed that the tsHHRz possesses a single highaffinity Mn2+ binding site with a KD of < 10 nM at a NaCl concentration of 0.1 M. This dissociation constant is three orders of magnitude smaller than the KD determined for the single high-affinity Mn2+ site in the mHHRz (KD = 4.4 μM). The measurements of catalytic activity have been performed using fluorescent-labeled RNAs. Compared to the mHHRz, the cis tsHHRz cleaves up to 20-fold faster in the presence of Mg2+/Mn2+ ions with no saturation of the cleavage rates at high metal(II) ion concentrations. This is in good agreement with the last investigations on the trans tsHHRz (Nelson et al. 2005). Thus, the much stronger Mn2+ binding and higher cleavage activity were attributed to the interaction between the two external loops of the tsHHRz which reduces the RNA dynamics and traps the Mn2+ in the tightly folded conformation. Intriguingly, according to the EPR studies the binding constants for Mn2+ ions are several orders higher than the concentration of Mn2+ ions required for the catalytic activity (mHHRz: KD = 4.4 ± 0.5 μM and the Mn2+ concentration required to achieve half of the maximum cleavage rate [Mn2+]1/2 = 4.1 ± 0.6 mM respectively). Therefore, strongly bound Mn2+ ions seem to be needed for the folding of the HHRz, whereas weakly bound metal(II) ions are required to achieve full catalytic activity, and may be directly involved in catalysis. A comparison between the Electron Spin Echo Envelope Modulation (ESEEM) and Hyperfine Sublevel Correlation (HYSCORE) spectra of m- and tsHHRz demonstrates that both binding sites in HHRzs are structurally very similar. This suggests that the Mn2+ is located in both ribozymes between the bases A9 and G10.1 of the sheared G•A tandem basepair, as shown previously and in detail for the mHHRz (Vogt and DeRose 1998, Schiemann et al. 2003). However, the hyperfine spectra of the tsHHRz with 15N labeled G10.1 revealed no difference in comparison with the ones with 14N. This leads to an interpretation that the Mn2+ binding sites in both ribozymes are not identical. In addition, aminoglycoside antibiotic neomycin B inhibits the cleavage activity of both despite of the fact that it displaces the high-affinity Mn2+ ion only from the mHHRz. Hence, binding of neomycin B to the m- and the tsHHRzs probably occurs at different sites and neomycin B displaces only loosely bound Me2+ ions from the tsHHRs, whereas in the mHHRz both the high-affinity ion and the weakly bound ions are replaced. Therefore, it cannot be excluded that weakly bound Mg2+/Mn2+ ions, together with looploop interactions, induce a structural rearrangement which brings the high-affinity ion closer to the cleavage site. In the case of the Diels-Alder ribozyme it possesses five Mn2+ binding sites with KD = 0.6 ± 0.2 μM in solution under conditions where it is catalytically active. The competition experiment with Cd2+ allows to distinguish three different types of Mn2+ binding sites in the Diels-Alder ribozyme including inner-sphere monomeric Mn2+, monomeric Mn2+ bound through water-mediated contacts and electronically coupled dimeric Mn2+. Three Mn2+ ions are more strongly bound to the ribozyme via inner-sphere contacts, whereas two other Mn2+ ions form water-mediated outer-sphere contacts with the nucleotides of the ribozyme. The inner-sphere Mn2+ with the highest affinity and the fourth Mn2+ ions added to the ribozyme form a dimer with a Mn2+-Mn2+ distance of ~6 Å (as arises from simulations). Moreover, an addition of the product analog inhibitor (AMDA) to the [Diels-Alder ribozymes/ Mn2+] complex shows no conformational changes in the Mn2+ binding pockets. This is in good agreement with the recent studies which suggest that the Diels-Alder ribozyme is preorganized (Keiper et al. 2004). Some considerations on the evolution of the project (Outlook) There may be several venues of continuation of this project, which exploit on unique combination of EPR experiments and biochemical studies on RNA. This combination may allow us to significantly contribute to understanding of metal role in HHRz catalysis. Since the tsHHRz possesses the high affinity Mn2+ binding site (Kd < 10 nM) it creates a possibility to find conditions where the structural site is occupied by Mn2+, while catalytic sites are occupied by Mg2+ ions. If these conditions will be established by EPR titration, a set of standard biochemical experiments may be designed to look at the kinetic of cleavage and differentiate the “structural” and catalytic effects. The other experiment would be to look at the Mn2+ binding site in the tsHHRz in comparison with P1 and P1/P2 complexes and compare the results with the ones for the mHHRz. No matter the answer, P1 can be used as a simpler model to study the effect of tertiary structure on Mn2+ binding. A set of the tsHHRz mutants can be created to observe the mutations affect on Mn2+ binding sites, Mn2+ affinity and correlate the data with the kinetic analysis. FRET-based kinetic assay with fluorophore pairs on P1 and P2 can be designed for the kinetic experiments. Having this system one will be able to perform kinetic measurements 100-fold faster comparing to standard gel procedures (everything will be done in 96-wells). By manipulating the lengths and the sequence of P2 we most likely will be able to use FRET assay for the chemical step analysis (provided Kd > k2), and measure it using stop-flow system with time resolution of microseconds. And finally, one will be able to quantitatively measure the effect of neomycin B on the tsHHRz. Another interesting possibility would be to look at the state of metal(II) in the tsHHRz – enzyme alone (dissociated product) and in the enzyme-product complex and compare with the full-length tsHHRz. It will provide the information about the local rearrangements upon catalysis and the role of metal(II) ions. Furthermore, additional pulse-EPR experiments using 15N labeling have to be performed in order to reveal the location of the high-affinity Mn2+ binding site in the tsHHRz. Additionally, paramagnetic Mn2+ ions can be localized within the global fold of HHRzs using PELDOR and site-directed spin labeling. Further characterization of the high-affinity binding site in the tsHHRz can be performed using high-field ENDOR measurements in order to obtain the 14N and 31P tensors.
Traditionell-morphologisch begründete Hypothesen zur Großphylogenie der Metazoa sind im Verlauf der letzten Jahre durch molekularbiologische Untersuchungen grundsätzlich in Frage gestellt worden. Die molekularbiologisch begründete Metazoen-Großphylogenie wird seit einem Übersichtsartikel von ADOUTTE et al. (2000) meist als „New Animal Phylogeny“ bezeichnet (kurz: NAP); sie beinhaltet eine Restrukturierung des Stammbaumes (kladogenetischer Aspekt) und die Infragestellung einer morphologischen Komplexitätssteigerung nach dem Schema acoelomat-pseudocoelomat-coelomat (anagenetischer Aspekt). Hinsichtlich der Kladogenese steht die Neueinteilung der Bilateria in drei Superphyla Deuterostomia, Ecdysozoa und Lophotrochozoa im Vordergrund; die Genealogie innerhalb dieser drei Großgruppen ist aber z.Z. relativ schlecht aufgelöst, so daß sich Vergleichsmöglichkeiten mit morphologischen Vorgängermodellen schnell erschöpfen. Aus diesem Grunde wird in vorliegender Arbeit der anagenetische Aspekt als Ausgangspunkt für eine umfassende morphologische Interpretation der molekularbiologischen Resultate gewählt. Momentan wird auf molekularsystematischer und vergleichend-entwicklungsgenetischer Basis davon ausgegangen, daß die frühesten Bilaterier eine acoelomate Organisation aufwiesen, von hier aus eine relativ komplexe, polymer-coelomate Organisation erwarben, welche dann aber in zahlreichen Bilaterierlinien sekundär reduziert wurde. Die ursprünglich acoelomate Organisation wird rezent nur durch eine sehr isolierte Linie, die Acoela (ggf. auch Nemertodermatida) vertreten, während alle anderen Bilaterier von einem polymer-coelomaten „Urbilaterier“ abstammen sollen. In vorliegender Arbeit wird die Auffassung vertreten, daß die morphologische Deutung eines solchen anagenetischen Szenarios am ehesten anhand der Hydroskelett-Theorie von W. F. GUTMANN (1972 et mult.), sowie späteren auf diesem Entwurf aufbauenden Arbeiten (insbesondere der Gallertoid-Hypothese, BONIK et al. 1976) möglich ist, d.h. auf konstruktionsmorphologischer Grundlage. Um den Nachweis einer weitgehenden Übereinstimmung von NAP und Gallertoid-Hydroskelett-Theorie zu führen, werden für 36 Metazoenbaupläne (4 Nonbilaterier, 32 Bilaterier) aktuelle molekularphylogenetische Befunde den jeweiligen konstruktionsmorphologischen Interpretationen gegenübergestellt. Für die vier Nonbilateria-Linien ergibt sich eine Vereinbarkeit auf kladogenetischer Ebene insbesondere dann, wenn die Placozoa vor den Porifera abzweigen (z.Z. aufgrund von mtDNADaten anzunehmen); auf anagenetischer Ebene aufgrund von Studien, welche die „Diploblastica/ Triploblastica“-Unterteilung in Frage stellen (Mesoderm-Problem). Für die Bilateria ist u.a. festzuhalten, daß im Rahmen der Hydroskelett-Theorie kein Schwestergruppenverhältnis Annelida + Arthropoda angenommen wurde, so daß die umstrittene neue Großgruppe Ecdysozoa unproblematisch ist: Ecdysozoa werden durch Ableitung der „Aschelminthen“ von polymeren Vorformen einer Deutung zugänglich. Die Molekularsystematik der Annelida, aber auch der Deuterostomia ist mit konstruktionsmorphologischen Interpretationen vereinbar, bei den Deuterostomia v.a. der hochderivierte Status der Pterobranchia und Tunicata. Als kennzeichnendste Übereinstimmung ist die Einordnung der Tentaculata als hochabgeleitete Protostomier hervorzuheben, was sowohl als „Grundstein“ der NAP gilt (HALANYCH et al. 1995) als auch eine sehr spezifische Position der Hydroskelett-Theorie darstellt. Es wird gefolgert, daß die Gallertoid- Hydroskelett-Theorie zentrale Resultate der NAP besser zu integrieren vermag als andere Entwürfe. Konsequenzen für merkmalsmorphologische Deutungen werden aufgezeigt.
In dieser Arbeit werden Monozyten mit Hilfe der Ficoll-Trennung und Positivanreicherung durch das MACS-Magnetsystem gewonnen und durch die Zytokine GM-CSF und Interleukin 4 stimuliert. Nach zwei Tagen weisen die Zellen eine veränderte Morphologie auf, adhärieren zum Teil an Plastik und zeigen sowohl in der adhärenten als auch der nonadhärenten Fraktion charakteristische Merkmale dendritischer Zellen: In der Mikroskopie längliche, fädige Zytoplasmaausläufer sowie in der Durchflusszytometrie das Erscheinen der Oberflächenmarker CD1a und CD40. Die Zellen sind zu diesem Zeitpunkt zu ca. 90% unreife dendritische Zellen, wie die fehlende Ausprägung des Reifemarkers CD83 zeigt. Als unreife dendritische Zellen sind sie somit geeignet für die Antigenaufnahme; zur weiteren Ausreifung ist die Zugabe anderer Zytokine, z.B TNF α, notwendig. Als Mediengrundlage eignen sich sowohl RPMI+FCS als auch X-Vivo 15 und X-Vivo 20, wobei X-Vivo 15 und X-Vivo 20 aufgrund ihrer immunologischen Vorteile RPMI vorzuziehen sind. Ausblick Insgesamt sind schon vielversprechende Wege aufgezeigt worden, dendritische Zellen für die Immuntherapie zu gewinnen, und zwar sowohl aus CD34+ Stammzellen als auch aus CD14+ Monozyten. Wichtig wäre an dieser Stelle ein genauer Vergleich zwischen aus Monozyten und aus CD34+ Vorläuferzellen generierten Zellen in der Laborpraxis. Zum einen sollte hier untersucht werden, aus welcher Ausgangszelle sich größere Mengen an dendritischen Zellen generieren lassen. Die genaue Ermittlung der Zellzahl an jedem Kulturtag wäre hier von Bedeutung. Zum anderen sollte auch die Funktionalität der jeweiligen Zellen, etwa in der mixed-lymphocte-reaction, analysiert und miteinander verglichen werden, und zwar vor und nach zusätzlicher Gabe von TNF alpha. Die Mediengrundlagen X-Vivo 15 und X-Vivo 20 haben sich als gute Alternativen zu dem herkömmlich verwendeten RPMI 1640 gezeigt. An dieser Stelle wäre noch eine vergleichende Analyse der beiden Medien wichtig, und zwar im Hinblick auf die oben genannte Fragestellung der Zellzahl, Ausprägung der Oberflächenmarker und Funktionalität .
Seit der erstmaligen Beschreibung der MALDI (Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionisation) durch Michael Karas und Franz Hillenkamp, welche die massenspektrometrische Analyse auch großer Proteine über 100 kDa erlaubt, fand diese Technik sowohl unter den Massenspektrometrie-Gruppen als auch in Biochemischen Laboratorien rasche Verbreitung. MALDI kann inzwischen auf eine breite Palette von Biomolekülen angewendet werden und stellt heute - neben Elektrospray (ESI) -eine der beiden gebräuchlichsten massenspektrometrischen Methoden überhaupt dar. In ähnlicher Weise erlangte das Gebiet der Proteomics, der "systematischen Erforschung der zahlreichen und unterschiedlichsten Eigenschaften von Proteinen in paralleller Weise mit der Zielsetzung einer detaillierten Beschreibung der Struktur, Funktion und Steuerung biologischer Systeme im gesunden und krankhaften Zustand" eine Schlüsselstellung in der Biologie und damit einen erheblichen Einfluss auf alle Gebiete der Biologie, der Pharmazie und medizinisch verwandter Bereiche. In der Tat sind Proteine an allen biologischen Aktivitäten beteiligt und weisen die vielfaltigsten Eigenschaften auf, die in ihrer Gesamtheit zu unserem Verständnis biologischer Systeme beitragen. Die systematische Untersuchung dieser Eigenschaften macht das Gebiet der Proteomics aus und beinhaltet die Erforschung der Sequenz, Menge, Modifikationen, Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, der biologischen Aktivität, sub-zellulären Verteilung und dreidimensionalen Struktur. .... Letztlich wäre es für den Analytiker wünschenswert, aiie Schritte der MS-basierten Proteomics im Detail zu verstehen und damit vollständig zu beherrschen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb die drei entscheidenden Probenvorbereitungsschritte der MALDI-MS - gestützten Pmteomics näher untersucht. Proteinverdau: Der gebräuchliche Ansatz der MS-basierten Proteomics beinhaltet im ersten Schritt den (enzymatischen) Verdau der Proteinprobe, meist mit Trypsin aufgrund seiner sauber definierten Schnittstellen auf der C-terminalen Seite der basischen Aminosäuren Arginin (R) und Lysin (K) bei pH um 8. Dazu wurden in den vergangenen Jahrzehnten etliche Protokolle entwickelt, die auf eine möglichst vollständige Proteolyse und damit hohe Ausbeute an Spaltpeptiden abzielen. Probenaufreinigung: Als Bindeglied zwischen Proteinisolierung und MS-Analyse kommt der Aufieinigung des beim Verdau anfallenden Peptidgemischs entscheidende Bedeutung zu, da die Reinheit der Proben letzten Endes ausschlaggebend für die Qualität der Spektren ist. Auch hier sind kontinuierliche Anstrengungen zur Verbesserung im Gange, wobei in den letzten Jahren insbesondere auch spezielle Aufreinigungsmethoden für den Mikro-Maßstab beschrieben wurden, die den Bedürfnissen der Proteomics besonders entgegenkommen. Probenpräparation: Der letzte entscheidende Schritt vor der MALDI-Analyse besteht im ,,Spotting", dem Auftrag der zu analysierenden Probe zusammen mit der Matrix und deren Co-Kristallisation auf dem Probenteller. Hier bestimmen u.a. die Wahl der Matrix, der verwendeten Lösungsmittel sowie die Zugabe verschiedener Additive das Ergebnis. Obwohl der Einfluss der Matrix und Additiven auf den Desorptionsprozess einleuchtend und aus empirischen Erfahrungen seit langem bekannt ist, fehlt einem rationalen Vorgehen hier insofern die Grundlage, als dass leider noch immer kein Desorptions- und Ionisationsmechanismus gesichert ist. .... Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die vorliegenden Untersuchungen viele interessante Details und neue Ideen lieferten, die zur Verbesserung der MALDI-TOF-Analytik bei Proteomics beitragen können, so etwa: - die Portierung der einfachen, schnelle und preiswerten Probenaufreinigung mittels PVDF- und Nitrozellulosemembranen auf titerplattenbasierte Robotersysteme, bei denen eine automatisierte Zugabe der geeigneten Membranstücke, gefolgt von einfachen Wasch- und Extraktions-Schritten das Probenhandling wesentlich erleichtern sollten, - eine mögliche Verbesserung der Proteinidentifizierung durch Selektion eher hydrophiler Peptide durch neue Materialien wie HILIC, da die Mehrzahl der zur herangezogenen Peptide eher hydrophoben Charakter besitzt, - die weitere Verwendung und Erweiterung der im Rahmen dieser Arbeit erstellten Datenbanken zur Aufklärung der Zusammenhänge zwischen Peptidsequenz, der damit verbundenen physikochemischen Eigenschaften und Selektivitäts- / Unterdrückungseffekten bei der MALDI-MS.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine medikamentöse Therapie mit Atorvastatin bei Patienten mit stabiler KHK zur Steigerung kultivierter EPCs mit verbesserter funktioneller Aktivität führt. Die Daten zeigen des weiteren, dass die Statintherapie nicht die Zahl hämatopoetischer Progenitorzellen erhöht, sondern die Differenzierung in zirkulierende EPCs fördert. Ein Faktor, wie z.B. VEGF, GM-CSF oder TNF-alpha, der die erhobenen Ergebnisse reflektiert bzw. vermittelt, konnte nicht gefunden werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass Atorvastatin über den PI3K-Signaltransduktionsweg, unabhängig von NO, die Differenzierung von EPCs stimuliert. In einer zweiten Studie konnte gezeigt werden, dass auch der ACE-Inhibitor Ramipril vor allem eine Verbesserung der funktionellen Aktivität der EPCs induzierte und ebenfalls zu einer Steigerung der Zahl der kultivierten EPCs führte. Aufgrund der starken Schwankungen der FACS-Messungen bei kleinen Patientenkollektiven besteht eine Diskrepanz zwischen den kultivierten und zirkulierenden EPCs. Auch konnte gezeigt werden, dass die EPC-Zahl und -Funktionalität vor Therapie durch den HGF-Serumspiegel reflektiert wurde und positiv mit ihm korrelierte. Diese Korrelation blieb jedoch unter Ramipriltherapie nicht bestehen, so dass davon auszugehen ist, dass der Einfluss von Ramipril nicht durch HGF, sondern über einen noch zu untersuchenden Mechanismus vermittelt wird. So können Statine und potentiell einige Subgruppen der ACE-Inhibitoren neue Therapieoptionen der KHK eröffnen.
Die durch das humane Zytomegalievirus (HCMV) ausgelöste Retinitis kann bei HIV-Infizierten und immunsuppremierten Patienten zu einer Einschränkung der Sehfähigkeit bis hin zu Erblindung geführt. Die HCMV-Retinitis schädigt die Retina, diese Schäden sind in der Regel nicht reversibel. Stets besteht auch die Gefahr des Ausbrechens der Infektion im kontralateralen Auge. Die Therapie kann zu schweren Nebenwirkungen führen, jedoch konnte durch die Entwicklung des oral anwendbaren Valganciclovir eine deutliche Vereinfachung der Behandlung erreicht werden. Mit der Untersuchung der HCMV-Replikation in retinalen Pigmentepithel (RPE)-Zellen steht ein Versuchsmodell zur Verfügung, in welchem sowohl die Vermehrung des Virus in einer für die HCMV-Retinitis bedeutsamen Zelllinie untersucht werden kann, als auch Erkenntnisse über das Verhalten des Virus in immunprivilegierten Geweben gewonnen werden können. Über Valproinsäure (VPA) ist bekannt, dass dieses Medikament zu einer gesteigerten Replikation des HI-Virus führt, auch wurde für supertherapeutische Konzentrationen ein Einfluss auf die Replikation von HCMV beschrieben. Valproinsäure erfährt neben ihrer ursprünglichen Indikation als Antiepileptikum zunehmend eine Erweiterung des Indikationsspektrums. Neben der Verwendung bei psychiatrischen Erkrankungen, insbesondere bipolaren Erkrankungen und der Schmerztherapie stellt die Anwendbarkeit von VPA und Derivaten des Medikaments in der Therapie maligner Tumore eine interessante Entdeckung dar. Obwohl gezeigt werden konnte, dass VPA neben einer Beeinflussung des Neurotransmitter-Stoffwechsels unter anderem zu einer Hemmung der Histondeacetylase (HDAC), zu Veränderungen an intrazellulären Signaltransduktionskaskaden, dem NO-Stoffwechsel und peroxysomal Proliferator-aktivierten Rezeptoren führt, ist eine genaue Zuordnung der Wirkmechanismen zu den Effekten des Medikaments noch nicht vollständig möglich. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Valproinsäure auch in therapeutischen Konzentrationen und in einer für die HCMV-Retinitis wichtigen Zelllinie zu einer Replikationssteigerung des HCMV führt. Die Replikationssteigerung zeigte sich sowohl im vermehrten Auftreten von frühen und späten Virusproteinen als auch in der vermehrten Abgabe von infektionsfähigen Viren an das Kulturmedium. In Zellkulturen ist die Vorbehandlung mit VPA vor der Infektion mit HCMV entscheidend für die Steigerung der Replikation, es lässt sich eine Konzentrations- und Zeitabhängigkeit der Replikationssteigerung für den untersuchten Bereich zeigen. Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Ergebnisse lassen es unwahrscheinlich erscheinen, dass die Steigerung der HCMV-Replikation über eine Stimulation der an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligten Enzyme PKC, ERK1/2 und p38 vermittelt wird. Ebenso weisen vorliegende Ergebnisse darauf hin, dass die durch VPA bedingte HCMVReplikationssteigerung nicht durch eine Veränderung der iNOS- und der PPAR-Aktivität bedingt ist. Es ist publiziert, dass VPA die HDAC inhibiert und dass die Replikation von HCMV, wie auch die anderer Viren, zum Teil über die Acetylierung von Histonen reguliert wird. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass auch in RPE-Zellen VPA zu einer Hemmung der HDAC führt, welche im untersuchten Rahmen zeit- und konzentrationsabhängig ist. In dieser Arbeit werden zudem eine Reihe von Parallelen zwischen dem HDAC-Inhibitor TSA und VPA aufgezeigt. Auch TSA führt in RPE-Zellen zu einer Stimulation der HCMV-Replikation. Unterschiede zwischen VPA und TSA zeigten sich im früheren Auftreten und kürzeren Anhalten der Stimulation der Virusreplikation nach TSA-Vorbehandlung. Diese Unterschiede könnten jedoch Ausdruck einer unterschiedlichen Pharmakokinetik der beiden Wirkstoffe sein. Die Ergebnisse vorliegender Arbeit lassen die Hemmung der HDAC und eine hieraus folgende Hyperacetylierung von Histonen durch VPA als wahrscheinlichste Ursache für die stimulierende Wirkung des Medikamentes auf die HCMV-Replikation erscheinen.
Unlimited self-renewal is an absolute prerequisite for any malignancy, and is the ultimate arbiter of the continuous growth and metastasis of tumors. It has been suggested that the self-renewal properties of a tumor are exclusively contained within a small population, i.e., the so-called cancer stem cells. Enhanced self-renewal potential plays a pivotal role in the development of leukemia. My data have shown that APL associated translocation products PML/RARalpha and PLZF/RARalpha increased the replating efficiency of mouse lin-/Sca1+ hematopoietic stem cells (HSCs). This effect is partly mediated by induction of gamma–catenin which is an important mediator of the Wnt signaling pathway and has been shown to be up regulated by the AML associated translocation products(AATPs). Suppression of gamma–catenin by siRNA can abrogate the increased replating efficiency induced by AATPs. Transduction of gamma–catenin in lin-/Sca1+ HSCs led to increased replating efficiency and the expression of stem cell markers Sca1 and c-kit. Additionally it induced accelerated cell cycle progression of mouse bone marrow HSCs. Transduction/transplantation mouse models have shown that ectopic expression of gamma–catenin in HSCs led to acute myeloid leukemia without maturation. These data suggest important roles of Wnt signaling pathway in the leukemogenesis induced by PML/RARalpha, PLZF/RARalpha and AML1/ETO. In contrast to AATPs, CML and Ph+-ALL associated translocation products p185(BCR-ABL) and p210(BCR-ABL) did not affect the self-renewal potential of hematopoietic stem/progenitor cells. However my studies indicated that their reciprocal translocation products p40(ABL/BCR) and p96(ABL/BCR) actually increased the replating efficiency of hematopoietic stem/progenitor cells. The effect is stronger when induced by p96(ABL/BCR) than by p40(ABL/BCR). It is very intriguing that p96(ABL/BCR) can activate Wnt signaling and up regulate the expression of HoxB4. Transduction/transplantation mouse model has shown that p40(ABL/BCR) and p96(ABL/BCR) both have their own leukemogenic potential. Given the fact that leukemic stem cells maintain the growth of tumor and are the origin of relapse, the cure of leukemia is dependent on the eradication of the leukemic stem cell and abrogation of aberrantly regulated self-renewal capability. Both t-RA and As2O3 have been shown to induce complete remission in APL patients with PML/RARalpha translocation product. However, t-RA as a single agent achieves completeremission (CR) but not complete molecular remissions (CMR). Therefore, virtually all patients will experience a relapse within a few months. In contrast to t-RA, As2O3 as a single agent is able to induce CR as well as CMR followed by long-term relapse-free survival in about 50% of APL patients even if relapsed after treatment with t-RA-containing chemotherapy regimens. Nothing is known about the mechanisms leading to the complete different clinical outcomes by the two compounds although both have been shown to induce differentiation of blast cells, proliferation arrest, induction of apoptosis and degradation of PML/RARalpha. We investigated the effect of t-RA and arsenic on PML/RARalpha-expressing cell population with stem cell capacity derived from the APL cell line NB4 as well as Sca1+/lin- murine bone marrow cells. We found that t-RA did not reduce the replating efficiency in PML/RARalpha- and PLZF/RARalpha-infected Sca1+/lincells whereas it selected small compact colonies representing very early progenitor cells. T-RA was unable to reduce the capacity to form colony forming units-spleen (CFU-S) of Sca1+/lin-cells expressing PML/RARalpha, additionally t-RA did not impair the capability of engraftment of NB4 cells in NOD/SCID mouse. On the contrary to t-RA, As2O3 abolished the aberrant self-renewal potential of Sca1+/lin- cells expressing PML/RARalpha. As2O3 not only abolished the replating efficiency of PML/RARalpha positive cells but also completely abrogated the ability of PML/RARalpha-positive HSC to produce CFU-S in vivo. On the contrary to As2O3, t-RA increased the absolute cell number and the percentage of cells in the side population with respect to the whole cell population in NB4 cells. Taken together these data suggest that arsenic but not all-trans retinoic acid overcomes the aberrant stem cell capacity of PML/RARalpha positive leukemic stem cells. My data prove for the first time that there is a direct relationship between the capacity of compounds to effectively target the LSC and their capacity to eradicate the leukemia, and, thereby, to induce complete molecular remission and long-term relapse-free survival. Thus, in order to increase the curative potential of leukemia therapies, future studies need to include the effect of given compounds on the stem cell compartment to determine their ability to eradicate the LSC.
Aortale Partikelfiltration zur Reduktion von neurologischen Komplikationen in der Koronarchirurgie
(2006)
Eine verminderte Neuropathogenität nach kardialen Eingriffen, die durch technischen Fortschritt erreicht werden könnte, wird durch das alternde Patientenkollektiv mit steigender Inzidenz für Arteriosklerose und erhöhtem Risiko zerebraler Komplikationen ausgeglichen. Zerebrale Dysfunktionen bleiben die häufigste Ursache für postoperative Morbidität und Mortalität. Als wichtigste Quelle partikulärer Embolien gilt die aortale Verkalkung. Der Zusammenhang zwischen partikulären Embolien und konsekutiver zerebraler Dysfunktion ist bekannt. Kritischer Zeitpunkt für die Embolisation der Gewebspartikel in das Gehirn ist die Öffnung der Aortenklemme. Es konnte gezeigt werden, dass die Platzierung eines intraaortalen Filters kurz vor Öffnung der Aortenklemme, die Inzidenz der neurologischen und neuropsychologischen Komplikationen in einer Hochrisiko-Patientengruppe reduzierte. Die vorliegende prospektiv randomisierte Studie untersuchte 50 Patienten mit niedrigem Risikoprofil, die sich im Zeitraum August 1999 bis Februar 2001 einer aortokoronaren Bypassoperation mit kardiopulmonalem Bypass, unterzogen. Bei 25 Patienten wurde der intraaortale Filter (Embol-X Inc, Mountain View, CA) eingesetzt. Zur Beurteilung der Effizienz der intraaortalen Filtration wurden neuropsychologische Untersuchungen (Mosaik-Test, Benton-Test, Zahlenverbindungs-Test, Zahlennachsprech-Test, d2-Test, Beck-Depressions-Inventar) erhoben und als laborchemisches Korrelat das S-100B-Protein und die NSE bestimmt. Die neuropsychologischen Untersuchungen wurden präoperativ, 5 Tage und 2 Monate postoperativ durchgeführt. Die Laborparameter wurden zu fünf Abnahmezeitpunkten bestimmt (vor Narkoseeinleitung, nach Beginn der extrakorporalen Zirkulation, 10 Minuten nach Öffnen der Aortenklemme, eine Stunde und 24 Stunden postoperativ) bestimmt. Die Patientengruppen zeigten hinsichtlich der demografischen und intraoperativen Daten keine statistisch signifikanten Unterschiede.Neurologische Komplikationen fanden sich in keiner der Gruppen. Die Ergebnisse der neuropsychologischen Untersuchungen zeigten im Gruppenvergleich für keinen Zeitpunkt einen signifikanten Gruppenunterschied. Die Mittelwerte des S-100B-Protein-Konzentration der Gruppe mit Filter waren zu allen Abnahmezeitpunkten niedriger als in der Gruppe ohne Filter, das Signifikanzniveau von 5% wurde nur zum Abnahmezeitpunkt nach Beginn der EKZ erreicht; es handelte sich hierbei also nicht um einen methoden-, sondern wahrscheinlich patientenbedingten Unterschied. Die Mittelwerte der NSE-Konzentration unterschieden sich im Gruppenvergleich nicht. Die Tatsache, dass sich weder aus den neuropsychologischen Untersuchungen, noch der NSE-Konzentration pathologische Werte ergaben, sehen wir im niedrigen Risikoprofil des Patientenkollektivs begründet. Bei sonst homogener Risikofaktorverteilung wurden bei 7 von 50 Patienten palpatorisch aortale Plaques oder Verkalkungen nachgewiesen (14%). Die Daten der zwei Patienten aus der Gruppe ohne Filter und der 5 Patienten aus der Gruppe mit Filter wurden gesondert ausgewertet. Trotz des erhöhten Risikos zeigte sich bezüglich der postoperativen Ergebnisse kein Unterschied. Ob dieser Risikoausgleich der intraaortalen Filtration zuzuschreiben ist, bleibt zum jetzigen Zeitpunkt eine Annahme. Zusammenfassend konnten wir in dieser Patientengruppe mit niedrigem Risikoprofil bezüglich der neurologischen und neuropsychologischen Ergebnisse keinen Behandlungsvorteil der intraaortalen Filtration feststellen. Weitere Untersuchungen von Patientengruppen mit aortaler Verkalkung oder Plaquebildung werden notwendig sein, um den Nutzen der aortalen Filtration beurteilen zu können.
Membranes are essential for life, because a cell must separate itself from the environment to keep its molecules from dissipating away and also must keep out foreign molecules that disturb them or their cell components. However, the cell must communicate with the environment and adapt to the external conditions, needs to pump in nutrients and release toxic products of its metabolism. Membrane proteins present in the membranes of the cell and cell organelles, help the cell to gather information about the environment and perform various biological processes. Membrane proteins perform a wide range of biological functions including respiration, signal transduction and transport. Despite their high importance in biological function, only few structures have been determined because of the difficulties in producing high amounts of membrane proteins and obtaining good quality crystals. This Ph. D. thesis involves the study of different kinds of cytochrome oxidases and a membrane anchored cytochrome oxidase electron donor. Though structures of many cytochrome oxidases are known to date, there exist many different types of oxidases in different organisms, which help the organism to survive under unfavorable environmental conditions. The structural differences between these terminal oxidases which make the organism to survive in extreme environments are unclear. To investigate these, structures of different types of oxidases are necessary. Therefore, we are interested in revealing the structural details of different types of oxidases. The different types of oxidase I worked with were the caa3 HiPIP:oxygen oxidoreductase from Rhodothermus marinus, the aa3-type quinol oxidase from Acidianus ambivalens and bd-type quinol oxidase from three different organisms (Escherichia coli, Bacillus thermodenitrificans and Aquifex aeolicus). Besides the protein from E. coli all other proteins are from thermophilic organisms from which the proteins obtained are generally believed to be highly stable. The presence of a high content of charged amino acids that enhances the occurrence of salt bridges contributes to the stability of thermophilic proteins. ....
Die vorliegende Fall-Kontroll-Studie untersucht den Zusammenhang zwischen der Belastung durch berufsbezogene psychosoziale Einflussfaktoren und bandscheibenbedingten Erkrankungen im Bereich der Lendenwirbelsäule bei Männern. Die Probanden der Fallgruppe wurden über vier Kliniken und zwei orthopädische Arztpraxen im Frankfurter Raum gewonnen (94 Patienten mit gesichertem symptomatischen lumbalen Bandscheibenvorfall und 94 Patienten mit radiologisch gesicherten, mit Beschwerden einhergehenden Osteochondrosen oder Spondylosen im Bereich der Lendenwirbelsäule). Sie wurden verglichen mit 197 anamnestisch rückengesunden Probanden (107 Bevölkerungskontrollen, 90 wegen Urolithiasis behandelte Kontrollpersonen mit röntgenologisch ausgeschlossener Osteochondrose/Spondylose). In einem strukturierten Interview wurden sämtliche Berufstätigkeiten von mindestens einem Jahr Dauer gesondert erfasst mit Schwerpunkt auf die physikalische Belastung durch Heben, Tragen und Tätigkeiten mit Belastung durch Ganzkörperschwingungen sowie auf die psychosoziale Belastung am Arbeitsplatz durch Monotonie, Langeweile, fehlende Möglichkeit des Einsatzes eigenen Wissens oder eigener Fähigkeiten, mangelnde Information über Pläne der Abteilung oder des Betriebes, mangelnde Zufriedenheit mit Vorgesetzten und Kollegen, psychische Belastung durch den Umgang mit Klienten, Arbeiten unter Zeitdruck und durch das Gefühl, zu viel Verantwortung tragen zu müssen. Zusätzlich wurden Daten erhoben zu Alter, Gewicht und Größe, Rauchgewohnheiten, Schulbildung, zu sportlichen Aktivitäten und außerberuflichen physikalischen Belastungen, zur Belastung durch sog. life-events sowie zum Gesundheitszustand des Achsenskeletts mit Schwerpunkt auf jemals aufgetretene Beschwerden im Bereich der Lendenwirbelsäule. Als Effektschätzer für die relativen Erkrankungsrisiken wurden mittels logistischer Regression Odds Ratios berechnet, adjustiert für Alter, Region, Staatsangehörigkeit, andere Erkrankungen mit Beteiligung der Lendenwirbelsäule und Belastung durch Heben, Tragen und Arbeiten in extremen Rumpfbeugehaltungen. Es fand sich ein grenzwertig signifikanter Zuammenhang zwischen psychischer Belastung durch den Umgang mit Klienten und dem Auftreten mit Beschwerden einhergehender osteochondrotischer und/oder spondylotischer Veränderungen im Bereich der Lendenwirbelsäule (OR=10,4; CI95%=1,0-113) sowie ein signifikanter Zusammenhang zwischen mehr als zehn Berufsjahren, in denen unter starkem Zeitdruck gearbeitet werden musste, und dem Auftreten eines behandlungsbedürftigen lumbalen Bandscheibenvorfalls (OR=2,9; CI95%=1,3-6,3). Diese Ergebnisse können verstanden werden als ein erster Hinweis auf einen möglichen Zusammenhang zwischen psychosozialer Belastung am Arbeitsplatz und dem Auftreten nicht nur von Schmerzen im Bereich der Lendenwirbelsäule (low back pain), sondern auch von mittels bildgebender Verfahren und/oder intraoperativ gesicherten morphologischen Korrelaten der Beschwerdesymptomatik. Ein alternativer Erklärungsansatz liegt in dem möglichen Einfluss psychosozialer beruflicher Faktoren auf Schmerzempfinden bzw. Schmerzverarbeitung und auf die Inanspruchnahme medizinischer Versorgung. Weitere und größere epidemiologische, aber auch psychobiologische und psychoimmunologische Studien werden notwendig sein, um eine mögliche Verursachung bandscheibenbedingter Erkrankungen durch berufsbezogene psychosoziale Belastungsfaktoren und die sie vermittelnden Mechanismen nachzuweisen.
Um die Veränderungen von der Natur- zur Kulturlandschaft des Hochtals von St. Antönien (Graubünden, Schweiz) zu erfassen, wurden unterschiedliche natürliche Archive, wie Böden, Moore und Bäume innerhalb eines Methodenverbunds aus Bodenkunde, Palynologie und Dendroökologie untersucht. Das Gerüst für die Paläoumweltrekonstruktion bilden dabei die Pollenanalysen der Moorprofile Capelgin (1680 m ü. NN) und Groß Ried (1720 m ü. NN) am NE-exponierten Hang des Chrüzes. Sie reichen bis ins Boreal zurück. Um bestimmte Landschaftszustände, wie Rodungen oder Nutzungsänderungen, zu beschreiben, erwiesen sich Bodenprofile ebenfalls als sehr aufschlussreiche landschaftsgeschichtliche Zeugnisse. Mit den dendroökologischen Untersuchungen war es möglich, kalenderjahrgenaue Angaben zur Wiederbewaldungsdynamik und zum Erosionsgeschehen zu machen. Der Beginn der Alpweidrodungen im Hochtal liegt in der Spätbronzezeit, damit wurde ein weiterer Beweis geliefert, dass auch die klimatisch weniger begünstigten nördlichen Randalpen schon in dieser Epoche vom Menschen genutzt wurden. Flächenhafte Brandrodungen um Weideland zu gewinnen, sind dann für die Eisen- und Römerzeit belegt. Die Ergebnisse des Methodenverbunds gaben zudem einen genaueren Einblick in das Wirkungsgefüge Mensch und Umwelt. Ein Schwerpunkt liegt dabei auf der Betrachtung der eisenzeitlichen Alpweidrodungen. Nach den Brandrodungen war es nicht möglich, die Flächen in Weideland zu überführen, sondern es gab zunächst eine Phase erhöhter Geomorphodynamik mit Ausbreitung der Grünerle.
Hintergrund—Derzeit können verschiedene Embolieprotektionssysteme bei der Carotis Stentimplantation angewandt werden. Diese Studie berichtet über Ergebnisse unter Verwendung des Flussumkehrsystems Parodi Anti-Embolie System. Patienten—Eine Carotis Stentimplantation wurde bei 56 Patienten durchgeführt (Durchschnittsalter 68 ± 9 Jahre). Der mittlere Stenosedurchmesser betrug 77% ± 10%. Während des Eingriffs wurde eine cerebrale Embolieprotektion mittels Ballonokklusion der Arteria carotis communis und externa mit dem Parodi Anti-Embolie System angewandt. Während der Stentimplantation, vor der Entlassung und 1, 6 und 12 Monate nach dem Eingriff wurde der neurologische Status der Patienten erhoben. Ergebnisse—Der Eingriff war bei allen Patienten technisch erfolgreich. Ein Patient entwickelte einen ischämischen Insult nach 6 Stunden. Es wurden keine Todesfälle oder Myokardinfarkte beobachtet. Während der Verlaufsbeobachtung (bis zu 40 Monate) starben 2 Patienten an einer sekundären Komplikation nach intrakranieller Blutung und ein weiterer Patient an Kammerflimmern. Bei keinem Patienten trat eine höhergradige Restenose auf. Schlussfolgerung—Die Akutergebnisse zeigen, dass die Flussumkehr bei der Carotis Stentimplantation eine sichere und effektive Methode der cerebralen Embolieprotektion darstellt. Die niedrige Komplikations- und Restenoserate entspricht den Ergebnissen in anderen Veröffentlichungen und zeigt, dass die Ballonokklusion keine Gefäßverletzungen verursacht.
Hintergrund und Fragestellung: Hörbahn und die kortikalen Hörzentren benötigen eine frühzeitige regelmäßige akustische Stimulation für ihre Reifung. Ohne die Reizung in den ersten Lebensjahren gehen ungenutzte neuronale Vernetzungen zugrunde bzw. werden gar nicht erst entwickelt. Deshalb kommt der Einführung eines universellen Neugeborenen-Hörscreenings zur Detektion frühkindlicher Hörstörungen in den letzten Jahren eine große Bedeutung zu. Zur Sicherstellung eines effektiven Screenings muss ein optimales objektives Verfahren gewählt werden, basierend auf OAE- und ABR-Technologien, eingesetzt in Form von Mono- oder Kombinationsverfahren. Voraussetzung für den Einsatz als Screening-Gerät sind höchstmögliche Sensitivität und Spezifität, eine einfache Bedienung sowie Kostengünstigkeit. Desweiteren ist dabei jenen Verfahren der Vorrang zu geben, welche, bei immer kürzer werdenden Liegezeiten der Patientinnen und Zunahme ambulanter Geburten, mit nur einem einzigen Test eine Rate an Testauffälligen von unter 4% erreichen. Patienten und Methode: An 473 Kindern wurden in drei Geburtskliniken monaural Hörscreening-Untersuchungen durchgeführt. Zur Verfügung standen hierbei das Kombinationsgerät echo-screen TA® zur Messung von TEOAE und AABR, sowie das MB11 BERAphon® mit zwei verschiedenen Verfahren zur Messung von AABR, einerseits der Zeitgang-AABR, andererseits einer steady-state-AABR. Ergebnisse: Mit nur einer einzigen Messung erreichten alle Verfahren bis auf die Zeitgang-AABR des MB11 BERAphon® eine Testauffälligen-Rate von 5 % bzw. darunter. Zudem bietet das Kombinationsgerät echo-screen TA® die Möglichkeit, ein mittels TEOAE-Verfahren als auffällig getestetes Kind anschliessend mittels AABR-Verfahren zu überprüfen. Die mittlere Messzeit betreffend zeigte sich das TEOAE-Verfahren des echo-screen TA® erwartungsgemäß schnell. Bei den AABR-Verfahren lieferte das MB11 BERAphon® mit der steady-state-AABR vor dem echo-screen TA® und vor der Zeitgang-AABR ein Ergebnis. Im Vergleich der mittleren Untersuchungszeiten zeigte sich die längste Untersuchungszeit für die kombinierte TEOAE- und AABR-Messung des echo-screen TA®. Betrachtet man jedoch die einzelnen Verfahren untereinander, so zeigte sich auch hier der geringe Zeitaufwand des TEOAE-Verfahrens. Das AABR-Verfahren des echo-screen TA® erwies sich, aufgrund der zu klebenden Elektroden, als zeitaufwendiger als die AABR-Verfahren des MB11-BERAphon®. Die Sensitivität ergab für alle hier verwendeten Verfahren 100%. Alle Verfahren, bis auf die Zeitgang-AABR des MB11 BERAphon® zeigten sehr gute Verfahrensspezifitäten von über 96%. In der Kostenanalyse wurde deutlich, dass die alleinigen TEOAE-Messungen des echo-screen TA® günstiger als die AABR-Messungen waren. Dennoch sind auch die AABR-Verfahren des MB11 BERAphon® aufgrund des eingeschränkten Materialverbrauchs nicht mehr deutlich kostenintensiver. Schlussfolgerung: Unter Berücksichtigung aller zu erfüllenden Kriterien eines Hörscreening-Gerätes sind sowohl die steady-state-AABR das MB11 BERAphon® als auch das Kombinationsverahren des echo-screen TA® für ein universelles Hörscreening geeignet. Kosten und Zeitaufwand des echo-screen TA® sind beim Gebrauch beider Verfahren (TEOAE und AABR) im Vergleich zum Monoverfahren (steady-state-AABR des MB11 BERAphon® ) höher und bedingten in der hier vorgestellten Studie einen leichten Vorteil der steady-state-AABR bei ansonsten nahezu ausgeglichenen Ergebnissen. Die Zeitgang-AABR des MB 11 BERAphon® konnte die gültigen Qualitätskriterien zum Studienzeitpunkt nicht erfüllen, wobei anwenderbedingte Gründe weitestgehend ausgeschlossen werden können.
Kontinuierliche Messung der Kreislaufparameter mit Finapres® bei Kipptischuntersuchungen von Kindern
(2006)
Hintergrund Bei etwa 1% aller Notfallpatienten, die in Kinderkliniken eingewiesen werden, liegt anamnestisch eine unklare Synkope vor. Die diagnostische Abklärung ist oft schwierig, da es gerade für Kinder keine nicht invasive und wenig zeitaufwendige Diagnostik gibt, pathologische Kreislaufreaktionen zu beurteilen. Methoden Bei dieser explorativen Studie wurden Kipptischuntersuchungen an 119 gesunden Kindern zwischen 7 und 15 Jahren durchgeführt. Zum Einsatz kamen ein elektronisch gesteuerter, sowie ein manueller Kipptisch. Mit verschiedenen Kippvorgängen (langsam vorwärts/rückwärts, schnell vorwärts/rückwärts, Impulskippen) wurden Lagewechsel vom Liegen zum Stehen bzw. umgekehrt simuliert. Dabei wurden mit Hilfe einer kontinuierlichen beat-by-beat Blutdruck- und Pulsmessung die Kreislaufreaktionen während und nach dem Kippvorgang registriert und Alter und Geschlecht miteinander verglichen. Aus den ermittelten Daten wurden Perzentilenkurven erstellt, in die, ausgehend vom individuellen Ruhewert des Kindes, die Veränderung der Kreislaufparameter eingetragen werden können. Ergebnisse Die Ruhewerte waren nicht geschlechts-, aber altersabhängig, so dass die Kinder in geschlechtsunabhängige Altersgruppen zusammengefasst werden konnten. Die Veränderungen der Kreislaufparameter erwiesen sich sowohl vom Geschlecht als auch vom Alter unabhängig. Beim Langsam-Vorwärts-Kippen stiegen sowohl der systolische und der diastolische Blutdruck als auch die Pulsfrequenz nach einer Latenzzeit von 10 Sekunden kontinuierlich an, um nach ca. 30 Sekunden einen neuen höheren Ruhewert zu erreichen. Beim Schnell-Vorwärts-Kippen kam es in den ersten 10 Sekunden zu einem systolischen Blutdruckeinbruch. Danach stieg der systolische Blutdruck auf ein neues Niveau, das wenige mmHg über dem Ausgangswert lag. Der diastolische Blutdruck erhöhte sich nach 10 Sekunden kontinuierlich auf einen 10 mmHg höheren Wert. Die Pulsfrequenz stieg innerhalb von 10 Sekunden durchschnittlich um 10 Schläge/min an. Beim Zurück-Kippen verhielten sich die Kreislaufparameter entgegengesetzt. Der systolische Blutdruck sank um ca. 10 mmHg, der diastolische Blutdruck um 15mmHg und die Pulsfrequenz sank um ca. 20 Schläge/min. Beim Schnell-Zurück-Kippen geschah die Veränderung der Parameter innerhalb von ca. 10 Sekunden, beim Langsam-Zurück-Kippen innerhalb von ca. 20 Sekunden. Beim Impuls-Kippen kam es zu einem Abfall der Blutdruckwerte um wenige mmHg, die Pulsfrequenz sank nach einem initialen Anstieg von ca. 10 Schlägen/min um ca. 5 Schläge/min im Vergleich zum Ausgangswert. Schlussfolgerung Mit Hilfe der beat-by-beat Blutdruck- und Pulsmessung war es möglich, die Kreislaufreaktionen bei orthostatischer Belastung in hoher zeitlicher Auflösung darzustellen. Der in Perzentilenkurven dargestellte Querschnitt von Daten gesunder Kinder soll die Erkennung pathologischer Kreislaufreaktionen bei herzkranken oder symptomatisch gewordenen Kindern erleichtern. So wird eine nicht-invasive Methode zur Verfügung gestellt, mit der die Kreislaufreaktionen bei Kindern genau abgebildet und einfach bewertet werden können.
Apoptose ist ein gemeinsamer Pathomechanismus vieler Autoimmunerkrankungen, so auch im Rahmen der Schilddrüsenautoimmunerkrankungen, deren häufigste Hashimoto Thyreoiditis und Morbus Basedow (Graves’ disease) darstellen. Während eine gesteigerte Apoptoserate der Schilddrüsenzellen bei Hashimoto Thyreoiditis zur Entwicklung einer Hypothyreose führt, sind es bei Morbus Basedow die infiltrierenden Lymphozyten, die durch Apoptose zu Grunde gehen, während die Schilddrüsenzellen unter dem protektiven Einfluß anti-apoptotischer Signale proliferieren können. Der zu Grunde liegende Pathomechanismus wird in der Reifung und Aktivierung des Immunsystems angenommen. Einige potentielle Ursachen sind eine insuffiziente systemische Elimination autoreaktiver Lymphozyten im Rahmen der positiven und negativen Selektion im Thymus, ein Versagen der peripheren immunological ignorance, oder eine inadäquate Aktivierung von Lymphozyten in einem pro-inflammatorischen Milieu. All diese Mechanismen können durch eine inadäquate Apoptose ausgelöst oder verstärkt werden. Die Fas/FasL-induzierte Kaskade ist einer der Haupt-Signalwege in der Apoptose-Induktion. Seine Bedeutung im Rahmen von Autoimmunerkrankungen ist vielfach untersucht, und eine Assoziation genetischer Polymorphismen in Fas und seinem Liganden wurde bereits für einige organspezifische und generalisierte Erkrankungen gezeigt (Typ I Diabetes, Multiple Sklerose, Rheumatoide Arthritis u.a.). Das genetisch vermittelte Risiko dieser Erkrankungen wird bisher vor allem der HLA DQ-Region und Polymorphismen im CTLA-4-Gen zugeschrieben. Aufgrund der funktionellen Relevanz der Fas/FasL-vermittelten Apoptose im Rahmen autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen wurden im Rahmen dieser Arbeit Kandidatengene untersucht, die von funktioneller Relevanz für die Entstehung autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen sind: die Apoptose-regulierenden Faktoren Fas, FasL und Bcl-2. 209 Familien kaukasischen Ursprungs mit insgesamt 730 Individuen, bei denen mindestens eines der Kinder an Hashimoto Thyreoiditis (n = 100) oder an Morbus Basedow (n = 109) erkrankt war, wurden genotypisiert auf zwei Polymorphismen des Fas-Gens (g-670 G-A in der Promotorregion, g-154 C-T in Exon 7), drei FasL Genpolymorphismen (C -843 T und EBP im Promotor, A IVS2nt-124 G in Intron 2) und einen Polymorphismus im Bcl-2-Gen. Nach Durchführung einer indirekten Haplotypisierung, Chi2- und Extended Transmission Disequilibrium-Test waren weder einzelne Fas- bzw. FasL-Polymorphismen noch kombinierte Haplotypen mit Hashimoto Thyreoiditis oder Morbus Basedow assoziiert. Bei der Analyse des Bcl-2 Polymorphismus ergab sich eine Tendenz zu einer Assoziation des G-Allels mit beiden Thyreopathien. Subgruppen-Analysen (männliche vs. weibliche Patienten, CTLA-4-Genotypen, DQ-Haplotypen) ergaben keinen weiteren Informationsgehalt, die Daten italienischer und deutscher Familien unterschieden sich ebenfalls nicht. Zusammenfassend ergeben die Daten keinen signifikanten Beitrag der untersuchten Varianten in Bcl-2, Fas oder FasL zum genetischen Risiko autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen. Zur Entwicklung möglicher diagnostischer und therapeutischer Optionen für autoimmune Schilddrüsenerkrankungen wird die Untersuchung weiterer funktionell bedeutsamer Regulatoren der apoptotischen Signaltransduktionswege von Bedeutung sein.
Die rheumatoide Arthritis stellt mit einer weltweit homogen verteilten Inzidenz von 30-300/100000 Menschen sowie einer Prävalenz von 1-2% eine häufig vorkommende, chronisch progredient verlaufende Autoimmunerkrankung dar. Der hohe Leidensdruck der Erkrankten, deren Lebenserwartung trotz moderner Therapeutika noch immer unter dem der Normalbevölkerung liegt, sowie die immensen volkswirtschaftlichen Kosten durch Minderung der Erwerbsfähigkeit und Therapie, fordern grundlegende Verbesserungen in der Diagnostik der RA. Die Hand- und Fingergelenke weisen mit über 90% Beteiligung im Verlauf sowie rund 40% Beteiligung in frühen Stadien der Erkrankung die häufigsten Gelenkveränderungen im Vergleich zu anderen Körperregionen auf. Aufgrund dieser statistischen prozentualen Gelenkbeteiligung wird als bildgebendes Verfahren der Früh- bzw. Erstdiagnostik meist ein Röntgenbild der Hände angefertigt. Hierfür ist ein Scoring-System mit Stadieneinteilung seit Längerem etabliert (nach Larsen). Eine gerade im Frühstadium der RA vorkommende Weichteilveränderung kann allerdings konstruktionsbedingt radiologisch nur unzureichend beurteilt werden, des Weiteren ist eine Strahlenbelastung nicht von der Hand zu weisen. Hier kann die Ultraschalluntersuchung als ergänzendes bzw. ersetzendes Mittel ihre eindeutigen Vorteile ausspielen, da die entzündlichen Veränderungen wie Erguss und Synovitis an den Gelenken sicher erkannt werden können und keinerlei schädliche Strahlung auftritt. In Ermangelung einer objektivierbaren Einteilung dieser arthrosonographisch erfasster Daten soll es Ziel dieser Arbeit sein, eine Stadieneinteilung der Weichteil-, Knorpel- und Knochenveränderungen der Knochenbinnenräume der rheumatoiden Hand analog der radiologisch erfassten Larsen-Stadien zu erstellen. Dieses Staging soll ein weites Spektrum von leichten Gelenkergüssen bis hin zur völligen Gelenkdestruktion umfassen. Als Patientengut dienen 35 Personen, bei denen von erfahrenen Rheumatologen ohne Kenntnis des Ultraschall-Befundes aus klinischen Aspekten die Diagnose RA gesichert ist. Um eine möglichst breit gefächerte Stadieneinteilung zu ermöglichen, handelt es sich bei den Patienten um Menschen verschiedenen Geschlechtes und Alters, Krankheitsdauer sowie –aktivität (ambulante, wenig betroffene bis schwer betroffene, stationäre Patienten) differieren ebenfalls stark. Alle Patienten erfüllen mind. 4 der in der Einleitung erwähnten Diagnosekriterien der ACR (von 1987). Als Kontrollgruppe fungieren 10 nicht an RA erkrankte Probanden verschiedenen Alters und Geschlechtes. Die arthrosonographischen Untersuchungen werden mittels moderner Ultraschallgeräte der Marke Siemens (Erlangen, Deutschland) mit 7,5 bzw. 10 MHz Linearschallkopf ohne Vorlaufstrecken durchgeführt. Diese Gerätetypen und Schallköpfe werden von der DEGUM als für diese Art der Untersuchung adäquat empfohlen. Die Untersuchung umfasst an beiden Händen die Carpal- (unterteilt in radiale und ulnare Seite), Carpometacarpal I-, Metacarpophalangeal I-V-, sowie IP I- und PIP II-V-Gelenke. Die Beurteilung erfolgt in definierten longitudinalen und transversalen Schnitten von dorsal und palmar. Kriterien sind Gelenkergüsse (im Gelenkspalt bzw. Recessus, eventuell mit pericapitaler Synovialitis), Erosionen, Usuren und Kortikalisdefekte bis hin zu schweren kortikalen Destruktionen. Analog zu den radiologischen Larsen-Stadien werden die Gelenkveränderungen in ansteigender Ausgeprägtheit von 0 bis 5 eingestuft. Stadium 0 stellt den Normalbefund dar. Stadium 1 beschreibt Veränderungen am Gelenk ohne ossäre Beteiligung. Dieses lässt sich weiter unterteilen in einen reinen Gelenkerguss im Gelenkspalt (Stadium 1a) bzw. im Recessus (Stadium 1b). Treten beide Veränderungen in einem Gelenk ohne ossäre Beteiligung auf, bezeichnen wir dies als Stadium 1c, evtl. unter Mitbeteiligung einer nur im power-Doppler zu differenzierenden Synovialitis. Stadium 2 beschreibt bereits ossäre Veränderungen im Sinne kleiner (unter 2mm) Erosionen eines Gelenkpartners. Sind diese Veränderungen stärker ausgeprägt (über 2mm), handelt es sich um Usuren (Stadium 3). Kortikalisdefekte, bei denen der Gelenkspalt noch zu differenzieren ist, definieren das Stadium 4, wohingegen beim Stadium 5 dies nicht mehr der Fall ist und auch keine knöchernen Leitstrukturen mehr erkennbar sind. Insgesamt gesehen lassen sich bei 60,9% der 897 untersuchten Gelenke Veränderungen feststellen. Stadium 0 (kein pathologischer Befund) ließ sich somit bei 39,1% der untersuchten Gelenke nachweisen. Die einzelnen Stadien nehmen prozentual von der Gesamtheit der Befunde mit der Zunahme der Ausgeprägtheit der Gelenkveränderungen ab. So kommt Stadium 1 bei 26,3% der untersuchten Gelenke vor, Stadium 2 bei 19,5%, Stadium 3 bei 10,4%, Stadium 4 bei 3,5%, Stadium 5 lediglich bei 1,2% vor. Der Vergleich der arthrosonographischen Untersuchungsergebnisse mit dem etablierten DAS 28 (disease activity score) ergibt einen signifikant hohen Korrelationskoeffizienten (nach Spearman) von 0,9, der mit den Parametern der klinischen Untersuchung (geschwollene Gelenke; druckschmerzhafte Gelenke) 0,83 bzw. 0,86. Diese Ergebnisse zeigen die hohe Aussagekraft des Untersuchungsverfahrens Arthrosonographie. Dieses Verfahren ist aufgrund seiner Vorteile (Erkennung von Weichteilveränderungen sowie Knorpel- und Knochendestruktionen, kostengünstig, beliebig oft wiederholbar, unschädlich, ubiquitär verfügbar) gegenüber anderen bildgebenden Verfahren (Röntgen, CT, MRT, Szintigraphie) zur (Früh-)Diagnostik der RA hervorragend geeignet.
Leukämien sind maligne Erkrankungen des hämatopoietischen Systems, die teilweise mit einer sehr schlechten Prognose einhergehen. Die Phänotypen sowie die verursachenden Mutationen in den hämatopoietischen Vorläuferzellen sind vielfältig. 5-10 % aller Akuten Leukämien korrelieren mit genetischen Veränderungen des MLLGens auf Chromosom 11q23. Besonders häufig findet man reziproke, chromosomale Translokationen. Leukämien mit diesen Mutationen zählen fast ausschließlich zu den Hochrisiko-Leukämien, wobei der Partner des MLL-Gens Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung hat. Bisher sind 43 Translokationspartner des MLL-Gens bekannt, von denen jedoch in der Routinediagnostik nur die 6 häufigsten, MLLT2, MLLT1, MLLT3, MLLT4, ELL und MLLT10 untersucht werden. Seltene oder unbekannte Partnergene werden von den Analysen ausgenommen. Da das Partnergen aber wichtig für die Risikoeinstufung der Erkrankung ist, ist es notwendig, dieses rasch zu identifizieren, um ein optimales Therapieprotokoll anwenden zu können. Aus diesem Grund wurde eine universelle, PCR-Methode entwickelt und etabliert, die es erlaubt, jede MLL-Translokation, auch ohne vorherige Kenntnis des Partnergens, zu identifizieren. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, sowohl das Partnergen, als auch den chromosomalen Bruchpunkt basengenau auf DNA-Ebene zu analysieren. Mit dieser Technik sind im Verlauf der Studie 501 Patienten untersucht worden (319 Kinder, 179 Erwachsene, 3 ohne Altersangabe). Bei diesen Analysen wurden 9 neue Partnergene entdeckt: ACACA, SELB, SMAP1, TIRAP, ARHGEF17, BCL9L, KIAA0284, MAML2 und APBB1IP. Für alle positiven Patientenproben sind außer den Partnergenen auch die basengenauen Bruchpunkte kartiert worden. Die Kenntnis des Patienten-spezifischen Bruchpunktes erlaubt eine exakte Quantifizierung der Blastenlast mittels qPCR und ermöglicht somit ein empfindliches Monitoring des Krankheitsverlaufs unter Therapie und die Detektion einer minimalen Resterkrankung (MRD).
Zur erfolgreichen Behandlung von Tumorerkrankungen sind effiziente Therapien notwendig. Oftmals kommt es nach einer klassischen Tumortherapie zum Auftreten von Rezidiven, die aus residuellen Tumorzellen hervorgehen. Grund hierfür können eine bereits erfolgte Metastasierung oder Resistenzmechanismen der Tumorzellen sein. Auf Grund ihrer Fähigkeit Gewebe aktiv zu infiltrieren bietet der Einsatz zytotoxischer Lymphozyten im Rahmen einer zellulären Immuntherapie den Vorteil, auch bereits metastasierte Tumorzellen zu erreichen. Dadurch können auch Tumorzellen eliminiert werden, die Resistenzmechanismen meist im oberen Teil apoptotischer Signalkaskaden aufweisen. Eine spezifische Ausrichtung zytotoxischer Lymphozyten auf Tumorantigene ist grundsätzlich über chimäre Antigenrezeptoren möglich. Dabei bietet die Generierung von Tumor-spezifischen zytotoxischen Effektorzelllinien den Vorteil, Zellklone mit definierter Aktivität und Spezifität bereitstellen zu können. Im Hinblick auf einen klinischen Einsatz scheint hierfür die Natürliche Killerzelllinie NK-92 besonders geeignet. Die Ergebnisse einer klinischen Studie mit parentalen NK-92 Zellen zeigten eine gute Verträglichkeit ohne Nebenwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden NK-92 Zellen genetisch so modifiziert, dass sie chimäre Antigenrezeptoren mit Spezifität für die Tumorantigene CD20, EpCAM, GD2 und CD138 exprimieren. In der Tumortherapie stellen das mit Tumoren der B-Zell-Reihe assoziierte CD20-Molekül und das auf den meisten Tumorzellen epithelialen Ursprungs exprimierte EpCAM-Protein wichtige Zielantigene monoklonaler Antikörper dar. Studien zeigten, dass auch die auf Tumorzellen des Neuroblastoms bzw. Multiplen Myeloms exprimierten Moleküle GD2 bzw. CD138 geeignete Angriffspunkte für immuntherapeutische Ansätze sein könnten. Die chimären Antigenrezeptoren sind aus einem Antigenspezifischen scFv-Antikörperfragment aufgebaut, das über ein Fragment der CD8alpha-Kette mit der CD3zeta-Kette als Signaltransduktionsdomäne verbunden ist. Nach retroviraler Transduktion zeigte sich eine hohe und homogene Oberflächenexpression dieser Rezeptoren auf modifizierten NK-92 Zellen. Auf das Oberflächenprotein CD20 ausgerichtete NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen wiesen gegen CD20- positive Tumorzelllinien und primäre Tumorzellen eine hohe zytotoxische Aktivität auf. Im Vergleich waren parentale NK-92 Zellen gegen diese Tumorzellen nicht oder deutlich weniger aktiv. Dabei war die zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen mit dem monoklonalen anti-CD20 Antikörper Rituximab kompetitierbar. Mit Hilfe der gegen parentale und modifizierte NK-92 Zellen resistenten Zelllinie NIH3T3 wurde gezeigt, dass allein über die stabile Expression des CD20-Proteins in NIH3T3 Zellen die Resistenz gegen modifizierte NK-92 Zellen überwunden werden kann. NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen waren in der Lage, CD20-positive NIH3T3-CD20 Zellen auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen effizient abzutöten. In Mischkulturen aus NIH3T3 und NIH3T3-CD20 Zellen war zudem eine selektive zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen ausschließlich gegen Antigen-positive Zellen nachweisbar. Über die Analyse von Zellkonjugaten zwischen zytotoxischen Effektorzellen und ihren Zielzellen, deren Bildung grundsätzliche Voraussetzung für eine Eliminierung ist, wurden Hinweise erhalten, dass der chimäre Antigenrezeptor hierzu keinen Beitrag zu leisten scheint, sondern vor allem die anschließende Aktivierung der modifizierten NK-92 Zellen bewirkt. Mit EpCAM-spezifischen NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen war auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen eine effiziente Abtötung von unterschiedlichen Tumorzelllinien epithelialen Ursprungs möglich. Eine erfolgreiche Blockierung dieser zytotoxischen Aktivität mit dem monoklonalen Antikörper MOC31 bestätigte, dass diese spezifisch über den chimären Antigenrezeptor vermittelt wurde. Die untersuchten epithelialen Zelllinien erwiesen sich dagegen als vollkommen resistent gegen parentale bzw. mit demleeren Expressionsvektor modifizierte NK-92-Mock Zellen. Weitere Ergebnisse zeigten, dass die zytotoxische Aktivität von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen tatsächlich über Granzym B vermittelt wird. Eine erhöhte FasL-Oberflächenexpression infolge der Cokultur mit Antigen-positiven Zielzellen war dagegen nicht nachweisbar. Anhand dieser Ergebnisse kann eine signifikante Beteiligung von FasL an der zytotoxischen Aktivität der modifizierten NK-92 Zellen ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden therapeutische Effekte von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen in einem Xenograftmodell in NOD-scid/scid Mäusen mit einer humanen EpCAM-positiven Tumorzelllinie untersucht. Hier wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe durch Behandlung mit EpCAM-spezifischen NK-92 Zellen, unerwarteterweise aber auch mit NK-92-Mock Zellen, ein signifikant längeres Überleben der Tiere beobachtet. Nach der Ableitung CD138-spezifischer NK-92-scFv(B-B4)-Zeta Zellen wurde zwar eine hohe zytotoxische Aktivität gegen CD138-positive Zelllinien erhalten. Es war jedoch keine im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen weiter verstärkte Zytotoxizität nachweisbar. Als Ursache hierfür ist eine mangelnde Funktionalität des scFv-Antikörperfragments im Kontext des chimären Antigenrezeptors denkbar. Da die Bindungseigenschaften von scFv-Fragmenten entscheidend durch die Anordnung ihrer schweren und leichten Antikörperketten zueinander beeinflusst werden können, wurden NK-92 Zellen etabliert, die ein scFv-Fragment mit umgekehrter Orientierung der Antikörperketten in ihrem chimären Antigenrezeptor tragen. Diese werden derzeit im Rahmen einer externen Zusammenarbeit auf ihre Funktionalität hin überprüft. Zur Konstruktion gegen das Disialogangliosid GD2 gerichteter chimärer Antigenrezeptoren wurden parallel zwei scFv-Fragmente des Antikörpers ch14.18 eingesetzt, die sich in der Orientierung der schweren und leichten Antikörperketten zueinander unterscheiden. Mit den Antigenrezeptorkonstrukten modifizierte NK-92 Zellen zeigten eine im Vergleich zu parentalen NK-92 und NK-92-Mock Zellen stark erhöhte Zytotoxizität gegen GD2 exprimierende humane Tumorzelllinien. Dabei wurde weder bei der Expressionsdichte der chimären Antigenrezeptoren noch in der zytotoxischen Aktivität modifizierter NK-92 Zellen mit unterschiedlicher Anordnung der variablen Antikörperdomänen im scFv Antikörperfragment ein signifikanter Unterschied beobachtet. Mit der extrazellulären Domäne von CTLA-4 als Modellprotein wurde der mögliche Einsatz einer zu scFv-Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomäne geprüft. CTLA-4 wird normalerweise auf T-Zellen exprimiert und bindet an CD80 bzw. CD86 auf APCs. CD80- und/oder CD86-positive Zielzellen wurden von NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen spezifisch und mit hoher Effizienz lysiert. In Zytotoxizitätsassays wurde mit Hilfe einer sowohl gegen parentale als auch modifizierte NK-92 Zellen resistenten Tumorzelllinie gezeigt, dass allein die stabile Expression des CD86 Proteins in dieser Zelllinie ausreicht, um die Resistenz gegen NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen aufzuheben. Daraus kann geschlossen werden, dass grundsätzlich auch der Einsatz von zu scFv- Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomänen eine spezifische Ausrichtung und effiziente Aktivierung von NK-92 Zellen gewährleistet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die genetische Modifikation der Natürlichen Killerzelllinie NK-92 zur Ausrichtung auf Tumor-spezifische Zielstrukturen einen grundsätzlich geeigneten Ansatz zur Behandlung maligner Erkrankungen darstellt. Eine Weiterentwicklung Antigen-spezifischer NK-92 Derivate als mögliche Zelltherpeutika erscheint daher sinnvoll und vielversprechend.
Schwerlösliche Arzneistoffe besitzen häufig unbeliebte biopharmazeutische Eigenschaften und ihre erfolgreiche Formulierung zur oralen Verabreichung stellt eine der häufigsten und größten Herausforderungen an die pharmazeutische Technologie dar. Unter zahlreichen Verfahren zur Überwindung von absehbaren Bioverfügbarkeitsproblemen kommt den physikalischen Methoden nach wie vor eine zentrale Bedeutung zu. In der vorliegenden Arbeit wurde erforscht, wie die Bioverfügbarkeit schwerlöslicher Verbindungen durch Anwendung physikalischer Verfahren und in fester Formulierung erhöht und ihre Auflösungsgeschwindigkeit als entscheidender Schritt hierzu optimiert werden kann. Als schwerlösliche Substanzen wurden die Arzneistoffe EMD 57033 und Albendazol, die eine vergleichweise niedrige Lipophilie aufwiesen, sowie Danazol, Felodipin und Fenofibrat (hohe Lipophilie) ausgewählt. Zunächst wurde untersucht, inwieweit eine klassische Wirkstoffmikronisierung dem Problem der schlechten Wasserlöslichkeit und der unzureichenden Auflösungsgeschwindigkeit zu begegnen vermag. In klassischer Art und Weise wurde gemäß der Noyes-Whitney-Beziehung durch Partikelgrößenreduktion die Auflösungsrate gesteigert. Bei großem Dosislöslichkeitsvolumen (>1000 ml) war eine Verbesserung nur bis zu einem gewissen Ausmaß möglich. Es wurde auch festgestellt, dass mit alleiniger Wirkstoffmikronisierung selbst bis in den unteren Mikrometerbereich und sogar bei Vorliegen eines kleinen Dosislöslichkeitsvolumens (<100 ml) eine optimale Auflösungsgeschwindigkeit nicht garantiert und oft nicht erzielt werden kann. Der Ansatz der Wirkstoffmikronisierung kann jedoch grundsätzlich empfohlen werden, da sich unabhängig von Dosis und Löslichkeit signifikante Verbesserungen in der Auflösungskinetik ergeben können. Luftstrahlmahlung ist eine zahlreichen anderen Verfahren überlegene Vermahlungstechnik. Sie erlaubt bei entsprechenden Einstellungen die trockene Herstellung ultrafeiner Partikel (1–3 Mikrometer) in kontinuierlichem oder Batch-Betrieb bei gut steuerbarem Prozess, der das Mahlgut praktisch keiner Temperaturbelastung unterwirft. Staubentwicklung und Abrieb müssen jedoch beachtet werden. Freisetzungen wurden in biorelevantem Medium (z.B. FaSSIF), das bestmöglich die gastrointestinalen Gegebenheiten simuliert, sowie zusätzlich in einem Mediumhöheren Tensidgehaltes durchgeführt, das zur Berücksichtigung einer ungehinderten Absorption der BCS-Klasse II-Substanzen in vivo-Sink-Bedingungen darstellte. Diese Vorgehensweise ist grundsätzlich zu empfehlen. Für EMD 57033 wurde zudem nachgewiesen, dass eine biorelevante Freisetzungsprüfung auch in einfachen SLSLösungen möglich ist. Das Dosislöslichkeitsvolumen nimmt grundsätzlich bedeutenden Einfluss auf das Freisetzungsverhalten. Die trockene Covermahlung ist ein äußerst erfolgreicher prozesstechnischer Schritt zur Formulierungsverbesserung. Sie wird durch Vermahlung eines Wirkstoffes mit einem oder mehreren Hilfsstoffen dargestellt. Durch Covermahlung per Gasstrahl zubereitete Formulierungen mit 10% Wirkstoffanteil erzielten für alle untersuchten Arzneistoffe eine optimale Auflösungsgeschwindigkeit und rasches Erreichen maximaler Freisetzung. Vergleichbaren physikalischen Mischungen sowie einfacher Mikronisierung war sie deutlich überlegen. Im Gegensatz zu reiner Wirkstoffmikronisierung bildete die Freisetzung nach Covermahlung nicht ausschließlich diskrete messbare Stoffeigenschaften ab (z.B. Korngröße), sondern war vielmehr das Ergebnis eines Herstellungsprozesses. Die qualitative und quantitative Auswahl der Hilfsstoffe prägte zudem das Freisetzungsverhalten entscheidend und in stärkerem Ausmaß als der Vermahlungsgrad. Die deutliche Verbesserung der Auflösungsgeschwindigkeit eines Wirkstoffes nach Covermahlung war unabhängig von der Wahl des Freisetzungsmediums und dem vorliegenden Dosislöslichkeitsvolumen. Die Kristallinität aller Arzneistoffe, mittels Röntgendiffraktometrie und DSC untersucht, wurde durch die Covermahlung nicht verändert. Die Korngröße eines covermahlenen Produktes konnte bei Einsatz schwer vermahlbarer Hilfsstoffe unter Umständen nicht auf den Wirkstoff projiziert werden. HPMC erwies sich als schwer vermahlbar. Für eine Aktivsubstanz (EMD 57033) wurde sogar die Ausbildung übersättigter Lösungen bei Freisetzung covermahlener Formulierungen nachgewiesen, die nicht in Phasenumwandlungen des Wirkstoffes oder in reiner Partikelgrößenreduktion begründet war. Lactose als Hilfsstoff förderte eine sehr hohe initiale Auflösungsgeschwindigkeit, oftmals wurde vollständige Freisetzung bereits nach 15 Minuten erreicht. Polymere wie HPMC und PVP wirkten stabilisierend, jedoch auch verzögernd. SLS förderte ebenfalls eine optimale Auflösungsrate durch Überwindung von etwaigen Benetzbarkeitsproblemen einesein gemahlenen) Wirkstoffes, unterband jedoch die Bildung von übersättigten Konzentrationen. Covermahlungen zeichneten sich durch eine sehr gute Reproduzierbarkeit von Herstellungsprozess und Produkt (einschließlich Freisetzungscharakteristik) aus und waren als deutlich robuster gegenüber reinen Wirkstoffvermahlungen einzustufen. Covermahlene Mischungen zeigten perfekte Homogenität. Der Wirkstoffgehalt ist zwingend nach Covermahlung zu prüfen, da sich durch den Herstellungsprozess leichte Verschiebungen in der quantitativen Zusammensetzung der Formulierung ergeben können. Covermahlungen sind industriell problemlos abbildbar. Covermahlene Formulierungen von EMD 57033 mit Lactose oder Polymeren bildeten ihre Überlegenheit gegenüber reinen Wirkstoffmikronisierungen, die sich in vitro durch die Ausbildung übersättigter Lösungen darstellte, auch in vivo in Hunden ab. Zwar steigerte bereits die Vermahlung des reinen Arzneistoffes seine orale Bioverfügbarkeit (0% - 37% relative BV), der Einsatz der Covermahlung konnte diese jedoch noch weiter erhöhen und nahezu verdoppeln (55%, 68%). Multiple Level CKorrelationen covermahlener und mikronisierter Wirkstoffformulierungen belegten erfolgreiche in vitro-Simulationen. Sprühtrocknungen schwerlöslicher Stoffe aus wässriger Umgebung geht das Problem voraus, den Stoff nicht in ausreichendem Maße auflösen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde daher mit Hilfe einer Rührwerkskugelmühle Kristallsuspensionen von Wirkstoffnanopartikeln (<200 nm, Messung durch Laserbeugung und Auswertung nach der Mie-Theorie) hergestellt, die dann getrocknet wurden. Den zwischenzeitigen Vorteil der extrem hohen Oberfläche in Form von Nanoteilchen gab der Wirkstoff nach Sprühtrocknung oder Sprüheinbettung (bei Anwesenheit gelöster oder (nano-) suspendierter Hilfsstoffe) wieder ab. Die Kombination aus Nanonisierung und Sprühtrocknung stellt prozesstechnisch zwei Herstellungsschritte dar und beeinträchtigt – neben der fundamentalen Problematik der Stabilisierung von Intermediaten – die Stabilität eines Wirkstoffes durch Flüssigkeitskontakt (Nassmahlung) und thermische Belastung (Sprühtrocknung). EMD 57033 verblieb bei Sprühtrocknungen kristallin und wies verglichen mit covermahlenen Formulierungen eine schwächere Auflösungsgeschwindigkeit auf. Eine Ausnahme bildete die Sprüheinbettung mit SLS, die jedoch in derPharmakokinetikstudie den Covermahlungen unterlegen war (relative Bioverfügbarkeit 47%). Fenofibrat ging fast vollständig in den amorphen Zustand über und zeigte bei Freisetzung das typische Bild einer schnellen Rekristallisation. Fazit Im Gegensatz zu Wirkstoffmikronisierungen oder Sprühtrocknungsverfahren können trockene Covermahlungen mit ausgewählten Hilfsstoffen universell das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Auflösung schwerlöslicher Stoffe optimieren (vollständige Auflösung oder Sättigung erreicht). In Abhängigkeit von Wirk- und Hilfsstoffen werden sogar Übersättigungen erzielt, die auch in vivo in einer gesteigerten oralen Bioverfügbarkeit abgebildet werden können.
Im Rahmen der vorliegenden retrospektiven Arbeit wurden die, bezogen auf die diagnostischen Möglichkeiten der peripheren Gefäßkrankheiten, Aufnahmequalitäten der als Goldstandard zu beurteilenden Untersuchungsmethode der intraarteriellen Digitalen Subtraktionsangiographie (i.a. DSA) mit der trotz bereits jahrelanger Anwendung immer noch „innovative“ Methode der kontrastmittelunterstützten Magnetresonanzangiographie verglichen. Insbesondere wurde die Frage der Qualität der Interventionsplanung und der Aspekt der aus den durch die Unterschiede der Imagequalität entstehenden Konsequenzen für den Patienten beleuchtet und so der Stellenwert für die KM-MRA in der präinterventionellen Diagnostik evaluiert. Die Bedeutung der kritischen Auseinandersetzung mit den beiden Untersuchungsmethoden liegt in den, durch die mögliche Ablösung der i.a. DSA aus der Position des Goldstandards, entstehenden Vorteilen für den Patienten. Zu nennen sind der Wegfall der Strahlenbelastung und des invasivinterventionellen Risikos, die renale Entlastung und die Verkürzung des Krankenhausaufenthaltes. Als zusätzlicher eindeutiger Nutzen der KM-MRA kann die gleichzeitige Aufnahme mehrerer Gefäßsegmente, durch die z.B. in dieser Studie 23 nicht vermutete zusätzliche Gefäßläsionen enttarnt werden konnten, gesehen werden. Im Zeitraum von Januar 2001 bis Dezember 2002 wurden 100 Patienten mit Gefäßläsionen und einer klinischen Symptomatik der Claudatio intermittens, eingeteilt nach Fontaine I-IV, durch beide Diagnosemethoden untersucht. Beide Untersuchungsmethoden wurden zur Sicherstellung der gleichen morphologischen Pathologie innerhalb von 4 Wochen durchgeführt. Dabei wurden von Observer 1 insgesamt 871 (Observer 2: 845) Stenosen in der KM-MRA und in der i.a. DSA Observer 1: 848 (Observer 2: 887) diagnostiziert. In 90,01%(=Observer 1) der Fälle stimmten die Befunde der beiden Aufnahmetechniken überein (Observer 2: 93,14%). Ein zusätzlicher Informationsgewinn durch die KM-MRA ließ sich ausschließlich bei Observer 1 mit 2,64% evaluieren. Anhand der guten Ergebnisse dieses großen Kollektivs, des hohen Positiven Vorhersagewertes von über 97,36% (bzw. 100%), sowie den insgesamt beachtlichen statistischen Werten für die Sensitivität, die Spezifität, Kappa und die Signifikanz, ist die KM-MRA mit Gadolinium (Gadobutrol=Gadovist) in hochdosierter 1,0 molarer Konzentration und die hier verwendeten technischen Möglichkeiten wie Tischverschiebung und der peripheren MRA-Spule eine exzellente Screening- und Nachuntersuchungsmethode bei der pAVK. Durch die im Vergleich mit der i.a. DSA ebenfalls akkurate Diagnostik mit insgesamt 11 therapeutisch-relevanten Abweichungen, gilt die KM–MRA als eine nichtinvasive empfehlenswerte Alternative zur Abstimmung der präinterventionellen Therapieplanung. Gerade für Patienten mit einer Re-stenose oder einer Re-okklusion ergibt sich mit der KM-MRA eine akkurate nicht-invasive diagnostische Alternative und eine Erleichterung der Behandlungsplanung.
Die Typ D Persönlichkeit, charakterisiert durch negative Affektivität und soziale Inhibition ist bei koronaren Herzpatienten mit ungünstigem Krankheitsverlauf und erhöhter Mortalität verbunden (Denollet et al. 1996). Die pathogenetischen Mechanismen der schlechteren Prognose bei KHK-Patienten mit Typ D Muster sind nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, ob die Patienten mit Typ D Persönlichkeit eine stärker ausgeprägte Dysbalance des autonomen Nervensystems nach einem Myokardinfarkt oder einem Herzeingriff aufweisen im Vergleich zur Patienten ohne Typ D Muster, was zu vermehrten lebensbedrohlichen Herzrhythmusstörungen führen und damit eine Erhöhung der Mortalität erklären konnte. 293 Patienten, die unmittelbar nach einem Myokardinfarkt und / oder Herzeingriff zur Anschlussheilbehandlung stationär (im Zeitraum von 2/02 bis 6/04) behandelt wurden, konnten mit der deutschen Typ D Skala (D 14 von Denollet entwickelt und von Arbeitsgruppe um Grande, Jordan und Herrmann-Lingen evaluiert ) als Typ D identifiziert werden. Die Funktion des autonomen Nervensystems wurde bei den Patienten mit Herzfrequenzvariabilität Parametern gemessen. Die Herzrhythmusstörungen wurden mit 24-Std. EKG erfasst. Es konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Typ D Risikocluster und der Reduktion der Herzfrequenzvariabilität festgestellt werden. Patienten mit erhöhten Angst- bzw. Depressionswerten zeigten ebenfalls keine signifikante Reduktion der HRV. Das häufigere Auftreten von schweren, komplexen Herzrhythmusstörungen bei kardiologischen Patienten mit Typ D-Persönlichkeit kurz nach einer Herzoperation und/oder Myokardinfarkt konnte auch nicht registriert werden. Die fehlende Korrelation zwischen Typ D-Persönlichkeit und Herzfrequenzvariabilität ist wahrscheinlich durch stark ausgeprägte Suppression des vegetativen Nervensystems kurz nach Herzoperation bedingt und wird zu diesem Zeitpunkt nicht gravierend durch psychosoziale Faktoren beeinflusst.
Im Rahmen dieser wissenschaftlichen Arbeit wurden retrospektiv die Daten von Patienten mit peripherer arterieller Verschlusskrankheit und subtotalen Stenosen oder Okklusionen im Bereich der Becken- oder Beinstrombahn und erfolgter perkutanen Rekanalisationen evaluiert. Hierbei erfolgte eine Läsionsklassifikation gemäß einer modifizierten Einteilung der Läsionen nach dem Transatlantic-Inter-Society-Consensus (TASC) Dokument. Hierzu wurden neben dem primären technischen Erfolg sowie die primäre Offenheitsrate auch die vaskulären Risikofaktoren, die Begleitmedikation sowie der Langzeitverlauf analysiert. Insbesondere sollte ein Vergleich der Ergebnisse zwischen der femoropoplitealen und der iliakalen Region hinsichtlich der Langzeitergebnisse analysiert werden. Diese differenzierte Betrachtung ist insbesondere wichtig, da eine einheitliche Therapieempfehlung für die infrainguinale Gefäßrekanalistion noch kontrovers diskutiert wird. Nach TASC sind die in der eigenen Arbeit hauptsächlich untersuchten Läsionsarten nur eingeschränkt mittels PTA und zusätzlicher Stentimplantation zu therapieren. Für diese Art von Läsionen wird vielmehr eine gefäßchirurgische Therapie empfohlen. Das Ziel dieser Untersuchung war, zu evaluieren, ob die perkutane Intervention bei iliakalen und femoropoplitealen Okklusionen bzw. hochgradigen Stenosen einen akzeptablen technischen Erfolg und primäre Offenheitsrate (PPR) erbringt. Gleichzeitig wurde analysiert, wie die PPR bei den verschiedenen Gefäßsegmenten unter dem Einfluss von Risikofaktoren und von Stentimplantationen variierte. In der vorliegenden Studie wurden in der Zeit von Januar 1999 bis April 2004 168 Patienten mit pAVK in unterschiedlichen Stadien beobachtet. Alle Patienten hatten einen Stenosegrad von >95% bzw. eine Gefäßokklusion. Somit galt es, 38 subtotale Stenosen und 130 Okklusionen zu therapieren. 54 Läsionen lagen im Bereich der A. iliaca communis (AIC) oder der A. iliaca externa (AIE). Iinfrainguinal waren 114 Läsionen in der A. femoralis superficialis lokalisiert. Zur perkutanen Rekanalisation wurde entweder die perkutane transluminale Angioplastie (PTA) oder die Laser assistierte Angioplastie (PTLA) angewendet. In 160 Fällen wurde eine Stentimplantation durchgeführt. In 76% der Patienten lag eine TASC C- (48%) oder TASC D-Läsion(28%) vor. Für die perkutane Therapie konnte ein technischer Erfolg von 96,5% in der infrainguinalen Region und von 96,3% im iliakalen Segment erzielt werden. In beiden Gefäßgruppen zeigten Stenosen gegenüber Okklusionen bessere Werte. Postinterventionell erfolgten Nachuntersuchungen einen Tag sowie 1, 3, 6, 12, 24 und 36 Monate nach dem Eingriff. Im Zuge dieser Kontrollen wurde auch die aktuelle Medikamentenanamnese erhoben. Die Evaluierung der Offenheit des therapierten Gefäßes erfolgte mittels farbkodierter Duplex-Untersuchung der Extremitäten sowie durch die Bestimmung des Tibio-brachialen Quotienten (TBQ). Die Nachuntersuchungen wurden von den Partnern des Gefäßzentrums (Abteilung für Angiologie) der Universitätsklinik Frankfurt am Main durchgeführt. Bis zum Ende des Nachbeobachtungszeitraumes traten 48 primäre Rezidive in den zuvor behandelten Gefäßsegmenten auf. Für die gesamte Population lag die primäre Offenheitsrate somit bei 71,4%. Unterteilt auf die beiden Gefäßsegmente konnte eine femoropopliteale Offenheit von 61,4% und eine iliakale von 92,5% ermittelt werden. Für beide Gefäßgruppen zeigten sich geringere primäre Offenheitsraten bei Okklusionen. Die Evaluierung hinsichtlich der TASC C und D Gruppen erbrachten ein akzeptables Ergebnis. In der Beckenregion betrug die primären Offenheitsraten hierfür 89,2% bzw. 91,6% und im infrainguinalen Segment 56,6% bzw. 61,6%. Die erzielten Werte liegen im Bereich der bislang publizierten Arbeiten und sprechen für den Einsatz der perkutanen Angioplastie bei iliakalen und femoropoplitealen Gefäßläsionen, da diese Therapie nur wenig Komplikationen aufweist. Dies gilt sowohl für die hochgradigen Stenosen als auch für die Okklusionen. Insbesondere kann aufgrund unserer Ergebnisse die Therapie mittels PTA mit Stentimplantation für Läsionen vom Typ TASC D empfohlen werden. Die perkutane Rekanalisation stellt in diesem Fall eine echte Alternative zur chirurgischen Therapie dar und sollte primär angestrebt werden.
Die Daten von 140 Patienten (105 Frauen und 35 Männer, Durchschnittsalter 55 Jahre) mit gesicherter rheumatoider Arthritis, die sich 155 typischen rheumachirurgischen Eingriffen an unterschiedlichen Gelenken unterziehen mussten und auf Medikamente der “modernen rheumatischen Basistherapie” (Methotrexat, Leflunomid, TNF-Alpha-Blocker und Kombinationen dieser) eingestellt waren, sind hinsichtlich der Entwicklung von postoperativen Wundinfektionen bzw. Wundheilungsstörungen untersucht worden. Die Patienten wurden in 5 Hauptgruppen unterteilt: Gruppe 1) Patienten mit Methotrexat; Gruppe 2) Leflunomid; Gruppe 3) Etanercept; Gruppe 4) Methotrexat + Leflunomid; Gruppe 5) Methotrexat + Etanercept; Besonderes Augenmerk wurde dabei auf eine Assoziation bezüglich der Einnahmeart (Fortführung bzw. Aussetzung) der Medikation perioperativ und der Entstehung von Wundheilungsstörungen bzw. einer Schubentwicklung gelegt. Ziel dieser Studie war es zu überprüfen, ob durch ein Absetzen bzw. einer Fortführung der Therapie mit Medikamenten der modernen rheumatischen Basistherapie perioperativ mit einer Schubententwicklung der rheumatoiden Arthritis, einer Verschlechterung der Wundheilungssituation oder mit einer erhöhten Rate oberflächlicher oder tiefer Infektionen zu rechen ist. Es wurde unterschieden zwischen Patienten die ihre Medikation perioperativ weitergenommen und Patienten die diese ausgesetzt haben [Gruppen 1 A)- 5 A) und Gruppen 1W) – 5 W)]. Die gesamten gesammelten Daten erhielten Informationen über Geschlecht, Alter, Medikation, Art und Anzahl der rheumaorthopädischen Operationen, Begleiterkrankung, sowie die Höhe des Rheumafaktors. In der Gesamtzahl der 140 untersuchten Fälle kam es zwölfmal (8,5 %) zu einer verzögerten bzw. zu einer gestörten Wundheilung, 128mal (91,4%) verlief die Wundheilung primär. In den Gruppen mit Aussetzen der Medikamente [Gruppen 1A) - 5A)] zeigten sich ingesamt fünf (7,1%) gestörte Wundheilungsverläufe gegenüber sieben (10%) innerhalb der Gruppen mit Fortführung der Medikation perioperativ [1W) – 5W)]. Die Medikamente der modernen rheumatischen Basistherapie scheinen sich demnach indifferent auf den Wundheilungsverlauf auszuwirken. Hinsichtlich Leflunomid lässt sich keine klare Aussage treffen. Die Fortführung von Leflunomid perioperativ zeigt einen Anteil von 30% Wundheilungsstörungen, gegenüber einer Rate von 10% innerhalb der Gruppe mit Aussetzung von Leflunomid. In Kombination mit Methotrexat scheint sich die Art der Einnahme jedoch nicht auf den Verlauf der Wundheilung auszuwirken [4 A) und 4W) je 20 % Whst.].
Zur Erforschung der in vivo Effekte von UVA-Strahlung, Creme-PUVA-Behandlung und der Alterungsprozesse auf die kleinmolekularen Antioxidantien in humaner Haut, insbesondere auf die wasserlöslichen Formen Askorbinsäure und Harnsäure sowie das fettlösliche alpha-Tokopherol, entnahmen wir Hautproben von 9 Patienten, die sich einer UVA-Provokation unterzogen, und Hautproben von 11 Patienten, die eine Creme-PUVA-Bestrahlung erhielten. Jedem Probanden wurden eine Kontrollbiopsie und eine Biopsie unmittelbar nach der Bestrahlung entnommen. Zusätzlich wurden Proben nach 48 h gewonnen. Da relativ geringe Mengen an Probenmaterial zur Verfügung standen, wurde eine neue Methode zur Extraktion von wasser- und fettlöslichen Antioxidantien im Gewebe in einem Arbeitsschritt etabliert. Um die Unterschiede in den Hautschichten zu berücksichtigen, wurden die gefrorenen Hautbiopsien horizontal in eine 1.5 mm dicke obere Schicht und eine 1.5 mm dicke untere Schicht getrennt. Wir fanden einen signifikanten Unterschied zwischen der Menge von Askorbinsäure und alpha- Tokopherol im oberen Kompartiment der Haut (Epidermis und obere Dermis) im Vergleich zum unteren Kompartiment der Haut (untere Dermis und obere Subkutis). Askorbinsäure hatte eine 7-fach höhere Konzentration in den oberen 1.5 mm (p < 0.0001), wohingegen alpha-Tokopherol eine 7-fach größere Konzentration in den unteren 1.5 mm der Haut aufwies (p < 0.0003). Die Konzentration von Harnsäure war geringfügig höher in den oberen 1.5 mm (p < 0.005). Beim Vergleich der unbehandelten Hautproben mit den UVA-bestrahlten Proben, fanden wir eine Erniedrigung der Askorbinsäure in den oberen 1.5 mm der Haut nach Behandlung (p < 0.05), aber keine signifikanten Unterschiede für Harnsäure und alpha-Tokopherol. In der Creme-PUVA-behandelten Haut fanden wir keine Veränderungen bzgl. der hydrophilen Antioxidantien, wohingegen sich alpha-Tokopherol direkt nach der Bestrahlung im unteren Kompartiment signifikant erhöhte (p < 0.01). Bezüglich möglicher altersabhängiger Veränderungen der kleinmolekularen Antioxidantien ergab sich keine signifikante Korrelation zwischen den Konzentrationen von Askorbinsäure, Harnsäure und alpha-Tokopherol in unbehandelter Haut und dem chronologischen Alter der Probanden. Die hier vorliegenden Untersuchungen zeigen damit, dass Askorbinsäure sich bei Dosen von UVA-Bestrahlung verringert, bei denen alpha-Tokopherol und Harnsäure noch unverändert bleiben. Unsere Daten lassen vermuten, dass Creme-PUVA-Behandlung keinen verringernden Effekt auf die kleinmolekularen Antioxidantien in humaner Haut hat und daher aus oxidativer Sicht eine sichere Therapie darstellt. Vielmehr scheint sich die Konzentration von alpha-Tokopherol in unteren Schichten der Haut während der PUVA-Behandlung zu erhöhen, obwohl nur eine sehr geringe Menge an alpha;-Tokopherol in der PUVA-Creme enthalten ist. Der genaue Grund hierfür bleibt unklar und sollte Gegenstand künftiger Untersuchungen sein.
Im Jahr 1991 trat das Abkommen zur Erhaltung der in Europa und den außereuropäischen Arealstaaten vorkommenden Populationen der Arten der Säugerordnung Chiroptera in Kraft (EUROBATS: The Agreement on the Conservation of Populations of European Bats). Zuvor waren die Säuger allgemein schon in dem „Übereinkommen zur Erhaltung der wandernden wildlebenden Tierarten“ in Anhang II (Oktober 1985) aufgelistet. Auch in der Liste der in Deutschland vorkommenden Arten der Anhänge II, IV und V der FFH-Richtlinie (92/43/EWG) sind alle einheimischen Fledermausarten (Anhang II und IV) erwähnt. Für die Erhaltung der Fledermäuse ist der Schutz wichtiger „Stätten“ (z. B. Zwischenquartiere, Winterschlafquartiere, Wochenstubenquartiere) unumgänglich. Die Erhaltung und der Schutz, sowohl der Quartiere als auch der Futterplätze, vor Beschädigung oder Beunruhigung sind nach diesem Abkommen sicherzustellen. Diese Arbeit über die Stoffwechseldaten soll klarstellen, wie wichtig der Schutz der Fledermausquartiere - vor allem im Winter – ist. Der Energieverbrauch und die Anpassung der einheimischen Arten an Umgebungstemperaturen (Ta) soll mit Messwerten untermauert und mit der tropischen Art Carollia perspicillata verglichen werden. Weiterhin ist es Ziel dieser Arbeit, einen alternativen Versuchsaufbau zu entwickeln, der die Berechnung der Stoffwechselrate (SWR) ohne das Fangen der Tiere ermöglichen soll. Mit Hilfe einer IR-Kamera sollen Bilder von der Körperoberflächentemperaturverteilung und gleichzeitig Stoffwechselmessungen gemacht werden. Da die Körpertemperatur (Tb) und die SWR bei den einheimischen Fledermausarten direkt voneinander abhängig sind (HANUS 1959), könnte diese Methode hier angewandt werden. Nach der Erstellung einer Datenbank (SWR/IR-Bild) kann dann nur durch die IR-Bilder Rückschlüsse auf die SWR gezogen werden. Bei nordamerikanischen Arten konnte bestimmt werden, dass mindestens 75 % der Energiereserven, die eine Fledermaus für den Winterschlaf zur Verfügung hat, während der Aufwachphasen verbraucht werden (THOMAS et al. 1990). Eine Störung im Winterquartier führt zum Erwachen der Tiere. Nach einem Aufwachvorgang sind die Abstände des Wiedererwachens zunächst kürzer. Je kürzer die Fledermäuse im Torpor sind, desto schneller wachen sie auf. Dies verstärkt die Aufwachwahrscheinlichkeit und die damit verbundene Kettenreaktion, je öfter die Störungen auftreten (THOMAS et al. l.c.). Dies führt zu einem zusätzlichen Energieverbrauch. Der Einfluss einer Störung ist noch bis zu 8 h später in einem Winterquartier durch erhöhte Flugaktivität zu bemerken (THOMAS 1995). Dies lässt sich daraus erklären, dass die Tiere, die aufgewacht sind und aktiv sind, andere Fledermäuse durch ihre Aktivität aufwecken (Berührung, Wärme, Reproduktionsverhalten etc.). Dies soll nun auch für einheimische Arten überprüft werden. Aus den vorliegenden Erkenntnissen und den eigenen Messergebnissen sollen dann folgende weitere Fragen beantwortet werden: - Warum besteht die Notwendigkeit die Winterquartiere vor Störungen zu schützen? Welche tatsächliche Bedeutung haben Störungen im Winterquartier auf die Energetik der Fledermäuse? - Wie viel Energie verbrauchen die Fledermäuse im Sommer in Abhängigkeit von der Ta? - Gibt es Unterschiede zwischen der SWR der tropischen Art Carollia perspicillata und den einheimischen Arten? Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist durch identische Messbedingungen gewährleistet. - Lassen sich aus den SWR unterschiedliche Abhängigkeiten (Körpermasse (bm), Ta etc.) ableiten? - Hat die Nahrung den erwarteten Einfluss auf den RQ-Wert? Die Stoffwechseldaten sind deshalb so wichtig, da man damit zeigen könnte, welch extremer Ressourcenverlust für die Fledermaus mit einer Störung verbunden ist. Die Notwendigkeit des Schutzes der Fledermäuse vor Störungen im Quartier, sowohl der Sommer-, als auch die Winterquartiere, wäre dann mit Messdaten belegt. Die Unterschiede in der Abhängigkeit der SWR von der Ta, der bm, der Ernährungsform und der Tb sowohl im Wachzustand als auch im Torpor, soll für verschiedene Arten geklärt werden.
Die Verarbeitung von Informationen im zentralen Nervensystem beruht auf dem Zusammenspiel von erregender und hemmender Neurotransmission. Die Übertragung von Signalen zwischen Neuronen erfolgt chemisch über die Ausschüttung von Neurotransmittern an spezialisierten Kontaktstellen, den Synapsen. Glyzin und gamma-Aminobuttersäure (GABA) sind die bedeutendsten inhibitorischen Neurotransmitter im zentralen Nervensystem von Säugern, welche Rezeptoren vom Glyzin- (GlyR) und GABAA-Typ (GABAAR) aktivieren. Diese ligandengesteuerten Ionenkanäle sind in postsynaptischen Membranen angereichert und mit intrazellulären Proteinen assoziiert. Die Rekrutierung der Rezeptoren in postsynaptischen Domänen ist ein an das zytoplasmatisch lokalisierte Protein Gephyrin gekoppelter Prozess. So bindet Gephyrin spezifisch an die intrazelluläre Domäne der beta-Untereinheit des GlyR (GlyR beta) und bildet für die Verankerung des Rezeptors ein gerüstartiges Netzwerk unterhalb der synaptischen Membran. Die gezielte Inaktivierung des Gephyrin-Gens führt in Mäusen zu einem postnatal letalen Phänotyp und zu dem Verlust der synaptischen Anreicherung des GlyR und bestimmter GABAA-Rezeptoren auf zellulärer Ebene. Gephyrin ist ein 93 kDa großes Protein, das nicht nur im zentralen Nervensystem (ZNS), sondern auch in anderen Organen wie Leber und Niere exprimiert wird, in denen es an der Synthese des Molybdän-Kofaktors von Oxido-Reduktasen beteiligt ist. Das Gephyrin-Protein wird durch 30 Exons codiert, von denen zehn als sogenannte Kassetten alternativ gespleißt werden können. Die bestuntersuchte Spleißvariante besitzt 736 Aminosäuren und ist in eine N- und eine C-terminale Domäne (Aminosäuren 1-181 bzw. 318-736) sowie eine zentrale Linker-Domäne unterteilt. Die N- und die C-terminalen Bereiche von Gephyrin sind den Proteinen MogA und MoeA aus E. coli homolog und werden daher auch als G-Domäne (N-terminal) bzw. E-Domäne (C-terminal) bezeichnet. In kristallographischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass die G- und E-Domänen zur Tri- bzw. Dimerisierung befähigt sind. Diese speziellen Oligomerisierungseigenschaften der beiden Gephyrindomänen bilden wahrscheinlich die Grundlage für die Entstehung von Gephyrin-Clustern sowie eines hexagonalen Gephyrin-Gerüstes. Dieses Gerüst stellt den Verknüpfungspunkt zwischen Rezeptoren und dem Zytoskelett dar und ermöglicht somit die effiziente Clusterbildung und die zielgerichtete Anordnung einer großen Anzahl inhibitorischer Rezeptoren. In der vorliegenden Arbeit sollten die Rolle dieser beiden Domänen bei der Bildung membranassoziierter Gephyrinaggregate und die molekularen Mechanismen der Clusterbildung des Gephyrinmoleküls untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden durch zielgerichtete Mutagenese unterschiedliche Gephyrin-Mutanten hergestellt, um die Fähigkeit der Oligomerisierung der G- und E-Domäne gezielt zu modifizieren. Dadurch sollte die Bedeutung der Oligomerisierung hinsichtlich der Aggregat- bzw. Clusterbildung untersucht werden. Außerdem sollten die Wechselwirkungen zwischen Gephyrin und anderen Proteinen und deren Einfluss auf die synaptische Lokalisation analysiert werden. Für diese Untersuchungen wurden auf der Basis von Röntgenstruktur-Daten spezifische Aminosäurereste an den bei der Oligomerisierung beteiligten Kontaktstellen ausgetauscht. In der G-Domäne wurden zu diesem Zweck vier separate Aminosäuren des Trimer-Interface durch Arginin ersetzt (GephRRRR). Analog hierzu wurden in der EDomäne einzelne Aminosäuren durch Arginin bzw. Glutamat substituiert (GephRER), um dadurch eine Dimersierung zu verhindern. Für die Kassette C5’ wird angenommen, dass deren Vorhandensein die Interaktion zwischen Gephyrin und GlyR beeinträchtigt, wodurch GlyR aus GABAergenen Synapsen ausgeschlossen wird. Daher wurde der Einfluss dieser Gephyrin-Spleißvariante (GephC5’), die zu einer Peptidinsertion innerhalb der G-Domäne führt, und einer Gephyrin-Mutante (Gephmut), die den Verlust der Wechselwirkung mit dem GlyR bedingt, auf die Aggregatbildung von Gephyrinoligomeren untersucht. Bei dem Konstrukt Gephmut wurden, basierend auf Daten von Röntgenstrukturuntersuchungen, neun Aminosäuren (713-721) am Cterminalen Ende der E-Domäne durch den homologen Bereich des bakteriellen MoeA Proteins aus E. coli ersetzt. Zunächst wurden die einzelnen isolierten Domänen mittels Gelfiltration hinsichtlich ihres Oligomerisierungsverhaltens untersucht. Die Mutationen wurden hierzu in verkürzte Proteine eingeführt, bei denen nur die G- bzw. die E-Domäne exprimiert wurden. Diese Konstrukte wurden daher als GRRRR, GC5’ bzw. ERER und Emut bezeichnet. Bei diesen zeigte sich, dass die G-Domäne des Gephyrin-Wildtyps zu trimeren Proteinkomplexen oligomerisiert. Im Gegensatz hierzu war die Mutante GRRRR nicht in der Lage, Trimere zu bilden. Das Einfügen der C5’-Kassette führte ebenfalls zu einer Störung der Trimerisierung. Gelfiltrationsexperimente mit der E-Domäne ergaben, dass die mutierte Domäne ERER, im Gegensatz zum Wildtyp-Konstrukt, keine Dimere ausbildet. Bisherige Studien haben jedoch gezeigt, dass das Emut Polypeptid zur Dimerisierung befähigt ist. Das Oligomerisierungsverhalten des kompletten Gephyrin-Proteins wurde mittels blauer nativer Gelelektrophorese (BN-PAGE) analysiert. Für die hier beschriebenen Untersuchungen mit BN-PAGE wurde rekombinantes Gephyrin in Xenopus laevis Oozyten heterolog exprimiert. Die Analyse ergab, dass Wildtyp Gephyrin nativ als Hexamer vorliegt, welches durch ansteigende Konzentrationen des Detergenzes Natriumdodecylsulfat (SDS) in Trimere, Dimere und Monomere zerfällt. Sowohl GephRRRR und GephC5’ liegen nativ fast ausschließlich als Dimere vor, während GephRER nur trimere Aggregate formt. Die entsprechende Doppelmutante mit Mutationen in Gund E-Domäne war wie erwartet nur noch als Monomer existent. Die als Kontrolle eingesetzte Glyzinrezeptor-Bindungsmutante Gephmut bildete, ebenso wie der Wildtyp, Hexamere aus. Daraus folgt, dass die Oligomere der G- bzw E-Domäne Zwischenprodukte der Hexamerbildung darstellen. Die Analyse der Oligomerisierungseigenschaften der Mutanten wurde nachfolgend in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293T) untersucht. Nach heterologer Expression von Wildtyp Gephyrin in HEK 293T-Zellen formen sich große, charakteristische Gephyrinaggregate. Die Oligomerisierungs-Mutanten GephRRRR, GephRER und GephC5’ aggregierten jedoch nicht, sondern waren diffus im Zytoplasma verteilt. Die wiederum als Kontrolle eingesetzte Bindungsmutante Gephmut hingegen wies eine normale Aggregation auf. Diese Ergebnisse bestätigen die grundlegende Rolle der Oligomerisierung von G- und E- Domänen für die Aggregatbildung von Gephyrin. Mittels GST-Pulldown und Kolokalisationsanalysen in HEK Zellen wurde die Wechselwirkung der Gephyrinmutanten mit der GlyR beta, dem Motorkomplexprotein Dynein light chain-1 (Dlc-1) und dem Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor Collybistin (Cb) untersucht. Beide Ansätze weisen darauf hin, dass die Trimerisierung der G-Domäne an der Interaktion von Gephyrin mit Dlc-1 und die Dimerisierung der E-Domäne bei der Bindung an GlyR beta und Cb beteiligt ist. Die Mutante Gephmut zeigte in beiden Fällen einen totalen Verlust der Bindungsfähigkeit sowohl an das GlyR beta Bindungsmotiv als auch an Cb. Der Einbau der C5’ Kassette in Gephyrin scheint jedoch nicht dessen Bindung an den GlyR zu beeinflussen. Für die Analyse der Clusterbildung und des zielgerichteten Transports in Neuronen wurden Wildtyp und mutiertes Gephyrin in hippocampalen und spinalen Primärkulturen der Ratte exprimiert. Zur Überprüfung einer synaptischen Lokalisation wurde Gephyrin gemeinsam mit dem vesikulären inhibitorischen Aminosäure-Transporter (VIAAT), einem präsynaptischen Marker-Protein, detektiert. In beiden Kulturen wies Gephyrin eine punktartige Verteilung in den Neuriten auf und wurde gezielt an Synapsen angereichert. Im Kontrast dazu zeigten alle Oligomerisierungsmutanten, GephRRRR, GephC5’ und GephRER keine Ausbildung von Clustern sondern eine diffuse Verteilung im Zellkörper und in Dendriten. Das Konstrukt Gephmut wies jedoch Clusterbildung und eine punktförmige Verteilung auf. Diese Daten belegen, dass die Oligomerisierung der G- wie auch der E-Domänen für die Clusterbildung und synaptische Lokalisation von Gephyrin unerlässlich ist. Die Wechselwirkung mit dem GlyR und/oder Collybistin ist ebenfalls für die Anreicherung in der Synapse erforderlich, nicht jedoch für die Bildung der Gephyrin-Cluster. Die dargestellten Ergebnisse belegen die Rolle der spezifischen Oligomerisierungseigenschaften der G- und E-Domäne für die Ausbildung des hexagonalen Gephyringerüstes und dessen grundlegende Bedeutung für die spezifische Anreicherung von Gephyrin an inhibitorischen Synapsen in Neuronen.
The Indian IT industry has received great attention. Although most studies cover South Indian locations, clustering has rarely been a topic. This study focuses on Bangalore addressing questions related to Bangalore’s successful development and lessons thereof for other regions in and outside India. The approach pertains to economic geography and international business; hypotheses have been developed from a multi-disciplinary literature survey and interview fieldwork in Bangalore. I emphasize human and social capital and networks. While the first chapter delineates cultural foundations of human capital formation, the second and third deal with bonding and bridging social capital (or dense and loose networks), respectively; the fourth is an outlook on future opportunities through intersectoral upgrading. The main hypothesis is that a combination of both forms of social networks - contingent upon sub-sectors – has helped Bangalore developing a successful IT industry. Positive attitudes towards education led to relatively more human capital spawning two positive feedbacks: 1) establishment of national research and educational institutes resulting in large inflows of a diversity of people providing the required setting for creativity and innovation; 2) transnational networks linking to Silicon Valley are dominated by people from South India, allowing for additional knowledge spillovers corroborating the regional clustering.
Leukämien sind eine heterogene Gruppe von malignen Erkrankungen der hämatopoetischen Zellen. Die Pathogenese der akuten myeloischen Leukämie (AML) ist durch einen Differenzierungsblock charakterisiert [Gelmetti V MCB 1998, Ruthardt M MCB 1997, Grignani F Cell 1993, Testa U Leukemia 1998]. Die akute Promyelozyten Leukämie (APL) ist eine gut charakterisierte Unterform der AML, die in 95% der Fälle die t(15;17) und in 2% die t(11;17) beinhaltet. Die resultierenden Fusionsproteine PML/RARalpha und PLZF/RARalpha (X-RARalpha) geben in verschiedenen Modellen den leukämischen Phänotyp wieder und induzieren einen Differenzierungsblock. Im Tiermodell induziert die Expression von PML/RARalpha und PLZF/RARalpha eine Leukämie. Die Behandlung mit all-trans-Retinolsäure (t-RA) ist in der Lage den Differenzierungsblock in PML/RARalpha, aber nicht in PLZF/RARalpha positiven Blasten zu überwinden. Diese beiden Fusionsproteine blockieren die Differenzierung durch verschiedene Mechanismen, so z.B. durch die aberrante Rekrutierung von Histon-Deazetylase-Korepressor-Komplexen (HD-NCR) und die Deregulierung differenzierungsspezifischer Transkriptionsfaktoren wie VDR oder c/EBPa [Puccetti E Blood 2004]. Der Vitamin D3 Rezeptor (VDR) ist ein Mitglied der hormoninduzierbaren Transkriptionsfaktoren und bindet direkt an PML/RARalpha, was zur funktionellen Inaktivierung von VDR und Blockierung der VitD3-induzierten Differenzierung führt [Puccetti 2002]. Das Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zu untersuchen, ob XRARalpha in der Lage sind andere differenzierungsrelevante Transkriptionsfaktoren, wie PU.1 und GATA-1, zu binden und dadurch funktional zu inaktivieren. GATA-1 und PU.1 sind Schlüsselfaktoren der myeloischen Differenzierung. Kürzlich wurde gezeigt, dass der Knockout dieser beiden Transkriptionsfaktoren zur Leukämogenese beiträgt [Rosenbauer F 2005, Stachura 2005]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass X-RARalpha sowohl GATA-1, als auch PU.1 direkt binden, ohne ihre Expressionsniveaus zu beeinflussen. Die DNA-Bindungskapazität dieser beiden Transkriptionsfaktoren auf ihre Zielpromotoren war durch X-RARalpha deutlich reduziert. Die Behandlung mit t-RA restorierte die Bindung von GATA-1, aber nicht von PU.1, was darauf schließen lässt, dass die funktionale Inaktivierung von GATA-1 ligandenabhängig, die von PU.1 -unabhängig ist. Die transkriptionelle Aktivität auf künstliche Zielpromotoren war in Gegenwart von X-RARalpha bei PU.1 stark reduziert, auf GATA-1 hatten X-RARalpha in diesem Zusammenhang keinen Einfluss. Die Überexpression dieser Transkriptionsfaktoren in X-RARalpha-positiven hämatopoetischen Stammzellen hat die aberrante Selbsterneuerung leukämischer Stammzellen (LSZ) reprimiert. Während PU.1 Differenzierung erzeugte, tat GATA-1 dies nicht. Die Vermutung liegt nahe, dass die Inhibition von Dissertation von Anita Seshire 2 GATA-1 über seinen Azetylierungsstatus in Gegenwart von X-RARalpha stattfindet, durch die Sequestrierung eines weiteren Proteins der Histon-Azetyltransferase (HAT) CBP/p300, die für die Azetylierung von GATA-1 verantwortlich ist. Zusammengenommen lassen diese Daten darauf schliessen, dass PU.1 durch die Interaktion mit PML/RARalpha seinem Wirkungsort entzogen wird (sequestriert) und das die Inhibition von GATA-1 ein Zusammenspiel aus Sequestrierung und Chromatin-Modellierung durch X-RARalpha ist. Die Fähigkeit von X-RARalpha, den leukämischen Phänotyp zu induzieren ist an ihre Fähigkeit zur Oligomerisierung und zur Formierung sog. Makrokomplexe gekoppelt [Grignani 1996, Minucci 2000, Puccetti 2005]. Um die Zusammensetzung dieser Makrokomplexe zu entschlüsseln, wurde ein Mockkontrollierter TAP-Proteomics-Screen mit PLZF/RARalpha in KG-1 Zellen durchgeführt. Es konnten verschiedene Proteine identifiziert werden, die spezifisch an PLZF/RARalpha binden und vermutlich eine Rolle für die Leukämogenese spielen. Die identifizierten Proteine spielen eine Rolle bei der Migration, den kleinen GTPasen, epigenetischer Regulation und Stammzellselbsterneuerung. Das „adenomatous poliposis coli“ Protein (APC) wurde als spezifischer Interaktionspartner für PLZF/RARalpha identifiziert und ist ein Hauptinhibitor des Wnt-Signalwegs. Die Deregulierung des Wnt-Signalwegs spielt eine bedeutende Rolle in der Leukämogenese durch die aberrante Induktion der Selbsterneuerung leukämischer Stammzellen [Zheng 2004]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass APC direkt an PLZF/RARalpha, aber nicht PML/RARalpha bindet ß-catenin/TCF vermittelte Transkriptionssignale, die zur Leukämogenese beitragen können, aktiviert. Die Bindung an APC ist abhängig von der Oligomerisierungsfähigkeit des PLZF/RARalpha und daher von der korrekten Konformation der Proteininteraktionsdomäne BTB/POZ, was durch POZ-Punktmutanten nachgewiesen wurde, die auch nicht mehr in der Lage waren ß-catenin/TCF-vermittelte Transkription in derselben Stärke wie PLZF/RARalpha zu aktivieren. Die Überexpression von APC in PLZF/RARalpha-positiven LSZ hat ihre aberrante Selbsterneuerung vollkommen reprimiert. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Interaktion von APC, GATA-1 oder PU.1 mit XRARalpha und der konsequente Sequester einen wichtigen Mechanismus zur Leukämogenese stellen. Weiterhin hat sich gezeigt, dass die Überexpression dieser Proteine, die aberrante Selbsterneuerung überwinden kann und teilweise Differenzierung erzeugt. Es konnten der Wnt-Signalweg als valides Ziel für neue Therapieansätze identifiziert werden und die molekularen Mechanismen der Pathogenese der APL weiter aufgeklärt werden.
Ausgangspunkt für diese Arbeit war die Fragestellung ob eine periprothetische Osteopenie nach zementfreiem endoprothetischem Hüftgelenksersatz durch die Bestimmung von Knochenresorptionsmarkern im Serum, hier speziell der osteoklastenspezifischen aktiven Isoform 5b der Tartrat resistenten sauren Phosphatase (TRAP 5b) diagnostizierbar ist. Außer der Tartrat resistenten sauren Phosphatase wurden gleichzeitig das Osteocalcin, die Knochenspezifische Alkalische Phosphatase sowie die Serum Cross Laps mitgemessen. Die Blutentnahmen erfolgten an den 17 ausgewählten Patienten erstmalig am Tage vor der Operation als Blutreferenzwert. Die weiteren Blutentnahmen wurden 2 Wochen, 3, 6, 8, 12, 16 und 26 Wochen postoperativ durchgeführt. Gleichzeitig wurde eine Messung der periprothetischen Knochendichte mit dem etablierten Verfahren der DEXA durchgeführt. Diese Messungen erfolgten 1,2,8,16 und 26 Wochen nach der Operation in den 7 Arealen um die Prothese nach GRUEN. Um eine generelle Änderung der Knochendichte erfassen und somit eine Beeinflussung der ermittelten Ergebnisse auszuschließen bzw. erkennen zu können wurde präoperativ sowie 26 Wochen postoperativ eine Knochendichtemessung der Lendenwirbelkörper 1-4 durchgeführt. Die durchgeführten Messungen zeigten einen signifikanten postoperativen Anstieg der Konzentrationen des Knochenresorptionsmarkers TRAP 5b, der sich parallel zu dem Knochendichteabfall in den 7 Arealen um die Prothese nach GRUEN verhielt. Als Schlussfolgerung aus den erzielten Ergebnissen kann man sagen, dass der Knochenresorptionsmarker TRAP 5b in der Lage ist, sensitiv die in der frühen postoperativen Phase nach Hüftendoprothesenimplantation auftretende Osteopenie im Bereich des Prothesenschaftes anzuzeigen.
An der Chirurgischen Klinik des Bürgerhospitals wurden 58 Patienten, davon 38 Frauen und 19 Männer, in dem Zeitraum von 1/2001 bis 8/2003 aus unter-schiedlicher Indikation und angemessen dem präoperativen Befund an der Schilddrüse operiert. Die mitentnommenen Schilddrüsen-Isthmi wurden separiert und getrennt immunhistochemisch auf Calcitonin, Chromogranin A, CGRP (Calcitonin-Gene-Related-Peptid) und CEA (Carcino-Embryonales-Antigen) untersucht mit der Fragestellung der C-Zell-Freiheit des Isthmus im chirurgischen Krankengut und daraus möglicherweise resultierendem innovativen Operationsverfahren bei erhöhtem Serumcalcitonin. Dem Gesamtkollektiv wurden konsekutiv 35 Patienten mit einem unbekannten oder nicht erhöhten Serum-Calcitoninwert (Gruppe A), dann im Verlauf 23 Patienten selektiv systematisch mit einem präoperativ erhöhten Serum-Calcitoninwert (Gruppe B) zugefügt. Die immunhistochemische Untersuchung der Isthmi zeigte in keinem Fall eine Positivität für Calcitonin, der als spezifischer C-Zell-Marker gilt. 44,8% aller Isthmi waren positiv für Chromogranin A und 62% für CGRP, CEA-positiv waren nur 3 Isthmi. Signifikant häufiger positiv für Chromogranin A und CGRP waren Isthmi der Patienten mit C-Zell-Hyperplasie als Isthmi bei Patienten mit medullärem Schilddrüsenkarzinom der Seitenlappen. Die Ursache ist bis dato ungeklärt. Chromogranin A, CGRP und CEA gelten als unspezifische Marker, können aber auch in C-Zellen positiv sein. Bis heute ist kein Fall einer Calcitonin-negativen und gleichzeitig Chromogranin A-, CGRP- und CEA-positiven C-Zelle beschrieben worden, so dass wir anhand unserer Studie am chirurgischen Patientengut einen Nachweis eines C-Zell-freien Isthmus liefern, der jedoch endokrine Zellen beinhaltet, deren genaue Funktion in der Schilddrüse nicht bekannt sind. Der Median der präoperativen basalen Serum-Calcitoninwerte der Gruppe B lag bei patho-histologisch nachgewiesener C-Zell-Pathologie-Freiheit bei 19,5 pg/ml (10-36,4), stimuliert bei Median 85 pg/ml (53-206,4), bei Patienten mit einer C-Zell-Hyperplasie lag der basale Median bei 25,5 pg/ml (16-75), der stimulierte Median lag bei 134 pg/ml (57,8-208), bei Patienten mit medullärem Schilddrüsenkarzinom lag der basale Median bei 523,1pg/ml (71-11360), der stimulierte Median lag bei 994pg/ml (189-11400). In Anbetracht dessen haben unsere Ergebnisse eine klinische Relevanz im Hinblick auf mögliche Modifikationen der Operationsverfahren vor allem bei Knotenstrumen, die mit leicht erhöhtem Serum-Calcitonin einhergehen oder bei prophylaktischen Operationen bei genetisch positiven Patienten. Eine Verlaufskontrolle ist mit Bestimmung des Serum-Calcitonins möglich, ein Zweiteingriff (im Falle eines patho-histologisch nachgewiesenen medullären Mikrokarzinoms) jederzeit und mit geringem Komplikationsrisiko durchführbar.
In der vorliegenden Arbeit wird die Anwendung einer optischen Detektionsmethode zur Messung der magnetischen Eigenschaften eines verdünnten Systems angewandt und zur Untersuchung von High-Spin–Low-Spin-Komplexen etabliert. Die von uns angewandte MCD-Spektroskopie vereint eine optische Messtechnik, die auf die Messung ultraschneller Effekte erweiterbar ist, mit einer direkten Messmethode für die magnetischen Eigenschaften einer verdünnten Probe des LD-LISC-Komplexes Fe(stpy)4(NCSe)2 (stpy = 4-styrylpyridin). Der LD-LISC-Effekt ist ein licht-induzierter Spinübergang, der auftreten kann, wenn von einem Paar metallorganischer Komplexe eines einen thermischen Spinübergang aufweist und optisch zwischen den beiden Komplexes geschaltet werden kann, beispielsweise durch eine Photoisomerisation. Im Falle von Fe(stpy)4(NCSe)2 ist der cis-Komplex für alle Temperaturen im high-Spin-Zustand, während der trans-Komplex einen thermischen Spinübergang aufzeigt. Mit MCD-Spektroskopie wurde die Magnetisierung des Grundzustands des Fe(II)(stpy)4 (NCS)2-Komplexes in der trans- und der cis-Konfiguration in verdünnten dotierten Polymerfilmen untersucht. Diese magnetooptische Spektroskopie-Technik ermöglicht die Identifizierung von MLCT-Bändern des Eisen-Komplexes, die in optischen Spektren durch stärkere Ligandenabsorptionsbäder überlagert sind und sich nur schlecht auflösen lassen. Das untersuchte System dient als Beispiel für eine Reihe von Verbindungen, die photoschaltbare magnetische Eigenschaften besitzen. Für den Komplex in der cis-Form können bei tiefen Temperaturen durch die Messung von MCD-Daten bei variablem Feld und variabler Temperatur der Spinzustand, der g-Tensor und die Übergangspolarisierung M, sowie achsiale und rhombische Verzerrungen der oktaedrischen Geometrie des Moleküls bestimmt werden. Für den Komplex in der trans-Form konnte erstmals der Unterschied im Spinübergangsverhalten zwischen einer verdünnten Probe und einer konzentrierten Pulverprobe mit einem High-Spin–Low-Spin-Übergangskomplex gezeigt werden. Mit MCD-Spektroskopie konnten die Spinübergangsparameter bestimmt werden, die mit SQUID-Magnetometrie nur unzureichend untersucht werden können. Erste Messungen der MCD-Spektren während gleichzeitiger optischer Anregung zur Beobachtung des LD-LISC-Effekts auf langsamen Zeitskalen zeigen keine Änderung der MCD-Spektren trotz ausreichender Anregungsleistung, die zu einer deutlich messbaren Photoisomerisation geführt hat. Bei einer Temperatur von 120K der Messung ist der trans-Komplex bereits zu einem großen Teil im High-Spin-Zustand, so daß der Unterschied zwischen den Spinzuständen des cis- und des trans-Zustandes unterhalb der Auflösung des verwendeten Aufbaus liegt. Die in dieser Arbeit erzielten Resultate demonstrieren, daß die MCD-Spektroskopie eine geeignete Technik zur Messung des magnetischen Zustands von LD-LISC-Komplexen (oder anderen Komplexen) in verdünnten, zufällig orientierten Proben ist.
Chalcogen-based species are common ligands in transition-metal chemistry and display a variety of coordination modes. Like alkyl- and arylchalcogenolates, silylchalcogenolates are able to stabilize transition-metal complexes. Metal chalcogenolates LnM-ESiR3 with small organic residues R can serve as precursors for larger metal–chalcogenide clusters, which can be accessed by cleaving the E-Si bond. Furthermore, large silyl residues at the chalcogen atom serve to kinetically stabilize reactive systems. To explore the diverse chemistry of this class of compounds, a number of different silyl chalcogenolates were synthesized, including the sodium siloxide Ph2MeSiONa and the chalcogen derivatives of the extremely sterically hindered silyl residues tBu2PhSi- und tBu3Si-. The anionic silyl species tBu2PhSiNa and tBu3SiNa nucleophilically degrade elemental chalcogens (S, Se, and Te), thus producing the silyl chalcogenolates tBu2PhSiENa and tBu3SiENa (E = S, Se, Te). The chemical and structural properties of these compounds were studied. Protonolysis produces the corresponding chalcogenols tBu2RSiEH, while oxidation leads to the dichalcogenides tBu2RSiE-ESiRtBu2 (R = tBu, Ph; E = S, Se, Te). Oxidative addition of the dichalcogenides to metal centers in low oxidation states offers one route to chalcogenolate complexes. To investigate the realm of this approach, three oligochalcogen compounds R3SiE-E′n-ESiR3 were synthesized. The tetrasulfane tBu3SiS-S2-SSitBu3 and the chalcogen(II)dithiolates (tBu3SiS)2Se and (tBu3SiS)2Te were produced, and their stability was investigated. The direct comparison of isoelectronic species allows for a deeper understanding of their similarities and differences. The silanides R3Si– can be considered as anionic phosphane analogues in which a phosphorus atom has been formally replaced with a Si– unit. Phosphanylborhydrides R2BH3P– also belong to this isoelectronic series. The same analogy holds true for the chalcogen derivatives related to the phosphane chalcogenides R3P=E. With this in mind, complexes of the CpFe(CO)2 fragment with the different isoelectronic ligands were synthesized and compared. The silyl-based ligands were found to be the strongest donors of the two isoelectronic series. The differences in donor strength were roughly twice as large for the nonchalcogen species as for the chalcogen-based ligands. To further investigate the chemistry of transition-metal silyl chalcogenolate complexes, the coordination behavior of the chalcogenolates tBu2RSiE– (R = tBu, Ph; E = S, Se, Te) was studied. Salt metathesis of silyl thiolates with appropriate metal halides leads to the multinuclear complexes [Cu(SSitBu2Ph)]4 and [ZnCl(SSitBu3)(THF)]2. Metathesis products were identified in the reactions of BrMn(CO)5 with one or two equivalents of tBu3SiSNa(THF)2. Diproporationation of these compounds leads to dimeric Mn(I)Mn(II) complexes. The crystal structure of the dinuclear disproportionation product [(CO)3Mn(mu-SSitBu3)3Mn(SSitBu3)]– displays a terminal tBu3SiS– ligand, which coordinates with a Mn-S-Si angle of 180°. This geometry indicates that the thiolate can be considered as a six-electron donor (2 sigma e–, 4 pie–), analogous to the cyclopentadienyl ligand. Photoinduced oxidative addition of the dichalcogenides to Fe(CO)5 leads to the dimeric complexes [(CO)3Fe(ESitBu3)]2 (E = S, Se, Te). The tellurolate complex forms quantitatively within 8 h. The thiolate complex, on the other hand, is formed slowly over a period of six months. IR-spectroscopic investigation of the CO vibrations of the three homologous complexes indicates that the tellurolate is the strongest donor of the series.
Echoviren und Polioviren gehören zur Gruppe der Enteroviren. Während Echoviren heute noch weltweit Infektionen verursachen, konnten durch Einführung der Polioimpfung die Poliomyelitisfälle deutlich reduziert werden. Echoviren verursachen vor allem in den Sommermonaten häufig unspezifische fieberhafte Infekte. Übertragen werden sie allein durch den Menschen, meist über fäkal-orale Schmierinfektionen. Die vorliegende Arbeit ist eine retrospektive epidemiologische Untersuchung zur Antikörperprävalenz gegenüber Echoviren und Polioviren in der Bevölkerung des Rhein-Main-Gebietes. Das Patientenkollektiv umfasst eingesandte Serumproben aus der Universitätsklinik Frankfurt vom 1. Juli 2000 - 30. September 2002. Im Rahmen der Labordiagnostik wurden die Serumproben, am Institut für Medizinische Virologie, auf spezifische Antikörper gegen die Echovirustypen -6,-7,-9,-11 und -30 untersucht. Ebenso wurden Serumproben aus der laufenden Labordiagnostik von insgesamt 8563 Patienten (von 1998 bis 2002) im Institut für Virologie gesammelt und auf Antikörper gegen das Poliovirus (Typ 1,2 und 3) untersucht. Als Testmethode zum Nachweis neutralisierender Antikörper wurde der Neutralisationstest eingesetzt. Die Prävalenz für Echovirus-spezifische Antikörper zeigt für Echovirustyp-30 die höchste Durchseuchung (69,4%). Die Prävalenz für Echovirustyp-9 lag bei 48,1%. Echovirustyp-6, -7 und -1 1 identifizierten wir mit einer relativen Häufigkeit von 28% in den untersuchten Seren. Die Antikörpemrteilung zeigt eine ausgewogene Geschlechterverteilung. Überwiegend stellten sich niedrigtitrige Antikörperspiegel, als Ausdruck einer früheren abgelaufenen Infektion, dar. Eine Epidemie konnte damit ausgeschlossen werden. Vereinzelt nachgewiesene höhere Titer entsprechen einem endemischen Auftreten der Echoviren im Raum Frankfurt. Bezüglich der Altersverteilung konnte keine signifikante Altersgruppe identifiziert werden. Das Risiko eine Echovirusinfektion zu erwerben liegt sicherlich im Kleinkindesalter (Kinder im Alter von 1 bis 4 Jahren), da diese Gruppe die geringste Prävalenz für neutralisierende Antikörper aufwies. .Wir eruierten, für die verschiedenen Echovirus-Serotypen, unterschiedliche altersabhängige Prävalenzspitzen, welche mit dem zyklischen Auftreten der Viren in einer Region vereinbar sind. Besonders für Echovirustyp-30 konnte eine hohe Durchseuchung im höheren Lebensalter festgestellt werden. Zurückführen lassen sich solche Ergebnisse auf die Genom Variation von Echovirustyp-30. Die vermutete negative Serokonversion der Echovirus-Antikörper, und dass damit das verbundene Nachlassen der Immunität, ließ sich auch im Vergleich mit einer Altstudie von 1991 nicht eindeutig durch unsere Untersuchungsergebnisse belegen. Spezifische Krankheitsverläufe ließen sich für Echovirustyp-30, mit einem vermehrten Vorkommen an Meningitis und für Echovirustyp-6 mit vermehrter gastrointestinaler Manifestation nachweisen. Im Jahre 1998 erfolgte die Umstellung der Poliomyelitisimpfung in Deutschland. Nach jahrzehntelanger Verwendung der OPV (oralen Schluckimpfung nach Sabin) wurde diese zugunsten der IPV (inaktivierte Poliovakzine nach Salk) verlassen. Gerechtfertigt wurde die Umstellung dadurch, dass seit 1990 in Deutschland kein autochthoner Poliomyelitisfall mehr aufgetreten ist. Bei fehlendem endemischen und epidemischen Vorkommen des Virus wurde das Risiko für das Auftreten einer VAPP(= vaccine associated paralytic polio), unter Anwendung der OPV, als nicht mehr vertretbar angesehen. In dieser kritischen Umstellungsphase untersuchten wir den Immunitätsstatus der Bevölkerung, um das Risiko einer Einschleppung aus nicht poliofreien Gebieten, und Verbreitung der Poliomyelitis unter der deutschen Bevölkerung zu beleuchten. Die Prävalenz der untersuchten Population zeigt eine gute Immunität gegen Poliovitustyp-1 , und -2. Eine geringere Antikörperprävalenz ließ sich, wie in anderen Studien auch, für Poliovirustyp-3 (73%) identifizieren. Diese lässt sich zurückführen auf eine unterschiedliche Immunogenität der lmpfviren bei Verwendung der OPV. Im Vergleich mit anderen nationalen und internationalen Studienergebnissen bemerkten wir niedrigere Antikörperprävalenz-Werte im untersuchten Patientenkollektiv. Wir vermuten einen Zusammenhang mit dem vermehrten Vorkommen von lmmunsuppremierten Patienten in der Studie. Bei Betrachtung der altersabhängigen Verteilung der Antikörperprävalenz fiel sowohl 1998 als auch im Jahre 2002 ein Defizit an Poliovirusantikörpern, besonders für Poliovirustyp-3, in den Geburtsjahrgängen von 1983-1 987 auf. Wir führten dies auf eine vernachlässigte Auffrischimpfung im Jugendalter zurück. Insgesamt konnte aber von 1998 bis 2002 eine Zunahme der Im,munität gegenüber den Polioviren beobachtet werden. Besonders die alleinigen Empfänger der IPV zeigten eine hervorragende Immunität. Das Defizit an Poliovirustyp-3 Antikörpern konnte durch Verwendung der IPV beseitigt werden. Davon profitierten nicht nur die alleinigen IPV Empfänger, sondern auch Personen, die mit IPV, im Sinne einer Auffrischimpfung, nachgeimpft wurden. Aus Erhebungen der Populationsimmunität wird deutlich in welchen Regionen und in welchen Bevölkerungsgruppen Defizite bestehen und behoben werden müssen, damit eine endgültige und weltweite Eradifikation der Poliomyelitis zukünftig zum Erfolg führen kann.
Ein gen-interner Transkriptionsstart koinzidiert mit einem Rekombinations-Hotspot imhumanen MLL-Gen
(2006)
Chromosomale Veränderungen des humanen MLL-Gens sind für 5-10% der akuten Leu-kämien im Säuglings- und Erwachsenenalter verantwortlich. Davon entstehen wiederum 5-10% der MLL-Aberrationen therapiebedingt. Das auf Bande 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homo-log of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Mittlerweile sind fast 90 cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40%), AF9 (27%), sowie ENL (7%), AF6 (6%), ELL (~5%) und AF10 (4%). Die Bruchpunkte von MLL-Translokationen sind nicht einheitlich über das 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in einer ca. 8.3 kb großen Bruchpunkts-clusterregion (bcr). Innerhalb dieser Region sind die Bruchpunkte nicht homogen verteilt. Bruchpunkte von Patienten mit de novo-Leukämien und einem Alter von über einem Jahr sind überwiegend in der 5’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster I (SCI), lokalisiert. Die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien sowie Säuglingen (<1 Jahr) liegen dagegen vornehmlich in der 3’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster II (SCII). Da DNA-Doppelstrangbrüche (DNA-DSB) auf zwei unterschiedlichen Chromosomen eine aus-reichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind, stellte sich die Frage, ob aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte innerhalb der MLL bcr, bestimmte Bereiche dieser Region für DNA-DSB besonders anfällig sind. Bisher konnte aufgeklärt werden, dass in SCII, durch Apoptose-auslösende Ereignisse oder cytotoxische Agenzien DNA-DSB sehr leicht induziert werden können. Durch Arbeiten in unserer Gruppe konnte im SCII ein ca. 200 bp großer Bereich um die MLL Intron 11/Exon 12-Grenze lokalisiert werden, in dem sich der größte Teil aller Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche konzentrierte. Dies galt jedoch nicht für eine perfekte TopoisomeraseII Konsensussequenz im Exon 12, die bisher mit einer Vielzahl Therapie-assoziierter Translokationsbruchpunkte in Verbindung gebracht wurde. Dieser Hotspot kolokalisiert außerdem mit einer scaffold/matrix attachment region (S/MAR), sowie einer DNaseI-hypersensitiven Stelle. Des Weiteren fanden sich in der Literatur Hinweise, dass SCII im Gegensatz zu SCI eine verstärkte Histonacetylierung besitzt. Die potentielle Anwesenheit eines Promotors wurde durch Computeranalysen bestätigt. In einer murinen embryonalen Fibroblasten-Zelllinie, die durch die Insertion einer LacZ/Neo-Kassette in Exon 4 des Mll-Gens einen Transkriptionsstop trug, wurden in anschließenden RT-PCR Experimenten sowohl alle Möglichkeiten des alternativen Spleißens ausge-schlossen, als auch der Start eines Transkripts unmittelbar vor Exon 12 detektiert. Zusätzlich durchgeführte Affymetrix-Chip-Experimente bestätigten die Anwesenheit von Mll-Transkript-signalen in der verwendeten Mll k.o.-Zelllinie. In nachfolgenden Versuchen konnte durch eine weitere Kartierung der Transkriptionsstart auf bis zu +/- 15 bp an der Intron 11/Exon12-Grenze festgelegt werden. Um nun die im Mausmodell gewonnenen Resultate auch im humanen System zu überprüfen, wurden die homologen Regionen des murinen und humanen Mll/MLL-Gens vor ein Luci-ferasereportergen kloniert. Durch RT-PCR konnte der gen-interne Transkriptionsstart im SCII des humanen MLL-Gens ebenfalls lokalisiert werden. Damit wurde gezeigt, dass genetische Instabilität und Transkriptionsinitiation im SCII des humanen MLL-Gens kolokalisieren. Durch die anfangs durchgeführten in silico-Analysen in Maus und Mensch, wurden Deletions-mutanten generiert, mit deren Hilfe die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotor-region ermittelt wurde. Hierbei zeigte sich, dass die Anwesenheit von zwei Retroelementen in der menschlichen Sequenz eine Enhancer-Funktion vermittelt. Dagegen zeigte die homologe murine Sequenz, für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-DSB bekannt ist, nur schwache Promotoraktivität. Da Histon Modifikationen beim Prozess der Transkription eine entscheidende Rolle spielen, wurde auch die nähere Umgebung des gen-internen Promotors in den murinen k.o.-Zellen untersucht. In der k.o.-Linie zeigte die Region stromaufwärts der putativen Transkriptionsinitiation die Signatur von inaktivem Chromatin (di-methyliertes H3 K9), wohingegen stromabwärts von Mll Exon 12 Chromatinstrukturen nachgewiesen wurden, die aktiv transkribiert werden (tri-methyliertes H3K4), und damit einen weiteren Beweis für die besondere Chromatinstruktur dieser Region lieferten. Durch Western-Blot Experimente wurde das Protein, das durch das Transkript des gen-internen Promotors kodiert wird, nachgewiesen. Das verkürzte murine Mll-Protein wird also, wie sein humanes Pendant, proteolytisch durch die Taspase1 gespalten, so dass sich ein MLL-Mini-Komplex ausbilden kann.
Entwicklung und Evaluation einer Methode zur Messung der Thrombinbildung in plättchenreichem Plasma
(2006)
Augmented Reality ist eine Technologie, mit der die Wahrnehmung der realen Umgebung durch computergenerierte Sinnesreize verändert bzw. erweitert wird. Zur Erweiterung dieser „angereicherten Realität“ werden virtuelle Informationen wie z.B. 3D-Objekte, Grafiken und Videos in Echtzeit in Abbildern der realen Umgebung dargestellt. Die Erweiterungen helfen dem Anwender Aufgaben in der Realität auszuführen, da sie ihm Informationen bereitstellen, die er – ohne AR – nicht unmittelbar wahrnehmen könnte. Die Zielsetzung ist, dem Benutzer den Eindruck zu vermitteln, dass die reale Umgebung und die virtuellen Objekte koexistent miteinander verschmelzen. Für AR-Anwendungen existieren zahlreiche potenzielle Einsatzgebiete, doch verhindern bisher einige Probleme die Verbreitung dieser Technologie. Einer breiten Nutzung von AR-Anwendungen steht beispielsweise die Problematik gegenüber, dass deren Erstellung hohe programmiertechnische Anforderungen an die Entwickler stellt. Zur Verminderung dieser Probleme ist es wünschenswert Benutzern ohne Programmierkenntnisse (Autoren) die Entwicklung von AR-Anwendungen zu ermöglichen. Zum anderen bestehen technologische Probleme bei den für die Registrierung der virtuellen Objekte essenziellen Trackingverfahren. Weiterhin weisen die bisherigen AR-Anwendungen im Allgemeinen und die mittels autorenorientierter Systeme erstellten AR-Applikationen im Besonderen Defizite bezüglich der Authentizität der Darstellungen auf. Dabei sind hauptsächlich inkorrekte Verdeckungen und unrealistische Schatten bei den virtuellen Objekten verantwortlich für den Verlust des Koexistenzeindrucks. In dieser Arbeit wird unter Berücksichtigung der Trackingprobleme und auf Basis von Analysen, die die wichtigsten Authentizitätskriterien bestimmen, ein Konzept zur authentischen Integration von virtuellen Objekten in AR-Anwendungen erarbeitet und dargelegt. Auf diesem Integrationsprozess basierend werden Konzepte für Werkzeuge mit grafischen Benutzungsschnittstellen abgeleitet, mit denen Autoren die Erstellung von AR-Anwendungen mit hoher Darstellungsauthentizität ermöglicht wird. Einerseits verfügen die mit diesen Werkzeugen erstellten AR-Anwendungen über eine verbesserte Registrierung der virtuellen Objekte. Andererseits stellen die Werkzeuge Lösungen bereit, damit die virtuellen Objekte der AR-Anwendungen korrekte Verdeckungen aufweisen und über Schatten und Schattierungseffekte verfügen, die mit der tatsächlichen Beleuchtungssituation der realen Umgebung übereinstimmen. Sämtliche dieser Autorenwerkzeuge basieren auf einem in dieser Arbeit dargelegten Prinzip, bei dem die authentische Integration mittels leicht verständlicher bzw. wenig komplexer Arbeitsschritte und auf Basis der Verwendung einer Bildsequenz der realen Zielumgebung stattfindet. Die Konzepte dieser Arbeit werden durch die Implementierung der Autorenwerkzeuge validiert. Dabei zeigt sich, dass die Konzepte technisch umsetzbar sind. Die Evaluierung basiert auf der Gegenüberstellung eines in dieser Arbeit entwickelten Anforderungskatalogs und verdeutlicht die Eignung des Integrationsprozesses und der davon abgeleiteten Konzepte der Autorenwerkzeuge. Die Autorenwerkzeuge werden in eine bestehende, frei verfügbare AR-Autorenumgebung integriert.
Mukoviszidose oder zystische Fibrose (CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv Erbkrankheit in der westlichen Welt. Sie wird durch Mutationen in einem Gen verursacht, das den „Cystic Fibrosis Transmembran Conductance Regulator“ (CFTR) kodiert. Das CFTR-Protein ist zum einen ein epithelialer Chloridkanal, zum anderen aber auch ein Regulator zahlreicher anderer epithelialer Ionenkanäle und Transporter. Der Ausfall des CFTR-Proteins verursacht eine Multiorganerkrankung, bei der vorwiegend sekretorische Funktionen beeinträchtigt sind. Besonders betroffen sind Lunge und Pankreas, wobei die Beteiligung der Lunge maßgeblich für die Ausprägung der Erkrankung und deren Letalität ist. Die Mehrzahl der Patienten leidet unter rezidivierenden bronchopulmonalen Infektionen und einer exzessiven pulmonalen Inflammation. Einen wesentlichen Beitrag zur Zerstörung der Lunge liefern dabei jedoch körpereigene neutrophile Granulozyten, die in großer Zahl in die Lunge eindringen, ohne jedoch den Erreger beseitigen zu können. Neuere Studien lassen darauf schließen, dass neben den neutrophilen Granulozyten auch Lymphozyten eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. Entzündungsmarker wie Zytokine und Eicosanoide sind nicht nur lokal in den Atemwegen erhöht, sondern auch systemisch, was auf einen generalisierten Entzündungsstatus hinweist. Die Ursache der gestörten Immunantwort bei CF sind immer noch unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen. Das Ziel unserer Studien war die vergleichende Untersuchung der Expression und Aktivität der Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPARs) sowie der 15-Lipoxygenase-1, einem Schlüsselenzym im Eicosanoidstoffwechsel, zwischen Patienten mit CF und gesunden Probanden. Da bekannt ist, dass PPARs sowie die 15-LO-1 in entzündlichen Prozessen regulatorische Funktionen besitzen, und man zudem annimmt, dass CF auf eine übermäßige Immunreaktion zurückzuführen ist, vermuten wir für PPARs bzw. 15-LO-1 ein verändertes Expressionsmuster. Eicosanoide sind wichtige Mediatoren und Modulatoren der inflammatorischen Antwort. Sie sind Derivate mehrfach ungesättigter Fettsäuren. Eine wichtige Rolle spielen sie bei der Thrombozytenaggregation, Kontraktion der glatten Muskulatur, Chemotaxis der Leukozyten, Zytokinproduktion, Schmerzübertragung sowie der Entstehung von Fieber. Einige Eicosanoide verursachen proinflammatorische, andere antiinflammatorische Aktionen, wiederum andere können beides verursachen. Arachidonsäure (AA), eine n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA), ist der Vorläufer für potente proinflammatorische Eicosanoide wie Prostaglandin E-2, Thromboxan A2 und Leukotrien B4 und ist in der Phospholipidschicht der Zellmembran gebunden. n-3 PUFA’s wie Docosahexaenoicsäure (DHA) und Eicosapentaensäure werden zu Eicosanoiden wie Prostaglandin E-3, Thromboxan A3 und Leukotrien B5 metabolisiert. DHA besitzt antiinflammatorische Eigenschaften, indem es mit AA um die Aufnahme/Verbindung in die Zellmembran konkurriert, dabei werden die AA Spiegel herunterreguliert. Veränderungen beim Stoffwechsel der Fettsäuren und Eisosanoide wurden bei CF-Patienten von verschiedenen Gruppen beschrieben. Zusätzlich zu dem erhöhten Spiegel proinflammatorischer Leukotriene in Atemwegen, Urin und Serum, wurden erniedrigte Spiegel von DHA im Plasma und übermäßige Freisetzung von AA aus der Zellmembran für CF beschrieben. Desweiteren wurden erhöhte Mengen membrangebundener AA und erniedrigte Mengen membrangebundener DHA in den von CF betroffenen Organen beschrieben. Veränderungen des Fettsäure-Haushalts sind von besonderem Interesse, weil sie die bei CF vorliegender Fehlregulation inflammatorischer Prozesse erklären könnten. Sie sind auch natürliche Liganden von Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren und darüber hinaus an der Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind drei unterschiedliche PPAR-Isoformen identifiziert, PPAR alpha, beta und gamma. Sie sind Transkriptionsfaktoren, die zu der Superfamilie der nukleäreren Rezeptoren gehören, und werden durch endogene Liganden wie Fettsäuren und Eicosanoide aktiviert. Es wurde gezeigt, dass PPARalpha und –gamma antiinflammatorische Aktivität besitzen, die auf Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, glatte Muskelzellen und Endothellzellen wirkt. Ein Modell dazu ist eine durch PPARalpha und -gamma vermittelte Hemmung der proinflammatorischen Eigenschaften des nuklearen Faktor-kappaB (NF-kappaB) und des aktivierenden Proteins-1 (AP-1). Beides sind Transkriptionsfaktoren, die eine Schlüsselrolle bei der inflammatorischen Antwort spielen, indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktoren veranlassen. Die PPARs werden unter anderem in peripheren Blutzellen exprimiert. Da die Spiegel einiger endogener Aktivatoren der PPARs bei CF verändert zu sein scheinen, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Einfluss auf Expression und Funktion der PPARs untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Patienten mit CF untersucht, die sich in einem stabilen Zustand befanden und im Rahmen von Routineuntersuchungen in die Klinik kamen. Da die CF-Patienten in unserer Klinik nicht bronchoskopiert werden, konnte kein Versuchsmaterial aus den Atemwegen gewonnen werden. Dennoch gehen wir aufgrund der erhöhten Entzündungsmarker im Blut der CF-Patienten davon aus, dass die Entzündungsreaktionen nicht auf den Respirationstrakt beschränkt sind. Auch in unserer Studie zeigten sich erhöhte IL-8 Spiegel im Plasma von Patienten mit CF. Dies unterstützt die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen und weist auf systemische proinflammatorische Vorgänge hin. Das Blut wurde über Venenpunktion erhalten. Monozyten, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten wurden isoliert und untersucht, da sie aufgrund der Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen und durch die Produktion von Antikörpern, wichtige Mediatoren in der Immunantwort sind. Die PPAR mRNA Expression wurde in Monozyten und Lymphozyten mittels RT-kompetitiver Multiplex PCR gemessen und mittels RT-Real-time PCR in neutrophilen Granulozyten. Die PPARgamma Spiegel in diesen Zellen lagen unterhalb der Nachweisgrenze. Die statistische Analyse zeigte dass in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Gesunden PPARalpha mRNA, aber nicht PPARbeta mRNA, signifikant erniedrigt exprimiert wird (-37%). Die gleiche Differenz konnte auf Proteinebene mit Hilfe von Western Blots detektiert werden. Hinsichtlich der Expression von PPARalpha und PPARbeta zeigten sich in Monozyten und Neutrophilen zwischen CF-Patienten und Gesunden keine signifikanten Unterschiede. Unseren Daten werden von verschiedenen Studien unterstützt. Zum ersten gibt es Hinweise, dass PPARalpha mRNA- und Protein-Expression von ihren eigenen Liganden direkt reguliert werden. Bei Patienten mit CF zeigen sich für die natürlichen Liganden, Eicosanoide und Fettsäuren, veränderte Spiegel, was zu einer verringerten Expression von PPARalpha beitragen könnte. Zum zweiten, da bekannt ist, dass die PPARalpha-Expression in proinflammatorisch aktivierten T-Lymphozyten herunterreguliert ist, wurde zusätzlich überprüft, ob die Lymphozyten von CF-Patienten aktiviert sind. Interleukin-2 Rezeptor im Serum (sIL-2 R) ist ein allgemein anerkannter Marker der Aktivierung von Lymphozyten. Tatsächlich zeigte sich, dass die Konzentration von sIL-2 R im Serum der vorliegenden CF Patienten erhöht ist, was mit den Erkenntnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt 128-130. Die verstärkte Aktivierung von Lymphozyten in CF-Patienten könnte eine Erklärung für die erniedrigten PPARalpha-Spiegel bieten. Der verantwortliche Mechanismus dafür ist bis jetzt noch nicht bekannt. Drittens wurde für die proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-alpha und IL-1 gezeigt, dass sie eine Reduktion der PPARalpha Expression verursachen können. CF-Patienten zeigen erhöhte Spiegel von IL-2, TNF-alpha, IL-6 und IL-8 im Sputum und Serum. Konsequenterweise kann die PPARalpha Expression durch die erhöhten Zytokinspiegel im Serum herunter reguliert werden. Eine weitere Unterstützung der vorliegenden Ergebnisse ergibt sich aus einem Kongressbeitrag von Andersson et al., die über eine epitheliale CF-Zelllinie berichten, die weniger PPARalpha-Protein exprimiert als eine normale epitheliale Zelllinie. Dieselbe Forschungsgruppe fand erniedrigte PPARgamma-Spiegel im CF-Maus-Modell in Geweben, die speziell durch CFTR reguliert werden und ihre Daten weisen darauf hin, dass CFTR eine Rolle bei der PPAR Expression spielen kann. Ein funktionales CFTR-Protein wird auch in Lymphozyten von Gesunden exprimiert. Folglich könnte ein defektes CFTR auch in CF-Lymphozyten für die veränderterte PPARalpha-Expression verantwortlich sein. Ob die beschriebene Veränderung der Menge an PPARalpha mRNA und Protein auch auf funktioneller Ebene zum Tragen kommt, wurde durch immunhistometrische Untersuchungen und die Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors überprüft. Die immunhistometrischen Untersuchungen zeigten, dass PPARalpha sowohl bei Gesunden als auch bei CF-Patienten hauptsächlich im Cytosol lokalisiert ist und dass sich nur ein kleiner Teil im Nukleus befindet. Eine Quantifizierung war hierbei nicht möglich. Über eine ähnliche zelluläre Verteilung wurde in humanen Makrophagen wie auch in Mäuselymphozyten berichtet. Die DNA-Bindungstudien zeigten, dass die PPARalpha DNA-Bindungsaktivität in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Kontrollpersonen um 36% signifikant erniedrigt war. Eine erniedrigte DNA-Bindungsaktivität bei CFTR knock-out Mäuse wurde auch für PPARgamma berichtet. Die Bindungsaktivität konnte wiederhergestellt werden, nachdem die Mäuse mit Troglitazon, einem PPARgamma Agonist, behandelt wurden. Darüber hinaus werden mit hoher Wahrscheinlichkeit auch die Veränderungen des Eicosanoidhaushalts bei CF zu der Verminderung sowohl der Expression als auch der Aktivität von PPARalpha beitragen. Hier ist besonders die bei CF verminderter Menge des PPARalpha–Liganden DHA hervorzuheben. Eine ligandeninduzierte Aktivierung von PPARalpha führt zu einer Abnahme verschiedener proinflammatorische Zytokine in Lymphozyten. Dies geschieht vermutlich über eine Antagonisierung der Aktivität von NF-kappaB. PPARalpha hat einen signifikanten Einfluss auf die Immunantwort. Somit könnte die bei CF-Patienten verminderte PPARalpha-Expression und -Funktion ursächlich oder mitverantwortlich für die inflammatorischen Vorgänge bei CF sein. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Regulierung der Aktivität von PPARalpha durch die Zugabe von DHA oder andere Liganden eine sinnvolle Therapieoption sein kann. Es sollte in weiterführenden Versuchen geklärt werden, ob eine Therapie mit PPARalpha-Aktivatoren einen Einfluss auf die inflammatorischen Vorgänge bei CF haben kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht ob CF einen Defekt in der Expression von 15-Lipoxygenase-1 (15-LO-1) verursacht. 15-LO-1 ist ein Schlüsselenzym für die Synthese einiger Eicosanoide wie z.B. 15(S)-HETE und Lipoxin A4. Beide Eicosanoide spielen eine wichtige Rolle in inflammatorischen Vorgängen in der menschlichen Lunge. 15(S)-HETE ist ein von der Arachidonsäure abgeleitetes Eicosanoid, das sich in hoher Konzentration in eosinophilen Granulozyten und Atemwegsepithelien findet. 15(S)-HETE wirkt in den Atemwegen stark mukosekretolytisch und bronchokonstriktorisch. Zum anderen inhibiert 15(S)-HETE die durch die 5-Lipoxygenase katalysierte Konversion von Arachidonsäure zu proinflammatorischen Mediatoren wie LTB4 in neutrophilen Granulozyten. Dies führt zu einer Reduktion der neutrophilen Chemotaxis. Es liegen bisher keine Daten zu 15-HETE-Spiegel in der CF-Lunge vor. Lipoxin A4 verursacht ebenfalls eine Reduktion der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, supprimiert darüber hinaus aber schon deren Aktivierung. Neben einer direkten Wirkung auf die neutrophilen Granulozyten, sind dabei auch indirekte Effekte beteiligt, wie zum Beispiel die Reduktion der broncho-epithelialen Ausschüttung von IL-8, als einem potenten Chemoattraktor und Aktivator neutrophiler Granulozyten. Tatsächlich ist die Konzentration des anti-inflammatorisch wirksamen LXA4 in der Atemwegsflüssigkeit von CF-Patienten reduziert. Die Expression von15-LO-1 in peripheren Blutzellen ist im Wesentlichen auf die eosinophilen Granulozyten beschränkt. Deren Mukoviszidose oder zystische Fibrose (CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv Erbkrankheit in der westlichen Welt. Sie wird durch Mutationen in einem Gen verursacht, das den „Cystic Fibrosis Transmembran Conductance Regulator“ (CFTR) kodiert. Das CFTR-Protein ist zum einen ein epithelialer Chloridkanal, zum anderen aber auch ein Regulator zahlreicher anderer epithelialer Ionenkanäle und Transporter. Der Ausfall des CFTR-Proteins verursacht eine Multiorganerkrankung, bei der vorwiegend sekretorische Funktionen beeinträchtigt sind. Besonders betroffen sind Lunge und Pankreas, wobei die Beteiligung der Lunge maßgeblich für die Ausprägung der Erkrankung und deren Letalität ist. Die Mehrzahl der Patienten leidet unter rezidivierenden bronchopulmonalen Infektionen und einer exzessiven pulmonalen Inflammation. Einen wesentlichen Beitrag zur Zerstörung der Lunge liefern dabei jedoch körpereigene neutrophile Granulozyten, die in großer Zahl in die Lunge eindringen, ohne jedoch den Erreger beseitigen zu können. Neuere Studien lassen darauf schließen, dass neben den neutrophilen Granulozyten auch Lymphozyten eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. Entzündungsmarker wie Zytokine und Eicosanoide sind nicht nur lokal in den Atemwegen erhöht, sondern auch systemisch, was auf einen generalisierten Entzündungsstatus hinweist. Die Ursache der gestörten Immunantwort bei CF sind immer noch unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen. Das Ziel unserer Studien war die vergleichende Untersuchung der Expression und Aktivität der Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPARs) sowie der 15-Lipoxygenase-1, einem Schlüsselenzym im Eicosanoidstoffwechsel, zwischen Patienten mit CF und gesunden Probanden. Da bekannt ist, dass PPARs sowie die 15-LO-1 in entzündlichen Prozessen regulatorische Funktionen besitzen, und man zudem annimmt, dass CF auf eine übermäßige Immunreaktion zurückzuführen ist, vermuten wir für PPARs bzw. 15-LO-1 ein verändertes Expressionsmuster. Eicosanoide sind wichtige Mediatoren und Modulatoren der inflammatorischen Antwort. Sie sind Derivate mehrfach ungesättigter Fettsäuren. Eine wichtige Rolle spielen sie bei der Thrombozytenaggregation, Kontraktion der glatten Muskulatur, Chemotaxis der Leukozyten, Zytokinproduktion, Schmerzübertragung sowie der Entstehung von Fieber. Einige Eicosanoide verursachen proinflammatorische, andere antiinflammatorische Aktionen, wiederum andere können beides verursachen. Arachidonsäure (AA), eine n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA), ist der Vorläufer für potente proinflammatorische Eicosanoide wie Prostaglandin E-2, Thromboxan A2 und Leukotrien B4 und ist in der Phospholipidschicht der Zellmembran gebunden. n-3 PUFA’s wie Docosahexaenoicsäure (DHA) und Eicosapentaensäure werden zu Eicosanoiden wie Prostaglandin E-3, Thromboxan A3 und Leukotrien B5 metabolisiert. DHA besitzt antiinflammatorische Eigenschaften, indem es mit AA um die Aufnahme/Verbindung in die Zellmembran konkurriert, dabei werden die AA Spiegel herunterreguliert. Veränderungen beim Stoffwechsel der Fettsäuren und Eisosanoide wurden bei CF-Patienten von verschiedenen Gruppen beschrieben. Zusätzlich zu dem erhöhten Spiegel proinflammatorischer Leukotriene in Atemwegen, Urin und Serum, wurden erniedrigte Spiegel von DHA im Plasma und übermäßige Freisetzung von AA aus der Zellmembran für CF beschrieben. Desweiteren wurden erhöhte Mengen membrangebundener AA und erniedrigte Mengen membrangebundener DHA in den von CF betroffenen Organen beschrieben. Veränderungen des Fettsäure-Haushalts sind von besonderem Interesse, weil sie die bei CF vorliegender Fehlregulation inflammatorischer Prozesse erklären könnten. Sie sind auch natürliche Liganden von Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren und darüber hinaus an der Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind drei unterschiedliche PPAR-Isoformen identifiziert, PPAR alpha, bera und gamma. Sie sind Transkriptionsfaktoren, die zu der Superfamilie der nukleäreren Rezeptoren gehören, und werden durch endogene Liganden wie Fettsäuren und Eicosanoide aktiviert. Es wurde gezeigt, dass PPARalpha und –gamma antiinflammatorische Aktivität besitzen, die auf Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, glatte Muskelzellen und Endothellzellen wirkt. Ein Modell dazu ist eine durch PPARalpha und -gamma vermittelte Hemmung der proinflammatorischen Eigenschaften des nuklearen Faktor-kappaB (NF-kappaB) und des aktivierenden Proteins-1 (AP-1). Beides sind Transkriptionsfaktoren, die eine Schlüsselrolle bei der inflammatorischen Antwort spielen, indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktoren veranlassen. Die PPARs werden unter anderem in peripheren Blutzellen exprimiert. Da die Spiegel einiger endogener Aktivatoren der PPARs bei CF verändert zu sein scheinen, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Einfluss auf Expression und Funktion der PPARs untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Patienten mit CF untersucht, die sich in einem stabilen Zustand befanden und im Rahmen von Routineuntersuchungen in die Klinik kamen. Da die CF-Patienten in unserer Klinik nicht bronchoskopiert werden, konnte kein Versuchsmaterial aus den Atemwegen gewonnen werden. Dennoch gehen wir aufgrund der erhöhten Entzündungsmarker im Blut der CF-Patienten davon aus, dass die Entzündungsreaktionen nicht auf den Respirationstrakt beschränkt sind. Auch in unserer Studie zeigten sich erhöhte IL-8 Spiegel im Plasma von Patienten mit CF. Dies unterstützt die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen und weist auf systemische proinflammatorische Vorgänge hin. Das Blut wurde über Venenpunktion erhalten. Monozyten, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten wurden isoliert und untersucht, da sie aufgrund der Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen und durch die Produktion von Antikörpern, wichtige Mediatoren in der Immunantwort sind. Die PPAR mRNA Expression wurde in Monozyten und Lymphozyten mittels RT-kompetitiver Multiplex PCR gemessen und mittels RT-Real-time PCR in neutrophilen Granulozyten. Die PPARgamma Spiegel in diesen Zellen lagen unterhalb der Nachweisgrenze. Die statistische Analyse zeigte dass in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Gesunden PPARalpha mRNA, aber nicht PPARbeta mRNA, signifikant erniedrigt exprimiert wird (-37%). Die gleiche Differenz konnte auf Proteinebene mit Hilfe von Western Blots detektiert werden. Hinsichtlich der Expression von PPARalpha und PPARbeta zeigten sich in Monozyten und Neutrophilen zwischen CF-Patienten und Gesunden keine signifikanten Unterschiede. Unseren Daten werden von verschiedenen Studien unterstützt. Zum ersten gibt es Hinweise, dass PPARalpha mRNA- und Protein-Expression von ihren eigenen Liganden direkt reguliert werden. Bei Patienten mit CF zeigen sich für die natürlichen Liganden, Eicosanoide und Fettsäuren, veränderte Spiegel, wass zu einer verringerte Expression von PPARalpha beitragen könnte. Zum zweiten, da bekannt ist, dass die PPARalpha-Expression in proinflammatorisch aktivierten T-Lymphozyten herunterreguliert ist, wurde zusätzlich überprüft, ob die Lymphozyten von CF-Patienten aktiviert sind. Interleukin-2 Rezeptor im Serum (sIL-2 R) ist ein allgemein anerkannter Marker der Aktivierung von Lymphozyten. Tatsächlich zeigte sich, dass die Konzentration von sIL-2 R im Serum der vorliegenden CF Patienten erhöht ist, was mit den Erkenntnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt 128-130. Die verstärkte Aktivierung von Lymphozyten in CF-Patienten könnte eine Erklärung für die erniedrigten PPARalpha-Spiegel bieten. Der verantwortliche Mechanismus dafür ist bis jetzt noch nicht bekannt. Drittens wurde für die proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-alpha und IL-1 gezeigt, dass sie eine Reduktion der PPARalpha Expression verursachen können. CF-Patienten zeigen erhöhte Spiegel von IL-2, TNF-alpha, IL-6 und IL-8 im Sputum und Serum. Konsequenterweise kann die PPARalpha Expression durch die erhöhten Zytokinspiegel im Serum herunter reguliert werden. Eine weitere Unterstützung der vorliegenden Ergebnisse ergibt sich aus einem Kongressbeitrag von Andersson et al., die über eine epitheliale CF-Zelllinie berichten, die weniger PPARalpha-Protein exprimiert als eine normale epitheliale Zelllinie. Dieselbe Forschungsgruppe fand erniedrigte PPARgamma-Spiegel im CF-Maus-Modell in Geweben, die speziell durch CFTR reguliert werden und ihre Daten weisen darauf hin, dass CFTR eine Rolle bei der PPAR Expression spielen kann. Ein funktionales CFTR-Protein wird auch in Lymphozyten von Gesunden exprimiert. Folglich könnte ein defektes CFTR auch in CF-Lymphozyten für die veränderterte PPARalpha-Expression verantwortlich sein. Ob die beschriebene Veränderung der Menge an PPARalpha mRNA und Protein auch auf funktioneller Ebene zum Tragen kommt, wurde durch immunhistometrische Untersuchungen und die Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors überprüft. Die immunhistometrischen Untersuchungen zeigten, dass PPARalpha sowohl bei Gesunden als auch bei CF-Patienten hauptsächlich im Cytosol lokalisiert ist und dass sich nur ein kleiner Teil im Nukleus befindet. Eine Quantifizierung war hierbei nicht möglich. Über eine ähnliche zelluläre Verteilung wurde in humanen Makrophagen wie auch in Mäuselymphozyten berichtet. Die DNA-Bindungstudien zeigten, dass die PPARalpha DNA-Bindungsaktivität in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Kontrollpersonen um 36% signifikant erniedrigt war. Eine erniedrigte DNA-Bindungsaktivität bei CFTR knock-out Mäuse wurde auch für PPARgamma berichtet. Die Bindungsaktivität konnte wiederhergestellt werden, nachdem die Mäuse mit Troglitazon, einem PPARgamma Agonist, behandelt wurden. Darüber hinaus werden mit hoher Wahrscheinlichkeit auch die Veränderungen des Eicosanoidhaushalts bei CF zu der Verminderung sowohl der Expression als auch der Aktivität von PPARalpha beitragen. Hier ist besonders die bei CF verminderter Menge des PPARalpha–Liganden DHA hervorzuheben. Eine ligandeninduzierte Aktivierung von PPARalpha führt zu einer Abnahme verschiedener proinflammatorische Zytokine in Lymphozyten. Dies geschieht vermutlich über eine Antagonisierung der Aktivität von NF-kappaB. PPARalpha hat einen signifikanten Einfluss auf die Immunantwort. Somit könnte die bei CF-Patienten verminderte PPARalpha-Expression und -Funktion ursächlich oder mitverantwortlich für die inflammatorischen Vorgänge bei CF sein. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Regulierung der Aktivität von PPARalpha durch die Zugabe von DHA oder andere Liganden eine sinnvolle Therapieoption sein kann. Es sollte in weiterführenden Versuchen geklärt werden, ob eine Therapie mit PPARalpha-Aktivatoren einen Einfluss auf die inflammatorischen Vorgänge bei CF haben kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht ob CF einen Defekt in der Expression von 15-Lipoxygenase-1 (15-LO-1) verursacht. 15-LO-1 ist ein Schlüsselenzym für die Synthese einiger Eicosanoide wie z.B. 15(S)-HETE und Lipoxin A4. Beide Eicosanoide spielen eine wichtige Rolle in inflammatorischen Vorgängen in der menschlichen Lunge. 15(S)-HETE ist ein von der Arachidonsäure abgeleitetes Eicosanoid, das sich in hoher Konzentration in eosinophilen Granulozyten und Atemwegsepithelien findet. 15(S)-HETE wirkt in den Atemwegen stark mukosekretolytisch und bronchokonstriktorisch. Zum anderen inhibiert 15(S)-HETE die durch die 5-Lipoxygenase katalysierte Konversion von Arachidonsäure zu proinflammatorischen Mediatoren wie LTB4 in neutrophilen Granulozyten. Dies führt zu einer Reduktion der neutrophilen Chemotaxis. Es liegen bisher keine Daten zu 15-HETE-Spiegel in der CF-Lunge vor. Lipoxin A4 verursacht ebenfalls eine Reduktion der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, supprimiert darüber hinaus aber schon deren Aktivierung. Neben einer direkten Wirkung auf die neutrophilen Granulozyten, sind dabei auch indirekte Effekte beteiligt, wie zum Beispiel die Reduktion der broncho-epithelialen Ausschüttung von IL-8, als einem potenten Chemoattraktor und Aktivator neutrophiler Granulozyten. Tatsächlich ist die Konzentration des anti-inflammatorisch wirksamen LXA4 in der Atemwegsflüssigkeit von CF-Patienten reduziert. Die Expression von15-LO-1 in peripheren Blutzellen ist im Wesentlichen auf die eosinophilen Granulozyten beschränkt. Deren Funktion ist bei der zystischen Fibrose ebenfalls verändert: in CF Serum und Sputum misst man erhöhte Spiegel an eosinophilen granulären Proteinen, obwohl die Anzahl der Eosinophilen normal ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob im Rahmen der zystischen Fibrose Veränderungen der Expression der 15-LO vorliegen. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten nach der statistischen Auswertung, dass die intrazelluläre Expression der 15-LO-1 in eosinophilen Granulozyten von CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen keine Unterschiede aufweist. Dies schliesst nicht aus, dass Unterschiede der 15-LO-1 Expression zwischen CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen im Atemwegsepithel zu finden wären, weil, eine erhöhte Expression der 15-LO-1 bei chronischer Bronchitis und Asthma bronchiale wurde beschrieben. Patientenmaterial für das Atemwegsepithel war jedoch nicht zugänglich und wurde von daher nicht untersucht.Funktion ist bei der zystischen Fibrose ebenfalls verändert: in CF Serum und Sputum misst man erhöhte Spiegel an eosinophilen granulären Proteinen, obwohl die Anzahl der Eosinophilen normal ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob im Rahmen der zystischen Fibrose Veränderungen der Expression der 15-LO vorliegen. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten nach der statistischen Auswertung, dass die intrazelluläre Expression der 15-LO-1 in eosinophilen Granulozyten von CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen keine Unterschiede aufweist. Dies schliesst nicht aus, dass Unterschiede der 15-LO-1 Expression zwischen CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen im Atemwegsepithel zu finden wären, weil, eine erhöhte Expression der 15-LO-1 bei chronischer Bronchitis und Asthma bronchiale wurde beschrieben. Patientenmaterial für das Atemwegsepithel war jedoch nicht zugänglich und wurde von daher nicht untersucht.
G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest membrane protein family and play an essential role in signal transduction through the cell membrane. They are currently the targets of approximately 50 % of the pharmaceuticals on the market (Klabunde and Hessler, 2002). However, only one high-resolution GPCR structure has been determined up to now, that of bovine rhodopsin (Palczewski et al., 2000). The GPCR activation and regulation mechanisms are still unknown and other GPCR structures are thus required. MePNet (Membrane Protein Network) was a European consortium dedicated to structural studies of GPCRs. The approach was to produce 100 GPCRs in three expression systems (Escherichia coli, Pichia pastoris and Semliki Forest Virus infected mammalian cells) in order to select at each step of the process (production, solubilization, purification) the constructs that fulfilled quantity and quality (functionality) requirements for crystallization trials. In our team, we screened 38 of the 100 targets in P. pastoris. For each receptor, the clone with the highest production level was identified by dot-blot. The size and homogeneity of each receptor were then analyzed by Western-blot. The human adenosine A2A receptor showed a well-defined and pronounced single band and was thus selected for further characterization. The adenosine A2A receptor is a GPCR mainly localized in the central nervous system and, as it antagonizes dopaminergic activity, it has great potential as a drug target for the treatment of Parkinson’s disease. Functional characterization by binding assays with the specific antagonist [3H]-ZM241385 demonstrated a Bmax of 56 +/- 3 pmol/mg i.e. pmol of binder per milligram of total membrane protein, and a KD of 0.40 +/- 0.02 nM. Receptor production was then improved by lowering the induction temperature, decreasing the induction time and adding DMSO to the medium. For large-scale production, fermention reached around 300 g cells (wet weight)/L culture, which provided 43 mg of functional receptor in membranes per liter of culture. Functional solubilization was achieved with dodecyl-β-D-maltoside and the soluble yield was increased to 70-80 % of the membrane content by addition of cholesteryl hemisuccinate and increasing the ionic strength. The receptor was successfully purified via Ni-NTA and monomeric avidin chromatography in the presence of the antagonist ZM241385. This strategy produced a pure, homogeneous and stable receptor preparation with functionality demonstrated by radioligand binding assays. The total receptor yield after purification was routinely around 20 % of the membrane functional receptor content and 2 g of membranes provided 4 mg of pure receptor for crystallization trials. GPCRs are very difficult targets for crystallization, and co-crystallization with antibody fragments has been shown to be a successful method for crystallization of membrane proteins. In order to develop such a tool for the adenosine A2A receptor, a single-chain Fv (scFv) fragment specific to the purified receptor was selected by phage display. The receptor was functionally immobilized on the surface of streptavidin beads and after two rounds of selection, 6 different phages were identified several times. After production in E. coli and purification via Ni-NTA affinity chromatography, 4 out of the 6 scFv fragments were sufficiently enriched to be tested by ELISA. For the ELISA, the receptor was functionally immobilized via the biotinylation domain of the construct in a 96-well streptavidin-coated plate. The antibody fragments binding to the receptor were identified based on interaction with HRP-conjugated protein L. One scFv fragment gave a positive ELISA signal 10 fold above background and titration of the scFv fragment binding to the receptor was specific and saturable. However no complex of scFv fragment and receptor was observed on gel filtration. In order to have a more sensitive detection method, the scFv fragment was labeled with fluorescein: a complex was then observed up on gel filtration but the binding appeared to be non-specific. A pull-down assay with immobilized non-labeled scFv fragment finally confirmed the specificity of the binding, but also the low affinity of the interaction. Affinity maturation of this specific scFv fragment by a random mutagenesis and selection process should improve this parameter in order to obtain an adapted tool for co-crystallization.
Anhand einer osmotischen Auffschlussmethode für B. subtilis konnte ohne Zugabe von Detergenzien erreicht werden, dass die beiden Modifikationsproteine SpaB und SpaC in löslicher Form vorliegen. Demzufolge handelt es sich bei dem Subtilin-Synthetase-Komplex nicht um einen starren membranständigen Komplex, sondern um eine transiente Assoziation der SpaB/C-Proteine mit dem Transportprotein SpaT während der Modifikationsreaktion. Durch Interaktionsstudien mit heterolog produzierten Subtilinpräpropeptid (SubHAHis) konnte eine spezifische Interaktion mit dem löslichen SpaC-Protein gezeigt werden. Komplementationsversuche zeigten, dass der DspaC amyE::spaS-Stamm durch das SpaCsowie das EriC-, jedoch nicht durch das NisC-Protein komplementiert wird. Ebenfalls ist ein C-terminal verkürztes bzw. verlängertes SpaC-Protein nicht in der Lage ist, Subtilin richtig zu modifizieren. Mit Hilfe einer in vitro Mutagenese der ligandierenden Aminosäuren Cystein 303, Cystein 349 und Histidin 350 konnte gezeigt werden, dass das Zink-Ion des SpaC-Proteins an der katalytischen Reaktion beteiligt ist. Beim Ausschalten der Aminosäuren Histidin 212 und Tyrosin 304 konnte ebenfalls ein Ausfall der Subtilinproduktion beobachtet werden. Es wäre denkbar, dass beide Aminosäuren in einer Säure/Base-Reaktion bei der Subtilinmodifikation involviert sein könnten. Die Aminosäure Tryptophan 302 hingegen bildet mit dem C-terminalen ALL-Motiv des Proteins ein hydrophobes Cluster, was eine Rolle beider Elemente in Stabilisation des Reaktionszentrums und Substratbindung nahe legt. Für das SubHAHis konnte gezeigt werden, dass es von der Modifikationsmaschinerie akzeptiert und auch produziert wird, jedoch entsteht ebenfalls ein Heterodimer zwischen dem SubHAHis und den Modifikationsproteinen SpaB und SpaC, an dessen Formation der Hexa-Histidin-Tag maßgeblich beteiligt ist. Eine mögliche Heterodimerformation im Subtilinproduzenten ATCC 6633 konnte unter bestimmten Bedingungen ebenfalls nachgewiesen werden, was auf eine mögliche kovalente Zwischenstufe bei der Lanthioninbrückenbildung hinweist. Des Weiteren konnte durch in vitro Mutagenese-Studien gezeigt werden, dass die katalytische Reaktion des SpaC-Proteins an der Heterodimerformation beteiligt ist. Das SpaC-SubHAHis Heterodimer konnte erfolgreich angereichert und mittels Peptidmassenkartierung eindeutig als kovalentes Heterodimer zwischen den beiden Proteinen identifiziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass bei der Modifikation des Subtilinpräpropeptids durch das SpaC-Protein eine transiente kovalente Bindung zwischen dem Präpropeptid und dem SpaCProtein ausgebildet wird. Die Bildung eines möglichen Heterodimers zwischen SpaC und dem Subtilinpräpropeptid konnte ebenfalls unter bestimmten Bedingungen beim Wildtyp nachgewiesen werden. Dieser Befund legt nahe, dass es sich bei der Heterodimerbildung um eine katalytische Zwischenstufe bei der Modifikation des Präpropeptids durch das SpaC handeln könnte, welches durch die Anwesenheit des Hexa-Hisitidin-Tags arretiert wird. Neben dem bekannten Subtilinproduzenten B. subtilis ATCC 6633 konnten weitere Stämme der W23-Untergruppe der Spezies B. subtilis als Subtilinproduzenten identifiziert werden, was impliziert, dass ein Merkmal der W23-Gruppe die Produktion von Subtilin ist und diese als Biomarker dienen könnte. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass ein um die Aminosäuren Glycin und Serin C-terminal verlängertes Subtilin (Subtilin-GS) eine gesteigerte Subtilin-Autoinduktion hervorruft. Durch die Zugabe von Mangan zu einer Subtilin-Produzierenden Kultur konnte ebenfalls gezeigt werden, dass das Mangan alleine einen steigernden Einfluss auf die Induktion des PspaB-Promotors besitzt, während eine gesteigerte Aktivität des PspaS-Promotors nur bei der gleichzeitigen Anwesenheit von Subtilin beobachtet werden konnte. Durch die gezielte Zugabe von Mangan und Subtilin-GS ist es dementsprechend möglich, eine erhöhte Autoinduktion und somit eine erhöhte Produktion an Subtilin zu erreichen.
Das aktuell diskutierte Modell der lichtabhängigen Magnetrezeption bei Vögeln beschreibt, dass die Richtung des Erdmagnetfelds durch Radikalpaarprozesse in spezialisierten Photorezeptoren wahrgenommen wird. Dabei werden Cryptochrome, eine Klasse photoaktiver Flavoproteine, als potentielle Kandidaten für das Radikalpaarmodell und damit als mögliches Magnetrezeptormolekül diskutiert. Verhaltensbiologische Experimente mit Zugvögeln zeigen, dass der Magnetrezeptionsprozess offensichtlich stark lateralisiert im rechten Auge stattfindet und dass dieser Prozess Licht aus dem blau-grünen Teil des Spektrums benötigt. Cryptochrome absorbieren Licht in diesem Bereich und besitzen darüber hinaus biochemische Eigenschaften, die für die Funktion des Radikalpaarmodells entscheidend sind. Vor dem Hintergrund dieser Überlegungen habe ich untersucht, ob Cryptochrom (CRY) in der Retina des Rotkehlchens, Erithacus rubecula, einem nachtziehenden Singvogel, zu finden ist. Mit molekulargenetischen Methoden konnte ich erstmals drei individuell exprimierte Cryptochrome aus der Rotkehlchenretina isolieren: Erithacus (e)-CRY1a, -CRY1b und -CRY2. Während eCRY1a und eCRY2 fast vollständig homolog zu Cryptochrom 1 und 2 in der Retina des Haushuhns sind, besitzt eCRY1b eine noch unbeschriebene C-terminale Domäne, die auf neue Proteinbindungseigenschaften und Interaktionspartner hindeutet. Die Identifizierung eines Kernlokalisierungssignals bei eCRY2 weist auf dessen Lokalisierung im Zellkern hin und macht seine Funktion als sensorischer Lichtrezeptor eher unwahrscheinlich. Ein mit Hilfe der Aminosäurensequenz erstelltes Proteinmodell von eCRY1 zeigt, dass dieser Typus zwei Cofaktoren besitzt: das katalytische Chromophor Flavinadenindinukleotid (FAD) und das lichtsammelnde Pterin Methenyltetrahydrofolat (MTHF). eCRY1a und eCRY1b sind Spleißprodukte des gleichen Gens; ihre C-terminalen Domänen sind auf unterschiedlichen Exonen codiert. eCRY1a und eCRY1b besitzen beide keine Membranbindedomäne und liegen zytosolisch vor. Weil jedoch laut Radikalpaartheorie die magnetosensitiven Rezeptoren zumindest im Moment der Photonenabsorption in einer bestimmten Anordnung und Raumrichtung vorliegen müssen, benötigen beide eCRY1-Varianten daher mindestens einen sphärisch fixierten Interaktionspartner. In meiner Arbeit diskutiere ich Opsine als mögliche Partner, da diese in den Aussensegmenten der Photorezeptoren stark geordnet und in konstanter Raumrichtung vorliegen. Die Genexpression von eCRY1a und eCRY1b unterscheidet sich sowohl zwischen den Augen als auch zwischen den CRY-Varianten. Im Mittel waren die Expressionswerte von eCRY1a in der Rotkehlchenretina fünf- bis zehnmal höher als die von eCRY1b. In der Dämmerung und nachts ist eCRY1a im linken Auge signifikant höher exprimiert als im rechten Auge. Im Gegensatz dazu ist die Expression von eCRY1b in beiden Augen gleich, zeigt jedoch einen signifikanten Anstieg zu Beginn des Zuges in der Dämmerung. Durch die unterschiedlichen Expressionsraten von eCRY1a und eCRY1b verschiebt sich zum Zeitpunkt der Richtungsentscheidung des Vogels in der Dämmerung das Verhältnis zwischen den beiden Cryptochrom1-Varianten im rechten Auge zugunsten von eCRY1b. Die Ergebnisse meiner Expressionsstudie deuten darauf hin, dass die in Verhaltensversuchen nachgewiesene Lateralisation des Magnetkompass bereits auf Rezeptorebene in der Retina beginnen könnte. mRNA in situ- als auch immunohistochemische Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass bei Zugvögeln sowohl die mRNA als auch die Proteine beider eCRY1-Typen in den Innensegmenten der retinalen Photorezeptoren lokalisiert sind. Die räumliche Nachbarschaft zu Opsinen unterstützt die Annahme einer möglichen Interaktion zwischen diesen und Cryptochrom. Darüber hinaus lässt dieser Befund Spekulationen zu, dass die neuronale Verarbeitung der aus den Photorezeptoren stammenden magnetischen Richtungsinformation analog zum bildverarbeitenden Sehen stattfinden könnte. Modelle für eine mögliche Verschaltung und Signalverarbeitung der Cryptochromsignale werden in dieser Arbeit diskutiert. Insgesamt unterstützen die Befunde meiner Arbeit die im Radikalpaarmodell diskutierte Annahme, dass Cryptochrome eine entscheidende Rolle bei der Perzeption von magnetischer Kompassinformation bei Zugvögeln spielen und möglicherweise als Magnetrezeptormoleküle fungieren. Darüber hinaus könnten die Ergebnisse einen wichtigen Beitrag zu einem besseren Verständnis des Gesamtprozesses der Magnetrezeption bei Tieren leisten, und zwar von der Rezeptorzelle bis zur Verhaltensantwort. Meine Ergebnisse tragen möglicherweise auch dazu bei, die bekannten neurowissenschaftlichen und funktionell morphologischen mit den entsprechenden ethologischen Ergebnissen zu verknüpfen. Ich würde es sehr begrüßen, wenn meine Arbeit zu weiterführender Forschung auf diesem spannenden Gebiet anregt und zu einem besseren Verständnis der noch unbekannten Aspekte der Magnetrezeption beitrüge.
A new technique for precision ion implantation has been developed. A scanning probe has been equipped with a small aperture and incorporated into an ion beamline, so that ions can be implanted through the aperture into a sample. By using a scanning probe the target can be imaged in a non-destructive way prior to implantation and the probe together with the aperture can be placed at the desired location with nanometer precision. In this work first results of a scanning probe integrated into an ion beamline are presented. A placement resolution of about 120 nm is reported. The final placement accuracy is determined by the size of the aperture hole and by the straggle of the implanted ion inside the target material. The limits of this technology are expected to be set by the latter, which is of the order of 10 nm for low energy ions. This research has been carried out in the context of a larger program concerned with the development of quantum computer test structures. For that the placement accuracy needs to be increased and a detector for single ion detection has to be integrated into the setup. Both issues are discussed in this thesis. To achieve single ion detection highly charged ions are used for the implantation, as in addition to their kinetic energy they also deposit their potential energy in the target material, therefore making detection easier. A special ion source for producing these highly charged ions was used and their creation and interactions with solids of are discussed in detail.
Die Entwicklung künstlicher Ribonucleasen bietet das Potential, Werkzeuge für die Biotechnologie und langfristig neuartige Pharmaka bereitzustellen. 2-Aminobenzimidazole haben sich als metallfreie Katalysatoren zur unspezifischen Spaltung von Ribonucleinsäuren bewährt. In der vorliegenden Arbeit sollte das Konzept von künstlichen Ribonucleasen auf Basis dieser Molekülklasse auf seine Tragfähigkeit gerprüft werden. Außerdem sollten weitere mechanistische Erkenntnisse über die Katalyse der RNA-Hydrolyse durch 2-Aminobenzimidazole gewonnen werden. Hierzu wurden kupplungsfähige 2-Aminobenzimidazol-Derivate hergestellt und anschließend an RNA-Liganden gekuppelt. Diese Konjugate wurden auf ihre Spaltaktivität gegenüber RNA bei physiologischen Bedingungen sowie auf ihre Substrat- und Ortsspezifität getestet. Zunächst wurden Tripeptidkonjugate synthetisiert und untersucht. Hierbei konnte eine gegenüber den unkonjugierten Spezies erhöhte Affinität der Konjugate zum Substrat festgestellt werden. Auch wurde gezeigt, dass 2-Aminobenzimidazole, die in wässriger Lösung zur Aggregation neigen, auch als Einzelmoleküle in der Lage sind, die RNA-Hydrolyse zu katalysieren. Die Substrat- und Ortsspezifität der Tripeptidkonjugate ließ jedoch zu wünschen übrig. Durch die Konjugation von 2-Aminobenzimidazol-Derivaten an Antisense-DNA gelang schließlich die sequenz- und ortsspezifische Affinitätsspaltung von RNA mit beachtlicher Aktivität. Damit war die Tragfähigkeit des Konzepts bewiesen. Ferner konnten durch die weitere Untersuchung der Konjugate starke Indizien gewonnen werden, die das Modell, auf dem die Auswahl der 2-Aminobenzimidazole als katalytische Einheit beruht, stützen.
In the present work we applied the Optically read out PArticle track Chamber, OPAC, for the measurement of radial dose distributions, d(r), around tracks of heavy ions passing through the gas-filled sensitive volume of the chamber. The measured data were compared with d(r) functions derived from data calculated with the Monte Carlo particle transport code, TRAX – which is used for the heavy ion therapy planning at GSI. To measure this quantity we have used here an optically read out time projection chamber (OPAC) with a parallel-drift field and one or several electron and light amplification stages. The two dimensional projection of the three dimensional ionization pattern caused by the ionizing particle passing through the chamber is captured by an image intensified CCD camera. The work is motivated by the role the radial dose distribution plays in the estimation of the relative biological effectiveness (RBE) of heavy ions, e.g. in radiation therapy and in radiation protection. The most successful model for high-dose irradiation with ions (applicable e.g. for heavy ion therapy) is found to be the local effect model (LEM). The present work intends to deliver measured data for one of the basic physical parameters which serve as input for the application of the local effect model: the radial dose distribution, d(r). The first goal of our measurement program was the measurement of d(r) distributions around carbon ions of different energies from 400 MeV/u down to the Bragg peak regions. We found an excellent agreement between the measured and simulated distributions at all carbon energies for the r–range in which the measurements deliver useful results. The lower limit of this range is about 100 nm and the upper limit is 6000 nm at a resolution of down to 33 nm - if scaled to water density. Despite the simplifications in the TRAX code (e.g. binary encounter theory for the emission ionization electrons), the discrepancies between the simulated and measured d(r) distributions are found to be lower than the measurement uncertainties at most measured carbon ion energies in almost the whole observed r-range. Hence, within the limitations of our measurements we can conclude that the precision of TRAX is sufficient to simulate the d(r) distributions around carbon ions to serve as input parameter for therapy planning. However, this conclusion is only valid for larger radial distances (r >100 nm). For smaller radial distances the measured data are dominated by the diffusion. Apart from carbon ion tracks, tracks of very heavy ions (40Ar, 84Kr and 238U) were also measured with OPAC. The simulated d(r) values were typically slightly or significantly higher than the measured data in the 100 nm < r < 5000 nm region. The experience has shown: the heavier or the faster the ion, the higher the discrepancies. On the one hand, we found a surprisingly good agreement between measurements and simulations if the ions had energies of around 50 MeV/u (i.e. relatively low energy). On the other hand, at higher energies, simulated data underestimate the measured ones by up to a factor of two in the region of 100 nm < r < 1000 nm for 84Kr (E = 650 MeV/u) or in the region of 100 nm < r < 6000 nm for 238U (E = 1 GeV/u). A possible reason for these discrepancies is that the BEA model, used in TRAX for the production ionization electrons, is not adequate for very heavy projectiles. The energy values of the very heavy ions were selected with the aim of comparing the track structures - and namely the d(r) distributions - of ions with largely different atomic mass but similar LET values. From the Z-dependency of the stopping power we know that for heavier ions a higher specific ion energy (expressed in MeV/u) is required to provide the same LET. For example the common LET of 315 keV/micro-m was achieved at largely different specific energy levels of 4,4 MeV/u for 12C, 65 MeV/u for 40Ar and 650 MeV/u for 84Kr ions. The difference in the track structures was expected mainly due to the different ion velocities and thus e.g. different ranges of d-electrons. This expectation could be confirmed by the measurements. The reason why - in line with the simulations - no strong differences could be observed in the d(r) distributions of the argon and krypton ions is the relatively small difference in the velocities of the both ion types in conjunction with the limited range in r, where the data can be compared. In contrary, the d(r) function of the carbon ion shows a qualitatively different behavior than the heavier ions inside the observable radius-range - in agreement with the simulations.
Entrepreneurship eröffnet aus didaktischer und organisatorischer Sicht vielversprechende Chancen zum Bewältigen der Modernitätskrise dualer Berufsausbildung, birgt jedoch auch Risiken in sich. Sowohl didaktische Konzeptionen, die von der – traditionell – funktional-objektivistischen Entrepreneurship-Definition ausgehen (z.B. der „Medienkoffer Selbstständigkeit“), als auch subjektorientierte Ansätze (z.B. die „Arbeitsorientierte Exemplarik“) zeichnen sich dadurch aus, dass sie, anders als duale Berufsausbildung, allgemeine Bildungsinhalte gegenüber fachbezogenen stärker gewichten, was sich u.a. in Fachgrenzen überschreitenden Lehr-/Lernarrangements (Projektunterricht) konkretisiert. Damit wird nicht nur den – Stichworte Lean Production und Globalisierung – veränderten Qualifikationsbedarfen am Arbeitsmarkt entsprochen. Auch bestehen Anknüpfungspunkte zu einem Teil der subjektiven Wissens- und Rationalitätsgrundlagen, die aus Sicht der Theorie der reflexiven Modernisierung in der Zweiten Moderne für unabdingbar erachtet werden (Anerkennung von Unsicherheit/nicht erwarteten Nebenfolgen, Befähigung zur kooperativen Entscheidungsfindung). Die untersuchten Ansatzmöglichkeiten weisen jedoch auch Schwachpunkte auf. Die „Arbeitsorientierte Exemplarik“ stellt zwar eine geschlossene didaktische Konzeption dar. Ihre Umsetzung beschränkt sich jedoch weitgehend auf die Erwachsenenbildung. Zudem fehlen Daten, die es ermöglichen, die Validität der „Arbeitsorientierten Exemplarik“ im Feld zu evaluieren. Umgekehrt liegt eine Vielzahl praxiserprobter und auch evaluierter „Entrepreneurship Education“-Programme, -Projekte und -Lehrgänge vor, die jedoch nicht bildungstheoretisch fundiert sind. Auch drohen „Entrepreneurship Education“ und die „Arbeitsorientierte Exemplarik“ entweder von neoliberalen wirtschaftspolititischen Interessen vereinnahmt oder unmittelbar in den Dienst der Gewinnerzielungsabsichten global operierender Konzerne gestellt zu werden. Während bildungstheoretische und empirische Lücken vergleichsweise einfach – durch Bildungsforschung – geschlossen werden können, verdichten sich im Spannungsfeld zwischen funktional-objektivistischen ökonomischen Interessen und dem anthropologisch begründbaren Ethos nach Entwicklung und Entfaltung individueller Persönlichkeitspotentiale divergierende politische Implikationen, mit denen Entrepreneurship (nicht nur) im Kontext erwerbsarbeitsbezogener Bildung konfrontiert ist. Hier bieten sich zwei Reaktionsmöglichkeiten an: Einerseits eine separierende Sichtweise, die entweder funktional-objektivistischen oder subjektivistisch-individuellen Rationalitäten Vorrang einräumt. Dies hätte zur Folge, dass Entrepreneurship entweder für unternehmerisches Denken und Handeln zu qualifizieren hätte oder, losgelöst von utilitaristischen Erwägungen, die gattungsspezifischen und individuellen Entwicklungsbedürfnisse des Menschen zu entfalten wären. Mit Blick auf die Herausforderungen der Zweiten Moderne erscheint gegenüber einer separierenden eine bündelnde Sichtweise erfolgversprechender, die versucht, Entrepreneurship als Option zur Gestaltung von Gesellschaft zu interpretieren ohne zu vernachlässigen, dass das Subjekt Resultat und Produzent seiner – durch die gegebene primär marktwirtschaftliche Wirtschaftsordnung beeinflussten – Vernetzung, Situierung, Verortung, Gestalt ist. Eine solche Quasi-Subjektbildung hätte neben den in der „Theorie reflexiver Modernisierung“ denominierten subjektiven Wissens- und Rationalitätsgrundlagen auch auf den Ausgleich wirtschafts-, gesellschafts- und sozialpolitischer Interessen zu zielen. Auch in organisatorischer Hinsicht beeinflussen ökonomische Rationalitäten die Modernisierungsmöglichkeiten erwerbsarbeitsbezogener Ausbildung. Zwar können die in das öffentliche Bildungssystem eingebundenen Schulen in nicht-staatlicher Trägerschaft als Repräsentanten des Entrepreneurship-Gedankens die kraft ihrer Rechtsform gegebenen pädagogischen Gestaltungsmöglichkeiten nutzen, um dem Berufsausbildungssystem Modernisierungsimpulse zu induzieren. In diesem Zusammenhang wären etwa Angebote zu nennen, in denen berufsbildende mit allgemeinbildenden Inhalten unter Einbezug neuartiger Theorie-Praxis-Kombinationen verschränkt werden. Auch sind einige Privatschulen an Modellversuchen zur Erprobung neuartiger Bildungsgänge beteiligt, die in Kooperation mit den Kultusministerien durchgeführt werden. Gleichwohl zeichnet sich ab, dass die Entscheidungsträger privater Schulen dazu übergehen, ihrer Auffassung nach moderne Erwerbsarbeitsqualifikation zunehmend außerhalb des Berufsausbildungssystems anzubieten, etwa in Form studienqualifizierender Bildungsgänge, im Rahmen berufsqualifizierender Bildungsangebote, die ausschließlich Abiturienten vorbehalten bleiben, oder gar indem berufsbildende durch Fachhochschulstudiengänge substituiert werden. Wenn nun aber moderne Erwerbsarbeitsqualifizierung zunehmend außerhalb des dualen Systems offeriert wird, so untermauert dies nicht nur die These, dass sich das duale System in einer Modernitätskrise befindet. Auch verstärkt dieses an leistungsstarken Schülern orientierte Angebotsverhalten die Selektionsfunktion, welche die Privatschulen ohnehin schon ausüben, indem sie regelmäßig Schulgeld erheben. Vieles spricht dafür, dass die staatliche Finanzhilfe, die sowieso nur Ersatz-, nicht jedoch Ergänzungsschulen beanspruchen können, allein nicht ausreicht, um den Finanzmittelbedarf der Einrichtungen zu decken. Sollen die (verbleibenden) von den Schulen in freier Trägerschaft ausgehenden Modernisierungsimpulse als nachhaltige Schrittmacher für zeitgemäße Erwerbsarbeitsqualifikation fungieren, so bedarf es nicht nur in finanzieller Hinsicht staatlicher Unterstützung. Auch die je nach Bundesland mehr oder weniger großzügigen schulrechtlichen Privatschulrechtsnormen einschließlich ihrer Anwendung durch die Aufsichtsbehörden bedürfen zumindest der Angleichung. Nicht umsonst konnten die von den Kaufmannsvereinigungen betriebenen Schulen Ende des 19. Jahrhunderts erst dann eine (allerdings auf berufliche Ertüchtigung) fokussierte Modernisierungsfunktion übernehmen, nachdem der Staat die hierfür erforderlichen, gesellschaftspolitisch motivierten, weil gegen die Sozialdemokratie gerichteten Rahmenbedingungen geschaffen hatte. Einen Rahmen, die herausgearbeiteten Spannungsbögen zwischen Theorie und Praxis, partikularistischem und holistischem Paradigma sowie ökonomischen und pädagogischen Interessen neuartig zu betrachten, vermag die Historische Anthropologie bereitzustellen. Historisch-anthropologische Forschung ist multiparadigmatisch und zeichnet sich durch Transdisziplinarität sowie Transnationalität aus. In transdisziplinären Forschungsprojekten können die Vertreter mehrerer Fachdisziplinen auf unterschiedliche Wissenskonstellationen, Fragestellungen, Begriffe sowie methodische Zugänge zurückgreifen und so – Stichwort „Quasi-Subjektivität“ – neuartige Lösungsvorschläge für konkrete Problemstellungen einbringen (vgl. WULF 2004, 262). Beim Überschreiten von durch Fachgrenzen begrenztem Denken „spielt das Staunen, das radikale Fragen, die philosophische Kritik und Selbstkritik eine wichtige Rolle“ (WULF 2004, 264). Staunen dürfte sich aller Voraussicht dann einstellen, wenn nicht nur ernsthaft diskutiert würde, dass private Schulen – unter Voraussetzung veränderter Rahmenbedingungen – den öffentlichen Bildungsauftrag möglicherweise besser umsetzen können als staatliche Einrichtungen, sondern auch seitens der politisch Verantwortlichen die hierfür erforderlichen Maßnahmen ergriffen würden. Transnationale (historisch-anthropologische) Forschung eröffnet zudem die Gelegenheit, Grenzen, genauer: ethnische oder kulturelle Grenzen zu überschreiten. (vgl. WULF 2004, 268). Bezogen auf Entrepreneurship böte sich insofern die Option, die anglo-amerikanische Färbung des Entrepreneurship-Diskurses ebenso zu erweitern wie den zentraleuropäischen Nexus des historischen Subjektbildungsdiskurses.
Klonierung und Charakterisierung eines ecotropen porzinen endogenen Retrovirus der Klasse C (PERV-C)
(2006)
Durch die vertikale Vererbung von endogenen Retroviren, deren Fähigkeit humane Zellen in vitro zu infizieren und ihrer Rekombinationsfähigkeit besteht ein Risikopotential bei der Verwendung porziner Gewebe bzw. Organe im Rahmen der XTx, weshalb ein Screening auf PERV im Genom von Spendertieren und eine immunologische Kontrolle von Xenotransplantatempfängern von Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnten vier native, teilweise unvollständige, provirale Sequenzen aus einer Genbibliothek einer Zelllinie von Minischweinen isoliert werden. Der Molekularklon PERV-C(1312) zeigt die vollständigen Leserahmen für das gag-, pol- und env-Gen, die 5LTR Sequenz beinhaltet einen Repeat mit 39 bp. Das Virus ist in der Lage produktiv porzine ST-IOWA Zellen in vitro zu infizieren und nach Transfektion in humane Nierenzellen in das Genom zu integrieren. Eine Rekombination mit PERV-B(33)/ATG Partikeln konnte nicht gezeigt werden. Nach Transfektion von Deletionsmutanten von PERV-B(33)/ATG in MAX-T Zellen, denen das gag- und pol-Gen fehlte und lediglich der offene Leserahmen für das env-Gen intakt war, konnte keine Rekombination bzw. Inkorporation von Env-B Proteinen in PERV-C Partikeln nachgewiesen werden. Für eine immunologische Detektion des Env-C Proteins wurde ein polyklonales Antiserums in Kaninchen generiert und ein monoklonaler Antikörper hergestellt. Die Epitope für beide Antikörper sind im SU des env-C Gens lokalisiert. Das Env-C Protein kann durch das polyklonale Antiserum durch Western Blot Analyse in Zelllysaten und in immunhistochemischen Analysen in verschiedenen Zelllinien detektiert werden. In PERV-C Partikeln wird das Env-Protein sowohl durch das polyklonale Antiserum als auch durch den monoklonalen Antikörper spezifisch detektiert. Durch den immunologischen Nachweis von PERV-C Proteinen ist es möglich im Hinblick auf eine XTx den Nachweis dieser Proteine in möglichen Rezipienten durchzuführen. Durch die zusätzlich isolierten Flankensequenzen des replikationskompetenten Molekularklons PERV-C(1312) wäre eine Screening Methode, durch die Verwendung einer spezifischen Flankensonde, möglich, um genomische Integrationsorte und somit die Präsenz dieses Provirus in den Zellen des Spendertieres vorab zu überprüfen, um möglichst Spendertiere für eine XTx zu verwenden, die frei von PERV-C(1312) sind. Somit leistet diese Arbeit einen Beitrag zur besseren Evaluierung des Risikopotentials zukünftiger Xenotransplantationen.
In der vorliegenden Arbeit wurden festkörperunterstützte Membranen in Verbindung mit schnellen Lösungswechseln als Methode zur Messung von elektrogenen Transportvorgängen in biologischen Membranen untersucht und charakterisiert. Parallel zu einem manuellen Messsystem wurde eine Technologie auf der Basis eines Pipettierroboters mitentwickelt und charakterisiert, die es erlaubt, automatisierte Messungen mit erhöhtem Durchsatz durchzuführen. Die Sensoren wurden als Sensorarray auf der Basis einer standardisierten 96er Mikrotiterplatte realisiert. Zur Lösungshantierung kam ein Pipettierroboter zum Einsatz, der mit einer selbstentwickelten Injektionseinheit bestückt wurde. In dieser Injektionseinheit ließen sich die verwendeten Lösungen überschichten, wodurch ein Lösungswechsel von einer substratfreien zu einer substrathaltigen Lösung durchgeführt werden konnte. Mit dem beschriebenen System konnten die in dieser Arbeit behandeleten Proteine EAAC1 und NhaA erfolgreich aktiviert und charakterisiert werden. Hinsichtlich der Transportaktivität wurden mit beiden Proteinen vergleichbare Ergebnisse erzielt wie mit dem manuellen Messsystem. Aus kultivierten CHO-Zellen, die den neuronalen Glutamattransporter EAAC1 rekombinant und fuktional exprimierten, wurden EAAC1-haltigen Cytoplasmamembranen in einem Aufreinigungsschritt (Membranpräparation) gewonnen. Die derart vorliegenden Membranfragmente konnten erfolgreich auf der festkörperunterstützten Membran angelagert werden. In der Abwesenheit von Natriumionen war der EAAC1 nicht aktiv, und er konnte durch den spezifischen kompetitiven Inhibitor TBOA inhibiert werden (Inhibitionskonstante Ki = 1µM). Es wurde beobachtet, dass die Transportströme des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine andere Kinetik aufwiesen als in der Anwesenheit von Kaliumionen, und die Affinität für L-Glutamat war in der Abwesenheit von Kaliumionen verringert (K0,5 = 144 µM). Analysen der Signalformen ergaben eine reduzierte Relokationsrate, wobei es wahrscheinlich ist, dass der EAAC1 ohne Kaliumionen einen Single-Turnover durchführt. Eine weitere Eigenschaft des EAAC1 ist die Fähigkeit, bestimmte Anionen zu leiten. Diese Anionenleitfähigkeit ist strikt Natriumabhängig und wird durch die Bindung von L-Glutamat getriggert. Wenn bei einem Experiment zusätzlich bestimmte Anionen (z.B. Chlorid oder Thiocyanat) anwesend waren, wies der Transportstrom des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine negative Komponente auf. Diese Komponente konnte auf den Einstrom der Anionen entlang des durch den Glutamattransport aufgebauten elektrischen Gradienten zurückgeführt werden. Des Weiteren konnte die Anionenleitfähigkeit mit Anionensprüngen in der Anwesenheit von L-Glutamat und Natriumionen direkt induziert werden. Damit wurden erstmals kanalartige Ionenströme an der festkörperunterstützten Membran nachgewiesen. Der Anionenstrom wies dabei die gleiche Abhängigkeit von der Glutamatkonzentration auf (K0,5 = 31 µM) wie der Transportstrom. Der Übergang in den leitfähigen Zustand und der Transport hängt demnach von dem gleichen L-glutamatgebundenen Zustand des EAAC1 ab. Dies konnte auch unter Verwendung des Inhibitors HIP-B gezeigt werden. HIP-B wurde erstmals an EAAC1 getestet und wies eine Inhibitionswirkung auf den Transportstrom auf, die nicht auf eine kompetitive Bindung zurückzuführen war. Die Anionenleitfähigkeit ließ sich mit HIP-B hingegen nicht inhibieren. Der bakterielle Natrium-Protonen-Austauscher NhaA lag rekonstituiert in Liposomen vor, die auf der festkörperunterstützten Membran angelagert wurden. Bedingt durch die RSO-Orientierung des NhaA, konnte der Natriumtransport entgegen der natürlichen Transportrichtung (extrazelluläre Natriumbindung) untersucht werden. Der Transportstrom wies eine ausgeprägte Abhängigkeit vom pH-Wert auf. Bei neutralen bzw. sauren pH-Werten (pH <= 7) war die Aktivität des NhaA gegenüber dem alkalischen Bereich (7 < pH < 9) erheblich reduziert. Dieses Verhalten entspricht Literaturangaben für die Intrazellulärseite des NhaA. Dennoch war der NhaA bei einem neutralen pH-Wert nicht vollständig inaktiv. Die Affinität für Natriumionen konnte bei einem pH-Wert von 8,5 zu K0,5 = 11 mM und bei pH 7,0 zu K0,5 = 180 mM bestimmt werden. Neben einer Verringerung der Wechselzahl sinkt im neutralen/sauren Bereich also auch die Affinität für Natriumionen. Durch die Verwendung von Liposomen, in denen der NhaA mit verschiedenen Lipid- zu Protein-Verhältnissen rekonstituiert wurde, konnte gezeigt werden, dass die Messströme auf die Aufladung der Liposomen zurückführbar sind. Der Transportstrom konnte mit der amiloridähnlichen Substanz 2-Aminoperimidin inhibiert werden (Ki = 3 µM). Eine Inhibitionswirkung war nur zu beobachten, wenn der pH-Wert kleiner als pH 8 war. Zusammmen mit der ausgeprägten pH-Wertabhängigkeit kann dieses Phänomen auf eine pH-induzierte Konformationsänderung des NhaA zurückgeführt werden.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der BFV-Reduktion von Hamiltonschen Systemen mit erstklassigen Zwangsbedingungen im Rahmen der klassischen Hamiltonschen Mechanik und im Rahmen der Deformationsquantisierung. Besondere Aufmerksamkeit wird dabei Zwangsbedingungen zuteil, die als Nullfaser singulärer äquivarianter Impulsabbildungen entstehen. Es ist schon länger bekannt, daß für Nullfasern regulärer äquivarianter Impulsabbildungen die in der theoretischen Physik gebräuchliche Methode der BFV-Reduktion zur Phasenraumreduktion nach Marsden/Weinstein äquivalent ist. In [24] konnte gezeigt werden, daß in dieser Situation die BFV-Reduktion sich auch im Rahmen der Deformationsquantisierung natürlich formulieren läßt und erfolgreich zur Konstruktion von Sternprodukten auf Marsden/Weinstein-Quotienten verwendet werden kann. Ein Hauptergebnis der vorliegenden Arbeit besteht in der Verallgemeinerung der Ergebnisse aus [24] auf den Fall singulärer Impulsabbildungen, deren Komponenten 1.) das Verschwindungsideal der Zwangsfläche erzeugen und 2.) einen vollständigen Durchschnitt bilden. Die Argumentation von [24] wird durch Gebrauch der Störungslemmata aus dem Anhang A.1 systematisiert und vereinfacht. Zum Existenzbeweis von stetigen Homotopien und stetiger Fortsetzungsabbildung für die Koszulauflösung werden der Zerfällungssatz und der Fortsetzungssatz von Bierstone und Schwarz [20] benutzt. Außerdem wird ein ’Jacobisches Kriterium’ für die Überprüfung von Bedingung 2.) angegeben. Basierend auf diesem Kriterium und Techniken aus [3] werden die Bedingungen 1.) und 2.) an einer Reihe von Beispielen getestet. Als Korollar erhält man den Beweis dafür, daß es symplektisch stratifizierte Räume gibt, die keine Orbifaltigkeiten sind und dennoch eine stetige Deformationsquantisierung zulassen. Ferner wird (ähnlich zu [92]) eine konzeptionielle Erklärung dafür gegeben, warum im Fall vollständiger Durchschnitte das Problem der Quantisierung der BRST-Ladung eine so einfache Lösung hat. Bildet die Impulsabbildung eine erstklassige Zwangsbedingung, ist aber kein vollständiger Durchschnitt, dann ist es im allgemeinen nicht bekannt, wie entsprechende Quantenreduktionsresultate zu erzielen sind. Ein Hauptaugenmerk der Untersuchung wird es deshalb sein, in dieser Situation die klassische BFV-Reduktion besser zu verstehen – natürlich in der Hoffnung, Grundlagen für eine etwaige (Deformations-)Quantisierung zu liefern. Wir werden feststellen, daß es zwei Gründe gibt, die Tate-Erzeuger (alias: Antigeister höheren Niveaus) notwendig machen: die Topologie der Zwangsfläche und die Singularitätentheorie der Impulsabbildung. Die Zahl der Tate-Erzeuger kann durch Übergang zu projektiven Tate-Erzeugern, also Vektorbündeln, verringert werden. Allerdings sorgt Halperins Starrheitssatz [57] dafür, daß im wesentlichen alle Fälle, für die die Zwangsfläche kein lokal vollständiger Durchschnitt ist, zu unendlich vielen Tate-Erzeugern führen. Erzeugen die Komponenten einer Impulsabbildung einer linearen symplektischen Gruppenwirkung das Verschwindungsideal der Zwangsfläche, so kann man eine lokal endliche Tate-Auflösung finden. Diese besitzt nach dem Fortsetzungssatz und dem Zerfällungssatz von Bierstone und Schwarz stetige, kontrahierende Homotopien. Ausgehend von einer solchen Tate-Auflösung konstruieren wir, die klassische BFV-Konstruktion für vollständige Durchschnitte verallgemeinernd, eine graduierte superkommutative Algebra. Wir können zeigen, daß diese graduierte Algebra auch im Vektorbündelfall eine graduierte Poissonklammer besitzt, die sogenannte Rothstein-Poissonklammer. Die Existenz einer solchen Poissonklammer war bereits von Rothstein [87] für die einfachere Situation einer symplektischen Supermannigfaltigkeit bewiesen worden. Darüberhinaus werden wir sehen, daß es auch im Vektorbündelfall eine BRST-Ladung gibt. Diese sieht im Fall von Impulsabbildungen etwas einfacher aus als für allgemeine erstklassige Zwangsbedingungen. Insgesamt wird also die klassische BFV-Konstruktion [95] auf den Fall projektiver Tate-Erzeuger verallgemeinert, und als eine Homotopieäquivalenz in der additiven Kategorie der Fréchet-Räume interpretiert.
The aim of the thesis was to identify structure activity relationships (SAR) in the primary screening data of high-throughput screening (HTS) assays. The strategy was to perform a hierarchical clustering of the molecules, assign the primary screening data to the created clusters and derive models from the clusters. The models should serve to identify singletons, clusters enriched with actives, not confirmed hits and false-negatives. Two hierarchical clustering algorithms, NIPALSTREE and hierarchical k-means have been developed and adapted for this purpose, respectively. A graphical user interface (GUI) has been implemented to extract SAR from the clustering results. Retrospective and prospective applications of the clustering approach were performed. SAR models were created by combining the clustering results with different chemoinformatic methods. NIPALSTREE projects a data set onto one dimension using principle component analysis. The data set is sorted according to the scoring vector and split at the median position into two subsets. The algorithm is applied recursively onto the subsets. The hierarchical k-means recursively separates a data set into two clusters using the k-means algorithm. Both algorithms are capable of clustering large data sets with more than a million data points. They were validated and compared to each other on the basis of different structural classes. NIPALSTREE provided with the loading vectors first insights into SAR whereas the hierarchical k-means yielded superior results. A GUI was developed allowing the display of and the navigation in the clustering results. Functionalities were integrated to analyse the clusters in the dendrogram, molecules in a cluster, and physicochemical properties of a molecule. Measures were developed to identify clusters enriched with actives, to characterize singletons and to analyse selectivity and specificity. Different protease inhibitors of the COBRA database were examined using the hierarchical k-means algorithm. Supported by similarity searches and nearest neighbour analyses thrombin inhibitor singletons were quickly isolated and displayed in the dendrogram. By scaling enrichment factors to the logarithm of the dendrogram level, clusters enriched with different structural classes of factor Xa inhibitors were simultaneously identified. The observed co-clustering of other protease inhibitors provided a deeper insight into selectivity and specificity and shows the utility of the approach for constructing focussed screening libraries. Specificity was analyzed by extracting and clustering relative frequencies of the protease inhibitors from the clusters of dendrogram level 7. A unique ligand based point of view on the pocketome of the protease enzymes was obtained. To identify not confirmed hits and false-negatives in the primary screening data of HTS assays, three assays were retrospectively analysed with the hierarchical k-means algorithm. A rule catalogue was developed judging hits in terminal clusters based on the cluster size, the percent control values of the entries in a cluster, the overall hit rate, the hit rate in the cluster and the environment of a cluster in the dendrogram. It resulted in the identification of a high proportion of not confirmed hits and provided for each hit a rating in context of related non-hits. This allows prioritizing compounds for follow-up studies. Non-hits and hits were retrieved from terminal clusters containing hits. Molecules bearing false-negative scaffolds were co-extracted and enriched. To minimize the number of false-positives in the extracted lists, Bayesian regularized artificial neutral network classification models were trained with the data. Applying the models marked improvement of enrichment factors for the false-negatives was obtained. It proofs the scaffold-hopping potential of the approach. NIPALSTREE, the hierarchical k-means algorithm and self-organising maps were prospectively applied to identify novel lead candidates for dopamine D3 receptors. Compounds with novel scaffolds and low nanomolar binding affinity (65 nM, compound 42) were identified. To provide a deeper insight into the SAR of these molecules, different alternative computational methods were employed. Support vector-based regression and partial least squares were examined. Predictive models for dopamine D2 and D3 receptor binding affinity values were obtained. Important features explaining SAR were extracted from the models. The prospective application of the models to the diverse and novel virtual screening data was of limited success only. Docking studies were performed using a homology model of the dopamine D3 receptor. The visual inspection of the binding modes resulted in the hypothesis of two alternative binding pockets for the aryl moiety of dopamine D3 receptor antagonists. A pharmacophore model was created simultaneously requiring both aryl moieties. Virtual screening with the model identified a nanomolar hit (65 nM, compound 59) corroborating the hypothesis of the two binding pockets and providing a new lead structure for dopamine D3 receptors. The presented data shows that the combined approach of hierarchically clustering a data set in combination with the subsequent usage of the clusters for model generation is suited to extract SAR from screening data. The models are successful in identifying singletons, clusters enriched with actives, not confirmed hits and false-negative scaffolds.
In the first part of the present work (Chapter 3), EPR spectroscopy at different microwave frequencies, namely at 9 GHz (X-band), 34 GHz (Q-band) and 180 GHz (G-band), was employed to resolve the g-values and the HFCs of a putative radical intermediate involved in the reduction of benzoyl-CoA catalyzed by benzoyl-CoA reductase. In particular, the effect of 33S-labeling on the EPR line shape was studied at X- and Q-band frequencies in order to gain further evidence for a sulfur centered radical proposed to be the electron donor in the reduction or the aromatic ring of BCoA [I]. The spectral components observed at X-, Q- and G-band were overall consistent and showed at least three overlapping EPR signals. The signal postulated to be due to a disulfide radical anion showed no resolved g-values and a relaxation behaviour faster than expected for such a radical species. These observations together with the simulations suggest that the signal could arise from a radical exchange coupled to an [4Fe-4S] cluster located nearby. In the future, pulsed EPR and ENDOR spectroscopy on the 57Fe-labeled enzyme could help to solve this question. The potential of high-field ENDOR in combination with 13C- and 31P-labeling for investigating the structure at the active site in proteins could be verified in the studies of the ligation sphere of the cofactor Mn2+ in Ras as reported in Chapter 4 [2]. Therein, high-field ENDOR performed at 94 GHz (W-band) was used to detect the hyperfine interactions between the electron spin mainly located on the metal ion and the phosphorous nuclei of the bound GDP and GppNHp as well as the carbon nuclei of bound amino acids in the wild-type Ras protein and its oncogenic mutant G12V. These studies aimed at searching for an additional free phosphate ion or amino acid ligand bound to the metal center in the wild type GDP-bound protein with respect to its oncogenic mutant. Rom the 13C- and 31P-ENDOR spectra, the hyperfine couplings of directly bound amino acids and the bound nucleotides were compatible with the hyperfine couplings obtained from DFT calculations based on the crystal structure data. No differences in the 13C- and 31P-ENDOR spectra could be found for the wild-type GDP-bound protein in comparison to its oncogenic mutant in frozen solution. Therefore, no evidence for binding of an additional free phosphate ion or amino acid ligand in the wild-type GDP-bound protein was found. The distances between the detected nuclei and the meta1 ion were in agreement with the ones extracted from crystal structures reported in the literature. Future 35C1-ENDOR studies could clarify whether a chloride ion from the buffer solution could be the ligand replacing one water molecule in the wild type GDP-bound Ras. In Chapter 5, the implementation of a high-field ENDOR setup into a homebuilt pulsed EPR spectrometer operating at 180 GHz is reported and its performance for 1H-ENDOR demonstrated on the model system BDPA. Mims and Davies ENDOR spectra were also obtained for Ras(wt).Mn2+.DP. The increased nuclear Zeeman resolution at 180 GHz may be further exploited in the future by extending the setup for studying hyperfine couplings of low-y nuclei such as 33S, 15N , 17O or 2H. In the present work, the advantages of performing EPR and ENDOR experiments at high fields and frequencies could be nicely demonstrated with the 94 GHz ENDOR studies of Ras. Furthermore, the complementing information obtained at X- and Q-band frequencies in the multifrequency EPR studies on BCR demonstrated that the analysis of EPR spectra can be greatly facilitated by simulating the spectra measured at different MW frequencies with the same set of parameters consistent with a proposed radical. Overall, it could be shown that the use of different experimental techniques at multiple fields and frequencies renders EPR spectroscopy a powerfull tool for structural studies in biological systems.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die kognitiven und neurophysiologischen Grundlagen des visuellen Arbeitsgedächtnisses (AG) zu untersuchen. Es wurden zwei Studien durchgeführt. In der ersten wurden per Verhaltensdaten die Ressourcen von Manipulationsprozessen im visuellen AG nach Materialart erfasst. Dazu wurden insgesamt sechs Experimente konstruiert. In der zweiten Studie wurden mit zwei Experimenten die neurophysiologischen Grundlagen des visuellen AG per funktioneller Magnetresonanztomographie (fMRT) dargestellt. Im Folgenden wird kurz das Modell des Arbeitsgedächtnisses nach Baddeley (1992) erläutert, gefolgt von einer Beschreibung der visuellen Pfade, welche für die Struktur des visuellen AG grundlegend sind. Danach werden die kortikalen Korrelate des visuellen AG skizziert. Anschließend werden aus den dargestellten Befunden die Methoden für die beiden Studien dargestellt und deren Ergebnisse diskutiert. Baddeley (1992) definiert das Arbeitsgedächtnis als ein System für das kurzfristige Halten und Manipulieren von Information, welche für weitere komplexe kognitive Prozesse wie Verstehen, Lernen und Schlussfolgern benötigt wird (Baddeley, 1992). Baddeley und Hitch (1974) entwickelten ein Modell des Arbeitsgedächtnisses, das aus drei getrennten Subsystemen besteht: Einer zentralen Exekutive (ZE), welche als übergeordnetes Aufmerksamkeits-Kontrollsystem arbeitet und die in das aktive Manipulieren von Material involviert ist, wie z.B. die mentale Rotation von Objekten. Dazu wurden zwei Sklavensysteme postuliert, die phonologischen Schleife und der visuell-räumlichen Notizblock (im folgenden visuelles AG genannt). Die phonologische Schleife hält phonologisch basierte Information und der visuell-räumliche Notizblock visuelles Material. Resultate aus psychologischen Experimenten und bildgebenden Studien dokumentieren, dass sowohl die kognitiven wie die neurophysiologischen Grundlagen des visuellen AG auf Basis der Materialart („Was vs. Wo“) und den operierenden kognitiven Prozessen („Halten vs. Manipulieren“) organisiert sind. Das Verhältnis zwischen den beiden Faktoren Material und Prozess ist bisher sowohl für die kognitive als auch für die neurophysiologische Ebene trotz einer Vielzahl an Untersuchungen umstritten. Im folgenden Abschnitt werden knapp die für die Struktur des visuellen AG wichtigen parallelen perzeptuellen Bahnen beschrieben. Eine funktionelle Trennung der visuellen Wahrnehmung erfolgt bereits in der Retina. Magnozelluläre Ganglienzellen sprechen vor allem auf Luminanzunterschiede an, parvozelluläre auf Wellenlängenunterschiede (Livingstone und Hubel, 1987). Kortikal wird die visuelle Information weiter in parallelen Bahnen verarbeitet. Eine ventrale Bahn analysiert vor allem Form und Farbe („Was“), eine dorsale die räumliche Position von Objekten und Bewegungen („Wo“, Ungerleider und Mishkin, 1982). Es konnte demonstriert werden, dass die Aufteilung der visuellen Wahrnehmung in eine ventrale und dorsale Bahn auch für höhere kognitive Prozesse wie das Halten von Information im visuellen AG erhalten ist (Della Sala et al., 1999). Die Autoren fanden bei neuropsychologischen Patienten Doppel-Dissoziationen in der Bearbeitungsleistung von Arbeitsgedächtnistests, welche sensitiv für das Halten von ventraler und dorsaler perzeptuelle Information sein sollten. Zusätzlich validierten die Autoren die Tests mit Interferenzaufgaben an Gesunden. Die Leistungen beider Tests wurden jeweils durch verschiedene Arten von Interferenz (räumliche vs. visuelle) beeinträchtigt. Somit konnte demonstriert werden, dass das Halten im visuellen AG nach Materialart getrennte Ressourcen aufweist. Ungeklärt ist, ob diese Trennung auch für aktive Prozesse wie das Manipulieren bestehen bleibt. Auch in den kognitiven Neurowissenschaften ist die Organisation der neurophysiologischen Grundlagen des Arbeitsgedächtnisses umstritten. Es fanden sich in einer Reihe von Studien deutliche Hinweise, dass der frontale Kortex (FK) eine zentrale Rolle für das visuelle AG einnimmt (Bauer und Fuster, 1976). Eine Vielzahl an Studien erbrachte allerdings widersprüchliche Ergebnisse hinsichtlich der funktionalen Organisation des FK nach Material („Was vs. Wo“, domänspezifische Theorie, Goldman-Rakic, 1987) und Prozessart („Halten vs. Manipulieren“, prozessspezifische Theorie, Petrides, 1994). Studien, die demonstrierten, dass der ventrolaterale FK für das Halten von Objekten und der dorsolaterale für das Halten von räumlichen Relationen spezialisiert ist (Courtney et al., 1998), konnten nicht immer bestätigt werden (DEsposito et al., 1998). Es konnte allerdings gezeigt werden, dass das verwendete Stimulusmaterial in den Experimenten großen Einfluss auf die Ergebnisse hatte und dass vor allem ein Defizit in der Konstruktion von ventralen Stimuli bestand, welche nur wenige räumliche Bestandteile beinhalteten (Sala, Rämä und Courtney, 2003). Somit ist diese unklare Befundlage unter anderem auf den Mangel an geeigneten Paradigmen zur Untersuchung vom Halten und Manipulieren ventraler Information zurückzuführen. Mit Studie 1 sollte per Verhaltensdaten untersucht werden, ob Prozesse der Manipulation auf materialspezifisch getrennten, kognitiven Ressourcen basieren. Die Studie bestand aus sechs Experimenten. Die ersten drei bestanden aus einer Dual-Aufgabe, in der ventrale und dorsale Information einzeln oder synchron manipuliert werden mussten. Die Manipulation ventraler Information wurde über das Mischen von Farben erfasst, die Manipulation dorsalen Materials über das mentale Rotieren von Halbkreisen. Zur Kontrolle von perzeptuellen und seriellen Lösungsstrategien wurden drei Varianten des Experimentes konstruiert, welche sich in der zeitlichen Darbietung der Stimuli unterschieden. In den Dual-Bedingungen der Experimente 1-3 trat keine Interferenz auf. Dieses Resultat unterstützt die Annahme getrennter, materialspezifischer kognitiver Ressourcen für das Manipulieren visuellen Materials. Im vierten Experiment mussten die Probanden eine räumlich-räumliche Dual-Aufgabe bearbeiten. In der Dual-Bedingung von Experiment 4 entstand Interferenz, da beide Aufgaben das gleiche dorsale System im visuellen AG beanspruchen. Zwei zusätzliche Experimente wurden zur Kontrolle der untersuchten Prozesse konstruiert (Experimente 5 und 6). Mit ihnen sollte überprüft werden, in welchen Umfang Prozesse des Manipulierens und des Haltens der visuellen Stimuli (Farbe und Rotation) auf Ressourcen der phonologischen Schleife und der zentralen Exekutive basieren. Es wurde dokumentiert, dass weder das Halten noch das Manipulieren des Materials die phonologische Schleife in Anspruch nimmt. Die Manipulation des visuellen Materials beruhte im Gegensatz zu deren Halten auf zentral-exekutive Ressourcen. Die Resultate zeigen, dass die materialspezifische Aufteilung der visuellen Verarbeitung auch für höhere kognitive Prozesse des Manipulierens erhalten ist und dass sich das Manipulieren im Ausmaß der benötigten zentral-exekutiven Ressourcen vom Halten unterscheidet. Studie 2 beschäftigte sich mit der funktionellen Organisation der neurophysiologischen Grundlagen des visuellen AG. Auf Basis des für Studie 1 entwickelten ventralen und dorsalen Halten- und Manipulationsparadigmas wurden zwei Experimente für das fMRT konstruiert. Im ersten Experiment mussten die Probanden Farben und räumliche Orientierungen halten, im zweiten Experiment mussten sie beide Materialarten manipulieren. Es konnte aufgezeigt werden, dass die Aufteilung des FK materialspezifisch erfolgt. Das Halten und Manipulieren der Farbinformation aktivierte Regionen um den Sulcus frontalis inferior, das Halten und Manipulieren des räumlichen Materials beanspruchte Regionen in der Nähe des Frontalen Augenfeldes (Kreuzung des Sulcus praecentralis / Sulcus frontalis superior). Der Kontrast zwischen Halten und Manipulieren erbrachte keine solche dorso-ventrale Dissoziation des FK. Die Ergebnisse der Verhaltens- und fMRT-Daten beider Studien verdeutlichen die Organisation der kognitiven und neurophysiologischen Ressourcen des FK nach Materialart, aufbauend auf dem ventralen und dorsalen perzeptuellen Pfad. Das Ergebnis der vorliegenden Studie bestätigt frühere Untersuchungen zur Organisation des FK (Courtney et al., 1998) und erweitert die bisherigen Resultate dahingehend, dass der FK auch für Manipulationsprozesse materialspezifisch organisiert ist.
Die vakuumassistierte stereotaktische Brustbiopsie (Mammotome) bei mammographisch verdächtigen aber nicht palpablen und sonographisch nicht nachweisbaren Veränderungen der Brust ist mittlerweile ein probates Verfahren. In der vorliegenden Studie werden 152 Mammotombiopsien genauer untersucht. Es werden die konventionellen, vor der Biopsie angefertigten, und wenn vorhanden Film-Folien- Vergrößerungsaufnahmen mit den während der Biopsie angefertigten digitalen Ausschnittsmammographien verglichen, um eventuell vorhandene Unterschiede deutlich zu machen. Die Veränderungen werden in die BI-RADS-Klassifikation eingeteilt und mit der gewonnenen Histologie korreliert. Die durchschnittliche Dauer einer Biopsie beträgt 49,2 min, zum Auffinden und korrektem Einspannen der Brust in den Biopsietisch sind 1,47 Fehlversuche nötig und es werden 2,75 Rotationen pro Biopsie durchgeführt. Die Entfernung der Läsion erfolgt in 32,9% der Läsionen komplett, 51,5% werden überwiegend entfernt und 12,5% können nur unvollständig entfernt werden. Im Durchschnitt werden 15,53 Mikrokalzifikationen im Film-Folien- und 14,45 Mikrokalzifikationen im digitalen Bild gezählt, in den Film-Folien- Vergrößerungsaufnahmen sind 17,98 Mikrokalzifikationen sichtbar. Signifikant sind diese Unterschiede nur in der Gruppe der Läsionen mit 1 – 5 Mikroverkalkungen, hier sind in der digitalen Ausschnittsmammographie signifikant mehr Verkalkungen zu sehen. In der Gruppe der Läsionen mit 16 – 30 Mikroverkalkungen sind ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen den beiden Aufnahmen zu sehen, wobei hier die Film-Folien-Mammographie mehr Verkalkungen sichtbar macht. Die Läsionen werden nach Betrachten der Film-Folien- Mammographien in signifikant höhere BI-RADS-Kategorien eingeteilt, als nach Beurteilung der digitalen Ausschnittsmammographien. Die histologische Untersuchung ergibt 7 invasive Karzinome, 30 in situ Karzinome, 14 ADHs und 101 benigne Veränderungen, wobei hier die duktale Hyperplasie und die Mastopathie den größten Anteil haben. Der Vergleich mit dem in der Literatur angegebenen Anteil an malignen Befunden in den einzelnen BI-RADS-Kategorien zeigt, dass die Film-Folien-Bilder recht gute Ergebnisse erzielen (27,5% maligne Befunde in Kategorie 4 und 6,5% in Kategorie 3-4), während die digitalen Bilder zu hohe Malignitätsanteile (45,0% in Kategorie 4) liefern. Es zeigt sich, dass bei der Unterscheidung von malignen Befunden und Präkanzerosen von benignen Befunden, die Film-Folien-Aufnahme signifikant bessere Ergebnisse erzielt als die digitale, gleiches gilt für die Unterscheidung von DCIS und ADH. Die Präparateradiographie zeigt, dass in 76,3% der Biopsien in der ersten Rotation Mikrokalk sichtbar ist, die histologische Diagnose kann aber in 92,1% der Biopsien bereits nach der ersten Rotation gestellt werden, auch wenn kein sichtbarer Kalk entnommen wurde. In 52 Fällen folgte auf die Biopsie eine operative Gewebeentnahme bzw. Tumorentfernung aus der Brust. In 13 Fällen ist die Veränderung im OP-Präparat nicht mehr nachweisbar, hier ist davon auszugehen, dass sie mit der Biopsie vollständig entfernt wurde. Bei 5 Läsionen wurde die Diagnose nach der OP als maligner eingestuft, die underestimation-rate beträgt 9,6%. Die Film-Folien-Mammographieaufnahmen eignen sich zur Einteilung in die BI-RADS-Klassifikation und Feststellung des Malignitätsrisikos besser, als die digitalen Ausschnittsmammographien.
In allen bislang durchgeführten Experimenten zur Mutagenese von embryonalen Stammzellen war auffällig, dass Gene, die für sekretierte oder membranständige Proteine kodieren, stark unterrepräsentiert waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Genfallen untersucht, die speziell diese Gene mutieren sollten. Als Selektionskassetten tragen beide Genfallen den 5' Bereich des humanen CD2, der eine kryptische Spleißakzeptorsequenz enthält und für eine Transmembrandomäne kodiert, als Fusion mit der bakteriellen Neomycinphosphotransferase. U3Ceo trägt diese Kassette als klassische retrovirale Genfalle im LTR des Mouse Molony Leukemia Virus, wogegen die ebenfalls retrovirale FlipRosaCeo Genfalle die Selektionskassette im Viruskörper enthält. Diese wird von Rekombinaseerkennungssequenzen flankiert, welche eine konditionale Aktivierung der Mutation für die spätere Analyse in einem Mausmodell ermöglichen. Beide Genfallen zeigten mit ca. 80% aller Integrationen eine hohe Spezifität für Gene, die für sezernierte und membranständige Proteine kodieren. Allerdings war die Frequenz für Insertionen in sogenannte „hot spots“ bei beiden Genfallen aufgrund der geringeren Zahl an Zielgenen höher als bei anderen im GGTC verwendeten Genfallen (z.B. FlipRosabetageo). Innerhalb dieser „hot spots“ zeigte sich die bekannte Präferenz retroviraler Genfallenvektoren, in das 5’ Ende von Genen zu integrieren, wobei hier meist die größten Introns zu finden sind. Ebenso zeigte sich für die in dieser Arbeit untersuchten sekretorischen Genfallen genau wie bei anderen bekannten Genfallen eine bevorzugte Integration in Chromosomen mit einer hohen Gendichte. Die Funktionalität der konditionalen Genfalle konnte in vitro sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten durch Einbringen der Genfalle und der jeweiligen Rekombinasen bestätigt werden. In ES Zellen, die eine X-chomosomale Integration aufwiesen, wurde der Mechanismus durch transiente Expression der Rekombinasen in Klonen überprüft. Hierbei stellte sich heraus, dass das Wildtyptranskript eines mutierten Gens nach der einmaligen Rekombination der FlipRosaCeo wieder exprimiert wird und nicht durch die auf dem Gegenstrang befindliche Genfalle beeinflusst wird. Nach einer weiteren Rekombination mittels FLPe konnte der mutagene Ausgangszustand der Genfalle wieder hergestellt werden. Die Mutagenität der beiden Genfallen wurde durch Überprüfung der Konzentration der restlichen endogenen Transkripts der mutierten Gene per quantitativer PCR an X-chromosomalen Klonen analysiert. Hier konnte bei etwa 80% der untersuchten Klone eine sehr starke Mutation des jeweils getroffenen Gens festgestellt werden. Zur in vivo Überprüfung der U3Ceo Genfalle wurde ein Mausmodell durch Blastozysteninjektion des ES Zellklons M076C04 generiert. Die Integration der Genfalle in das erste Intron des Gens C030019F02Rik sollte eine deutliche Verkürzung des membranständigen Genproduktes bewirken. In Gehirnen von homozygoten Mäusen konnte die Expression des Wildtyptranskripts nicht mehr festgestellt werden, so dass diese Mauslinie eine Nullmutation des Gens trägt. Die in dieser Arbeit untersuchte KO Maus zeigte bisher keinen feststellbaren Phänotyp, obwohl das Genprodukt in vielen Spezies hoch konserviert vorliegt und auch nur in bestimmten Bereichen im Organismus nachweisbar ist, so dass eine wichtige Funktion des Proteins anzunehmen ist. Eine weitere Analyse dieser Mauslinie wird sich dieser Arbeit anschließen.
In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal explizite Ausdrücke für Strahlungskorrekturen zur Grundzustandsenergie der relativistischen Dichtefunktionaltheorie hergeleitet und im Rahmen einer Langwellennäherung ausgewertet. Dazu wurde, ausgehend von einer angemessenen Zerlegung des Wechselwirkungs-Hamiltonians (2.23), ein DFT-Analogon zu Sucher's Level-Shift Formel abgeleitet, G1. (3.54). Mit Hilfe der Ausdrücke für die Gesamtenergie Etd (3.17), die Hartree-Energie EH (3.21) sowie die korrespondierenden Potentiale (3.29), (3.30) und der Grundzustandsenergie des nichtwechselwirkenden KS-Systems, (3.41), kann diese DFT Level-Shift Formel dann mit dem Austauschkorrelationsenergiefunktional in Verbindung gebracht werden. Der resultierende Ausdruck für den Level-Shift, G1. (3.55), liefert eine exakte Darstellung des Austauschkorrelationsenergiefunktionals der RDFT. Dieses Funktional ist ein implizites Dichtefunktional, da es von den KS-Orbitalen und Eigenwerten abhängt. Der Vergleich mit dem Ausdruck für Exc aus Kapitel 6.1, der das Ergebnis des in der DFT weit verbreiteten Kopplungskonstantenintegrations-Schemas ist, zeigt, dass beide Zugänge vollkommen äquivalent sind. Allerdings wurde die in dieser Dissertation erarbeitete DFT Level-Shift Formel analog zur Standard QED-Störungsreihe abgeleitet und stellt damit einen idealen Zugang für , die Untersuchung von QED-Effekten im Rahmen relativistischer DFT dar. Insbesondere beinhaltet unser Zugang das bekannte QED-Schema, wenn man im Störanteil des Hamiltonoperators (3.32) das KS-Potential ... (3.29) durch das Potential eines wasserstoffartigen Systems ersetzt. Eine selbstkonsistente Anwendung dieses Zugangs verlangt jedoch die Lösung der relativistischen OPM-Integralgleichung. Während in Kapitel 4 gezeigt wurde, dass dies für den transversalen Austausch relativ direkt möglich ist, ist bisher noch nicht explizit überprüft worden, wie Vakuumkorrekturen im Zusammenspiel mit der OPM-Integralgleichung zu berücksichtigen sind. Da eine solche Untersuchung den Rahmen der vorliegenden Arbeit gesprengt hätte, haben wir uns auf eine perturbative Auswertung der Ausdrücke für Vakuumpolarisation und Vertexkorrektur beschränkt. .....
Die Rolle des cAMP/CREB-Signalwegs in der noradrenergen Differenzierung sympathischer Nervenzellen
(2006)
Um die sympathische Differenzierung in Abwesenheit von CREB zu untersuchen, wurden zunächst Embryonen von CREB-Null-Mäusen analysiert. In diesen Mäusen wiesen die sympathischen Ganglien an Embryonaltag E10,5 und E12 keine Unterschiede in der Differenzierung zu heterozygoten und wildtyp-Ganglien auf. Es wurde deshalb vermutet, dass die mit CREB interagierenden Transkriptionsfaktoren CREM und ATF1 den Verlust von CREB im sympathischen Ganglion funktionell kompensieren. Da Mäuse mit einem Knock-out von CREB und CREM bereits vor E10 sterben, konnte die Entwicklung sympathischer Ganglien in diesen Mäusen nicht weiter untersucht werden. Durch Immunfärbung gegen ATF1 in CREB-deletierten Mäusen und in situ-Hybridisierung gegen CREM und ATF1 wurde gezeigt, dass im Rumpf der CREB-KO-Maus keine drastische Hochregulation der Expression beider Gene stattfindet. Eine geringfügige Hochregulation konnte aber nicht ausgeschlossen werden kann. Um die cAMP/CREB-Signaltransduktion in Ganglienvorläuferzellen auszuschalten, und Kompensation durch CREM und ATF1 zu umgehen, wurden die dominant-negative Effektoren ACREB und PKA-R(I)mut verwendet. ACREB blockiert die Funktion von CREB, CREM und ATF1 (Ahn et al., 1998). Durch PKA-R(I)mut sollte die Aktivität von PKA inhibiert werden. Die Funktionalität beider Effektoren wurde in differenzierenden Zellkulturen bestätigt. Um in vivo geeignete Expression der Inhibitoren zu erzielen, wurden verschiedene Methoden des Gentransfers im Huhnembryo erprobt. Durch Infektion der Neuralplatte des Embryos mit Retroviruskonzentrat konnte frühe embryonale Expression der dominant-negativen Effektoren in Neurallleistenzellderivaten erzielt werden. Die Expression von ACREB im Embryo zeigte, dass CREB in der initialen adrenergen Differenzierung bis E4 erforderlich ist, die sympathischen Ganglien wiesen reduzierte adrenerge Genexpression auf. In späteren Embryonalstadien ist dieser Effekt nicht mehr nachzuweisen. Im Gegensatz zur Inhibition von CREB, hatte die Inhibition von PKA durch PKAR(I)mut keine Auswirkungen auf die Ganglienentwicklung in vivo. Durch pharmakologische Inhibition von PKA wurden kleinere Ganglien erzielt, ein selektiver Effekt auf die adrenerge Differenzierung wurde auch in diesem in vivo Experiment nicht beobachtet. Dies widerspricht den Hinweisen aus Zellkultur auf die selektive Funktion von PKA in der adrenergen Differenzierung. Der Befund, dass die Funktion von CREB in vivo auf die initiale adrenerge Differenzierung sympathischer Neurone beschränkt ist, und nicht für den Erhalt adrenerger Differenzierung erforderlich ist, wurde in vitro in differenzierten sympathischen Neuronen des Embryo bestätigt. ACREB und PKA-R(I)mut hatten keine bzw. nur geringe Auswirkungen auf den Anteil TH-positiver Neurone in Kulturen sympathischer Neurone aus Embryonen der Embryonaltage E7 und E12. Somit konnte erstmals in vivo eine physiologische Rolle für CREB in der Differenzierung sympathischer Neurone gezeigt werden: CREB ist für die initiale Expression von TH erforderlich.
Im Beobachtungsintervall vom 01.01.1985 bis zum 31.12.1995 wurden 49 Patienten ab dem vollendeten 16. Lebensjahr in der Klinik für Allgemein- und Gefäßchirurgie der Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt/Main aufgrund eines Weichteilsarkoms therapiert. Von diesen wurden 22 Patienten zur Primärtherapie, 5 zur sekundären Herstellung der Radikalität nach extern erfolgter Primäroperation, 21 zur Rezidivtherapie – Lokalrezidiv oder Fernmetastase – und 1 Patienten zur Service- Operation – Einlage eines Expanders vor geplanter adjuvanter Radiatio nach extern erfolgter Primäroperation – eingewiesen. Untersucht wurden in der vorliegenden Studie Sarkomeigenschaften, Patientendaten, Diagnostik, Therapie und Follow up auf ihre Prognosesignifikanz hinsichtlich Lokalrezidivierungs-, Fernmetastasierungsrisiko und Gesamtüberleben. Trotz der relativ niedrigen Patientenzahl in der vorliegenden Studie fanden sich mit der Literatur vergleichbare Ergebnisse der hier untersuchten Sarkomeigenschaften: Die drei häufigsten Sarkomtypen waren Leiomyosarkome (13/49, 26,5%), maligne fibröse Histiozytome (13/49, 26,5%) und Liposarkome (9/49, 18,5%). Konform mit der Literatur zeigten die Liposarkome die signifikant günstigste Gesamtüberlebensprognose (10-Jahres Überlebensrate von 88,89%), was trotz einer hohen Lokalrezidivrate von 66,7% (6/9) mit der geringen Fernmetastasierungsrate von 33% (3/9) in Zusammenhang zu bringen ist. Eine T1-Sarkomgröße nach UICC stellte sich hinsichtlich Lokalrezidivierung und Gesamtüberleben übereinstimmend mit der Literatur als signifikant günstiger Prognosefaktor dar (p=0,031951 und p=0,004346). Es fand sich des weiteren konform mit der Literatur eine Lokalisationsbevorzugung am muskuloskelettalen System mit 57,1% (28/49). Eine muskuloskelettale Sarkomlokalisation stellte sich als statistisch signifikanter Überlebensvorteil heraus (p=0,001704). Die Begründung hierfür ist in der höheren Anzahl an hier befindlichen T1-Sarkomen (13/28, 46,4%) verglichen mit den intraabdominellen Sarkomen (1/21, 4,8%), der höheren adäquaten Operabilität (18/28, 64,3% vs. 8/21, 38,1%) sowie der insgesamt niedrigeren metachronen Fernmetastasierungsrate (12/28, 42,9% vs. 17/19, 89,5%) zu suchen. Eine intrakompartimentale Sarkomlokalisation nach Enneking wurde auch in der vorliegenden Studie als signifikant günstiger Prognosefaktor hinsichtlich Gesamtüberleben bestätigt (p=0,021523) mit einer 10-Jahres Überlebensrate von 78,57% vs. 40,76% für extrakompartimentale Sarkome. Dies lässt sich auf eine deutlich bessere adäquate Operabilität intrakompartimentaler gegenüber extrakompartimentaler Sarkome zurückführen (11/15, 73,3% vs. 15/34, 44,1%), deren allgemeine Eigenschaft es ist, zunächst in Richtung des geringsten Widerstandes innerhalb eines anatomisch definierten Kompartimentes zu wachsen. Analog hierzu konnte auch eine epifasziale Sarkomlokalisation nach den UICC Kriterien von 2002 als statistisch signifikanter Überlebensvorteil (p=0,031622) konform mit der Literatur bestätigt werden...
In dieser Arbeit wurde das Proteom synaptischer Vesikel mit Hilfe vier verschiedener elektrophoretischer Techniken in Kombination mit Massenspektrometrie eingehend charakterisiert. Die bisherigen Proteomansätze resultierten in der Identifizierung einer deutlich geringeren Anzahl von Proteinen. Bis auf wenige Ausnahmen wurden alle in der Literatur beschriebenen Proteine detektiert. Dies zeigt, daß die Verwendung der eingesetzten Techniken die umfassende Charakterisierung der Proteinbestandteile der Vesikel zuläßt. Ferner kann aus den Analysen geschlossen werden, daß zum jetzigen Zeitpunkt die technischen Grenzen für die Charakterisierung nicht weiter subfraktionierter synaptischer Vesikel erreicht sind. Die Anwendung der drei Techniken legt nahe, daß jede Technik ihre Vor- und Nachteile für die Identifizierung bestimmer Proteinklassen besitzt. Dies wurde bisher noch nicht in dieser Form gezeigt und liefert wertvolle Informationen für weitere Proteomanalysen. Zu den in der Summe 238 identifizierten Proteinen gehören neun Proteine, für die weder Lokalisations- noch Funktionsdaten vorliegen. Die zwei ausgewählten Proteine Svap30 und SV35 zeigen eine gliale bzw. neuronale Verteilung. SV35 befindet sich in Subpopulationen von Neuronen, die nach immunhistochemischer Untersuchung als GABAerg und glutamaterg zu werten sind. Welche Funktion dieses Protein in diesen Neuronen ausübt, bleibt zu klären. Analysen mittels RNA-Intereferenz in PC12-Zellen und Untersuchungen zur Änderung der catecholaminergen Transmitterausschüttung könnten erste Indizien liefern. Zudem könnte über Transfektion des Proteins in Oozyten die Identität des putativ transportierten Substrates bestimmt werden. All diese Arbeiten werden in Zukunft zu einer eingehenden Charakterisierung des Proteins beitragen.
Die sekretorischen Phospholipasen A2 (sPLA2) sind eine Familie von Enzymen, die die Fähigkeit besitzen, die Hydrolyse der mittleren (sn-2) Esterbindung aus Phospholipiden zu katalysieren. Die Produkte dieser Hydrolyse, freie Fettsäuren und Lysophospholipide, sind nicht nur Bausteine für die Synthese von Lipiden, sondern sie haben wichtige Funktionen als Lipid „second-messenger“ in zellulären Signaltransduktionsprozessen. In der Klasse der sekretorischen PLA2 wurden in Säugern bisher 10 Isoenzyme identifiziert, wobei die sPLA2-IIC beim Menschen nur als Pseudogen vorkommt. In der murinen Epidermis scheinen eines oder mehrere dieser Enzyme eine Rolle bei der Bildung der epidermalen Permeabilitätsbarriere zu spielen. Darüber hinaus kontrollieren sie die Freisetzung von Arachidonsäure für die Produktion von Eicosanoiden, die sowohl für die Proliferation der Keratinozyten als auch für inflammatorische Prozesse und die Entstehung von Tumoren in der Haut von entscheidender Bedeutung sind. Da bislang weder das detaillierte Expressionsmuster der einzelnen sPLA2-Enzyme noch deren spezifische Funktionen in muriner Epidermis bekannt war, wurde in der vorliegenden Arbeit eine umfassende Analyse an Schnitten von neonataler Maushaut und an murinen Papillomschnitten durchgeführt. Zusätzlich zum Nachweis der sPLA2-Expression in vivo wurden primäre murine Keratinozyten in vitro verwendet, um die Auswirkungen der Differenzierung der Keratinozyten auf die Expression der verschiedenen sPLA2-Enzyme zu untersuchen. Die Tumorzellinie HEL30 wurde zur Durchführung funktioneller Studien und für Kolokalisationsstudien verwendet. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut in vivo sowie in isolierten primären murinen Keratinozyten alle bisher bekannten sPLA2 Enzyme exprimiert sind. Für die sPLA2-IB, -IIE, -IIF, -V und -XII konnte sowohl in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut als auch in den primären Keratinozyten eine Expression vor allem in den differenzierten Zellen nachgewiesen werden. Dass diese Enzyme somit wahrscheinlich mit Differenzierungsprozessen gekoppelt sind, zeigte sich am Beispiel der sPLA2-V, die im murinen Papillom, welches vorwiegend aus proliferierenden Keratinozyten steht, nicht exprimiert war. Hingegen waren sPLA2 -IIA, -IID, und -X fast ausschließlich in Keratinozyten der Basalzellschicht der Epidermis und in den proliferierenden primären Keratinozyten exprimiert. Dies läßt vermuten, dass diese Enzyme eventuell eine Rolle bei der (Hyper-)Proliferation von Keratinozyten spielen. Darüber hinaus sind diese Enzyme auch in der Lage, Arachidonsäure freizusetzen, und sind somit eventuell an der Eicosanois-Homöostase beteiligt. Um eine eventuelle Beteiligung der basal exprimierten sPLA2 Enzyme an der Eicosanoidbiosynthese nachzuweisen, wurden Immunfluoreszenzstudien an neonataler Maushaut und an murinen Hautpapillomen des 2-Stufen-Tumorpromotionsmodells durchgeführt. Wie zuvor beschrieben waren alle drei Enzyme in der Basalzellschicht der neonatalen Maushaut exprimiert. Im Gegensatz dazu war die sPLA2-IIA im murinen Papillom nur am äußersten, nicht mehr hochproliferativen, Papillomrand zu detektieren. Die sPLA2-X dagegen zeigte eine starke Expression in den hochproliferativen basalen Keratinozyten dieses Gewebes. Für die sPLA2-IID konnte im Papillom ein Expressionsmuster festgestellt werden, das bis in die suprabasalen Schichten reicht. Betrachtet man die Expression der phospho-cPLA2, so konnte dieses Enzym in der neonatalen Maushaut vor allem in der Basalzellschicht, aber auch suprabasal im Stratum spinosum detektiert werden. Im Papillom zeigt dieses Enzym dagegen eine sehr starke Expression im gesamten Gewebe. Wie erwartet konnte COX-2 in der neonatalen Maushaut nicht detektiert werden, während das Expressionsmuster dieses Enzymes im Papillom mit dem der sPLA2-IID und phospho-cPLA2 korreliert Um Hinweise über die Expression und Funktion von sPLA2 –IID, -X und cP LA2 im Karzinom zu bekommen, wurde als Modellsystem die murine Karzinomzelllinie HEL30 verwendet. Diese Zellen produzieren bereits konstitutiv eine hohe Menge an PGE2. Eine TPA Stimulation dieser Zellen induziert eine zusätzlich stark erhöhte PGE2 Produktion. Anhand der Ergebnisse aus den Western Blot Analysen konnte gezeigt werden , dass sPLA2-IID und -X in den HEL30-Zellen auf Proteinebene exprimiert sind, jedoch konnte keine Veränderung der Proteinexpression dieser beiden Enzyme nach TPA-Behandlung der HEL30 Zellen detektiert werden. Dies führte zu der Annahme, dass diese Enzyme eventuell, wie die cPLA2, über ihre Enzymaktivität oder eine zelluläre Translokation reguliert werden. Durch den Einsatz des sPLA2-Inhibitors Me-Indoxam konnte jedoch weder die konstitutive noch die TPA-stimulierte PGE2 Produktion gehemmt werden, was vermutlich, wie die anschließenden siRNA Studien zeigen, auch an der Eigenschaft dieses Inhibitors liegen könnte nicht membrangängig zu sein. Weiterhin konnte durch den Einsatz des COX-2-spezifische Inhibitors Celecoxib und des COX-1-präferierende Inhibitor Indomethazin gezeigt werden, dass COX-2 vor allem an der TPA induzierte PGE2-Freisetzung, und COX-1 sowohl an der konstitutiven als auch an der der TPA induzierten PGE2-Freisetzung aus HEL30 Zellen beteiligt sind. Die Ergebnisse der Untersuchungen mit dem cPLA2-Inhibitor Pyrrolidin-1 lassen vermuten, dass in diesen Zellen die cPLA2 vor allem an der TPA induzierten PGEs-Synthese beteiligt ist, aber nicht an der konstitutiven Freisetzung. Während in unbehandelten HEL30 Zellen die sPLA2-IID im Cytosol exprimiert ist und eine schwache Kolokalisation mit COX-2 zeigt, verlagert sich dieses Enzym nach 20 minütiger TPA Stimulation, in Richtung Kernmembran und zeigt nun eine sehr starke Kolokalisation mit COX-2. Nach Inkubation der HEL30 Zellen mit einer siRNA, die die Expression der sPLA2-IID ausschalten sollte, war sowohl die konstitutive als auch die TPA-induzierte PGE2-Biosynthese signifikant reduziert. Gleichzeitig konnte durch den Einsatz der siRNA eine Reduktion des sPLA2-IID-Proteins beobachtet werden. Dies deutet an, dass die sPLA2-IID mit beiden Cyclooxygenasen gekoppelt sein könnte und ihr Substrat je nach Stimulation und Änderung der Lokalisation dem einen oder dem anderen Enzym zur Verfügung stellt. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die sPLA2-IID intrazellulär katalytisch aktiv ist und signifikant zur PGE2-Biosynthese beiträgt. Um genauere Aussagen über die Bedeutung dieser sehr interressanten Ergebnisse machen zu können, sind weitere Untersuchungen nötig, um herrauszufinden, ob die Herunterregulierung der sPLA2-IID - z.B. in Form einer sPLA2-IID-knockout-Maus - Konsequenzen für die Hyperproliferation derKeratinozyten hat, und somit einen Einfluß auf die Progression der Tumorpromotion ausüben könnte. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein spezifisches Expressionsmuster für die Gruppen I, II, V, X und XII sPLA2 in der murinen Haut beschrieben werden, welches mit der Regulation von Wachstum und Differenzierung verbunden ist. Hieraus läßt sich schließen, dass die einzelnen sPLA2 Enzyme unterschiedliche Funktionen in der epidermalen Homöostase sowohl unter normalen als auch pathologischen Bedingungen ausüben.
In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Allergie gegen Süßkirsche untersucht. Zunächst wurde die Leistungsfähigkeit eines professionellen Tests mit re-kombinanten Allergenen aus Süßkirsche untersucht. Hierzu wurden rPru av 1, 3 und 4 einzeln eingesetzt, um die Sensibilisierungsmuster von Kirschallergikern aus Mitteleuropa und Spanien zu untersuchen. Vor allem die Untersuchung LTP-sensibi-lisierter Patienten aus diesen Regionen in einer Zahl, die einen statistischen Ver-gleich ermöglichte, offenbarte neue Aspekte des Phänomens schwerer Reaktionen bei solchen Patienten. Die drei rekombinanten Kirschallergene wurden auch kombiniert in einem einzigen Test eingesetzt, um schwer standardisierbare Proteinextrakte als Hilfsmittel zur in vitro Diagnose zu ersetzen. Um die Leistungsfähigkeit dieses Tests umfassend beurteilen zu können, wurde sie mit der des SPT in Birkenpollenallergikern mit und ohne Kirschallergie verglichen. Die mögliche Bedeutung unbekannter Allergene oder Isoformen wurde durch die Abschätzung des Beitrags der bekannten Kirschallergene zum IgE-Bindungsanteil von Kirschextrakt untersucht. Mit dem ImmunoCAP konnten die bereits veröffentlichten regional unterschiedlichen Sensibilisierungsmuster bestätigt werden. Die dominierende Rolle des Bet v 1-Homologen Pru av 1 in Patienten aus Mitteleuropa und damit die Bedeutung der Birkenpollenassoziation in dieser Region, konnte ebenso bestätigt werden wie die überragende Relevanz von Pru av 3 für Kirschallergiker aus Spanien. Der Vergleich der größten bisher publizierten und für statistische Untersuchungen ausreichend großen Gruppe LTP-sensibilisierter Patienten aus Mitteleuropa mit solchen Patienten aus Spanien, legte im Gegensatz zu früheren Studien keine ausschließlich auf die molekularen Eigenschaften von Pru av 3 beschränkte Assoziation von sys-temischen Reaktionen und einer Sensibilisierung gegen LTPs nahe. Die Assoziation scheint eher zwischen der Herkunft LTP-sensibilisierter Patienten und systemischen Reaktionen zu bestehen. Diese Schlussfolgerung konnte gezogen werden, da bei keinem der LTP-sensibilisierten Patienten aus Mitteleuropa systemische Reaktionen auftraten. Weder eine Co-Sensibilisierung gegen Pollen noch eine Allergie gegen andere Nahrungsmittel wie zum Beispiel Pfirsich korrelierten mit dem Auftreten sys-temischer Reaktionen. Eine Erklärung für dieses Phänomen konnte aus den vor-liegenden Daten daher nicht abgeleitet werden. Die Leistungsfähigkeit des rMix-ImmunoCAP mit rPru av 1, 3 und 4 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche war exzellent. Weder der kommerziell erhältliche Extrakt-ImmunoCAP noch der ImmunoCAP, der einen optimierten Extrakt an der Festphase trug konnte mit diesem Test konkurrieren. Die klinische Sensitivität des rMix-ImmunoCAP war mit ≥95% hervorragend, und der Test stimmte in 92% der Fälle mit dem SPT überein. Eine Unterscheidung zwischen Birkenpollenallergikern ohne Allergie gegen Süßkirsche und Kirschallergikern war hingegen weder mit dem rMix-ImmunoCAP noch mit dem SPT möglich. Die Spezifität beider Tests war von klinisch insignifikanter IgE-Reaktivität gegen Pru av 1 beeinträchtigt und auch die Konzentration spezifischen IgEs erlaubte keine Unterscheidung zwischen beiden Gruppen auf der Ebene einzelner Patienten. Der rMix-ImmunoCAP ist aber sehr gut geeignet eine Sensibilisierung bei einem Verdacht einer Allergie gegen Süßkirsche nachzuweisen, ohne auf weitere Allergene wie Pru av 2 oder Isoformen von Pru av 1 zurückgreifen zu müssen. Damit wurde zum ersten Mal ein diagnostischer Test ein-gesetzt, der einen Proteinextrakt aus Früchten vollständig ersetzen kann Die quantitative Abschätzung des Beitrages der bereits bekannten Allergene aus Süßkirsche zur IgE-Bindung mittel EAST-Inhibition hat gezeigt, dass bei einem Großteil der untersuchten Seren erhebliche Anteile des IgEs gegen Süßkirsche nicht erfasst werden. Die Ursache für dieses Phänomen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend aufgeklärt werden, aber es ist als sehr wahrscheinlich anzu-sehen, dass die neu identifizierte Isoform von Pru av 1 zumindest bei einem Teil der Seren hierfür verantwortlich ist. Darüber hinaus waren im Immunoblot bei Seren bei denen die IgE-Bindung nicht vollständig zu inhibieren war IgE-Reaktivität gegen noch unbekannte Strukturen zu erkennen. Neben der Beteiligung glykosilierter Proteine war auch eine Beteiligung von Pru av 2 nicht vollständig auszuschließen, wenngleich im Verlauf dieser Arbeit keine Hinweise auf eine Relevanz dieses Allergens in dem untersuchten Patientenkollektiv gefunden werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Grundlagen gelegt, um die Allergenität von Süßkirsche in einem in vitro Modell zu reduzieren. Es wurden Isoformen von Pru av 1 mit einer Kombination aus molekularbiologischen und proteinchemischen Methoden untersucht. Es wurden hierzu Techniken gewählt, die eine weitgehend um-fassende und zuverlässige Identifizierung von Isoformen ermöglichten. Ferner wurde der Gehalt an Pru av 1 von verschiedenen Kirschsorten verglichen, das Splice-Intron von Pru av 1 sequenziert, um die Herstellung eines spezifischen und wirksamen RNAi-Konstruktes zu ermöglichen, sowie die Eignung in vitro regenerierter Kirschpflanzen als Zielorganismus durch den Nachweis von Pru av 1 in den Blättern solcher Pflanzen geprüft. Die in dieser Arbeit verwendeten Methoden haben sich als geeignet erwiesen zuverlässig Isoformen von Allergenen zu identifizieren. Es konnte mit Hilfe einer syn-ergistischen Kombination aus einer cDNA-Bibliothek, PCR, und 2-D-PAGE / MS mit Pru av 1.02 eine neue Isoform von Pru av 1 identifiziert werden. Die mit den molekularbiologischen Methoden erzielten Ergebnisse stimmten dabei mit den Re-sultaten der proteinchemischen Untersuchungen sehr gut überein. In beiden Fällen wurden zwei Pru av 1 Isoformen nachgewiesen und lediglich die eine Variante von Pru av 1.02 mit sehr hoher Sequenzidentität konnte nicht als Protein nachgewiesen werden. Die auf Protein- und DNA-Ebene übereinstimmenden Ergebnisse bezüglich der beiden IgE-bindenden Isoformen, lassen darüber hinaus auf eine weitgehend vollständige Erfassung der Pru av1 Isoformen schließen. Pru av 1.02 besteht aus drei Varianten und zeigte ein anderes IgE-Bindungs-verhalten als das bereits bekannte Pru av 1.0101. Diese Isoform ist daher sowohl für eine zukünftige gentechnische Reduzierung der Allergenität von Süßkirsche als auch für diagnostische Zwecke bedeutsam. Für eine erfolgreiche Reduzierung der Aller-genität von Süßkirsche muss die Expression aller IgE-reaktiven Isoformen des in Mitteleuropa dominierenden Allergens Pru av 1 unterdrückt werden. Wenngleich Pru av 1.0201 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche nicht not-wendig erscheint, könnte sie jedoch sowohl einen Einfluss auf die Höhe der gemes-senen IgE-Werte und die Ausbildung von Symptomen haben, als auch besser ge-eignet sein zwischen Birkenpollenallergikern mit und ohne Allergie gegen Süßkirsche zu unterscheiden. Abschließend wurden dann die Grundlagen für die gentechnische Redu-zierung der Allergenität von Süßkirsche geschaffen. Der Gehalt an Pru av 1 war in allen elf Kirschsorten sehr ähnlich, und erlaubt daher alle untersuchten Kirschsorten als Ausgangsmaterial einzusetzen. Die Sequenzierung des Splice-Introns aus Pru av 1 ermöglicht es jetzt ein intron-spliced hairpin RNAi-Konstrukt herzustellen. Dieses Konstrukt könnte dann eingesetzt werden, um die Reduktion der Allergenität von Süßkirsche experimentell in einem in vitro Modell zu zeigen. Mit dem Nachweis von Pru av 1 in den Blättern in vitro regenerierter Kirschpflanzen konnte gezeigt werden, dass die Voraussetzungen hierzu gegeben sind.
In dieser Arbeit wurde die Verteilung von Glykolyseenzymen in Kulturzellen unter normalen und die Glykolyse stimulierenden und hemmenden Bedingungen untersucht. Die Hauptfunktion, die der Strukturbindung und -Bildung von Glykolyseenzymen zugeschrieben wird, ist das so genannte metabolite-channelling bzw. substratechannelling, also die effiziente, lokale Bereitstellung von ATP. Im Mittelpunkt dieser Untersuchungen stand Aldolase (EC 4.1.2.13). Unter allen Bedingungen liegt Aldolase, wie die meisten anderen Glykolyseenzyme gleichzeitig sowohl in strukturgebundener, als auch in gelöster Form im Cytoplasma vor. Unter normalen Kulturbedingungen wurde die strukturgebunde Aldolase an Stressfasern sowie dem fibrillären Aktin-Netzwerk des Zellkortex vorgefunden. Diese Beobachtungen wurden an fixierten Zellen gemacht; an lebenden Zellen konnte die Bindung an Stressfasern durch Mikroinjektion fluorochromierter Aldolase direkt nachgewiesen werden. Ferner wurde beobachtet, dass Aldolase selbst, unabhängig vom Vorhandensein von Aktin in der Zelle netzwerkartige Strukturen bilden kann. Das Hinzufügen von Aldolase zu in vitro polymerisierten Aktinfilamenten führte zu einer Bündelung der Aktinfilamente, die wahrscheinlich auf eine quervernetzende Wirkung dieses Enzyms zurückzuführen ist. Durch Injektionen mit Gemischen unterschiedlich markierter Glykolyseenzyme konnte gezeigt werden, dass diese Enzyme auch in gelöster Form nicht völlig homogen in den Zellen verteilt sind. In Gegenwart hoher Substratkonzentrationen wurde entdeckt, dass Aldolase in großem Ausmaß an Intermediärfilamente gebunden wird. Da dieses Verhalten zwar unabhängig von der Präparationsmethode auftrat, in vitro durch Kosedimentation aber nicht bestätigt werden konnte, ist anzunehmen, dass neben dem Substrat weitere Faktoren bei diesem Phänomen eine Rolle spielen. Die Applikation von Insulin führte zu keinerlei mikroskopisch beobachtbaren Änderungen im Bindungsverhalten der Aldolase. Dennoch konnte eine geringe Steigerung der Aktivität in der unlöslichen Fraktion des Zellproteins nachgewiesen werden. Die Mikroinjektion unphysiologisch hoher Mengen von Aldolase führte zu einem drastischen Abbau von Aktinfilamenten und Stressfasern in den injizierten Zellen. Andere Glykolyseenzyme (GAPDH, PGM, LDH und TIM) zeigten dagegen keinerlei Wirkung. Der selbe Effekt ist bereits für PFK beschrieben worden, wo er durch eine starke Assoziation der PFK mit Gelsolin hervorgerufen wird. Der Wirkungsmechanismus bei der Aldolase ist dagegen bislang nicht bekannt. Durch die Inkubation fixierter Zellen mit fluorochromierter Aldolase wurden eine große Zahl freier Bindungsstellen an Mikrotubuli entdeckt. Allerdings konnten keine Bedingungen ermittelt werden, unter denen die intrazelluläre Aldolase an Mikrotubuli bindet. Weiterhin wurde ein Experiment entworfen, um die lokale Bereitstellung von Energie in Form von ATP und metabolite-channelling nachzuweisen. Dazu wurden Monolayerkulturen durch Hemmung von Atmung und Glykolyse ATP-entleert und durch Permeabilisierung alle löslichen Bestandteile freigesetzt. Die Gabe verschiedener ATP-Konzentrationen führte in diesem Fall zu einer Kontraktion der verbleibenden Zellbestandteile, wobei die Kontraktionsgeschwindigkeit abhängig von der gegebenen ATPKonzentration war. Durch die Gabe von FBP und ADP konnte diese Kontraktion ebenfalls ausgelöst werden, was für die Konversion von ADP zu ATP wodurch ein von FBP und den strukturgebundenen Enzymen unterhaltener glykolytischen FluSS und somit metabolite-channelling nachgewiesen wurde.
Ziel der vorliegenden Arbeit sind Strukturuntersuchungen an geplant gezüchteten Einkristallen elektronenreicher Iod- und Schwefel-Verbindungen, ergänzt durch zugehörige Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen. Besonderes Augenmerk gilt insbesondere Molekülen mit Thiophenyl-Substituenten R-S-(C6H5) und ihren isovalenzelektronischen Derivaten vom Typ R-NH-(C6H5) sowie den bisher unbekannten Donator/Akzeptor-Komplexen des Iodanils. Durch optimierte Auswahl jeweils geeigneter Lösungsmittel und Kristallisationsbedingungen gelingt es, zahlreiche unterschiedliche Typen kristalliner Nichtmetall-Verbindungen zu züchten. Die Strukturen der isolierten Einkristalle werden durch Vergleich mit bereits literaturbekannten sowie anhand quantenchemischer Berechnungen diskutiert und vertiefen das Verständnis der experimentellen Befunde wesentlich. ... Insgesamt belegen die in der Dissertation detalliert beschriebenen Ergebnisse, daß Kombinationen von gezielter Kristallzüchtung, anschließender Strukturbestimmung und quantenchemische Berechnungen zahlreiche Informationen über Wechselwirkungen in Kristallen liefern. So verdeutlicht die anschauliche Betrachtung der I2-Komplexe durch zugehörige Einkristallstrukturen sowie quantenchemische Modellrechnungen, daß auch geringe Wechselwirkungen teils beträchtliche Einflüsse auf Stöchiometrien und Strukturparameter in Kristallen ausüben. Das Schlußbeispiel Tris(thiophenyl)methan-Dimer belegt durch alle notwendigen Messungen wie Kristallstrukturanalyse, quantenchemische hochkorrelierte Berechnungen und massenspektrokopische Messungen, wie sich durch das Zusammenwirken moderner Methoden unerwartete Ergebnisse für einen neuartigen Verbindungstyp festigen lassen. Die lohnenden Ergebnisse der Untersuchungen erweitern die Kenntnisse statischer Aspekte bei Selbstorganisations-Phänomenen.