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Eisbildende Prozesse sind für die Wolkenbildung von großer Bedeutung und haben erhebliche Auswirkungen auf das Wetter und Klima der Erde, indem sie den Strahlungsantrieb und die Niederschlagsbildung beeinflussen. In den mittleren Breiten entsteht der meiste Niederschlag in sogenannten Mischphasenwolken (MPC), welche sowohl aus unterkühlten Wolkentröpfchen als auch aus Eiskristallen bestehen. Bei Temperaturen zwischen 0°C und -38°C erfolgt die Bildung von Eiskristallen in MPC in Gegenwart von Aerosolpartikeln, die als sogenannte Eiskeime (INP) die Fähigkeit besitzen, auf ihrer Oberfläche Eis zu nukleieren. Trotz der großen wissenschaftlichen Fortschritte in den letzten Jahrzehnten, weist der heterogene Eisbildungsprozess, als einer der wichtigsten in der Atmosphäre auftretenden Aerosol-Wolken-Wechselwirkungsprozesse, immer noch große Unsicherheiten auf. Um zukünftige Klimavorhersagen und -projektionen in Modellen besser abbilden zu können, ist es somit notwendig den Wissensgrad der räumlichen und zeitlichen Heterogenität von INP in Bezug auf Herkunft, Anzahl und Zusammensetzung zu erhöhen. Im Zentrum dieser Arbeit steht der Eiskeimzähler FINCH (Fast Ice Nucleus Chamber), der für Labor- und Feldexperimente von der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main entwickelt wurde. Durch das Mischen des Probenstroms mit einem warm-feuchten und einem kalten-trockenen Luftstrom wird eine Übersättigung in der in-situ Eiskammer erreicht, die benötigt wird, eisbildende Partikel zu aktivieren. Die aktivierten Partikel können beim Durchströmen der Kammer zu Wassertropfen oder Eiskristallen anwachsen. Am Ausgang der Kammer wird die Anzahl und Größe der Partikel durch die FINCH-Optik erfasst. Als grundlegender Schritt und aufbauend auf den Charakterisierungsmessungen von Frank (2017) wurden in der vorliegenden Arbeit die Leistung, die Zuverlässigkeit sowie die Reproduzierbarkeit von FINCH in Validierungsexperimenten im Labor überprüft. Im Zuge dessen wurden heterogene Gefrierexperimente mit definierten Referenzaerosolproben (bspw. K-Feldspat) bei wasserübersättigten Bedingungen und verschiedenen Gefriertemperaturen durchgeführt. Für den Großteil der erzielten Resultate konnte eine zufriedenstellende Übereinstimmung mit Literaturwerten von anderen INP-Messinstrumenten aus der ganzen Welt erzielt werden. Es zeigte sich, dass die Leistungsfähigkeit von FINCH messtechnische Limitationen für Messexperimente bei Temperaturen >-10°C und <-30°C aufweist, was eine Einschränkung des Messbereichs bedeutet. Hinsichtlich der Quantifizierung des Unsicherheitsbereiches des Messgerätes in Bezug auf Temperatur und relativer Feuchte bedarf es im Nachgang an dieser Arbeit weiterer Charakterisierungsmessungen. Im Rahmen der Ice Nuclei Research Unit (INUIT) Forschergruppe wurde FINCH mit einem gepumpten Gegenstrom-Impaktor PCVI und dem online Einzelpartikel-Massenspektrometer ALABAMA gekoppelt. Diese spezielle Messmethodik dient zur chemischen und mikrophysikalischen Charakterisierung der INP und der Eispartikelresiduen (IPR). Der Fokus lag zunächst darauf die Funktionalität des gekoppelten Messsystems im Labor zu überprüfen. Ausführliche Charakterisierungsmessungen zeigten unter eisübersättigten und unterkühlten Bedingungen, dass das Prinzip der Trennung der INP von nicht-aktivierten Aerosolen und unterkühlten Tropfen hinter FINCH durch den PCVI funktioniert. Ebenso konnten erste quantitative Aussagen zur chemischen Zusammensetzung der IPR getroffen werden. Es zeigte sich, dass bei den Aktivierungsexperimenten ein geringer Anteil an Partikeltypen metallischer Art von ALABAMA detektiert wurden, der nicht dem untersuchten Aerosoltyp zugeordnet werden konnte. Der Ursprung dieser Kontamination konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend geklärt werden und bedarf weiterer Validierungsmessungen im Labor. Atmosphärische Eiskeimkonzentrationen wurden im Rahmen von Feldmesskampagnen an der Hochalpinen Forschungsstation Jungfraujoch (JFJ) in den Schweizer Alpen und am Campus Riedberg der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main untersucht. Hier konnten erste Erfahrungen mit Außenluftmessungen bezüglich der Leistungsfähigkeit und der Nachweisgrenze (LOD) des Messgerätes gesammelt werden. Durch den Einfluss der freien Troposphäre am JFJ waren die Messungen hauptsächlich von aerosolpartikelarmer Luft mit einer geringen Anzahl von Eiskeimen geprägt, so dass sich die gemessenen INP-Konzentrationen oftmals unter die Nachweisgrenze von FINCH fielen. Unter Einsatz eines Aerosolkonzentrators konnte die Detektionseffizienz verbessert und das LOD herabgesetzt werden. Am JFJ wurden die INP im Mittel bei einer Temperatur von -23°C und einem Wassersättigungsverhältnis von 107% beprobt. Die mediane (mittlere) INP-Konzentration inklusive LOD lag bei 2,1 (3,3) sL-1 und oberhalb des LOD bei 3,1 (4,5) sL-1. Ein Vergleich mit den Messungen am Campus Riedberg unter annähernd gleichen Bedingungen resultiert in ähnlichen Konzentrationen.
Background: Increasing numbers of patients surviving malignant bone tumors around the knee joint have led to an increasing importance to investigate long-term results. This study assessed the long-term results of rotationplasty after resection of malignant bone tumors regarding functional outcome and quality of life to allow better comparison with other treatment options in bone cancer treatment.
Procedure: 60 participants who underwent rotationplasty due to bone cancer took part in this multicentric questionnaire- based study. The long-term functional outcome was measured by the Musculoskeletal tumor society score (MSTS) and the Tegner activity level scale. The health-related quality of life (HRQL) was assessed by using the Short Form Health Survey (SF-36).
Results: Patients treated with rotationplasty (median follow- up of 22 years, range 10–47 years) regained a high level of activity (median MSTS score of 24). Even a return to high level sports was possible (mean Tegner activity level scale of 4). Duration of follow-up did not influence the functional outcome. HRQL scores were comparable to the general German popula tion. Concerns of psychological problems due to the unusual appearance of the rotated foot have not been confirmed.
Conclusion: Rotationplasty can be a good alternative to en- doprosthetic replacement or amputation, either as primary surgery or as a salvage procedure. Especially for growing children and very active patients rotationplasty should be considered.
Acute myeloid leukemia (AML) is a neoplastic disease of an early myeloid precursor cell in hematopoiesis. It leads to the accumulation of monoclonal cells in the bone marrow and the peripheral blood, showing a differentiation block and deregulated self-renewal. Frequently, the leukemic cells exhibit genetic aberrations with reciprocal chromosomal translocations. These translocations induce the formation of a fusion protein, that can lead to new cellular functions and a transformation into a leukemic cell. Common chromosomal translocation in AML are t(8;21) or t(15;17), which cause the formation of the fusion proteins AML1/ETO and PML/RARα and determine the leukemic phenotype of the AML.
The translocation t(6;9) leads to the formation of the fusion protein DEK/CAN and is of special interest, because of its association with mostly young patients and a very aggressive course of the disease. The fusion product induces leukemia in a small subset of hematopoietic stem cells, but its mechanism of leukemogenesis is greatly unknown.
The intention of this work was to characterize the DEK/CAN-induced AML on a molecular genetic level to gain a deeper understanding of the disease pathogenesis. Therefore, gene expression analysis with polymerase chain reaction (PCR) and microarray analysis was performed.
To detect DEK/CAN in different cell lines by PCR and real-time quantitative PCR (qPCR), specific primers and probes were designed, and a standardized workflow was established. Emphasis was placed on the optimization of RNA isolation, DNase treatment, cDNA synthesis with following PCR and qPCR, which enabled the detection of the fusion product DEK/CAN in the cell lines 32B, Phoenix and FKH-1. To quantify the fusion product DEK/CAN, the method of qPCR with absolute and relative quantification was used. Absolute quantification enabled the calculation of an exact copy number of the fusion transcript DEK/CAN with a detection limit of 50 copies/µl at a sensitivity of 10-6, which is of importance in determining the minimal residual disease (MRD) of patients with DEK/CAN-positive AML. MRD detection by qPCR is a highly sensitive diagnostic method to identify leukemic cells, even in low cell counts. This enables a thorough evaluation of the treatment response and allows an early detection of changes in the MRD level as part of the remission control.
Additionally, a microarray gene expression analysis was performed to identify alterations in relevant target genes and associated signaling pathways in DEK/CAN-positive cells.
Because of DEK/CAN’s potential to induce leukemia in a subset of hematopoietic stem cells, Sca+/Lin- cells of the bone marrow of C57Bl/6 mice were used and transfected with the gene products DEK/CAN and PML/RARα. Microarray analysis led to the identification of 16 different genes of interest, which demonstrated significant alterations of gene expression in DEK/CAN-positive cells. They were validated and quantified with TaqMan assay assisted qPCR. The elevated expression of the transcription factors TRIM25, HIF1α and ATF2, in DEK/CAN-positive cells, indicated an altered transcription factor activity and interaction with DNA in the nucleus. The localization of DEK/CAN in the nucleus emphasizes this assumption. Also, the upregulated expression of the nuclear export receptor XPO1 suggested changes in nuclear transport processes and impaired export activity in DEK/CAN-positive cells.
Furthermore, the results demonstrated changes of gene expression in genes that are involved in the JAK/STAT signaling pathway. PTPRC, the Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type C, functions as a direct inhibitor of JAKs (Janus Kinases) and STATs (Signal Transducers and Activators of Transcription) and their associated signaling pathway.
It was shown that the gene expression of PTPRC was significantly reduced in DEK/CAN-positive cells. This allowed the assumption, that the reduced expression of PTPRC led to a loss of inhibition and thus a consecutive hyperactivation of the JAK/STAT signaling pathway. This hypothesis was supported by an independent activation of PIM1, a target gene of STAT5 and the activation of LMO2, a direct target gene of JAK2. In addition, the transmembrane receptor CSF1R, which is directly involved in STAT activation, also showed an upregulation in gene expression.
The results of this work show an activation of the JAK/STAT signaling pathway in DEK/CAN-positive cells, which may be a key mechanism in DEK/CAN-induced leukemogenesis.
Considering treatment options in the future, the addition of targeted therapy, such as pan-JAK inhibitors, to the standard therapy, could be a chance to improve the overall survival rate and the prognosis of t(6;9)-positive AML.
Ischemic heart disease caused by occlusion of coronary vessels leads to the death of downstream tissues, resulting in a fibrotic scar that cannot be resolved. In contrast to the adult mammalian heart, the adult zebrafish heart can regenerate following injury, enabling the study of the underlying cellular and molecular mechanisms. One of the earliest responses that take place after cardiac injury in adult zebrafish is coronary revascularization. Previous transcriptomic data from our lab show that vegfc, a well-known regulator of lymphatic development, is upregulated early after injury and peaks at 96 hours post cryoinjury, coinciding with the peak of coronary endothelial cell proliferation. To test the hypothesis that vegfc is involved in coronary revascularization, I examined its expression pattern and found that it is expressed by coronary endothelial cells after cardiac damage. Using a loss-of-function approach to block Vegfc signaling, I found that it is required for coronary revascularization during cardiac regeneration. Notably, blocking Vegfc signaling resulted in a significant reduction in cardiomyocyte regeneration. Using transcriptomic analysis, I identified the extracellular matrix component gene emilin2a and the chemokine gene cxcl8a as effectors of Vegfc signaling. During cardiac regeneration, cxcl8a is expressed in epicardium-derived cells, while the gene encoding its receptor cxcr1 is expressed on coronary endothelial cells. I found that overexpressing emilin2a increases coronary revascularization, and induces cxcl8a expression. Using loss-of-function approaches, I observed that both cxcl8a and cxcr1 are required for coronary revascularization after cardiac injury.
Altogether, my findings indicate that Vegfc acts as an angiocrine factor that plays an important role in regulating cardiac regeneration in zebrafish. Mechanistically, Vegfc promotes the expression of emilin2a, which promotes coronary proliferation, at least in part by enhancing Cxcl8a-Cxcr1 signaling. This study helps in understanding the mechanisms underlying coronary revascularization during cardiac regeneration, with promising therapeutic applications for human heart regeneration.
Die vorliegende Dissertation stellt eine Methode zur Löslichkeitsbestimmung vor, die für die Anwendung im Rahmen von BCS-Biowaiver Monografien entwickelt wurde. Der Methode und dem dafür konzipierten Studienprotokoll liegt das Prinzip der „Minimallöslichkeit“ zugrunde. Damit lässt sich einfach, kosteneffizient und wissenschaftlich verlässlich feststellen, ob ein Arzneistoff „hochlöslich“ gemäß den BCS-Biowaiver Richtlinien der Gesundheitsbehörden FDA, EMA und WHO ist und sich dementsprechend generische Produkte des Arzneistoffs grundsätzlich für das BCS-Biowaiver Zulassungsverfahren eignen.
Dieses Verfahren für die Zulassung von Generika erlaubt die Beurteilung der Bioäquivalenz eines festen generischen Arzneimittels zur peroralen Anwendung auf Basis von in vitro-Freisetzungsuntersuchungen anstatt von in vivo-Studien wie z.B. pharmakokinetischen Studien am Menschen und erleichtert dadurch eine Marktzulassung sowohl durch Zeit- als auch Kosteneinsparung. Die Anwendung des Verfahrens ist von Vorteil, um die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen, generischen (und damit kostengünstigen) Arzneimitteln zu erhöhen. Dies ist besonders wünschenswert für die Verfügbarkeit von gemäß der Weltgesundheitsorganisation essenziellen Arzneistoffen und unter denen gerade von solchen, die zur Bekämpfung von Krankheiten mit nur wenigen und/oder teuren therapeutischen Alternativen benötigt werden.
Entstanden ist die Löslichkeitsbestimmungsmethode im Rahmen von zwei Projekten, die beide zu diesem Ziel einer guten globalen Gesundheitsversorgung beitragen: die Erstellung der Biowaiver Monografien von Proguanilhydrochlorid (ein Malaria-Prophylaktikum) und Cefalexinmonohydrat (ein Antibiotikum aus der Gruppe der Cephalosporine) setzt die Publikationsreihe „Biowaiver Monograph Series“ der FIP Focus Group „Bioclassification/Biowaiver“ fort. Jede Monografie gibt eine umfassende wissenschaftliche Empfehlung zur Eignung eines Wirkstoffs der WHO „Model List of Essential Medicines“ und seiner generischen Produkte für das BCS-Biowaiver Verfahren hinsichtlich aller regulatorisch geforderten Aspekte ab. Proguanilhydrochlorid (BCS Klasse III – „hochlöslich“ und nicht „hoch permeabel“) und Cefalexinmonohydrat (BCS Klasse I – „hochlöslich“ und „hoch permeabel“) sind beide für dieses Zulassungsverfahren geeignet.
Im Zuge des anderen Projektes wurde die Löslichkeit und anschließend die BCS Klasse von Wirkstoffen bestimmt, die der 16. und 17. Version der WHO „Model List of Essential Medicines“ neu hinzugefügt wurden. Neun von 16 untersuchten Wirkstoffen, die in feste, perorale Arzneimittel formuliert werden können, sind im Hinblick auf ihre BCS Klasse für das eine Zulassung per BCS-Biowaiver geeignet. Eine umfangreichere Empfehlung könnte im Rahmen einer Biowaiver Monografie gegeben werden.
Die experimentelle Bestimmung der Löslichkeit über einen pH-Wert-Bereich von 1-6,8 war essenzieller Bestandteil beider Projekte, da Literaturdaten zur Löslichkeit der Wirkstoffe nicht oder nur unvollständig vorlagen. Die entwickelte Methode basiert auf einer im Kleinmaßstab angesetzten „Shake-Flask“-Methode zur Bestimmung der thermodynamischen Löslichkeit, wird jedoch in einem Zeitrahmen von 24 Stunden durchgeführt. Sie nutzt die höchste Dosis der Wirkstoffe als Substanzmenge, um zu bestimmen, ob dieser „hochlöslich“ gemäß den BCS-Biowaiver Richtlinien ist oder nicht. Die Methode bzw. das dazugehörige Studienprotokoll beinhalten Empfehlungen zu den einzelnen Schritten der Durchführung, der Auswahl der Medien und Herausforderungen wie Präzipitation (Fallbeispiel: Proguanilhydrochlorid) und Zersetzungsreaktionen (Fallbeispiel: Cefalexinmonohydrat). Löslichkeitsdaten, die mit dieser Methode erhoben werden, können für eine Zulassung per BCS-Biowaiver bei den Gesundheitsbehörden eingereicht werden, aber auch für ein Vorab-Screening genutzt werden, dass „hochlösliche“ Arzneistoffe aus einer Vielzahl von Substanzen herauszufiltern soll, um nähere Untersuchungen im Rahmen einer Biowaiver Monografie anzuschließen.
Die Vorläuferform der eukaryotischen mRNA (prä-mRNA) durchläuft, eine Reihe von Prozessierungs-Schritte, die schließlich zu der Synthese einer „reifen“ und Exportkompetenten mRNA führt. prä-mRNA Spleißen ist ein essentieller Teilschritt dieser Reifung bei der intragene Sequenzen, sogenannte Introns, von der prä-mRNA entfernt werden, während Exons legiert werden. Das prä-mRNA Spleißen wird durch das Spleißosom katalysiert. Dieser Mega-Dalton Komplex, besteht aus fünf Sub-Komplexen, die sich wiederum aus katalytisch aktiven „kleinen nukleären Ribonukleinsäuren“ (snRNAs) und einer Vielzahl von proteinogenen Faktoren zusammensetzen. Diese Subkomplexe, bezeichnet als snRNPs (small nuclear Ribonucleoprotein Particles), binden die prä-mRNA an charakteristischen Sequenzen und richten die prä-mRNA durch eine Reihe von Konformations-Änderungen so aus, dass benachbarte Exons in Kontakt treten und über eine biochemische Ligations-Reaktion verbunden werden können.
Die Exon- bzw Intronerkennung der snRNPs wird durch zahlreiche Spleißfaktoren reguliert. Eine Proteinfamilie, die essentiell für die Regulierung des Spleißens ist, sind Serin/Arginin-reiche Proteine (SR-Proteine). Diese binden vorzugsweise an das 3‘ oder 5’ Ende von Exons, rekrutieren snRNPs und stimulieren dadurch die Exon-Inklusion. Durch diese Stimulierung können Spleiß-Events reguliert und gezielt spezifische Exons ausgeschlossen oder eingeschlossen werden. Dieser Prozess, der als alternatives Spleißen (AS) bezeichnet wird, tritt in 95% des menschlichen Transkriptoms auf und erweitert die Diversität eines Organismus, da verschiedene Transkripte von demselben Gen erzeugt werden können und folglich die Translation unterschiedlicher Proteine mit distinkten Funktionen ermöglicht wird.
Darüber hinaus verfügt die Zelle durch das AS über eine weitere posttranskriptionale Genregulationsebene, die insbesondere unter zellulären Stressbedingungen zur Expression von alternativen Protein-Isoformen von der Zelle genutzt wird. Eine in medizinischer Hinsicht besonders relevante Stressbedingung ist die sogenannte Hypoxie, die eine Sauerstoff-Unterversorgung von Zellen oder Gewebebereichen beschreibt. Hypoxie bzw. hypoxische Bereiche finden sich in Krebszellen und treten in 90% aller soliden Tumoren auf. Als Teil der Hypoxie Stress-Antwort, verfügt die Zelle über einen Adaptations-Mechanismus, der durch Hypoxieinduzierbare Faktoren (HIF) vermittelt wird. Diese Faktoren induzieren die Transkription zahlreicher Gene und stimulieren die Expression von Stressfaktoren, die an der zellulären Adaption der Hypoxie beteiligt sind. Einer dieser Faktoren ist der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor A (VEGFA), welcher unter hypoxischen Bedingungen sekretiert wird und dadurch die Proliferation von Endothelzellen, die Neubildung von Blutgefäßen und damit die Vaskularisation des hypoxischen Bereichs stimuliert.
Die zelluläre Anpassung ist jedoch nicht nur auf die transkriptionelle Regulation des HIF-vermittelten Hypoxie Signalwegs beschränkt, sondern wird auf multiplen Genexpressions-Ebenen reguliert. Obwohl bekannt ist, dass tausende Transkripte unter hypoxischen Bedingungen alternativ gespleißt werden, sind die Faktoren, die die zelluläre Stress-Antwort durch AS regulieren, sowie deren molekularer Mechanismus jedoch weitestgehend unbekannt.
Diese Arbeit umfasst die Identifizierung und Charakterisierung von AS Events, sowie den Einfluss und die Regulation von Spleißfaktoren auf AS unter hypoxischen Bedingungen. Hierzu führten wir globale Genexpressions- und AS-Analysen in HeLaKarzinomzelllinien unter Normoxie (21% O2) und Hypoxie (0.2% O2) durch und zeigen, dass 7962 Gene nach 24h Hypoxie unterschiedlich exprimiert werden. Über AS-Analysen konnten 4434 Transkripte identifiziert werden, die bei Hypoxie über AS reguliert sind. Dabei trat „Exon-Skipping“ als das am häufigsten auftretende AS-Events auf. Über PCR basierte Validierungs-Experimente konnten 5 regulierte Transkripte nachgewiesen werden. Dabei weisen Exon 3 und 4 in BORA, Exon 6 in MDM4 und Exon 4-5 in CSSP1 Exon-Skipping Events auf, während Exon-Inklusionen in CEP192 Exon 28 und in der 3’UTR von EIF4A2 validiert werden konnten.
Darüber hinaus wurde im Rahmen der AS-Analyse die Regulation des sogenannten „backsplicings“ bei Hypoxie untersucht. Im Gegensatz zum linearen Spleißens, wird beim backsplicing das 5’Ende und das 3’Ende von Exons verbunden, was die Bildung von sogenannten zirkulären RNAs (circRNAs) zufolge hat. Obwohl nur wenige Funktionen dieser RNA-Klasse bekannt sind, wurde die Regulation von circRNAs während der Zell-Differenzierung sowie in diversen Krebszellen beschrieben. Dabei können circRNAs als microRNA- oder Protein-Schwämme fungieren oder dienen als Protein-Interaktion Plattform und regulieren dabei die Genexpression.
The expansion of actors and instruments in sovereign debt markets through bond financing generated a coordination problem among bondholders during the debt restructuring process. There is a risk that an individual bondholder will be passive or act against the restructuring slowing down or even precluding the process of restructuring even though it is in the general interest of bondholders as a group, not to mention the population of the country experiencing the shortage of funds for public welfare. In particular, the disruptions to sovereign debt restructuring by frivolous litigation is considered as one of the main threats.
This dissertation is the first major study devoted to sovereign bonds structured through a trust arrangement and the promising features that such a legal structure possesses for an effective and efficient sovereign debt restructuring. It provides a comprehensive inquiry into the evolution of the mechanisms to coordinate creditors, with a focus on bondholders and institutional frameworks which facilitated this coordination. It examines intriguing primary sources from League of Nations archives and provides in-depth case studies on the functionality of the trustees in sovereign bond restructurings performed by Argentina in 2016 and Ecuador in 2008.
Assessing the utility of trust arrangements to address coordination problems, this thesis is driven by the puzzle: How to better balance (i) the need for smooth sovereign debt restructurings, which by definition entails some losses for creditors, with (ii) bondholders’ legitimate interests? What approach can be used in constructing a legal and institutional framework for trustees to promote the best interest of the bondholders in sovereign debt restructuring? As a solution, it seems that incentives for bond trustees to pursue debt sustainability will achieve both goals.
In this regard, recognition of the concept of debt sustainability, being in substance the IMF and WB debt sustainability assessment, as the best interest of bondholders in sovereign debt restructuring is beneficial from multiple aspects. It enables a bond trustee to excel in its role as a guardian of bondholders by following the best interest of bondholders in exercising its discretion. Moreover, it fosters an equilibrium between the interests of private creditors and a state taking into account its socio-political aspects.
Bei fehlender Milz nach einer totalen Splenektomie kann es unter anderem zum lebensgefährlichen Postsplenektomie-Syndrom (overwhelming postplenectomy infection, OPSI) kommen, weshalb die partielle Splenektomie (PS) zunehmend in den Fokus rückt. Die Reduktion perioperativer Komplikationen erscheint zudem wünschenswert, weswegen der laparoskopische Operationsansatz zunehmende medizinische Resonanz genießt. Letzteren verbinden Chirurgen häufig mit geringeren postoperativen Schmerzen für den Patienten, besseren kosmetischen Ergebnissen und einer Reduktion chirurgischer Komplikationen.
Ziel dieser Studie war es, anhand verschiedener Parameter die perioperativen Ergebnisse zwischen der laparoskopischen partiellen Splenektomie (LPS) und der offenen partiellen Splenektomie (OPS) bei Kindern und Jugendlichen zu vergleichen. Betrachtet wurde ein Zeitraum von etwa zehn Jahren (2008-2018), wobei insgesamt 26 Patienten die Einschlusskriterien erfüllten. 10 Patienten unterzogen sich der LPS, während bei 16 Patienten eine OPS durchgeführt wurde. Anhand der digitalen Patientenakten wurden verschiedene perioperative Parameter erhoben, welche unter anderem die postoperative Schmerzstärke, den Analgetikabedarf, verschiedene hämatologische Variablen sowie die perioperativen Komplikationen umfassten.
Zwischen den beiden Gruppen unterschieden sich das postoperative Schmerzbefinden mit entsprechend analgetischer Therapie, der zeitliche Beginn des oralen Kostaufbaus und der postoperativen Mobilisation sowie die Dauer des stationären Aufenthalts nicht signifikant. Ferner wurden die chirurgischen Komplikationen anhand der Clavien-Dindo-Klassifikation (CDC) in verschiedene Grade eingeteilt und konnten sowohl in der laparoskopischen als auch in der offen-chirurgisch operierten Gruppe zeigen, dass hauptsächlich leichte Komplikationen vorlagen, bei denen ein Großteil der Patienten lediglich eine medikamentöse Therapie (80.8%) für die aufgetretenen Komplikationen (CDC ≤ II) benötigte. Lediglich bei 13% der offen operierten Patienten bedurfte es einer chirurgischen bzw. endoskopischen Intervention (CDC ≥ III).
Die Operationsdauer zwischen den beiden Gruppen unterschied sich jedoch signifikant. Bei der partiellen Splenektomie nahm der laparoskopische Zugangsweg signifikant mehr Zeit in Anspruch als bei der offen-chirurgisch operierten Gruppe. Darüber hinaus wurde der perioperative Blutverlust anhand der Mercuriali-Formel berechnet und zeigte bei der LPS-Gruppe einen signifikant höheren perioperativen Blutverlust als bei der OPS.
Die durch diese Studie erzielten Resultate zeigen anhand verschiedener perioperativer Parameter, dass die LPS im Vergleich zur etablierten OPS trotz signifikanter Unterschiede in der Operationszeit und dem perioperativen Blutverlust beide sichere und praktikable Operationsverfahren sind. Zusammenfassend stellten sich hinsichtlich der weiteren perioperativen Ergebnisse keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen dar.
Im Rahmen unserer Untersuchung konnte zudem dargestellt werden, dass die postoperativen Rekonvaleszenzvariablen sowie die Scores zur Erfassung der chirurgischen Komplikationen keinen signifikanten Unterschied ergaben. Ebenso wies die postoperativ dokumentierte Schmerzstärke der Patienten und der daraus resultierende Analgetikabedarf keine signifikanten Unterschiede auf.
Im Rahmen dieser vorliegenden Thesis wurden verschiedene photosensitive Systeme anhand statischer und zeitaufgelöster optischer Spektroskopiemethoden charakterisiert. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag in der Entwicklung und Untersuchung neuer Quantenpunkt-basierter Hybridsysteme. Es war möglich die optischen Eigenschaften der Quantenpunkte über Optimierung der Syntheseschritte zu variieren und so auf geplante Projekte anzupassen.
Im Projekt „Quantenpunkte als Zwei-Photonen Antenne“ sollten die hohen Zwei-Photonen Einfangquerschnitte von Quantenpunkten ausgenutzt werden um in Kombination mit einer photolabilen Schutzgruppe, ein Uncaging im NIR-Bereich zu realisieren. Es wurden ZnSe/ZnS Partikel synthetisiert, die eine starke Emission im Bereich der Absorption der Schutzgruppe zeigen. Anhand von zeitaufgelösten transienten Absorptionsexperimenten mit einer Anregungswellenlänge bei 775 nm wurde eine Zwei-Photonen Absorption der Partikel nachgewiesen. Jedoch wurden starke Emissionsbeiträge aus Fallenzuständen und eine geringe Stabilität beobachtet. Die Synthese von CdS/ZnS Quantenpunkten lieferte stabile Partikel mit geringer trap state Emission. Diese Partikel wurden in einem Modellhybridsystem als Energiedonoren eingesetzt. Als Akzeptor wurde der Farbstoff Cumarin343 gewählt. In statischen Absorptions- und Emissionsmessungen, zeitkorrelierten Einzelphotonenmessungen sowie in fs-zeitaufgelösten transiente Absorptionsmessungen konnte ein ultraschneller Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung des Hybridsystems beobachtet werden. Über TPiF Messungen wurde die Zwei-Photonen Absorption der Quantenpunkte detektiert. Ein Energietransfer nach Zwei-Photonen Anregung der Quantenpunkte wurde beobachtet. Schließlich wurde ein Hybridsystem aus CdS/ZnS und der photolabilen Schutzgruppe Az-NDBF (Synthese im AK Heckel, Goethe Universität, Frankfurt a. M.) untersucht. Auch in diesem System wurde ein Energietransfer von Quantenpunkt auf die Schutzgruppe nach Ein- und Zwei-Photonen Anregung beobachtet. Anhand von TA Experimenten wurde eine Zeitkonstante von <100 ps für den Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung ermittelt. Es konnte anhand der vorgestellten Resultate gezeigt werden, dass sich Quantenpunkte, aufgrund der guten Anpassung ihrer optischen Eigenschaften generell sehr gut als Antennen für organische Verbindungen eigenen.
Des Weiteren wurde ein Hybridsystem aus CdSe/ZnS Quantenpunkten und einer Dyade (Verbindung eines DTE Photoschalters und BODIPY Derivats), entworfen und charakterisiert. Ein ultraschneller EET von BODIPY auf den geschlossenen DTE Schalter wurde in vorangegangenen Studien beobachtet. Dieser EET führte zur Löschung der BODIPY-Emission. Sobald der Photoschalter im offenen Zustand vorliegt, findet aufgrund des fehlenden spektralen Überlapps kein EET statt und es wird die BODIPY-Emission detektiert. Die Erweiterung der Dyade um einen Quantenpunkt zeigte nach Anregung des Quantenpunkts dessen Fluoreszenzlöschung. Da die Emissionsbande der Quantenpunkte im Absorptionsbereich des BODIPY Farbstoffes liegt, konnte über statische und zeitaufgelöste Experimente ein ultraschneller EET von CdS/ZnS auf den Farbstoff ermittelt werden. Dies führte zu der Erweiterung des Anregungsspektrums des BODIPY Farbstoffs. Die Kopplung der Dyade an die Quantenpunktoberfläche lieferte eine Verbindung mit dem breiten Anregungsspekrum des Quantenpunkts und der schaltbaren Fluoreszenz der Dyade.
Das Hybridsystem aus CdSe Quantenpunkten und PDI zeigte vom Verhältnis der Quantenpunkte zu gekoppelten PDI Molekülen abhängige Fluoreszenzsignale. In TA Experimenten wurde ein ultraschneller EET ermittelt. Für hohe PDI Konzentrationen wurde ein weiterer EET von höher angeregten Elektronen auf das PDI identifiziert. Neben der EET Charakterisierung konnte ein zusätzlicher Prozess innerhalb des Hybridsystems mit hoher PDI Konzentration beobachtet werden. Auf den EET von Quantenpunkt auf PDI folgt ein ET aus dem Valenzband des Quantenpunkts in das HOMO des PDI*. In vorangegangene Arbeiten zu Hybridsystemen aus CdSe/ZnS und PDI wurde kein ET beobachtet. In dem beschriebenen Projekt konnte der Einfluss einer passivierenden Schale auf die elektronischen Eigenschaften von CdSe Quantenpunkten gezeigt werden.
Im letzten Teil dieser Thesis wurde die spektroskopische Charakterisierung einer NVOC und zweier NDBF Schutzgruppen beschrieben. Es konnten anhand statischer Absorptionsmessungen eine Freisetzungsquantenausbeute für NVOC-Adenin von 1,1 % ermittelt werden. Die Charakterisierung der Schutzgruppen mit einer NDBF Grundstruktur (DMA-NDBF und Az-NDBF) ergab eine Abhängigkeit der Freisetzungs- und Fluoreszenzausbeute von der Polarität des Lösungsmittels. In polarer Umgebung reduzierten sich die Quantenausbeuten deutlich...
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene metabolische Anpassungsmechanismen des humanpathogenen Bakteriums Acinetobacter baumannii an seinen Wirt untersucht. Im ersten Teil wurde die Rolle von verschiedenen Trimethylammoniumverbindungen (Cholin, Glycinbetain und Carnitin) und den zugehörigen Aufnahmesystemen, sowie ihren Stoffwechselwegen während dieses Prozesses analysiert. Für die Analyse der Transportsysteme wurde eine markerlose Vierfachmutante (Δbcct) von A. baumannii generiert, sodass alle bekannten Transportsysteme für die genannten Verbindungen deletiert vorlagen. Wachstumsversuche mit dieser Mutante zeigten, dass es in A. baumannii keine weiteren Transporter für die Aufnahme von Cholin gibt, jedoch weitere primär aktive oder sekundär aktive Transporter für die Aufnahme von Glycinbetain. Weiterhin konnten innerhalb dieser Arbeit die KM-Werte der Transporter bestimmt werden. Verschiedene Virulenz- und Infektionsanalysen führten zu dem Schluss, dass die Transporter keine Rolle bei der Virulenz von A. baumannii spielen. In Genomanalysen konnten die Gene, die für die Enzyme des Oxidationsweges von Cholin zu Glycinbetain kodieren identifiziert werden (Cholin-Dehydrogenase (betA), GlycinbetainAldehyd-Dehydrogenase (betB) und ein potenzieller Regulator (betI)). Es wurden Deletionsmutanten innerhalb dieses Genclusters generiert, mit dessen Hilfe gezeigt werden konnte, dass Cholin unter Salzstress ausschließlich als Vorläufer für das kompatible Solut Glycinbetain fungiert und nicht als kompatibles Solut von A. baumannii genutzt werden kann. Virulenz- und Infektionsstudien mit den Deletionsmutanten zeigten, dass der Cholin-Oxidationsweg keine Rolle bei der Virulenz von A. baumannii spielt.
Die Cholin-Dehydrogenase BetA wurde zusätzlich in E. coli produziert und anschließend mittels NiNTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die biochemische Charakterisierung des Enzyms zeigte, dass BetA membranständig ist und die höchste Aktivität bei einem pH-Wert von 9,0 hat. Salze wie NaCl oder KCl hatten keinen Effekt auf die Aktivität des Enzyms, während Glutamat die Aktivität stimulierte.
Weiterhin konnte FAD als Cofaktor identifiziert werden und der KM-Wert ermittelt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Oxidation von Cholin zu Glycinbetain unter isoosmotischen Bedingungen zu einem Anstieg der ATP-Konzentration in A. baumannii-Zellsuspensionen führt und damit, dass Cholin als alternative Energiequelle genutzt wird. Das Phospholipid Phosphatidylcholin konnte als natürliche Cholinquelle identifiziert werden. Eine Rolle der Phospholipasen D bei der Abspaltung der Cholin-Kopfgruppe des Phosphatidylcholins konnte ausgeschlossen werden. Die Gene für die Oxidation von Cholin zu Glycinbetain werden ausschließlich in Anwesenheit von Cholin exprimiert, jedoch unabhängig von der extrazellulären Salzkonzentration. Diese Studien zeigten, dass der Cholin-Oxidationsweg eine Rolle in der metabolischen Adaptation von A. baumannii an den Wirt spielt. Phosphatidylcholin kann hier als natürliche Cholinquelle im Wirt genutzt werden, da die Wirtsmembranen aus bis zu 70 % Phosphatidylcholin bestehen. Transportstudien mit Carnitin führten zu dem Schluss, dass der Transporter Aci01347 aus A. baumannii neben Cholin ebenfalls Carnitin transportiert. Wachstumsversuche mit einer aci01347-Mutante bestätigen, dass Aci01347 essenziell für die Aufnahme und anschließende Verwertung von Carnitin als Kohlenstoffquelle ist. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass das Transportergen mit essenziellen Genen für den Carnitin-Abbau in einem Operon liegt. Für die Analyse des Abbauweges von Carnitin wurden markerlose Deletionsmutanten innerhalb des Operons generiert. In Wachstumsstudien mit diesen Mutanten konnte der Abbauweg aufgeklärt werden und der Regulator des Operons identifiziert werden. Carnitin wird hier über Trimethylamin und Malat-Semialdehyd zu D-Malat umgewandelt und anschließend über Pyruvat in den TCA-Zyklus eingespeist. Der Regulator wurde zusätzlich in E. coli produziert und mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Mithilfe von EMSA-Studien konnte die Bindestelle des Regulators auf eine 634 Bp lange DNA-Sequenz stromaufwärts des CarnitinOperons eingegrenzt werden. Durch Transkriptomanalysen konnte gezeigt werden, dass bei Wachstum mit Acetylcarnitin, Carnitin und D-Malat die Expression des Carnitin-Operons induziert wurde. Darüber hinaus wurden die Gene konservierter Aromatenabbauwege wie z. B. des Homogentisatweges, des Phenylacetatweges und des Protocatechuat-Abbaus, verstärkt exprimiert. In G. mellonellaVirulenzstudien konnte eine Rolle des Abbaus von Carnitin bei der Virulenz von A. baumannii nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte dieser Effekt dem entstehenden Trimethylamin zugesprochen werden...
The most versatile tool for visualizing endogenous RNA is molecular beacons (MBs). MBs are modified oligonucleotides that consist of a stem-loop structure equipped with a fluorophore and a quencher at the opposite ends. They only give a fluorescent signal when hybridized to the target RNA. Here we present our recent efforts to enhance the spatiotemporal resolution of RNA visualization by refining MBs.
We first asked if we could refine MBs to visualize defined subcellular populations of RNA in living neurons. To achieve this, we utilize visible light-activatable Q-dye MBs to allow only a subcellular fraction to be activated. Here, the fluorophore at the 5’-end was linked to a second quencher via a photolabile coumarin protecting group. Therefore, the MB only gives a fluorescent signal, when activated with visible light and hybridized to the target. This architecture allowed local activation of a hybridized subpopulation in a defined area of the cell. Knowing the exact origin of the activated RNA, we were able to increase the available monitoring time for neuronal mRNA from several minutes (literature known MBs) to more than 14 hours.
We next asked if it would be possible to gain spatiotemporal control over where the MB hybridization events occur. Therefore, we developed photo-tethered MBs where two phosphates in the loop backbone are covalently linked to each other via two photocages. This prevents the MB from hybridization to the target RNA. Only when light is applied, the photo-tethers are cleaved, and the inherent hybridization function of the MB is activated. This architecture allowed us to control the hybridization of photo-tethered MBs in primary cultured neurons.
Ziel unserer retrospektiven Studie war es, die refraktiven und kornealen Veränderungen nach DMEK bei pseudophaken Patienten, die sich auf Grund einer endothelialen Hornhauterkrankung behandeln ließen, zu untersuchen. Durch unsere einheitlich pseudophake Patientenkohorte wollten wir untersuchen, ob sich die refraktiven Veränderungen nach DMEK von den bereits bekannten Änderungen bei einer simultan durchgeführten Katarakt- und DMEK-Operation sogenannte „Triple“-DMEK unterscheiden. Primärer Endpunkt der Studie war die Veränderung der Refraktion unter besonderer Berücksichtigung des sphärischen Äquivalents (SEQ) des jeweiligen pseudophaken Auges nach DMEK. Sekundäre Endpunkte umfassten die Entwicklung des Visus, der CCT, der ECD und verschiedener kornealer Parameter, die mittels Scheimpflug- Tomographie ermittelt wurden.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte hierzu die retrospektive Analyse von Daten, die in den Patientenakten dokumentiert und digital gespeichert waren (Pentacam® HR). Es wurden 109 Augen von 95 Patienten, die sich im Zeitraum von Februar 2015 bis Dezember 2018 mittels DMEK in unserem Zentrum behandeln ließen, in die Studie eingeschlossen. Davon stammten 66 Augen (61%) von weiblichen und 43 Augen (39%) von männlichen Patienten. Es handelte sich bei 61 Augen (56%) um ein linkes und bei 48 Augen (44 %) um ein rechtes Auge. Die Patienten waren 20 bis 91 Jahre alt. Das mittlere Alter zum Zeitpunkt der DMEK-Operation betrug 71,9 Jahre (SD ±10,23). Der Altersmittelwert der Männer lag bei 70,4 Jahren (SD 11,23, Spannweite: 20-84) und der der Frauen bei 72,9 Jahren (SD 9,49, Spannweite: 47-91). Der mittlere Nachbeobachtungszeitraum betrug 10,47 Monate (SD 6,78, Spannweite: 1-28 Monate).
Für das SEQ konnte bei Betrachtung aller ausgewerteten Daten eine leichte Tendenz in Richtung eines „hyperopen shifts“ mit einer mittleren Veränderung des SEQ von + 0,1 D gezeigt werden, die jedoch nicht statistisch signifikant war. Zwischenzeitlich kam es im Nachbeobachtungszeitraum zu einer klaren Tendenz hinsichtlich einer Myopisierung bei Betrachtung aller ausgewerteten Daten. Der „hyperope shift“ konnte erst am Ende, möglicherweise infolge einer deutlich reduzierten Patientenzahl, beobachtet werden. In der Subgruppe „vollständige Kontrollen“ für das SEQ zeigte sich eine Tendenz hinsichtlich einer leichten Abnahme des SEQ, die jedoch ebenfalls nicht statistisch signifikant war und aufgrund der geringen Gruppengröße (n=32) kritisch betrachtet werden sollte. In unserer Kohorte konnte somit keine eindeutige Aussage über eine postoperative Änderung des SEQ in Richtung eines „hyperopen shifts“ oder „myopen shifts“ gemacht werden. Die Refraktion verhielt sich in unserem Patientenkollektiv nach DMEK insgesamt weitestgehend stabil. Insofern sind refraktive "Überraschungen", wie sie weiterhin häufig nach "Triple"-DMEK zu beobachten sind, bei zuvor pseudophakisierten Patienten in einem weitaus geringeren Maße zu erwarten. Unter den mittels Scheimpflug-Technologie untersuchten kornealen Parametern wies lediglich der posteriore Astigmatismus signifikante Veränderungen im Sinne einer Reduktion der kornealen Krümmung auf. Indirekt heben unsere Ergebnisse damit die Bedeutung des posterioren Hornhautprofils auf die postoperative Refraktionsentwicklung und somit auch auf die IOL-Kalkulation bei "Triple"-DMEK-Prozeduren hervor. Außerdem scheint der postoperative Anstieg der Sehschärfe mit den gleichfalls signifikanten Änderungen der kornealen Densitometrie in der 2-6 mm Zone, des Hornhautvolumens und der zentralen Hornhautdicke umgekehrt korreliert zu sein.
Darüber hinaus lässt sich festhalten, dass auch unsere Untersuchung in einem gewissen Maße die Überlegenheit der DMEK gegenüber etablierten Techniken, wie beispielsweise der PK verdeutlicht. Sowohl anhand der refraktiven Stabilität als auch der Visusergebnisse konnten wir belegen, dass das DMEK-Verfahren nach der anfänglichen Lernkurve die wohl besten funktionellen Ergebnisse in der Behandlung von Patienten mit endothelialen Hornhauterkrankungen liefert. Besonders bei bereits pseudophaken Patienten weist die DMEK durch die zu erwartende hohe postoperative refraktive Stabilität viele Vorteile auf
und erscheint insbesondere hinsichtlich der Vorhersagbarkeit des postoperativen refraktiven Ergebnisses der „Triple“- DMEK überlegen.
To this day, stroke is the leading cause of death and disability worldwide. Due to increasing age of the world population and poor lifestyle, the incidence is further rising. Besides mechanical thrombectomy as a surgical option, there is a lack of therapeutic options with recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA) being the only approved drug for treatment for ischemic stroke. However, there are various problems that make the administration of rt-PA difficult. In particular, it can only be given for ischemic (not hemorrhagic) stroke, and there is a narrow time frame of 4.5 hours after onset of stroke, in which it can be successfully applied. While the success rates of combined thrombectomy with rt-PA are around 60%, less than 5% of patients receive this therapy.
ß-Hydroxybutyrate (BHB) is a ketone body that is formed in high amounts during fasting and lipolysis. Ketone bodes and the ketogenic diet have been shown to have neuroprotective properties in neurodegenerative diseases. In prior work of our group, the ketogenic diet was shown to have beneficial effects in mice after transient ischemia. In the present work, a single dose of BHB was tested for beneficial effects. For this purpose, microdialysis was used to demonstrate that BHB can cross the blood-brain barrier. For the next series of experiments, transient cerebral ischemia was induced in mice for 90 minutes by unilaterally occluding the middle cerebral artery (MCAO) with a silicone-covered filament. Behavioral tests one day after BHB administration showed that the moderate dose of 30 mg/kg, given immediately after reperfusion, improved the neurological score significantly whereas a lower (10 mg/kg) and a higher dose (100 mg/kg) had no effects The main part of the experiments focused on mitochondrial respiration as a potential mechanism of action for BHB. In isolated mitochondria from mouse brain, BHB (1-10 mM) was able to stimulate mitochondrial respiration stronger than pyruvate, but not as strong as succinate.. In the following experiments, MCAO was induced in vivo, and mitochondria were isolated and investigated ex vivo. Experiments were conducted 60 minutes, 24 hours, 72 hours, and 7 days after cerebral ischemia and reperfusion. Besides mitochondrial respiration (normalized to mitochondrial protein content or citrate synthase activity), several other parameters were monitored: the development of bodyweight throughout the experiment, citrate synthase activity, plasma metabolites and behavior to assess motor functions. Three behavioral tests were conducted: first, the Corner test, an experiment for measuring the extent of unilateral movement. Here, if a stroked mouse is put into a narrow corner (30°), it is most likely to turn unilaterally to the right, whereas an unimpaired mouse will turn to both sides randomly. From a total of 10 turns, a laterality index was calculated. Second, in the Chimney test, the mouse walks heads first into a tube. Once it reaches the end, the tube is tipped 90 degrees to stand on the table vertically. Motorically impaired animals have difficulties crawling backwards up to the top of the tube. The experiment was stopped if an animal did not reach the top of the tube within 60 seconds. Third, in the Rotarod test, the mouse is placed on a rotating beam on which it is supposed to walk for at least 60 seconds, and the time when the animal falls off the rotating tube is measured.
All animals that had undergone ischemia showed massive weight loss until 72 hours after reperfusion. Weight loss then stagnated and there was a trend of increasing weight 7 days after reperfusion. The behavioral analysis showed that 24 hours after reperfusion, BHB-treated animals performed significantly better in the Corner test, meaning their moving patterns were more heterogeneous than those of saline-treated animals and in the Chimney test. 72 hours after reperfusion, BHB-treated animals still performed significantly better in the Chimney test, but 7 days after reperfusion, the performances of BHB- and saline-treated animals were no longer different from each other in any of the behavioral tests. In separate experiments, the plasma metabolites glucose, lactate, and pyruvate were changed in the animals that had undergone ischemia but were not affected by BHB administration.
Mitochondrial respiration was tested at four time points after the administration of BHB after reperfusion – 60 minutes, 24 hours, 72 hours, and 7 days after transient cerebral ischemia. 60 minutes later, data showed an increase of oxygen consumption of the complexes I and II. OxPhos was also increased but the effect at this point, did not reach statistical significance. 24 hours after reperfusion, this effect was consolidated: complex I, complex II and OxPhos respiration were significantly improved in the BHB-treated group compared to saline...
Untersuchung von long non-coding RNA im Entzündungsmodell mit mesenchymalen Stamm-/Stromazellen
(2022)
Entzündungsprozesse sind essentiell zur Abwehr exogener und endogener Pathogene sowie bei der Geweberegeneration. Ihre Dysregulation ist an unzähligen Krankheitsprozessen beteiligt. Die Auslösung einer Entzündung ist besonders gut untersucht bei Toll-like Rezeptoren, die Strukturen von Mikroorganismen erkennen können und durch Signalkaskaden beispielsweise ΝF-κB aktivieren. LncRNAs regulieren die Genexpression und wurden dabei bereits im Rahmen von Entwicklung, Proliferation, Karzinogenese und Entzündung nachgewiesen. ASC sind für die regenerative Medizin aufgrund ihrer einfachen Gewinnung und ihrer Differenzierbarkeit höchst interessant. Zudem haben sie einen Einfluss auf inflammatorische Prozesse. Daher könnte es relevant sein, welche Rolle lncRNAs während Entzündungsprozessen bei ASC spielen. Daraus könnten sich auch potentielle Ansätze für Diagnostik und Therapie entwickeln.
Es wurde ein Entzündungsmodell mit ASC etabliert, welche mit Bakterientoxinen stimuliert wurden. Das Modell wurde mit einem im nephrologischen Labor etablierten Modell mit renalen Epithelzellen hinsichtlich der Entzündungsantwort verglichen. Diese Entzündungsantwort wurde anhand der Zytokinproduktion auf mRNA- und Proteinebene quantifiziert. Anschließend erfolgte eine RNA-Sequenzierung und Vergleich der RNA bei stimulierten und nicht-stimulierten ASC. Die detektierten veränderten lncRNAs wurden mittels qPCR validiert. Zuletzt wurde durch knockdown einer ausgewählten lncRNA versucht, Einfluss auf die Entzündungsprozesse zu nehmen.
Die vorgelegte Arbeit zeigt deutlich, dass ASC eine stärkere Entzündungsantwort als renale Epithelzellen zeigen. Als Mittelweg aus maximaler Entzündungsantwort und realistischen Stimulationsbedingungen wurde eine Stimulation mit 10 ng/ml LPS für 4 h gewählt. Nach der RNA-Sequenzierung zeigte die funktionelle Analyse der veränderten codierenden RNA Hinweise auf Entzündungsprozesse, Zellmigration, Chemotaxis, Differenzierung, Proliferation sowie Alkoholismus, Atherosklerose, Diabetes mellitus und Insulinresistenz. Diese Ergebnisse lassen sich mit dem aktuellen Stand der Forschung in Einklang bringen und legen die Bedeutung von Entzündung und ASC in diesen Bereichen dar. Bei den lncRNAs ergab die Sequenzierung insgesamt 48 expressionsveränderte Transkripte, H19 konnte hierbei erfolgreich validiert werden. Diese lncRNA war im Rahmen der LPS-induzierten Entzündung expressionsvermindert. Aufgrund donorspezifischer Einflussfaktoren auf die Genexpression bei ASC wie Körpergewicht und Morbidität sowie allgemeiner interindividueller Schwankung der Expression von lncRNA sind aber weitere Untersuchungen zur Detektion relevanter lncRNAs erforderlich. Die Transfektionsversuche zeigten Hinweise darauf, dass der H19-knockdown möglicherweise die LPS-vermittelte Entzündungsantwort bei ASC verstärkt.
Zusammenfassend wurde ein Modell zur Untersuchung von lncRNA bei LPS-induzierter Inflammation in ASC etabliert sowie im Rahmen dessen H19 als relevante lncRNA detektiert, die den Ausgangspunkt für weitere Forschung darstellt.
Sensors for high rate charge particle tracking have to withstand the harsh radiation doses deposited by the particles to be sensed. This holds particularly for the novel CMOS Monolithic Active Pixel Sensors, which are considered a promising sensor technology for future vertex detectors due to their very light material budget and excellent spatial resolution. To resist the radiation doses expected close to the interaction regions of heavy-ion experiments, the sensors have to be hardened against radiation doses, which exceed the native tolerance of CMOS technology significantly. In this thesis, the results of non-ionizing radiation hardness studies at the IKF on sensor prototypes developed at the IPHC in Strasbourg are presented. Our results demonstrate that the CMOS sensors evaluated in the context of this thesis can withstand non-ionizing radiation of up to 5×10^14 neq/cm^2. This hardness qualifies them as promising candidates for use in future vertex detectors.
Macroautophagy, herein referred to as autophagy, is an evolutionarily conserved homeostatic process that normally occurs inside eukaryotic cells which involves degradation of cytoplasmic substances via lysosomes. It can be induced by various conditions such as starvation and drug exposure, as well as be inhibited by numerous compounds. Under normal conditions, the doublemembrane autophagosomes engulf the cytosolic substrates and deliver them to lysosomes for digestion. These substrates include unnecessary or dysfunctional cell components, such as faulty macromolecules, organelles and even invading pathogens. Autophagosomes are formed through the co-operative work of various autophagy-related (ATG) proteins organized into complexes. Upon closure of the autophagosomes, they fuse with the acidic lysosomes, resulting in formation of autolysosomes and the delivery of lysosomal hydrolases to degrade the engulfed contents. The fusion of the autophagosome with lysosome is carried out by specific SNARE proteins, small GTPases and their effectors including tethers, adaptors and motor proteins. Autophagy is impaired in many human diseases including cancer, neurodegenerative diseases, aging and inflammation. Therefore, manipulation of autophagy pathway holds a great promise for new therapeutic applications ...
Erhöht die Gabe intravenöser Tranexamsäure die Wahrscheinlichkeit für thromboembolische Ereignisse?
(2022)
Hintergrund: Tranexamsäure (TXA) ist ein Antifibrinolytikum, welches Blutungen effizient reduzieren kann. Auf Grund des Wirkmechanismus bestehen jedoch Bedenken, dass TXA zu einem erhöhten Risiko für thromboembolische Ereignisse (TE) führen könnte.
Zielsetzung: Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung eines möglichen Zusammenhanges zwischen der Applikation intravenöser (iv) TXA und dem Auftreten von TE sowie der Mortalität. Ebenfalls soll ein möglicher Dosis-abhängiger Effekt untersucht werden.
Methoden: Es erfolgte eine systematische Suche der MEDLINE Datenbank und des Cochrane Central Register of Controlled Trials. Berücksichtigt wurden alle randomisiert kontrollierten Studien bis inklusive 2020, welche iv TXA mit Placebo oder einer Kontrollgruppe ohne Intervention verglichen. Die eingeschlossenen Studien sind in englischer, deutscher, spanischer oder französischer Sprache publiziert. Übergeordnete Endpunkte waren die Summe aller TE sowie die
Gesamtmortalität. Zusätzlich wurden die Endpunkte venöse Thrombosen, Lungenembolien, venöse thromboembolische Ereignisse (VTE), Myokardinfarkte, Schlaganfälle oder transitorische ischämische Attacken, Mesenterialischämien, arterielle Verschlüsse, blutungsassoziierte Mortalität sowie nicht-blutungsassoziierte Mortalität untersucht. Anhand der „Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses“ (PRISMA) wurden die vorliegende Metaanalyse, Subgruppen- und Sensitivitätsanalyse erstellt. Als Effektstärkemaß wurde die Risikodifferenz (RD) berechnet. Für den primären Endpunkt der Summe aller TE erfolgten zusätzliche Sensitivitätsanalysen zur Berechnung des Risikoquotienten (RR). Eine Metaregressionsanalyse wurde zur Untersuchung eines dosisabhängigen Effektes durchgeführt. Das Bias-Risiko der eingeschlossenen Studien wurde anhand des Cochrane Risk of Bias Tool bewertet.
Ergebnisse:
Insgesamt wurden 216 Studien in die vorliegende Metaanalyse eingeschlossen. Die Summe aller TE betrug 1020 (2,1%) in der TXA-Gruppe und 900 (2,0%) in der Kontrollgruppe. Es fand sich kein Zusammenhang zwischen iv TXA und dem Risiko für die Summe aller TE (RD = 0,001; 95%-Konfidenzintervall (CI): -0,001 bis 0,002; P = 0,49) sowie für venöse Thrombosen, Lungenembolien, VTE, Myokardinfarkte oder -ischämien und Schlaganfälle oder transitorische ischämische Attacken. Die Sensitivitätsanalyse für die Summe aller TE zur Berechnung des RR zeigte keine Assoziation mit iv TXA, weder unter Ausschlussder Studien ohne TE (RR = 1,03; 95%CI: 0,95 bis 1,12; P = 0,52) noch unter Einschluss dieser Studien (RR = 1,02; 95%CI: 0,94 bis 1,11; P = 0,56). Die Sensitivitätsanalyse der Studien mit einem geringen Selektionsbias zeigte ein vergleichbares Ergebnis. Die Sensitivitätsanalyse mit Patienten mit einem erhöhten Thromboembolie-Risiko fand keine Assoziation zwischen iv TXA und TE (RD = 0,000; 95%CI: -0,008 bis 0,009; P = 0,95). Die Subgruppenanalyse von Studien mit bis zu 99 Patienten, 100 bis 999 Patienten und 1.000 oder mehr Patienten zeigte keine Assoziation zwischen iv TXA und der Summe aller TE. Die Gabe von iv TXA war mit einer signifikanten Reduktion der Gesamtmortalität (RD = -0,007; 95%CI: -0,012 bis -0,004; P < 0,001) und der blutungsassoziierten Mortalität verbunden. Für die nicht-blutungsassoziierte Mortalität zeigte sich kein signifikanter Zusammenhang. Eine Metaregression mit 143 Interventionsgruppen fand keinen Zusammenhang zwischen der TXA-Dosierung und dem Risiko für VTE.
Diskussion: Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass keine Assoziation zwischen iv TXA und TE besteht. Die Sensitivitätsanalysen konnten dieses Ergebnis bestätigen. Die Metaregressionsanalyse fand keinen dosisabhängigen Zusammenhang zwischen iv TXA und VTE. Gleichzeitig wird die Gesamtmortalität durch TXA signifikant reduziert. Die vorliegende Analyse unterstützt die sichere Anwendung von iv TXA und legt einen wahrscheinlichen Überlebensvorteil nahe. Die Subgruppenanalysen der neurologischen Patienten lieferten uneindeutige Ergebnisse, weshalb der Nutzen von iv TXA für dieses Patientenkollektiv unklar bleibt.
In Europe, the sugar refinery is largely based on sugar beets. This route for obtaining household sugar results in a large amount of biomass waste, consisting mainly of the insoluble beet resi-dues, e.g., cell wall fragments. To a vast moiety this debris consists of the polymer pectin (up to 20% in the dry total solids). The structure of pectin is based on a backbone of D-galacturonic acid units (GalA), but also contains various other sugar monomers, predominantly L-arabinose, D-galactose, L-rhamnose and D-xylose. The amount of GalA adds up to a moiety of up to 70% with-in this sugar cocktail. So far, this debris is only fed to cattle or simply burnt. In nature, pectin is a common substrate for various organisms. The degradation of pectin-rich biomass is often per-formed by filamentous fungi like Hypocrea jecorina (also known as Trichoderma reesei) and As-pergillus niger, which evolved pectinases to degrade the pectin backbone and pathways to con-sume the monomer GalA as a sole carbon source. The fungal catabolism of pectin residues starts with the reduction of GalA to L-galactonate (GalOA) by a GalA-reductase. Even though filamen-tous fungi are native hosts of the GalA-catabolism and certain engineering approaches have al-ready been demonstrated, this class of organisms remains challenging with regard to bioreactor cultivation and tedious genetic accessibility. In contrast, the yeast S. cerevisiae is well known in fermentation processes and easily modified by a versatile set of genetic tools. So far, first ap-proaches have already been conducted to transfer the GalA utilization pathways into S. cerevisiae, but these approaches indicated limitations regarding GalA-uptake and redox cofac-tor replenishment due to the relatively high oxidative state of GalA compared to other sugars like glucose and galactose. Furthermore, the generally strongly increased demand for redox co-factors must be met by GalA reduction by finding new cofactor sources or redirecting reactions of the core metabolism.
This work aimed at the production of GalOA, which is the first intermediate of the fungal GalA catabolism. This compound shows an interesting range of potential applications, for instance as a food and cosmetic additive. To overcome the oxidized character of GalA, the presence of a more reduced co-substrate as a redox donor and as a carbon and energy source was required. To further enhance the reduction of GalA, modulation of the redox-cofactor supply and enzyme engineering were performed.
Generally speaking, protein import into mitochondria and chloroplasts is a post-translational process during which the precursor proteins destined for mitochondria or chloroplasts are translated with cytosolic ribosomes and targeted. The previous results showed that the isolated chloroplasts can import in vitro synthesized proteins and the absence of ribosomes in the immediate area around chloroplasts in electron microscopy (EM) images. However, none of the EM images were recorded in the presence of a translation elongation inhibitor. Also, the observation showed that ribosomes stably bind to purified liver mitochondria in vitro, and the first indication of chloroplast localization of mRNAs encoding plastid proteins in Chlamydomonas rheinhardtii, which challenge the post-translational import and support the co-translational process. Therefore, in this study, the association of the ribosomes to the isolated chloroplasts were analyzed, a binding assay was established and showed that naked ribosomes are not considerably bound to chloroplasts. Additionally, mRNA localize in close vicinity to mitochondria also challenged post-translation protein import. Global analysis of transcripts bound to mitochondria in yeast or human revealed that around half of the transcripts of mitochondrial proteins displayed a high mitochondrial localization. The observed association of mRNAs with chloroplast fractions and the in vivo analysis of the distribution of mRNAs was used as base to formulate the hypothesis that mRNA can bind to chloroplast surface. Therefore, in this study, the mRNA binding assay was established and revealed that mRNAs coding for the mitochondrial cytochrome c oxidase copper chaperone COX17 showed unspecific binding to the chloroplasts. The mRNA coding for chloroplast outer envelope transport protein OEP24 and mRNA coding for the essential nuclear protein 1 (ENP1) showed specific binding, and OEP24 has a 3-fold higher affinity than ENP1 mRNA. Moreover, the BY2-L (Nicotiana tabacum non-green cell culture) could confer the highest enhancement of OEP24 mRNA binding efficiency than the COX17 and ENP1 mRNA and the preparation of the BY2-L was optimized. Afterwards, the feasibility to fix the interaction between mRNA and the proteins on the surface of chloroplasts was confirmed. OEP24 mRNA showed more efficiency in the UV-crosslinking. Following, the pull-down with antisense locked nucleic acid (LNA)/DNA oligonucleotides was established which could be used for the further investigation of the proteins involved in the mRNA binding to the chloroplasts.
The climate system is one of the classical examples of a complex dynamical system consisting of interacting sub-systems through mass, momentum, and energy exchange across various spatial and temporal scales. This thesis aims to detect and quantify sub-component interactions from an information exchange (IE) perspective. For this purpose, IE estimators derived from information theory are explored and applied to the available climate data obtained from observations, reanalysis, global and regional climate models. Specifically, this thesis investigates the usefulness of information theory methods for process-oriented climate model evaluation.
Firstly, methods derived from the concepts of information theory such as transfer entropy and information flow along with their linear and non-linear estimation techniques are initially tested and applied to idealized two-dimensional dynamical systems. The results revealed an expected direction and magnitude of IE providing insights into underlying dynamics. However, as expected the linear estimators are robust for linear systems but fail for non-linear systems. Though the non-linear estimators (kernel and kraskov) showed expected results for all the idealized systems, their free tuning parameters are to be tested for consistent results. Moreover, these methods are sensitive to the available time series length.
A real world example case study involving the dynamics between the Indian and Pacific oceans revealed a physically consistent bi-directional IE. However, unexpected IE was detected in the example of North Atlantic and European air temperatures indicating hidden drivers. Though IE provides insights into system dynamics, the availability of time series length and the system at hand must be carefully taken into account before inferring any possible interpretations of the results.
Quantifying the IE from El-Ni\~{n}o southern oscillation (ENSO) and Indian Ocean Dipole (IOD) to the Indian Summer Monsoon Rainfall (ISMR) with the observational and reanalysis data sets revealed that both ENSO and IOD are synergistic predictors for the inter-annual variability of the ISMR over central India i.e., the monsoon core region. Though the investigated three Global Climate Models (GCM) could not reveal the underlying IE dynamics of ENSO, IOD, and ISMR, a Regional Climate Model (RCM) simulation downscaling one of the GCMs with realistic large scale signals across the lateral boundaries showed good agreement with the observations.
Evaluating a coupled regional climate modeling system driven by two different global data sets with IE estimators revealed significant differences between the process chains linking the north-west Mediterranean sea surface temperatures, evaporation, wind speed, and the Vb-cyclone induced precipitation over Danube, Odra, and Elbe catchments in the historical period (1951-2005). Detailed investigation revealed that the north-west Mediterranean Sea in the coupled regional simulation driven by ERA-20C reanalysis corresponded to the Vb-cyclone precipitation over the three catchments while no such correspondence is noted in the EC-EARTH driven simulation. This discrepancy is attributed to the inheritance of the simulation biases from GCM into the RCM. In the future period (1965-2099), no significant changes in the processes are noted from the simulation.
Overall, this thesis used IE estimators in investigating the underlying dynamics of climate system and climate models. The estimators proved useful in providing insights into climate system dynamics assisting in a process based climate model evaluation.