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Im Rahmen dieser Arbeit wurde die humane Leukotrien A4-Hydrolase untersucht.
Die hLTA4H ist ein bifunktionelles Enzym, welches neben der Hydrolaseaktivität, welche für die Umwandlung des instabilen LTA4 zu LTB4 verantwortlich ist, auch eine Peptidaseaktivität aufweist. Beide Enzymaktivitäten spielen bei Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle, weshalb die LTA4H ein interessantes pharmakologisches Target darstellt. Aufgrund der gegensätzlichen Eigenschaften der beiden Aktivitäten der LTA4H (Produktion des proinflammatorischen LTB4 durch die Hydrolase-Aktivität, sowie der Abbau des PGP-Tripeptids durch die Peptidase-Aktivität) wird deutlich, dass die Entwicklung selektiver Hydrolase-Inhibitoren von Vorteil ist.
Das Protein der humanen LTA4H konnte erfolgreich kloniert werden und in E. coli-Zellen exprimiert werden. Zur Gewinnung des reinen rekombinanten Proteins konnte ein Aufreinigungsprotokoll mittels Nickel-Affinitätschromatographie sowie anschließender Größenausschlusschromatographie etabliert werden. Durch die Testung unterschiedlicher Lysemethoden konnte die Ausbeute deutlich erhöht werden.
Um herauszufinden, ob es durch den potentiellen Inhibitor zu einer Hemmung der Enzymaktivität kommt, muss diese detektiert werden können. Hierfür wurde ein geeignetes fluoreszenzbasiertes Testsystem zur Detektion der Enzymaktivität der hLTA4H entwickelt. Dies lässt auch die Quantifizierung der Wirksamkeit der möglichen Inhibitoren zu. Mit Hilfe eines pharmakophorbasierten Ansatzes wurden 22 Testsubstanzen für die in vitro Testung ausgewählt. Nach der Evaluierung dieser Substanzen wurden weitere 14 Derivate der besten Verbindung ausgewählt und ihre inhibitorischen Eigenschaften an rekombinanter LTA4H getestet. Die Ergebnisse wurden mittels Differential Scanning Fluorimetrie validiert, wofür ein einfaches Protokoll etabliert werden konnte.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 5 bereits bekannte Inhibitoren der LTA4H ausgewählt, um sie hinsichtlich ihres thermodynamischen Profils zu untersuchen. Hierzu wurden die ausgewählten Inhibitoren mittels Isothermer Titrationskalorimetrie vermessen. Die Dissoziationskonstanten der untersuchten Inhibitoren wurden ebenfalls mittels Differential Scanning Fluorimetrie bestimmt, wobei sich zeigte, dass diese Methode nicht zur präzisen Messung von Protein/Ligand Interaktionen herangezogen werden kann. Mittels eines in silico Ansatzes zur Vorhersage von stabilisierten und destabilisierten Wassermolekülen in der Bindetasche konnten die thermodynamischen Daten im strukturellen Kontext interpretiert werden. Durch diese Kombination konnten neue Erkenntnisse zum Design neuer Inhibitoren der LTA4H gewonnen werden.
Die NADPH-Oxidasen stellen eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoffspezies (Reactive oxygen species; ROS) im Organismus dar. Hierbei dienen die NADPH-Oxidasen nicht nur der Pathogenabwehr, sondern haben einen Einfluss auf eine Vielzahl an oxidativen, physiologischen Prozessen. Unter den NADPH-Oxidasen ist NOX4 einzigartig, da es hauptsächlich im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert ist, konstitutiv aktiv ist und Wasserstoffperoxid (H2O2) produziert. Wir vermuten, dass diese besonderen Eigenschaften eine Konsequenz aus der Interaktion mit bislang unentdeckten NOX4-interagiereden Proteinen ist.
Zweidimensionale blau-native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) kombiniert mit SDS-PAGE zeigte NOX4 in makromolekularen Komplexen. Interagierende Proteine wurden durch eine quantitative SILAC (stable isotope labeling of amino acids in cell culture)-Co-immunopräzipitation (Co-IP) in NOX4-überexprimierenden HEK293-Zellen gescreent. Hierdurch konnten verschiedene interagierende Proteine identifiziert werden, wobei Calnexin die robusteste Interaktion aufwies. Calnexin konnte zudem in NOX4-haltigen Komplexen durch Complexome Profiling der BN-PAGE oder gleichzeitiger Antikörperfärbung nachgewiesen werden. Die Calnexin-NOX4-Interaktion konnte mittels reverser Co-IP und Proximity ligation assay bestätigt werden, während NOX1, NOX2 und NOX5 nicht mit Calnexin interagierten. Calnexin-Defizienz, untersucht in embryonalen Mausfibroblasten oder durch shRNA gegen Calnexin, reduzierte die NOX4-Proteinexpression und ROS-Bildung, wobei die mRNA-Expression unverändert blieb. Des Weiteren wurde untersucht, ob der bekannte Interaktionspartner von NADPH-Oxidasen, p22phox, wirklich essentiell für die Expression oder Aktivität von NOX4 ist, da es nur in manchen der NOX4-Co-IPs nachgewiesen wurde. Um den Einfluss von p22phox für NOX4 aufzuklären wurde ein CRISPR/Cas9 Knockdown in NOX4-überexprimierenden HEK293 Zellen etabliert. p22phox zeigte keinen Einfluss auf die NOX4-Expression, jedoch war die NOX4-abhängige ROS-Produktion in p22phox-Knockout Zellen verschwunden.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass endogenes NOX4 makromolekulare Komplexe mit Calnexin ausbildet, welches für die korrekte Reifung, Prozessierung und Funktion von NOX4 im ER nötig ist. Darüber hinaus ist p22phox nicht für die Reifung von NOX4, aber für dessen Aktivität nötig. Diese Ergebnisse zeigen eine vielfältige Regulation von NOX4 auf Proteinebene.
Cells perform a wide range of functions such as signalling, transportation, immunoprotection and metabolism. Unravelling the molecular mechanism behind those processes will provide a platform for more targeted and rational drug design. This is achieved by discerning the structural and functional aspects of the biological macromolecules involved. This thesis discusses about the biophysical characterization of protein structures and the biological importance of protein dynamics. Membrane receptors and enzymes which are ubiquitously present in our biological systems and regulate wide variety of functions are excellent choice for such study. From a pharmaceutical point of view, receptor and enzymes are exceptionally important drug targets as they represent the major share (receptor, 30% and enzymes, 47%) of all marketed drugs. Therefore, apart from biological insights, the detailed study of receptors and enzymes will provide the basis for new pharmaceutical applications. Most information about receptor activation and enzyme activity come from the structural and functional analysis of target members of the above mentioned systems.
In “Chapter 1 – General Introduction” the readers are introduced to the world of proteins with special focus on G-protein coupled receptors (GPCRs) and methyltransferases. The first part of this chapter discusses about GPCRs with emphasis on their classification, structural features and functions. GPCRs are the most abundant membrane receptors present in mammalian cells, accounting for almost 15% of all membrane proteins. The GPCR superfamily consists of ~800 members and can be subdivided into six classes (A-F). Class A containing rhodopsin, peptide hormones, olfactory GPCRs, is the most abundant with a large share of 85% of GPCR protein family. GPCRs share a common architecture of 7 transmembrane a-helices, with different ligand binding sites. Although a variety of ligands ranging from subatomic particles (a photon) to large proteins can activate a GPCR, their mechanism of signal transduction is almost similar. There are two major signal transduction pathways identified for GPCRs: the cAMP pathway and the phosphatidylinositol pathway. The therapeutic relevance of GPCRs has also been pointed out here since a large share (30%) of modern marketed drugs target GPCRs.
In the second part of this chapter, the structural and functional characterizations of methyltransferases (MTs) are discussed in detail. Several important biological processes in cells e.g. drug metabolism, gene transcription, epigenetic regulations are modulated by methylation of targets ranging from small biomolecules to large proteins. MTs are the proteins which catalyze this methylation reaction and transfer the methyl group to an acceptor molecule through SN2 like nucleophilic substitution reaction. The MTs can be classified on the basis of the substrate atoms they methylate: O (54% of all MTs), N (23%), C (18%), S (3%) and other acceptors (such as halides; 2%). They can also be categorized into five different classes (Class I-V) depending upon distinctive structural features facilitating substrate binding or catalytic activity. Rossmann fold and SET (acronym acquired from the Drosophila Su(var)3-9 and 'Enhancer of zeste' proteins) domain are the two characteristic structural motifs commonly found in MTs. Similar to GPCRs, MTs dysfunction has been shown to be involved in various diseases including neuropsychiatric diseases and cancer. Therefore they are also interesting targets for drug development. The final part of this chapter discusses the importance of structural biology in gathering information related to structure and conformational dynamics of proteins. The two prominent biophysical techniques used in structural biology, X-ray crystallography and NMR, are discussed with focus on their advantages and limitation. The importance of NMR spectroscopic techniques to investigate different dynamic processes of protein at atomic resolution under physiological conditions is also discussed. Real time NMR spectroscopy required for the analysis of slow protein dynamic processes (protein folding, enzyme catalysis, domain rearrangement) has been explained in detail.
The second part of the thesis (Chapters 3-4), which is the cumulative part, comprises the original publications grouped into 2 chapters according to their topic:
• NMR-spectroscopic characterization of the transiently populated photointermediates of bovine rhodopsin and it’s interaction with arrestin (Chapter 3)
• Structural and biophysical characterization of PaMTH1, a putative SAM dependent O-methyltransferase from filamentous fungi Podospora anserina (Chapter 4)
Each chapter is initiated by a detailed introduction to the topic, providing the framework for the following papers. The personal contribution of this thesis’ author to each publication is stated in the introduction to the respective article.
The Large Hadron Collider (LHC) is the biggest and most powerful particle accelerator in the world, designed to collide two proton beams with particle momentum of 7 TeV/c each. The stored energy of 362MJ in each beam is sufficient to melt 500 kg of copper or to evaporate about 300 litre of water. An accidental release of even a small fraction of the beam energy can cause severe damage to accelerator equipment. Reliable machine protection systems are necessary to safely operate the accelerator complex. To design a machine protection system, it is essential to know the damage potential of the stored beam and the consequences in case of a failure. One (catastrophic) failure would be, if the entire beam is lost in the aperture due to a problem with the beam dumping system.
This thesis presents the simulation studies, results of a benchmarking experiment, and detailed target investigation, for this failure case. In the experiment, solid copper cylinders were irradiated with the 440GeV proton beam delivered by the Super Proton Synchrotron (SPS) at the High Radiation to Materials (HiRadMat) facility at CERN. The experiment confirmed the existence of the so-called hydrodynamic tunneling phenomenon for the first time. Detailed numerical simulations for particle-matter interaction with FLUKA, and with the two-dimensional hydrodynamic code, BIG2, were carried out. Excellent agreement was found between the experimental and the simulation results that validate predictions for the 7TeV beam of the LHC. The hydrodynamic tunneling effect is of considerable importance for the design of machine protection systems for accelerators with high stored beam energy. In addition, this thesis presents the first studies of the damage potential with beam parameters of the Future Circular Collider (FCC).
To detect beam losses due to fast failures it is essential to have fast beam instrumentation. Diamond based particle detectors are able to detect beam losses within a nanosecond time scale. Specially designed diamond detectors were used in the experiment mentioned above. Their efficiency and response has been studied for the first time over 5 orders of bunch intensity with electrons at the Beam Test Facility (BTF) at INFN, Frascati, Italy. The results of these measurements are discussed in this thesis. Furthermore an overview of the applications of diamond based particle detectors in damage experiments and for LHC operation is presented.
Already today modern driver assistance systems contribute more and more to make individual mobility in road traffic safer and more comfortable. For this purpose, modern vehicles are equipped with a multitude of sensors and actuators which perceive, interpret and react to the environment of the vehicle. In order to reach the next set of goals along this path, for example to be able to assist the driver in increasingly complex situations or to reach a higher degree of autonomy of driver assistance systems, a detailed understanding of the vehicle environment and especially of other moving traffic participants is necessary.
It is known that motion information plays a key role for human object recognition [Spelke, 1990]. However, full 3D motion information is mostly not taken into account for Stereo Vision-based object segmentation in literature. In this thesis, novel approaches for motion-based object segmentation of stereo image sequences are proposed from which a generic environmental model is derived that contributes to a more precise analysis and understanding of the respective traffic scene. The aim of the environmental model is to yield a minimal scene description in terms of a few moving objects and stationary background such as houses, crash barriers or parking vehicles. A minimal scene description aggregates as much information as possible and it is characterized by its stability, precision and efficiency.
Instead of dense stereo and optical flow information, the proposed object segmentation builds on the so-called Stixel World, an efficient superpixel-like representation of space-time stereo data. As it turns out this step substantially increases stability of the segmentation and it reduces the computational time by several orders of magnitude, thus enabling real-time automotive use in the first place. Besides the efficient, real-time capable optimization, the object segmentation has to be able to cope with significant noise which is due to the measurement principle of the used stereo camera system. For that reason, in order to obtain an optimal solution under the given extreme conditions, the segmentation task is formulated as a Bayesian optimization problem which allows to incorporate regularizing prior knowledge and redundancies into the object segmentation.
Object segmentation as it is discussed here means unsupervised segmentation since typically the number of objects in the scene and their individual object parameters are not known in advance. This information has to be estimated from the input data as well.
For inference, two approaches with their individual pros and cons are proposed, evaluated and compared. The first approach is based on dynamic programming. The key advantage of this approach is the possibility to take into account non-local priors such as shape or object size information which is impossible or which is prohibitively expensive with more local, conventional graph optimization approaches such as graphcut or belief propagation.
In the first instance, the Dynamic Programming approach is limited to one-dimensional data structures, in this case to the first Stixel row. A possible extension to capture multiple Stixel rows is discussed at the end of this thesis.
Further novel contributions include a special outlier concept to handle gross stereo errors associated with so-called stereo tear-off edges. Additionally, object-object interactions are taken into account by explicitly modeling object occlusions. These extensions prove to be dramatic improvements in practice.
This first approach is compared with a second approach that is based on an alternating optimization of the Stixel segmentation and of the relevant object parameters in an expectation maximization (EM) sense. The labeling step is performed by means of the _−expansion graphcut algorithm, the parameter estimation step is done via one-dimensional sampling and multidimensional gradient descent. By using the Stixel World and due to an efficient implementation, one step of the optimization only takes about one millisecond on a standard single CPU core. To the knowledge of the author, at the time of development there was no faster global optimization in a demonstrator car.
For both approaches, various testing scenarios have been carefully selected and allow to examine the proposed methods thoroughly under different real-world conditions with limited groundtruth at hand. As an additional innovative application, the first approach was successfully implemented in a demonstrator car that drove the so-called Bertha Benz Memorial Route from Mannheim to Pforzheim autonomously in real traffic.
At the end of this thesis, the limits of the proposed systems are discussed and a prospect on possible future work is given.
Die vorliegende Dissertation untersucht wie Hegel nicht nur den Begriff der Freiheit, aber auch das Subjekt der Freiheit verstanden hat. Sie versucht diese Idee Hegels durch die gegenwärtige Philosophie, insbesondere die analytische Philosophie, und auch die Soziologie, insbesondere die Soziologie von Talcott Parsons, umzudenken.
Im ersten Kapitel wird die Idee der Freiheit als private Sphäre analysiert, die durch eine ganze Gruppe von subjektiven Rechten gesichert oder sogar geschaffen ist, die ohne Hilfe anderer Struktur existierte und von den meisten Naturrechttheoretiker verteidigt wurden, den alten sowie den neuen. Hegel nannte diese Ideen abstraktes Recht. Er wirft diese Vorstellung als noch funktional unvollständig oder metaphysisch inkohärent vor.
Im zweiten Kapitel wird das andere große Modell der Freiheit in der Moderne, nämlich, die Freiheit als Autonomie analysiert. Hegel untersucht diese Idee durch die Konzepte der Verantwortlichkeit und Handelns, die sich in der Praxis des Strafrechts befinden. Nach Hegel ist Verantwortlichkeit das Ergebnis einer gesamten sozialen Beziehung der Anerkennung. Daher ist ein Verbrechen, erstens, die Verletzung einer Norm und diese Normverletzung ist zugleich Anerkennungsverletzung. Zweitens, ein Verbrechen ist die Negation des objektiven Rechts, die dem Akteur zurechnen werden kann, und das ist, warum ein Verbrechen eine Anerkennungsverletzung ist. Ein zentraler Begriff für die Verantwortlichkeit ist der Vorsatz. In dem Konzept von Vorsatz finden wir sowohl die Absicht wie das Wissen, d. i. wenn jemand vorsätzlich handelt, nicht nur wünscht er etwas, sondern er denkt auch, wie er handeln sollte, um zu erreichen, was sie will. Man findet im Vorsatz auch die Idee des Grundes. Dies öffnet wiederum die Idee der moralischen Standards und auch die Möglichkeit eines moralischen Gewissens. Hegel sieht Kant als der größte Befürworter dieser Theorie. Hegel kritisiert Kant, dass er eine Art solipsistischer Methode hat. Die Gewissheit des Guten in die eigene Handlung könnte das Böse verbreiten. Hegel argumentiert, dass ohne eine soziale Basis dafür, die Sittlichkeit, solche moralischen Standards und moralisches Gewissen nicht möglich sind.
Im letzten Kapitel wird analysiert, wie jemand in der hegelschen Lehre frei sein könnte. Nach Hegel gibt es mindestens drei Bedingungen, sodass jemand tatsächlich als frei betrachtet werden könnte: eine metaphysische Bedingung, eine psychologische Bedingung, und eine soziale Bedingung. Diese drei Bedingungen entsprechen den Hauptkritiken gegen die Möglichkeit des freien Willens. Die erste der Kritik besagt, dass es in einer durch mechanische Gesetze geregelten Welt keinen Raum für die Freiheit gibt. Nach Hegel sei die Möglichkeit der teleologischen Erklärung zugleich die Möglichkeit für die Freiheit. In der psychologischen Bedingung argumentiert Hegel, dass das hedonistische oder Wunsch-Überzeugung-Handlung Modell in der Tat fast eine mechanische Erklärung wäre. In einem systemischen Selbstbewusstsein Vorstellung der individuellen Persönlichkeit, in dem alle Teile des Akteurs systemisch artikuliert sind, könnte das Individuum wirklich frei handeln, da das Individuum nicht mehr in seinen Wünschen oder anderen Trieben verschwunden wäre. Am Ende argumentiert noch Hegel, dass die Gary Strawson‘ Kritik an der Idee des freien Willens, dass wir nicht den ersten Umstand unseres Lebens, unsere Sozialisierung und Erziehung ändern könnten, nicht korrekt wäre. Freiheit bedeutet nicht, jeden Aspekt unseres Lebens zu bestimmen, sondern uns selbst und unser Handeln zu bestimmen. Hegel zufolge können wir in der Tat unseren Anfang ändern, indem wir uns selbst neu interpretieren. Diese Art der Selbstbestimmung setzt die Teilnahme an der Gesellschaft voraus. Wenn wir die semantische in unserer Kultur ändern, ändern wir uns selbst und solches aktive Engagement mit unserer Gesellschaft wäre auch eine Bedingung, um ein freies Leben zu führen.
Identification of disease modulating compounds in juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis (JNCL)
(2016)
Mutationen im CLN3 Gen verursachen die neurodegenerative Erkrankung juvenile neuronale Zeroidlipofuszinose (JNCL). Bei dieser Erkrankung sind die Autophagie, der lysosomale pH Wert und der mitochondriale Metabolismus beeinträchtigt. Störungen dieser Prozesse führen zu einer erhöhten Verletzlichkeit neuronaler Zellen gegenüber alters- und umweltbedingten Schäden, einer Anhäufung von Autophagosomen und lysosomalem Speichermaterial, Zelltod und Neurodegeneration. Um die JNCL zu erforschen bedienen wir uns eines Zellmodels aus der Maus, welches die häufigste krankheitsauslösende CLN3 Mutation im Menschen, die Deletion der Exons 7 und 8, nachbildet. Die aus dem Kleinhirn dieser Mäuse stammenden cerebellaren Körnerstammzellen werden als CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen, solche aus wild-typ Mäusen als CbCln3+/+ Zellen bezeichnet. Die JNCL ist nicht heilbar und die Entwicklung von Wirkstoffen steht noch am Anfang.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Durchführung eines Hochdursatzscreenings um Wirkstoffe zu identifizieren, welche eine Anhäufung von Autophagosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen verhindern können. Unter 1750 verschiedenen untersuchten Wirkstoffen konnten wir 28 aktive „Hits“ identifizieren und stellten fest, dass Kalziumkanalblocker, Östrogene und HMG-CoA-Reduktase Inhibitoren gehäuft vertreten waren. Eine sorgfältige Untersuchung die möglichen Interaktionen der aktiven Wirkstoffe mit zellulären Signalwegen und die Analyse ihrer Dosis-Wirkungskurven unterstützte uns bei der Auswahl von Verapamil, Nicardipin und Fluspirilen zur näheren Untersuchung. Diese Wirkstoffe sind Kalziumkanalblocker und Fluspirilen blockt auch D2 Dopaminrezeptoren.
Außerdem untersuchten und quantifizierten wir mitochondriale Phänotypen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen. Unsere Untersuchungen ergaben, dass Mitochondrien in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen einer signifikanten Hyperfusion unterliegen und ein schwächeres Membranpotenzial aufweisen. Weiterhin fanden wir eine Verringerung der maximalen der mitochondrialen Elektronentransportkapazität und eine verringerte Aktivität des Enzyms Zitratsynthase, welches die Effizienz des Zitratzyklus bestimmt.
Fluspirilen, Verapamil und, in geringerem Ausmaß, Nicardipin, verbesserten einige krankheitsbedingte lysosomale und mitochondriale Phänotypen. Des Weiteren konnten Verapamil und Nicardipin, nicht aber Fluspirilen, den erhöhten zellulären Kalziumspiegel in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen absenken. Erniedrigungen im Kalziumgehalt können durch die Inhibition der kalziumabhängigen Protease Calpain 1 zu einer Induktion der Autophagie führen. Wir untersuchten, ob eine chemische Inhibition der Calpain 1-Protease die Anzahl der Autophagosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen senkt, und stellten fest, dass dies nicht der Fall ist. Eine Inhibition von Calpain 1 führte lediglich zu einem Anstieg der Zahl zellulärer Autophagosomen. Als Nächstes untersuchten wir die Auswirkung der Wirkstoffbehandlung auf den Autophagiefluss. Verapamil und Nicardipin hatten keinen Einfluss auf den Autophagiefluss in der getesteten Konzentration in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen während Fluspirilen die Autophagie induzierte. Gleichzeitig stellten wir fest, dass hohe Dosen von Nicardipin und Verapamil teilweise vor einem Verlust des lysosomalen pH-Werts durch eine Behandlung mit Bafilomycin A1 schützen konnten. Da Fluspirilen auch ein Dopaminrezeptorblocker ist, untersuchten wir die Auswirkung einer erhöhten Dosis von Dopamin auf die Zahl der Autophagosomen. Wir fanden, dass eine mittlere Dosierung von Dopamin einen Trend zu einer leichten Verringerung von Autophagosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen zur Folge hat.
Wir vermuten, dass die Kalziumkanalblocker Verapamil und Nicardipin und der Dopaminrezeptorblocker Fluspirilen unterschiedliche zelluläre Signalwege benutzen, aber letztendlich um ähnliche Botenstoffe verwenden, um die Funktion der Lysosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen zu verbessern. Die Verringerung des intrazellulären Kalziumgehalts durch Verapamil und Nicardipin führt zu einer Aktivierung von Adenylatzyklasen, welche eine Erhöhung des intrazellulären cAMP Spiegels herbeiführen. Fluspirilen inhibiert Dopaminrezeptoren vom Typ D2 (D2DR), was zu einer selektiven Aktivierung von Dopaminrezeptoren des Typs D5 (D5DR) führen könnte. Im Gegensatz zu D2 führen D5D Rezeptoren zu einer Aktivierung von Adenylatzyklasen und einer Erhöhung des cAMP Spiegels. cAMP aktiviert die Protein Kinase A (PKA), welche durch eine Proteinphosphorylierung von lysosomalen Chloridkanälen und Protonenpumpen die lysosomale Aktivität erhöht. Dies führt zu einer Verbesserung des Abbaus von Autophagosomen und lysosomalem Speichermaterial und zu einer verbesserten Zellgesundheit in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen.
Eine Verbesserung der lysosomalen Funktion in der JNCL kann einen wirksamen Therapieansatz ergeben. Wir hoffen, dass die hier vorgestellten Methoden und Ergebnisse einen ersten Schritt in diese Richtung darstellen.
Der Nucleus suprachiasmaticus (SCN) ist ein Kerngebiet des Hypothalamus mit der Funktion des zentralen Taktgebers für die Generierung der circadianen Rhythmik. Zahlreiche petale Verbindungen zum SCN dienen der Synchronisierung der circadianen Uhr mit der tatsächlichen Tagesphase. Fugale Verbindungen des SCN dienen der Verteilung der Tageszeiteninformation über das Gehirn, insbesondere in vegetativen Zentren. So werden beispielsweise die physiologischen Vorgänge des Kreislaufsystems, Hormonausschüttung, der Schlaf-Wach-Zyklus etc. kontrolliert und mit Tag-Nacht-Wechsel synchronisiert. Obwohl viele dieser Verbindungen verstanden und beschrieben sind, sind die nahen Verbindungen in der unmittelbaren Nähe des SCN und des-sen intrinsische Verbindung nicht genau untersucht. Zur Darstellung dieser nahen Verbindungen wurden DiI-Tracer-Studien an Gehirnschnitten von Mäusen durchgeführt. Untersucht wurde parallel zu der DiI-Färbung das Neuropeptid Vasopressin innerhalb und außerhalb des SCN bei Mäusen von zwei verschiedenen Mäusestämmen (C3H und C57BL); C57BL ist defizient für das photoperiodische sezernierte Epiphysenhormon Melatonin, C3H-Mäuse er-blinden im frühen Lebensalter. Die immunzytochemische Untersuchung des Vasopressin-Systems belegte einen Unterschied in der Zytoarchitektur des SCN zwischen den C3H und C57BL Mäusen. Obwohl einige Elemente ähnliche Lokalisations- und Reaktivitätscharakteristika aufwiesen z.B. die dorsomediale Verteilung der Vasopressin-Perikaryen im Kerngebiet, so zeigte sich bei den C57BL-Mäusen eine deutlich schwächere Reaktivität des Neuropeptids AVP in diesem Bereich und ferner eine deutliche inhomogenere Verteilung der Vasopressin-Elemente im gesamten Kerngebiet. Die Tracing Untersuchung zeigte bei beiden Mäuse-Stämmen die gleichen Verbindungswege des SCN mit der nahen Periphere. Zum einen zeigen die Ergebnisse, dass der Hauptpassage des SCN im dorsomedialen, also im periventrikulären Bereich lokalisiert ist und das der SCN multiple Zugänge an seiner dorsalen und lateralen Grenze zur subparaventrikulären Zone besitzt. Ferner konnte auch gezeigt werden, dass beide bilateralen SCN-Kerne direkt über ausgeprägte Kommissurfaserverbindungen miteinander kommunizieren. Diese Kommissuren dürften dafür verantwortlich sein, den SCN einer Seite mit dem SCN der kontralateralen Seite zu synchronisieren. Obwohl in der vorliegenden Arbeit der Tracer nur einseitig appliziert wurde, ist dennoch von einer gekreuzten kontralateralen Verbindung auszugehen. Hier liegen Ansätze für weitere Un-tersuchungen. Ein weiterer Aspekt der Untersuchungen zeigen Faserverbin-dungen in die Area hypothalamica lateralis (AHL), die eine wichtige Rolle in der Kontrolle der zentralen Nahrungsaufnahme besitzt. Diese Faserverbin-dungen haben ihren Ursprung im SCN bzw. Nucl. paraventricularis und dem Nucl. arcuatus. Diese Verbindungen dienen am ehesten der Modulation der zentralen Regulation der Nahrungsaufnahme und spielen daher eine besondere Rolle in der Krankheitsentstehung wie Adipositas, Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankung bei gestörter circadianen Rhythmik. Neu ist der Befund einer beachtlichen Anzahl von suprachiasmaticopetalen Fasern aus der sub-paraventrikulären Zone. Diese könnten die Einbindung des limbischen Systems in die Modulation der inneren Uhr erklären, die darüber hinaus ursächlich für zahlreiche Pathologien sein könnten.
Anhand ausgewählter Materialien – insbesondere anhand von Vorträgen, die zwischen 1966/68 und 2001 auf den vom Deutschen Germanistenverband (DGV) veranstalteten sog. Deutschen Germanistentagen gehalten wurden – wird gezeigt, dass sich das Fach in seinem expliziten bzw. impliziten Diskurs über das Verhältnis der Germanistik zur Politik nach – den für den fachhistorischen Diskurs einschneidenden Daten – 1966/68 auf mehreren relevanten Ebenen auf der Suche nach einer neuen Identität befindet.
Zugleich führen Spezialisierungs-, Ausdifferenzierungs- sowie Entdifferenzierungsprozesse der Disziplin als wissenschaftssysteminhärente Prozesse das Fach an seine Grenzen bis hin zur (Selbst-)Auflösung. Diese Auflösung ist systemtheoretisch als Prozess der Szientifizierung und der Entkoppelung von Wissenschaft und Politik zu beschreiben – eine Koppelung, die für die Entstehung des Faches wesentlich war. Gleichzeitig zeigen sich – gegen den sog. Elfenbeinturm gerichtete – Diskurse, diese Abkoppelung zu kompensieren (z.B. Sprachenpolitik).
Die eukaryotische RNA-Polymerase II (RNAPII) ist der zentrale Faktor für die Umsetzung des genetischen Codes in funktionelle Proteine. Durch die Transkription wird die statische Information der DNA in ein transient nutzbares RNA-Molekül umgewandelt. Bei diesem fundamentalen Prozess der Genexpression wird ein spezifischer DNA-Abschnitt des Genoms abgelesen und in die komplementäre RNA transkribiert, die entweder direkt regulatorische bzw. funktionelle Aufgaben in der Zelle übernimmt oder als Matrize für die Proteinbiosynthese dient. Zur Erhaltung der Funktionalität eines Organismus und zur schnellen und gezielten Reaktion auf exogene Reize ist eine strikte Regulation der Transkription und der zahlreichen beteiligten Faktoren notwendig. Aufgrund der zentralen Rolle in der Genexpression ist diese Regulation äußerst vielschichtig und erfordert eine feinabgestimmte Maschinerie an Enzymen und Transkriptionsfaktoren, deren genaue Wirkungsweise und Abhängigkeit noch nicht vollständig verstanden sind. Fehler in der Transkriptionsregulation werden mit einer Reihe von schwerwiegenden metabolischen Störungen und der möglichen malignen Transformation der betroffenen Zelle in Verbindung gebracht.
Während einige Regulationsmechanismen der RNAPII bereits seit längerer Zeit beschrieben sind, ist eine besondere Form der RNAPII-abhängigen Regulation erst in den letzten Jahren Gegenstand genauerer Untersuchungen geworden. So erfährt die RNAPII bei einer Vielzahl von Genen unmittelbar nach der Transkriptionsinitiation einen Arrest, der das Enzym nicht weiter über die DNA prozessieren lässt und somit die produktive Elongation des Gens blockiert. Die Aufhebung dieses promotornahen Arrests wird durch den positiven Transkriptions-Elongationsfaktor b (P-TEFb) dominiert, der durch distinkte post-translationale Modifikationen der C-terminalen Domäne der RNAPII und assoziierter Faktoren den Übergang in die produktive Transkriptionselongation ermöglicht. P-TEFb selbst unterliegt dabei einer strengen Regulation durch die Inkorporation in inhibierende Speicherkomplexe (7SK snRNPs), bestehend aus der 7SK snRNA und mehrerer assoziierter Proteine. Abseits des 7SK snRNP wurde P-TEFb als Bestandteil großer Multiproteinkomplexe identifiziert, die einen positiven Einfluss auf die Transkriptionselongation besitzen. Die Transition von P-TEFb aus dem 7SK snRNP in diese sogenannten Superelongationskomplexe (SECs) stellt einen der zentralen Regulationsmechanismen der eukaryotischen Transkription dar, ist jedoch noch nicht ausreichend verstanden.
Ein zentrales Element aller SECs bilden die Mitglieder der AF4/FMR2-Proteinfamilie, darunter das AF4 Protein, dem neben der Erhaltung der strukturellen Integrität mittlerweile auch eine Funktion in der Rekrutierung von P-TEFb zugeschrieben wird. Dabei scheint AF4 jedoch auf die Hilfe bislang noch nicht charakterisierter Faktoren angewiesen zu sein. AF4 ist über diese Rolle hinaus als Bestandteil des Fusionsproteins AF4-MLL eng mit der onkogenen Zelltransformation im Falle einer durch die Translokation t(4;11)(q21;q23) bedingten, akuten lymphoblastischen Leukämie assoziiert.
Das zentrale Thema dieser Arbeit stellen Untersuchungen zum Transfer von P-TEFb aus dem 7SK snRNP zum AF4-Protein dar. Dabei konnte zunächst die DEAD-Box RNA-Helikase DDX6 als Integraler Bestandteil der AF4-SECs identifiziert werden, der bereits eine Funktion in der Kontrolle des microRNA- wie auch des mRNA-Metabolismus zugeschrieben werden konnte. Aus diesem Grund wurde von uns eine mögliche Beteiligung von DDX6 an der Rekrutierung von P-TEFb zum AF4-SEC durch Modulationen der 7SK snRNA postuliert. Des Weiteren konnte eine Bindefähigkeit von DDX6 gegenüber der 7SK snRNA sowie eine direkte Korrelation zwischen des zellulären DDX6-Proteinlevel und der Akkumulation von P-TEFb im AF4-SEC nachgewiesen werden. Sowohl die Überexpression von DDX6 als auch die von AF4 resultierten in einer gesteigerten mRNA-Produktion, wobei die Ergebnisse auf einen kooperativen Mechanismus zwischen den beiden Proteinen in der Aktivierung der Transkription hindeuteten. Außerdem konnte die These einer DDX6-vermittelten Aktivierung von P-TEFb anhand von Expressionsanalysen des bekannten P-TEFb Zielgens HEXIM1, dessen Expression im Zusammenhang eines negativen Rückkopplungsmechanismus gesteigert wird, bestätigt werden. Damit konnte der DEAD-Box RNA-Helikase DDX6 in dieser Arbeit das erste Mal eine entscheidende Funktion in der Rekrutierung von P-TEFb aus dem 7SK snRNP in den AF4-SEC, und somit an der Kontrolle der eukaryotischen Transkription, zugeschrieben werden.
Juvenile neuronal ceroid-lipofuscinosis (JNCL) is a rare lysosomal storage disease in children with lethal outcome and no therapy. The origin of JNCL has been traced to autosomal recessive mutations in the CLN3 gene, and ~85% of the JNCL patients harbor a 1.02 kb deletion that removes the exons 7 and 8 and the surrounding intronic DNA (CLN3Δex7/8). So far, structure, function and localization of the CLN3 protein remain elusive. However, there is strong evidence that CLN3 modulates a process or condition that is essential in many cellular pathways. Lipid metabolism and antero-/retrograde transport, two mechanisms CLN3 was previously implicated in, fulfill these requirements. Notably, also a bioactive group of glycosphingolipids referred to as gangliosides is tightly interrelated with these functions. Furthermore, a-series gangliosides have been shown to be involved in the development and sustenance of the brain, where they are essential for neurite outgrowth and cell survival. Defects in ganglioside metabolism were shown to play a crucial role in many lysosomal storage disorders. However, the contribution of gangliosides to NCL pathology is largely unknown.
The present study analyzed central enzymes and metabolites of the a-series ganglioside pathway in a JNCL cell model. The core finding was, thereby, the reduced amount of the neuroprotective ganglioside GM1 in homozygous CbCln3Δex7/8 cells. This was caused by the enhanced action of the GM1-degrading multimeric enzyme complex and in particular, by the upregulation of protein levels and increased enzyme activity of β-galactosidase (Glb1).
Improved binding of Glb1 to substrate-carrying membranes was provided by an increase in LBPA levels. In combination with other smaller alterations in the ganglioside pattern, a shift towards less complex gangliosides became present. The resulting loss of neuroprotection may be the reason for the multifocal pathology in homozygous CbCln3Δex7/8 cells.
The second part of the present study investigated the cellular mechanisms behind the altered ganglioside profile with regard to the potential role of CLN3. Here, the anterograde transport of GM1 to the plasma membrane presented a positive correlation with the amount of full-length CLN3. In case of the truncated protein this correlation was missing, resulting in reduced PM staining with CTxB-FITC. However, transfection of full-length CLN3 in these cells restored the CTxB-FITC intensity. Based on the neuroprotective role of GM1, the corresponding increase in GM1 levels may be the cause for the restoration effects observed in previous studies using full-length CLN3. Hence, administration of GM1 was expected to improve cell viability of homozygous CbCln3Δex7/8 cells and beyond that to rescue potentially some disease phenotypes. However, no effect could be observed. The reason for this may be reduced caveolar uptake and the mislocalization of ganglioside GM1 to the trans-Golgi network (TGN) and redirection towards degradative compartments.
Both are in line with the idea of an impaired endocytic flux in CLN3 deficiency. The observed localization of CLN3 in the TGN suggests a potential role for CLN3 in the lipid sorting machinery, subsequently altering membrane composition and its regulatory functions. The resulting imbalance may affect many of the cellular processes impaired in JNCL.
The elliptic flow of heavy-flavour decay electrons is measured at midrapidity |eta| < 0.8 in three centrality classes (0-10%, 10-20% and 20-40%) of Pb-Pb collisions at sqrt(sNN) = 2.76TeV with ALICE at LHC. The collective motion of the particles inside the medium which is created in the heavy-ion collisions can be analyzed by a Fourier decomposition of the azimuthal anisotropic particle distribution with respect to the event plane. Elliptic flow is the component of the collective motion characterized by the second harmonic moment of this decomposition. It is a direct consequence of the initial geometry of the collision which is translated to a particle number anisotropy due to the strong interactions inside the medium. The amount of elliptic flow of low-momentum heavy quarks is related to their thermalization with the medium, while high-momentum heavy quarks provide a way to assess the path-length dependence of the energy loss induced by the interaction with the medium.
The heavy-quark elliptic flow is measured using a three-step procedure.
First the v2 coefficient of the inclusive electrons is measured using the event-plane and scalar-product methods. The electron background from light flavours and direct photons is then simulated, calculating the decay kinematics of the electron sources which are initialised by their respective measured spectra. The final result of this work emerges by subtracting the background from the inclusive measurement. A significant elliptic flow is observed after this subtraction. Its value is decreasing from low to intermediate pT and from semi-central to central collisions.
The results are described by model calculations with significant elastic interactions of the heavy quarks with the expanding strongly-interacting medium.
Recently, two of the most common types of bone cancers in children and young adults have been proven to exhibit vulnerability to poly(ADP)-ribose polymerase, (PARP) inhibitors (e.g. olaparib, talazoparib). Ewing’s sarcoma (ES) are reported to harbor a fusion gene EWS-FLI1 (85%), inducing tumorigenesis. Additional, as the fusion gene acts as aberrant transcription factor, it similarly induces elevated PARP expression levels sensitizing ES to PARP inhibition. Second, by an exome sequencing approach in a set of primary osteosarcomas (OS) we identified mutation signatures being reminiscent of BRCA deficiency. Therefore, the sensitivity of a panel of OS cell lines to either talazoparib single treatment or in combination with several chemotherapeutic drugs was investigated.
To screen ES tumor cell lines against PARP inhibitors we applied four different PARP inhibitors (talazoparib, olaparib, niraparib and veliparib) that are frequently being used for clinical studies. We combined those PARP inhibitors with a set of chemotherapeutics (temozolomide (TMZ), SN-38, etoposide, ifosfamide, doxorubicin, vincristine and actinomycin D) that are part of the first-line therapy of ES patients. Here, we demonstrate how PARP inhibitors synergize with TMZ or SN-38 to induce apoptosis, whereas the combination of PARP inhibitors with the other drugs are not favorable. By investigation of key checkpoints in the molecular mechanisms of cell death, the pivotal role of the mitochondrial pathway of apoptosis mediating the synergy between olaparib and TMZ was revealed.
Employing talazoparib monotherapy in combination with or without several chemotherapeutic drugs (TMZ, SN-38, cisplatin, doxorubicin, methotrexate and etoposide/carboplatin), the correlation between homologous recombination (HR) repair deficiency (BRCAness) and the response to talazoparib as prototypical PARP inhibitor was validated in different OS cell lines. By calculation of combination indices (CI) and fraction affected (Fa) values, we identified TMZ as the most potent chemotherapeutic drug in combination with talazoparib inducing the mitochondrial apoptotic pathway in OS.
In our studies of two independent tumor entities with contrary genetic background we identified the combination of PARP inhibitor and TMZ as being most effective. Our studies point out that after TMZ induced DNA methylation and concomitant PARP trapping, DNA damage-imposed checkpoint kinase activation consequently induces G2-cell cycle arrest. Subsequent, PARP inhibitor/TMZ causes MCL-1 degradation, followed by activation of BAK and BAX, succeeding in loss of mitochondrial outer membrane potential (LMMP) and activation of downstream effector-caspases in mitochondrial apoptosis. Our findings emphasize the importance of PARP inhibition in order to chemosensitize ES, which express high PARP levels, or OS that bear features of BRCAness.
Weltweit sind ca. 130–180 Millionen Menschen mit HCV infiziert und jährlich sterben etwa 500.000 Menschen an dessen Folgen. Die neuartigen Therapien versprechen zwar eine sehr hohe Heilungsrate, sind aber aufgrund ihrer enorm hohen Kosten nur in Industrieländern verfügbar. Noch immer gibt es keine prophylaktische Vakzinierung gegen HCV. Deshalb ist es wichtig, den HCV-Lebenszyklus und die Interaktion zwischen Wirtszelle und Virus detailliert zu verstehen, um die Entwicklung von Therapien und Impfungen zu ermöglichen. Außerdem kann ein fundiertes Wissen von HCV translatiert werden und auf neuartige Erreger der Familie der Flaviviridae, wie Denguevirus und Zikavirus, angewendet werden. Während der Zelleintritt und die Replikation von HCV relativ gut charakterisiert sind, bleiben die Assemblierung und Freisetzung der viralen Partikel schlecht verstandene Schritte des HCV-Lebenszyklus. In dieser Arbeit sollte die Rolle des zellulären Proteins α-Taxilin im Lebenszyklus von HCV untersucht werden. In einer späteren Phase der Arbeit wurde der endosomale Freisetzungsweg von HCV untersucht. Dazu wurden HCV Varianten generiert und charakterisiert, die Fluoreszenz-Proteine im NS5A- und E1-Protein enthalten, durch die es möglich ist, den Replikationskomplex und die Viruspartikel zu visualisieren und zu quantifizieren und den viralen Lebenszyklus dadurch besser untersuchen zu können...
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, vor- und nachbereitenden Unterricht zu Biodiversitätsführungen an den vier außerschulischen Lernorten Palmengarten, Senckenbergmuseum, Stadtwaldhaus und Zoo Frankfurt zu evaluieren. Durch den Unterricht mithilfe neu entwickelter Arbeitsmaterialien sollte die aktuelle Motivation der Schüler und weitere pädagogisch-psychologische Lernvariablen gefördert werden. Es stellte sich die Frage, ob so eine erhöhte Auseinandersetzung mit dem Themenkomplex Biodiversität erreicht werden kann und welche Einflussfaktoren dabei eine Rolle spielen.
Theoretische Grundlage war dabei das Risikowahlmodell der Leistungsmotivation nach Atkinson, das von Rheinberg zum handlungstheoretischen Modell der Motivation erweitert wurde (Rheinberg & Vollmeyer, 2012). Auf dieses bezieht sich der von Rheinberg et al. (2001) entwickelte und hier eingesetzte Fragebogen zur aktuellen Motivation (FAM).
Die Stichprobe setzte sich aus insgesamt 523 Schülern der Klassen 5 bis 9 zusammen. Davon nahm jeweils die Hälfte mit (Versuchsgruppe) und die andere ohne (Kontrollgruppe) vor- und nachbereitendem Unterricht an den Biodiversitätsführungen teil. Die Erhebung der aktuellen Motivation, des erworbenen Fachwissens und weiterer Variablen erfolgte in einem Pre/Post/Follow-Up-Design mit Fragebögen, deren Auswertung analytisch statistisch durgeführt wurde.
Es zeigte sich, dass in der Gesamtstichprobe die Teilnahme an der Biodiversitätsführung die aktuelle Motivation der Schüler erhöhte. Dauerhafte Lernparameter wie die Biologieeinstellung und die Interessenshandlung wurden jedoch nicht signifikant verändert. Ein eindeutiger Effekt der unterrichtlichen Vorbereitung konnte jedoch nicht ermittelt werden. Einzig beim gemessen Fachwissen zu den Führungsinhalten schnitt die Versuchsgruppe signifikant besser ab. Insgesamt wird angenommen, dass der Effekt des Besuchs des außerschulischen Lernortes an sich den Effekt der Vor- und Nachbereitung überdeckt oder vom Einfluss anderer Parameter beeinflusst wird. Hier stach besonders das Alter der Jugendlichen hervor, das vor allem in der hier evaluierten Schülergruppe bedingt durch die Pubertät eine große Rolle spielt. Weitere Einflussfaktoren waren die Biologieeinstellung und die Unterrichtsvariablen der Führung. In den Stichproben der einzelnen außerschulischen Lernorte zeigten sich leichte Abweichungen von der Gesamtstichprobe. Diese waren meist auf die leicht unterschiedliche Zusammensetzung der Stichproben zurückzuführen. Aber auch Besonderheiten der Lernorte hatten dabei ein bedeutendes Gewicht.
Bezüglich der Lernbedingungen für die Lernorte ließen sich aus den Ergebnissen vor allem zwei Komponenten ermitteln: Zum einen die Architektur/räumliche Struktur der Lernorte. Hier können Faktoren wie drinnen/ draußen, Größe und die räumliche Orientierung unterschieden werden. All dies hat Auswirkungen auf das physische Wohlbefinden der Schüler, was wiederum eine Voraussetzung für eine hohe Lernmotivation ist. Die andere Hauptkomponente ist das am Lernort behandelte Thema. Hier kann grob zwischen Pflanzen und Tieren unterschieden werden. Pflanzen wurden dabei in mehreren Studien von den Schülern als weniger attraktiv eingeschätzt. Trotzdem sollten aber die Möglichkeiten, auch botanische Themen außerhalb der Schule zu behandeln, von den Lehrkräften zur Vermittlung biologischer Vielfalt genutzt werden.
Als Konsequenz der Ergebnisse kann der Besuch eines außerschulischen Lernrotes im Biologieunterricht bezüglich der Förderung der Lernmotivation unbedingt empfohlen werden. Da kein klarer Effekt des vor- und nachbereitenden Unterrichts der Biodiversitätsführungen erkennbar war, wären hier weitere Untersuchungen vonnöten, um genauere Aussagen machen zu können. Hier böten sich Studien mit Schülern anderer Altersgruppen und der Vergleich nur zweier außerschulischer Lernorte an.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Anaylsenmethoden zur Quantifizierung von Ceramiden und Prostanoiden in verschiedenen biologischen Matrices unter Verwendung von Nano-LC gekoppelt mit Tandemmassenspektrometrie entwickelt und bei diversen biologischen Fragestellungen angewendet.
Die analytische Methode zu Quantifizierung der Ceramide ermöglichte deren Bestimmung in einem Probenvolumen von 2 μL CSF. Diese neu entwickelte Methode ist die erste publizierte Nano-LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung der Ceramide in biologischen Proben, gleichzeitig ist es auch diejenige analytische Methode mit der höchsten Empfindlichkeit [171]. Die beschriebene Methode umfasste die Substanzen C8:0, C16:0, C18:1, C18:0, C20:0, C24:1 und C24:0 Ceramid, als interner Standard wurde C17:0 Ce-ramid verwendet. Die Probenaufarbeitung bestand in einer einfachen Proteinfällung und Verdünnung mit Methanol, die chromatografische Trennung der Analyten erfolgte mit einer RP-C8 Säule unter Verwendung eines Gradientenprogramms. Die Methode wurde anhand von FDA-Richtlinien bezüglich Linearität, Bestimmungsgrenze, Präzision, Richtigkeit und Autosampler-Stabilität validiert. Die erreichten Bestimmungsgrenzen betrugen 0,225 pg auf der Säule (2,25 pg/μL CSF) für alle Ceramide außer C24:0 Ceramid, für das der Wert von 0,75 pg auf der Säule (7,5 pg/μL CSF) ermittelt wurde. Mit der durchgeführten Validierung wurde die Zuverlässigkeit der Methode für die Quantifizierung der Ceramide in CSF gezeigt. Mit einem Standardadditionsexperiment konnte belegt werden, dass PBS als Ersatzmatrix für CSF geeignet ist und somit die Ergebnisse der Validierung mit dotierten PBS-Proben auf CSF-Proben übertragbar sind. Das entwickelte Verfahren wurde für die Quantifizierung der Analyten in murinen CSF-Proben im Rahmen eines Projekts zur Erforschung der Rolle der Ceramide bei Multipler Sklerose angewendet. Anhand der Ergebnisse wurde die Hypothese bestätigt, dass die Konzentration von C16:0 Ceramid in CSF von EAE-Mäusen erhöht ist.
Die zweite entwickelte Nano-LC-MS/MS-Methode ermöglichte die Quantifizierung der Prostanoide PGE2, PGD2, 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2 in einer geringen Anzahl Immunzellen. Für eine erfolgreiche Bestimmung der Analyt-Konzentrationen waren nur 5.000 T-Zellen oder 40.000 Mastzellen erforderlich. Damit ist die beschriebene Methode geeignet für die Quantifizierung in Zellen, die durch Isolation aus tierischen Geweben oder Organen erhalten werden, ohne dass das Vereinigen mehrerer Proben erforderlich ist. Durch die Messung dieser bestimmten Zellpopulationen kann, im Unterschied zur Vermessung des gesamten Organs, eine differenziertere Analyse der Lokalisation der gemessenen Analyten erfolgen. Mittels der entwickelten Methode konnten die Prostanoide PGE2, PGD2, 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2 quantifiziert werden. Als interner Standard stand für jedes dieser Prostanoide ein vierfach deuteriertes Strukturanalogon zur Verfügung. Die Aufarbeitung der Immunzell-Proben erfolgte durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat, die Chromatografie wurde mit einer RP-C8-Säule und einem Gradientenprogramm durchgeführt. Eine Validierung erfolgte für die Quantifizierung in T-Lymphozyten und Mastzellen für die Parameter Linearität, Bestimmungsgrenze, Präzision, Richtigkeit, Wiederfindung, Selektivität und Stabilität. Auch ein Standardadditionsexperiment mit beiden Matrices wurde durchgeführt. Die Bestimmungsgrenzen betrugen 75 fg auf der Säule für PGE2 und PGD2 sowie 112,5 fg für 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2, damit zeichnet sich die Methode durch höchste Empfindlichkeit aus. Die Me-thode wurde zur Messung der Prostanoid-Konzentration in T-Zellen, die im Rahmen eines Kontaktallergie-Modells aus dem Blut von unterschiedlich behandelten Mäusen isoliert worden waren, angewendet. Es konnte kein Unterschied in den Prostanoid-Konzentrationen in den T-Zellen sensibilisierter und nicht-sensibilisierter bzw. provozierter und nicht-provozierter Mäuse festgestellt werden. Bei einer zweiten Anwendung wurden die Prostanoide in murinen Mastzellen, die nach Zymosan-Injektion in die Hinterpfote zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Auslösen der Entzündung aus dem entstandenen Ödem isoliert worden waren, gemessen. Zusätzlich für diese Anwendung wurden einige Leukotriene in die Methode integriert. Es wurde festgestellt, dass die Konzentrationen von PGE2, PGD2 und PGF2α in Mastzellen nach der Injektion von Zymosan-Injektion ansteigen, wobei die gemessenen Konzentrationen für PGE2 48 Stunden nach der Injektion verglichen mit denen nach 24 Stunden, bezogen auf die anderen beiden Prostaglandine, am stärksten ansteigen. Außerdem wurde mittels der für die Immunzellen entwickelten Methode die Prostanoide in murinem Urin, humanem Plasma und humaner Tränenflüssigkeit quantifiziert.
Zusammenfassend ermöglichen die entwickelten Methoden die Analyse geringer Ana-lytkonzentrationen in sehr kleinen Probenmengen und damit eine Reduktion von Versuchstierzahlen und Kosten.
The humanized non-depleting anti-CD4 monoclonal antibody Tregalizumab (BT-061) is able to selectively activate the suppressive function of regulatory T cells and has been investigated up to phase 2b in clinical trials in patients suffering from rheumatoid arthritis (RA).
A pharmacokinetic-pharmacodynamic model, which is based on clinical data from RA and healthy subjects, used the cell surface CD4-down-modulation as marker of the antibodies' activity. This model surprisingly revealed a stronger effect of Tregalizumab in healthy subjects compared to RA patients. This thesis presents a series of experiments performed to understand this phenomenon.
To counteract oxidative stress, which is strongly associated with RA pathophysiology, the organism employs the small oxidoreductase thioredoxin-1 (Trx1). Therefore, augmented expression and secretion of Trx1 was seen in many studies the synovial fluid and plasma of RA patients. Moreover, the binding site of Tregalizumab is in close proximity to a disulfide bond in domain 2 (D2) of CD4, which is a known target for a reduction by Trx1. So, this thesis also evaluated the influence of Trx1 on binding of Tregalizumab to its target CD4.
With the experiments reported herein, it was possible to demonstrate that specific reduction of the D2 disulfide bond of CD4 by Trx1 led to diminished binding of Tregalizumab to recombinant human soluble CD4 (rh sCD4) and membrane-bound CD4 on T cells from a human leukemia cell line and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Moreover, the experiments revealed that this caused changes in the Tregalizumab-induced CD4 signalling pathway via the lymphocyte-specific protein tyrosine kinase p56Lck.
In summary, this thesis provides evidence that high Trx1 levels in RA patients compared to healthy subjects are a potential valid reason for diminished binding of Tregalizumab to CD4-positive T cells and offers an explanation for the observed decreased CD4 down-modulation in RA patients in comparison with healthy subjects. It emphasizes that binding of Tregalizumab is impaired in a particular way in RA patients.
Ziel. Lokoregionäre Rezidive sind der Hauptgrund für ein Therapieversagen nach primärer multimodaler Behandlung von Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region (SCCHN). Wir verglichen die Effektivität und Toxizität von Cisplatin oder Cetuximab simultan zur Re-Bestrahlung (ReRT) bei inoperablen SCCHN-Rezidiven. Ein prognostischer Score sollte auf Grundlage verschiedener klinischer und pathologischer Faktoren etabliert werden.
Patienten und Methoden. 66 Patienten mit in vorbestrahlten Regionen rezidivierten SCCHN wurden von 2007 bis 2014 simultan mit Cetuximab (n=33) oder cisplatin-basierter Chemotherapie (n=33) re-bestrahlt. Die Toxizität wurde wöchentlich sowie bei jedem Nachsorgetermin erfasst. Klinische Untersuchung, Endoskopie, CT- oder MRT-Untersuchungen wurden zur Beurteilung des Therapieansprechens und der Krankheitskontrolle eingesetzt.
Ergebnisse. Nach einer mittleren Nachbeobachtungszeit von 18,3 Monaten betrug das 1-Jahres-Überleben (OS) für ReRT mit Cetuximab 44,4% und mit cisplatin-basierter Chemotherapie 45,5% (p=0.352). Die lokalen Kontollraten nach einem Jahr waren jeweils 46,4% und 54,2% (p=0.625); die Raten an Metastasenfreiheit 73,6% und 81% (p=0.842). Hämatologische Toxizität ≥ Grad 3 kam in der Cisplatin-Gruppe häufiger vor (p<0.001), dagegen trat Schmerz ≥ Grad 3 in der Cetuximab-Gruppe häufiger auf (p=0.034). Ein physiologischer Hb-Wert und ein längeres Intervall zwischen primärer RT und ReRT erwiesen sich als signifikante prognostische Faktoren für das OS (multivariat: p=0.003 und p=0.002). Die Rezidivlokalisation sowie das GTV zeigten keinen signifikanten Einfluss auf das OS in der multivariaten Analyse (p=0.160 und p=0.167). Ein auf Grundlage dieser Variablen konstruierter Prognose-Score (0 bis 4 Punkte) zeigte signifikante Überlebensunterschiede: 1-Jahres-OS für 0/1/2/3/4 Prognosepunkte: 10%, 38%, 76%, 80% und 100% (p<0.001).
Schlussfolgerung. Sowohl Cetuximab- als auch Cisplatin-basierte ReRT für SCCHN-Rezidive sind gut durchführbare und effektive Behandlungsoptionen mit vergleichbaren Ergebnissen bezüglich Tumorkontrolle und Überleben. Die akuten Nebenwirkungen könnten gering variieren. Unser Prognose-Score könnte zur Identifizierung der für ReRT geeigneten Patienten sowie zur Stratifizierung in künftigen klinischen Studien dienen.
The brain is a highly dynamic and variable system: when the same stimulus is presented to the same animal on the same day multiple times, the neural responses show high trial-to-trial variability. In addition, even in the absence of sensory stimulation neural recordings spontaneously show seemingly random activity patterns. Evoked and spontaneous neural variability is not restricted to activity but is also found in structure: most synapses do not survive for longer than two weeks and even those that do show high fluctuations in their efficacy.
Both forms of variability are further affected by stochastic components of neural processing such as frequent transmission failure. At present it is unclear how these observations relate to each other and how they arise in cortical circuits.
Here, we will investigate how the self-organizational processes of neural circuits affect the high variability in two different directions: First, we will show that recurrent dynamics of self-organizing neural networks can account for key features of neural variability. This is achieved in the absence of any intrinsic noise sources by the neural network models learning a predictive model of their environment with sampling-like dynamics. Second, we will show that the same self-organizational processes can compensate for intrinsic noise sources. For this, an analytical model and more biologically plausible models are established to explain the alignment of parallel synapses in the presence of synaptic failure.
Both modeling studies predict properties of neural variability, of which two are subsequently tested on a synapse database from a dense electron microscopy reconstruction from mouse somatosensory cortex and on multi-unit recordings from the visual cortex of macaque monkeys during a passive viewing task. While both analyses yield interesting results, the predicted properties were not confirmed, guiding the next iteration of experiments and modeling studies.