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Shrew-1 wurde bei der Suche invasivitätsassoziierter Gene mittels eines DDRT-PCR-Ansatzes aus invasiven Zellen isoliert. Wie computergestützte Analysen der Sequenz ergaben, wies das bis dahin unbekannte Protein keinerlei Ähnlichkeiten mit bereits bekannten Proteinen auf und homologe Proteine wurden bisher nur in Vertebraten gefunden. Expressionsanalysen mit einem GFP-markierten shrew-1 zeigten, dass es an der basolateralen Plasmamembran lokalisiert, wo es mit dem E-Cadherin vermittelten Adhäsions-Komplex kolokalisiert. Eine Integration in diesen Komplex geschieht höchstwahrscheinlich durch direkte Interaktion mit β-Catenin. Ein weiteres Molekül das als potenzieller Interaktionspartner von shrew-1 identifiziert wurde und das in der Literatur oft als Tumorsuppressor diskutiert wird, ist Caveolin-1. Ferner konnten Überexpressionexperimente bereits zeigen, dass shrew-1 die Invasivität von HT1080-Zellen erhöhen kann. Das Ziel dieser Arbeit war es, zum einen mit Hilfe des Hefe-Split-Ubiquitin-Systems eine Interaktion von shrew-1 und Caveolin-1 zu bestätigen und zum anderen neue Interaktionspartner zu identifizieren, die helfen könnten, die Rolle von shrew-1 in invasiven Vorgängen zu erklären. Um eine mögliche Verbindung von shrew-1 und einem neuen Interaktionspartner in Bezug auf die Zellinvasivität zu untersuchen, sollten sowohl shrew-1 als auch der potenzielle Interaktionspartner mittels RNAi ausgeschaltet werden. Mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems war es möglich, die Interaktion zwischen shrew-1 und caveolin-1 zu bestätigen und zu zeigen, dass diese durch die zytoplasmatische Domäne von shrew-1 vermittelt wird. Weiterhin konnte CD147 als neuer Interaktionpartner identifiziert werden. Eine Interaktion beider Proteine konnte ferner mit Hilfe des Bimolekularen-Fluoreszens-Komplementations-Systems (BIFC), des Fluoreszens-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) und Coimmunoprezipitationen bestätigt werden. Die Interaktion von shrew-1 und CD147 scheint allerdings abhängig vom zellulären Kontext zu sein, wie die FRET-Analysen vermuten lassen. So konnte nämlich mit diesen Analysen eine starke Interaktion in MCF7-Zellen gezeigt werden, wohingegen die Interaktion in MDCK-Zellen schwächer war. Einer der auffälligsten Unterschiede dieser beiden Zelllinien im Bezug auf diese Interaktion könnte sein, dass MCF7-Zellen im Gegensatz zu MDCK-Zellen kein Caveolin-1 exprimieren. Caveolin-1 konnte seinerseits als Interaktionspartner von shrew-1 mit Hilfe des Hefe-Split-Ubiquitin-Systems bestätigt werden und andererseits wurde von einer anderen Arbeitsgruppe eine Interaktion von CD147 mit Caveolin-1 publiziert. Um dies näher zu untersuchen, wurde Caveolin-1 in MCF7-Zellen exprimiert und die FRET-Analysen in diesen wiederholt. Wie vermutet kam es zu einer Reduktion der Interaktion in Caveolin-1 exprimierenden MCF7-Zellen. CD147 ist neben vielen anderen Funktionen auch maßgeblich an der Regulation von Matrix-Metalloproteinasen beteiligt und kann somit die Invasivität von Zellen beeinflussen. Um einen Einfluß von shrew-1 und CD147 auf die Invasivität zu untersuchen, wurden beide Proteine mittels RNAi in HeLa-Zellen ausgeschaltet. Nachdem ein negativer Einfluss dieses Ansatzes auf das Proliferationsverhalten der Zellen ausgeschlossen werden konnte, wurde ein möglicher Effekt auf die Invasivität der Zellen untersucht. Durch die Analyse in Matrigel-Invasionsassays konnte gezeigt werden, dass das unabhängige Ausschalten beider Proteine die Invasivität der Zellen auf 35-55% im Vergleich zu Kontrollzellen reduziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern die Annahme, dass shrew-1 eine Rolle bei invasiven Vorgängen spielt und weisen darauf hin, dass dies möglicherweise durch eine Interaktion mit CD147 geschieht. Die Interaktion mit CD147 und damit eine mögliche Funktion von shrew-1 bei invasiven Vorgängen scheinen dabei abhängig vom zellulären Kontext zu sein.
Die Arbeit befasst sich mit der Zusammenhangsstruktur einer Vielzahl von Aufmerksamkeitskomponenten, welche aus deutlich unterscheidbaren theoretischen Perspektiven postuliert werden. Untersucht wird insbesondere die Frage, inwieweit zu den auf konzeptueller Ebene differenzierten Aufmerksamkeitskomponenten entsprechende kognitive Fähigkeiten empirisch separiert und in ein gemeinsames, theorienübergreifendes Aufmerksamkeitsmodell integriert werden können. Zunächst wurde unter Fragestellung 1 untersucht, ob fünf häufig postulierte Aufmerksamkeitskomponenten in der Tradition Posners (s. Posner & Boies, 1971; Posner & Rafal, 1987), Alertness, räumliche Aufmerksamkeit, fokussierte Aufmerksamkeit, Aufmerksamkeitswechsel und geteilte Aufmerksamkeit, empirisch unterscheidbare kognitive Fähigkeiten darstellen. Im Anschluss daran wurde unter Fragestellung 2 analysiert, welchen Beitrag die Aufmerksamkeitskomponenten in der Tradition Posners zur Erklärung konzeptuell unterscheidbarer Aufmerksamkeitskomponenten aus Sicht der Handlungstheorie (Neumann, 1992), aus der Arbeitsgedächtnisperspektive (Baddeley, 1986) sowie aus Sicht der psychometrischen Konzentrationsforschung (z.B. Brickenkamp, 1994; Moosbrugger & Goldhammer, 2006) leisten. Unter Fragestellung 3 wurde eine faktorenanalytische Integration aller einbezogenen Aufmerksamkeitskomponenten in ein theorienübergreifendes, integratives Aufmerksamkeitsmodell vorgenommen. In Anlehnung an Theorien, welche Aufmerksamkeit sowohl auf perzeptive Prozesse als auch auf die exekutive Kontrolle bei der Bearbeitung komplexer Aufgaben beziehen (Bundesen, 1990; Logan & Gordon, 2001), wurden zwei Basisdimensionen bzw. grundlegende Aufmerksamkeitsfaktoren vermutet, nämlich perceptual attention und executive attention, welche interindividuelle Fähigkeitsunterschiede über die verschiedenen Aufmerksamkeitskomponenten hinweg erklären. Schließlich wurde unter Fragestellung 4 auf theoretischer wie auch auf empirischer Ebene untersucht, inwieweit sich Konzentration in den Erklärungsrahmen mehrdimensionaler Aufmerksamkeitsmodelle eingliedern lässt, indem eine konzeptuelle sowie statistische Rückführung von Konzentration auf mehrdimensionale Aufmerksamkeit vorgenommen wurde. An einer Stichprobe von 232 Studierenden wurde die Leistung in 13 Aufmerksamkeits- und Konzentrationstests erfasst. Konfirmatorische Faktorenanalysen zeigten, dass die fünf Aufmerksamkeitskomponenten in der Tradition Posners miteinander in Beziehung stehen, jedoch klar separierbar sind. Aus den getesteten Strukturgleichungsmodellen ging hervor, dass diese Aufmerksamkeitskomponenten signifikant und in unterschiedlicher Weise zur Erklärung von konzeptuell unterscheidbaren Aufmerksamkeitskomponenten beitragen. In hypothesenkonformer Weise erwiesen sich Aufmerksamkeitswechsel und geteilte Aufmerksamkeit als bedeutsam für die Erklärung von Konzentration sowie von handlungsorientierten Aufmerksamkeitskomponenten. Hinsichtlich des integrativen Aufmerksamkeitsmodells konnte die vermutete 2-Faktorenstruktur, welche einen Generalfaktor perceptual attention sowie einen spezifischen Faktor executive attention enthält, bestätigt werden. Das vielfach von Aufmerksamkeit getrennt behandelte Konzentrationskonstrukt konnte auf theoretischer Ebene durch Aufzeigen konzeptueller Entsprechungen in den Erklärungsrahmen mehrdimensionaler Aufmerksamkeit eingegliedert werden. In konsistenter Weise ließ sich Konzentration auf empirischer Ebene durch Aufmerksamkeitskomponenten nach Posner sowie die beiden Faktoren des postulierten integrativen Aufmerksamkeitsmodells substanziell erklären.
Characterisation of cytosolic prion protein-mediated putative cytotoxicity in neuronal cell lines
(2006)
Prion diseases are a complex group of fatal neurodegenerative disorders with a broad host spectrum, which are characterised by strong neuronal cell loss, spongiform vacuolation and astrocytic proliferation. The molecular mechanisms of prion-mediated neurodegeneration are not yet fully understood. Recently, it has been proposed that neuronal cell death might be triggered by cytosolic accumulation of misfolded cellular prion protein (PrPC) due to impairment of proteasomal degradation. Cytosolic PrPC could result from either retro-translocation via the endoplasmatic reticulum-associated degradation system (ERAD) or abortive translocation of PrPC into the ER. Indeed, expression of cytosolic PrP (Cy-PrP) was shown to be neurotoxic both in vivo and in vitro. However, contradicting results on cytosolic PrP-mediated neurotoxicity in cultured cells have been reported. Cytosolic PrP–mediated cytotoxicity may play a central role in the pathogenesis of prion diseases. In order to investigate the molecular mechanisms of this process, a detailed analysis of N2a cells conditionally expressing cytosolic PrP (Cy-PrP) was performed in this study. The following results were obtained: First, Cy-PrP expression is not per se sufficient to trigger cytotoxicity in N2a cells independently of proteasome inhibition. Second, Cy-PrP is degraded with kinetics resembling the degradation of cell membrane-anchored full-length PM-PrP. In this process, the 20/26S proteasome was responsible for Cy-PrP degradation while the proteolysis of matured full length PM-PrP is not affected by the proteasomal system. Third, Cy-PrP accumulates in fine foci when expressed at high levels and co-localises with the cytosolic chaperone Hsc70 in EEA-1 positive endocytic vesicles. From these data it was proposed that the chaperone Hsc70 acts as a regulator for the controlled formation of amorphous Cy-PrP aggregates and their transport to endosomal vesicles. This Hsc70-dependent mechanism may confer protection to N2a cells against toxic accumulation of Cy-PrP in the cytosol.
Ziel der vorliegenden Arbeit war eine mehrdimensionale Analyse der Trainingsqualität von Leistungssportlern in ausdauerorientierten Sportarten aus Akteurssicht. Im Theorieteil wurden zunächst strukturelle Besonderheiten des Leistungssportsystems aus systemtheoretischer Perspektive kritisch analysiert, um einen gegenstandsadäquaten Qualitätsbegriff zu konzeptualisieren. Innerhalb dieses Theorieteiles wurden aktuelle - innerhalb von ausdauerorientierten Sportarten zumeist an der Trainingsquantität orientierte - Steuerungsmodalitäten, deren Ziele und Veränderungstendenzen aufgezeigt. Dies beinhaltetet die Darstellung gängiger kybernetischer Steuerprogramme sowie neuerer, synergetischer Ansätze bezüglich der Steuerungsmöglichkeiten sportlicher Leistungsentwicklungen. Zudem wurden handlungsleitende Rationalitäten herausgestellt, die von der sportlichen Organisation kommuniziert werden. Hierzu gehören Leitbilder, die sich in der sportlichen Förderstruktur in Form von Kaderstrukturen sowie Rahmentrainingsplänen zeigen. Neuere Studien, die solche Leitbilder und deren Effektivität empirisch überprüften, führen zu einer notwendigen Relativierung gängiger Steuerungsannahmen. Besonders betont wurde innerhalb der systemtheoretischen Ausführungen die vorherrschende dominierende Orientierung der am (Sport-)System Beteiligten an der systemspezifischen Codierung Sieg/Niederlage und die gegenwärtige Diskussion um die Rolle der Einflussnahme externer Interessen auf die Akteure (also auf die Athleten). Der Darstellung der strukturellen Aspekte im Leistungssportes folgte die Darstellung subjektorientierter Forschungsprojekte im Leistungssport. Insbesondere den Nachwuchsleistungssport betreffende Forschungsprojekte rückten hier ins Zentrum. Hierzu wurden solche Studien reflektiert, die die Lebenswelt der Athleten sowie deren Trainingsalltag untersuchten. Die Zielperspektive solcher Studien liegt im Interesse, mögliche Bildungspotentiale im Leistungssport zu explorieren. Die historisch gesehen kritische Haltung der Sportpädagogik gegenüber des Leistungssports zeigte sich bisher in der Ambivalenz der Zielorientierung leistungssportlichen Engagements, die sich aus struktureller Perspektive ausschließlich am Siegen bzw. der maximalen Leistung orientiert, aus pädagogischer Perspektive jedoch die Entfaltungsmöglichkeit des Subjektes vorsieht (insbesondere dessen Reflexionsfähigkeit sowie dessen Selbstbestimmtheit, also am Leitbild des „mündigen Athleten“ sensu LENK 1979). Diese sich zunächst konfligierend gegenüberstehenden Ansprüche begründeten die bisherige Abwehrhaltung der Sportpädagogik gegenüber dem Leistungssport. In der Analyse von Projekten, die sich mit der Entwicklung und Förderung sportlichen Talentes befassen, wurde eine weitere Facette deutlich, die in der vorliegenden Arbeit ins Zentrum gerückt wird: „Pädagogische“ Zieldimensionen wie Reflexionsfähigkeit sowie Selbstbestimmtheit des eigenen Tuns avancieren auch in leistungssportlichen Zusammenhängen als wichtige, talentbewahrende Komponente (PROHL 1996, Kapitel 2.3.1). Diese Einordnung pädagogischer Zieldimensionen ist Ausgangspunkt des hier verwendeten mehrdimensionalen Qualitätsverständnisses leistungssportlichen Trainings, welches zum einen die Ermächtigung (Empowerment) und zum anderen die Weiterentwicklung (Enhancing) der Agierenden im Prozess (im Training) vorsieht. Der in dem hier konzeptualisierten Qualitätsmodell individuelle, auf Transformation (Kapitel 2.3.3.2) abzielende Zugang zum leistungssportlichen Training, basiert nicht auf angenommenen Interventionsprogrammatik einer linearen Förderstrategie. Neben dem pädagogische Zugang weist Training dienstleistungstypische Kriterien auf wie das „uno-actu-Prinzip“ (Konsumption und Produktion fallen zeitlich zusammen) sowie die Wichtigkeit der instrumentellen Qualität (Zielerreichung) und einer subjektiven Qualität (Kundenzufriedenheit). Diese wichtigen Qualitätskriterien wurden in einer triangulativen Studie in Form eines quasi längsschnittlichen Unersuchungsdesigns analysiert. Zentrale Fragestellungen betrafen den Forschungsdefiziten entsprechend die Rolle der subjektiven Qualität (Athletenzufriedenheit) und deren Zusammenhang mit der sportlichen Leistung sowie die Rolle der o.g. pädagogischen Qualitätskriterien (Empowerment und Enhancing). Dabei sollen solche Rationalitäten, die per se bei den Athleten vorliegen und die auf den oben genannten (institutionalistischen, systemspezifischen) Annahmen beruhen, durch faktische Praktiken und deren nutzbringende bzw. hemmende Folgen für das Subjekt exploriert werden. Die Stichprobe setzte sich aus 20 Bundeskaderathleten zusammen, die ausdauerorientierte Sportarten (Triathlon, Radrennsport, Speedskaten) betreiben. Die oben beschriebenen Qualitätsdimensionen wurden zum einen durch einen Fragebogen (AZL, FESSLER 1992) erhoben, zum anderen wurden problemzentrierte Interviews mit den Athleten durchgeführt. Die im Forschungsstand aufgeführten Aspekte konnten im quantitativen Fragenblock (Fragenblock A und B, vgl. Kapitel 2.4.2) zu entsprechenden Arbeitshypothesen verdichtet werden, die explorativen, qualitativ untersuchten Fragestellungen (Fragenblock C) erhielten keinen hypothesenprüfenden Charakter. Innerhalb dieses Abschnittes wurde die Stichprobe der Kaderathleten sowie relevante statistische sowie insbesondere die qualitativen Daten betreffende Auswertungsmodalitäten dargestellt. Die nachfolgenden Ergebnisse sind hervorzuheben und erheben keinen Anspruch auf Repräsentativität: • Die Daten der Fragebogenerhebung zeigen eine hohe Athletenzufriedenheit an. Dies beinhaltet die Zufriedenheit mit dem Trainer, dem Training, den Trainingsbedingungen, der Trainingsgruppe und Wettkampfleistung. Diese hohe Zufriedenheitsstruktur ließ sich in den Interviews nicht wiederfinden. Die Ergebnisse zeigen, dass durch Fragebögen nur ein Ausschnitt erfasst werden konnte, ein für die Praxis relevanter Mehrwert entstand allerdings nur durch eine mehrperspektivische und individuelle Betrachtung (Interview) der Akteure. • In Bezug auf das Qualitätskriterium Empowerment ist zu resümieren, dass sich in der vorliegenden Studie viele Athleten „selbst“ ermächtigt haben, eine Förderung (bspw. durch Trainer) der Selbstbestimmung und der Selbstreflexion liegt in äußerst wenigen Fällen vor. • Die Mitbestimmung im Trainingsprozess sowie die Selbstbestimmung im Leistungssport werden aus Athletensicht vom Sportsystem kritisch wahrgenommen und restriktiv gehandhabt. • Viele Athleten betrieben vor ihrer derzeitigen Hauptsportart eine weitere Sportart. • In Bezug auf das Qualitätskriterium Enhancing (Weiterentwicklung) lässt sich zusammenfassen, dass die Karriereverläufe sehr heterogen sind. Eine „klassische“ Kaderkarriere (vom D- zum A-Kader) weisen nur sehr wenige Athleten auf. • In Bezug auf die instrumentelle Qualität von Training seien folgende Erkenntnisse aufgeführt: Zwar zeigte die Analyse der instrumentellen Qualitätsdimension, dass die Athleten ihre langfristige Entwicklung positiv belegen („habe meine Leistungsziele in den letzten Jahren erreicht“, vgl. Analyse in Kapitel 4.4.1). Bezogen auf die letzte Saison bewerten die Athleten ihre Leistungszielerreichung ausgewogen zustimmend und ablehnend (Kapitel 4.4.1). Die Bezeichnung „instrumentell“ trägt dem Inhalt des angenommenen „Outputs“ von Training jedoch nicht Rechnung, da „instrumentell“ im klassischen dienstleistungsorientierten Verständnis den unmittelbaren, also kurzfristigen „Output“ beschreibt. Deswegen sollte „instrumentell“ adäquat in die (pädagogische) Bezeichnung „Enhancing“ modifiziert werden. Enhancing fasst die langfristige Entwicklung als Qualitätskriterium individueller und prozessbezogener. • Bzgl. der Einordnung der Trainingsquantität in Ausdauersportarten ist folgendes Ergebnis von Relevanz: Die Daten geben keinen Hinweis darauf, dass dann, wenn mehr trainiert wird, auch die Leistungsziele oder Platzierungen eher erreicht wurden. Diese Arbeit konnte zeigen, dass die Sportpädagogik durch eine qualitative Betrachtung von leistungssportlichem Tun ihren Platz im Sinne der Praxisverantwortung und durch die Formulierung der Gegenstandspflicht (indem im Forschungsprozess auch hinterfragt wird, was Qualität überhaupt bedeutet, vgl. PROHL 2006a, 219) einnehmen kann - insbesondere dadurch, dass es den mündigen Athleten in einer pluralistischen Gesellschaft offen steht, sich leistungssportlich zu engagieren und gleichzeitig leistungssportliches Engagement als etwas begriffen wird, das Bildungspotential in sich birgt, allerdings ausschließlich unter den hier genannten Voraussetzungen der Mündigkeit.
Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen Behandlung mit der Verapamil - Injektionen und der ESWT Behandlung bei der Induratio penis plastica festgestellt. Bei der Analyse von Zusammenhaengen der Symptome vor der Behandlung wurde es statistisch bewiesen, dass eine Abhaengigkeit zwischen Schmerzen und Kohabitationsfaehigkeit existiert. Beide Therapieverfahren zeigten gute Ergebnisse bei Wirkung auf das Schmerzsymptom. Schmerzlinderung konnte durch ESWT Verfahren schneller als durch Verapamil Injektionen erfolgen. Der Schmerzrueckgang fuehrte automatisch zur einer verbesserten sexuellen Funktion. Im Bezug auf objektive Parameter der Plaquegroesse und der Deviation wurde keine signifikanten Effekte beobachtet, deswegen erscheint der Behandlungserfolg der IPP mit ESWT oder Verapamil - Therapie fragwuerdig. Moeglicherweise wird ESWT, wie schon die Verapamil Therapieverfahren zuvor, ihren Platz im historischen Kapitel der IPP finden.
Die Cytochrom c Oxidase von Paracoccus denitrificans katalysiert die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser und „pumpt“ zusätzlich vier Protonen von der cytoplasmatischen Seite auf die periplasmatische Seite der Cytoplasmamembran. Die Spaltung des molekularen Sauerstoffes im binuklearen Zentrum erfolgt im katalytischen Zyklus des Enzyms bei der Umwandlung des Intermediates A, in welchem molekularer Sauerstoff an das Häm a3 Eisen gebunden ist, in das Intermediat PM durch spontane elektronische Umorganisation. Drei der dazu benötigten vier Elektronen werden von den Metallzentren geliefert. Das vierte Elektron wird sehr wahrscheinlich von einer Aminosäure in der Nähe des binuklearen Zentrums durch Bildung eines Aminosäureradikals beigesteuert. Dieses Radikal sollte in den Intermediaten PM und F• des katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase vorhanden sein. Durch Reaktion von stöchiometrischen Mengen an Wasserstoffperoxid mit dem vollständig oxidierten Enzym lassen sich PM; F• und F-Intermediate künstlich erzeugen und durch ihre Maxima in Absorptionsdifferenzspektren charakterisieren. Mit paramagnetischer Elektronenresonanzspektroskopie (EPR-Spektroskopie) können Struktur und Dynamik paramagnetischer Zentren in Proteinmolekülen untersucht werden. Mit dieser Methode konnte in mit Wasserstoffperoxid generierten PM und F•-Intermediaten ein Tyrosinradikal nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Identifikation dieses Tyrosins mittels einer Mutagenesestudie. Dazu wurden Tyrosinvarianten (Y35F, Y167F, Y267F, Y280H, Y328F und Y414F) aus Untereinheit I, die einen maximalen Abstand von 25 Angström vom binuklearen Zentrum aufweisen, mit Hilfe von Absorptions- und EPR-Spektroskopie charakterisiert. Auf diese Weise konnte nachgewiesen werden, dass Tyrosin 167 eindeutig der Ursprungsort des Tyrosinradikals ist, das bei der Generierung von PM- und F•-Intermediaten der Cytochrom c Oxidase mit Wasserstoffperoxid entsteht. Da die Variante Y167F jedoch eine hohe katalytische Aktivität aufwies und in der Lage war, die Oxoferrylintermediate PM; F• und F zu bilden, konnte gleichzeitig gezeigt werden, dass dieses Tyrosin nicht der primäre Donor des vierten Elektrons sein kann, das im katalytischen Zyklus des Enzyms für die Spaltung der Sauerstoffbindung benötigt wird. Diese Ergebnisse wurden dahingehend interpretiert, dass Tyrosin 167 eine thermodynamische Senke darstellt, in die das von einem unbekannten kurzlebigen Elektronendonor bei der Wasserstoffperoxidreaktion gebildete Radikal verschoben wird. Als Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung kommt auch Tryptophan 272 infrage. Daher wurde auch die Variante W272M spektroskopisch charakterisiert. Diese Variante war katalytisch inaktiv und nicht in der Lage in Reaktion mit Wasserstoffperoxid die Intermediate PM, F• und F zu bilden. Es ließen sich weder das Tyrosin-167-Radikal noch ein anderes Radikal nachweisen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Tryptophan 272 möglicherweise der ursprüngliche Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase sein könnte. Während des PM zu F-Übergangs im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase werden zwei Protonen gepumpt. Diese können vom Enzym entweder über den D-Weg oder den K-Weg aufgenommen werden. Eine Untersuchung des PM zu F-Übergangs von D-Weg- und K-Weg-Varianten der Cytochrom c Oxidase kann Aufschluss über die Beteiligung der beiden Protonenaufnahmewege des Enzyms an diesem Schritt des katalytischen Zyklus geben. Daher wurde die Reaktion der D-Weg Varianten D124N, N131D, Y35F und E278Q und der K-Weg Variante K354M mit Wasserstoffperoxid absorptionsspektroskopisch untersucht. Durch diese Experimente konnte die zentrale Bedeutung des D-Weges für die Protonentranslokation im PM zu F-Übergangs bestätigt, aber auch ein gewisser Einfluss des K-Weges nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurde der PM zu F-Übergang der Variante R437N, die eventuell Teil des noch nicht konkret identifizierten Protonenaustrittsweg der Cytochrom c Oxidase ist, untersucht.
Die Entwicklung neuer und die Adaption bestehender Methoden ist weiterhin eine der vordringlichsten Aufgaben der Forschung zur Bekämpfung der tödlichen Infektion mit dem HI-Virus. So wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Methode der Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen Oberflächenproteine, die bereits in der experimentellen Tumortherapie verwendet wird, für die HIV Therapie adaptiert werden kann. In dieser Arbeit war das HIV Hüllprotein Env das Zielmolekül. Der zweite Teil der Arbeit versucht, Erkenntnisse aus der HIV-Forschung für alternative Tumortherapieansätze am Beispiel des kutanen T-Zell Lymphoms zu verwenden. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Verwendung des Hüllproteins Env von HIV als Zielstruktur für die Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen HIV-infizierte Zellen. Hierfür wurden CD4, 5-Helix sowie zwei Varianten von DC-SIGN als HIV Env-bindende Liganden als chimäre T Zell-Rezeptoren, zusammen mit Teilen von CD3 und CD28, in humanen Zellen exprimiert. Die Funktionalität der Konstrukte konnte gezeigt werden, ein therapeutischer Effekt in vitro war jedoch nicht nachweisbar. Der zweite Teil untersucht die Verwendung des HIV Hüllproteins als therapeutischem Gen zur Behandlung des kutanen T-Zell Lymphoms. Die Pseudotypisierung von MLV-basierenden Vektoren mit HIV Env ermöglicht das zielzellspezifische Eindringen der Vektoren in humane CD4-positive Zellen. Aus diesen Zellen besteht auch das kutane T Zell Lymphom (CTCL). MLV/HIV pseudotypisierte retrovirale Vektoren, die die 89.6P Variante des HIV Hüllproteins Env als therapeutisches Gen transportieren, wurden generiert und zunächst in vitro getestet. Das Wachstum von CTCL-Zellen konnte durch Zugabe dieser Vektorpartikel verhindert und die Zellzahl unter den Ausgangswert reduziert werden. Die Verwendung im Maus-Experiment zeigte einen vergleichbaren Erfolg wie die Verwendung der Herpes simplex Thymidinkinase, obwohl von syn Env nur etwa ein Viertel der Vektorpartikel appliziert wurde. Ein bystander-Effekt ließ sich damit also nachweisen. Die Verwendung chimärer T-Zell-Rezeptoren für MHC-unabhängige Immunantworten gegen HIV-Reservoirs im Körper ist ein vielversprechender Therapieansatz. Neben der Verwendung HIV Env-bindender zellulärer Proteine könnte das Spektrum möglicher Liganden durch die Verwendung Subtypen-übergreifender, nicht-inhibitorischer Antikörper, erweitert werden. Dies ist möglich, da für die Immunantwort lediglich die Bindung an das Hüllprotein notwendig ist. Zur Erhöhung des therapeutischen Effektes des retroviralen Gentransfers zur Therapie kutaner T-Zell Lymphome eignen sich hoch fusogene virale Hüllproteine, die auf diese Weise einen noch stärkeren bystander-Effekt ermöglichen. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser sehr groß sein muss, solange replikationsinkompetente Vektoren verwendet werden.
In this thesis, I study the phase diagram of dense, locally neutral three-flavor quark matter as a function of the strange quark mass, the quark chemical potential, and the temperature, employing a general nine-parameter ansatz for the gap matrix. At zero temperature and small values of the strange quark mass, the ground state of quark matter corresponds to the color–flavor-locked (CFL) phase. At some critical value of the strange quark mass, this is replaced by the recently proposed gapless CFL (gCFL) phase. I also find several other phases, for instance, a metallic CFL (mCFL) phase, a so-called uSC phase where all colors of up quarks are paired, as well as the standard two-flavor color-superconducting (2SC) phase and the gapless 2SC (g2SC) phase. I also study the phase diagram of dense, locally neutral three-flavor quark matter within the framework of a Nambu–Jona-Lasinio (NJL) model. In the analysis, dynamically generated quark masses are taken into account self-consistently. The phase diagram in the plane of temperature and quark chemical potential is presented. The results for two qualitatively different regimes, intermediate and strong diquark coupling strength, are presented. It is shown that the role of gapless phases diminishes with increasing diquark coupling strength. In addition, I study the effect of neutrino trapping on the phase diagram of dense, locally neutral three-flavor quark matter within the same NJL model. The phase diagrams in the plane of temperature and quark chemical potential, as well as in the plane of temperature and leptonnumber chemical potential are presented. I show that neutrino trapping favors two-flavor color superconductivity and disfavors the color–flavor-locked phase at intermediate densities of matter. At the same time, the location of the critical line separating the two-flavor color-superconducting phase and the normal phase of quark matter is little affected by the presence of neutrinos. The implications of these results for the evolution of protoneutron stars are briefly discussed.
Der Brustkrebs ist eine der häufigsten Todesursachen bei der Frau. In Deutschland und den industriell fortgeschrittenen Ländern erkrankt jede zehnte Frau im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs. Nach Schätzungen der International Agency for Research on Cancer (IARC) erkrankten im Jahr 2004 ca. 1,2 Millionen Frauen weltweit an Brustkrebs. In den USA wurden ca. 215.990 Frauen mit einem invasiven Brustkrebs 2004 diagnostiziert (Breast Cancer: Statistics on Incidence, Survival, and Screening: http://imaginis.com/breasthealth/statistics.asp). Laut Berechnungen der IARC für das Jahr 2000 liegt die altersstandardisierte Neuerkrankungsrate für die industrialisierten Länder bei 63 Fällen (Weltstandard – WSR) je 100.000, bei den weniger entwickelten Regionen bei 23 Fällen je 100.000. Die Erkrankungsrate in Deutschland liegt mit 70,1 (WSR) deutlich unter den USA mit 99,6 (weiße Frauen - WSR) je 100.000 und geringfügig über dem Durchschnitt der EU mit 68,57 (WSR) je 100.000 (Stabenov und Eisinger 2001). Es gibt große Fortschritte in der Früherkennung, Diagnostik und Therapie des Brustkrebses, die eine bessere und längere Überlebenschance für die erkrankten Frauen bedeuten: Die Magnetresonanz(MR)-Mammographie hat einen neuen Stellenwert in der Diagnostik des Brustkrebses gefunden. Die Kernspintomographie ist die zurzeit sensitivste Methode zur Detektion von Karzinomen bei Hochrisikofrauen (Loibl et al. 2003). Seit Mitte der neunziger Jahre können bei unklaren Befunden MR-gesteuerte Biopsien oder präoperative Markierungen durchgeführt werden (Diebold et al. 2004). Die intraoperative Strahlentherapie verkürzt die mehrwöchige postoperative Strahlentherapie. Die Rate der brusterhaltenden Operationen nimmt stetig zu. Die endokrine Therapie beim hormonsensitiven Brustkrebs mittels dreijähriger ovarieller Downregulation und fünfjähriger Tamoxifenbehandlung hat sich fest etabliert. Es gibt klare Vorteile der stadiengerechten primären systemischen Therapie. In Zukunft könnten monoklonale Antikörper auch außerhalb von Studien zum Einsatz kommen. Man findet heute in den meisten westlichen Industrieländern eine rückläufige Mortalität an Brustkrebs. Die Inzidenz des Brustkrebses wächst jedoch in den westlichen Industrieländern seit 25 Jahren stetig weiter. Änderungen der Lebensweise, des Fortpflanzungsverhaltens und verbesserte Diagnostik erklären diese Entwicklung jedoch nur zum Teil. Die Vorsorge- und Früherkennungsprogramme haben leider nicht den erhofften Erfolg gebracht: Nur etwa ein Drittel der Frauen geht regelmäßig zu den angebotenen Vorsorgeuntersuchungen. Der Nutzen eines Mammographie-Screening-Programms wird kontrovers diskutiert (Miller et al.1992, Baines 1994, von Minckwitz und Kaufmann 1997, Gotzsche und Olsen 2000), manche Autoren machen Mammographien sogar für einen Teil der Inzidenzsteigerung bei jungen Frauen verantwortlich. Zielgruppen des Screenings sind aktuell Frauen zwischen dem 50. und dem 69. Lebensjahr. Derzeitig wird ein Screening-Intervall von 24 Monaten für diese Frauen empfohlen. Bisher ist eine evidenzbasierte Mortalitätsreduktion der Mammographie-Screenings für jüngere Frauen nicht nachgewiesen worden (Jackisch et al. 2004). Es muss daher nach weiteren Ursachen geforscht werden, die diese stetige Steigerung der Inzidenz erklären. Seit Mitte des 20. Jahrhunderts nimmt der Prozentsatz der Frauen in der Arbeitswelt stetig zu, so dass man hier neben den zivilisatorisch bedingten Veränderungen der Umwelt und des Konsumverhaltens arbeits- und berufsspezifische Ursachen für die Entstehung des Brustkrebses vermutet. Weltweit ist in den letzten zehn bis 20 Jahren eine Vielzahl von Studien mit kontroversen Ergebnissen in der Fachliteratur publiziert worden, die die Rolle dieser neuen Faktoren zu klären versuchen. Wir führten daher eine Fall-Kontroll-Studie zur Untersuchung arbeitsund umweltbedingter chemischer und physikalischer Faktoren für die Entstehung eines Brustkrebses durch. Im ersten Teil dieser Arbeit, die sich ausschließlich mit der Hypothese einer chemischen Verursachung befasst, erfolgt die Darstellung des heutigen Standes der Forschungsergebnisse zum Brustkrebs. Es werden Hypothesen zur Entstehung des Brustkrebses und die publizierte Literatur vorgestellt. Im zweiten Teil der Arbeit werden dann die Methodik und die Ergebnisse dieser Fall-Kontroll-Studie dargestellt. Im dritten Teil dieser Arbeit werden schließlich die Ergebnisse dieser Studie diskutiert und zu den bekannten internationalen Forschungsergebnissen in der Literatur ins Verhältnis gesetzt. Die Arbeit wird anhand der Kriterien für Qualität und Kausalität von Sir Austin Bradford Hill analysiert. Die Methodik der Arbeit wird auf systematische Fehler und Verzerrungen untersucht. Zum Schluss wird eine Zusammenfassung der Arbeit gezogen, und es wird ein Ausblick auf die künftig zu erwartenden Ergebnisse der Forschung unternommen.
On the molecular basis of novel anti-inflammatory compounds and functional leukocyte responses
(2006)
Inflammation is a complex pathophysiological event that can be triggered by activation of a number of distinct activation pathways eventually leading to the release of pro-inflammatory molecules and enzymes. Among all cells involved in inflammatory processes, neutrophils, monocytes and platelets are of major relevance. Activation of leukocytes occurs via binding of agonists to distinct GPCRs leading to activation of G proteins and proximate signaling cascades. In short, GPCR activation by pro-inflammatory agonists such as fMLP, PAF or LTB4 leads to activation of G proteins that are associated with the receptor at the cytosolic side of the plasma membrane. G proteins consist of a Gα- and a Gβγ-subunit which are associated in the inactive state. In this state, G proteins bind GDP. Upon activation, GDP is replaced by GTP that results in the dissociation of the Gα- from the Gβγ-subunit. Both subunits are capable of activating distinct PLC-β isoenzymes that catalyze the turnover of PtdIns(4,5)P2 into the second messengers Ins(1,4,5)P3 and DAG. Every GPCR holds a distinct pattern of associated G proteins which preferentially activate distinct PLC-β isoenzymes. Ca2+ channels within the SR/ER-membrane function as specific receptors for Ins(1,4,5)P3. Ligation of Ins(1,4,5)P3 to this receptor causes a release of Ca2+ from intracellular stores into the cytosol that is subsequently followed by the influx of Ca2+ e through channels in the plasma membrane. Ca2+ represents an important signaling molecule, involved in the regulation of cellular processes and enzymes that mediate inflammatory events such as ROS formation and the release of degradative enzymes. 5-LO and COXs are involved in the biosynthesis of pro-inflammatory eicosanoids and catalyze the turnover of AA into LTs and PGs, respectively. Both enzymes play pivotal roles in the initiation and maintenance of allergic diseases and inflammatory processes. LTB4 is regarded as a potent chemotactic and chemokinetic substance, whereas the cysteinyl-LTs cause smooth muscle contraction and increased vascular permeability. Therefore, 5-LO inhibitors are assumed to possess therapeutic potential for the treatment of diseases related to inflammation. Besides the intervention with 5-LO activity, inhibition of COX-activity is an effective way to suppress inflammatory reactions. The two COX isoenzymes, namely COX-1 and COX-2 show different patterns in terms of tissue expression and sensitivity towards inhibitors. COX-1 is supposed to be constantly expressed whereas COX-2 expression is upregulated at sites of inflammation. The extract of H. perforatum is commonly used for the treatment of mild to moderate depressive disorders, accompanied by a moderate profile of side effects. The extract´s efficacy as an antidepressant can be traced back to the content of the phloroglucinol hyperforin which represents the most abundant lipophilic constituent. However, in folk medicine hypericum extracts are additionally used for the treatment of inflammatory disorders such as rheumatoid arthritis or inflammatory skin diseases. In fact, it was shown that hypericum extracts and hyperforin possess anti-inflammatory potential. Hyperforin was described as a dual inhibitor of 5-LO and COX-1. The phloroglucinols MC and S-MC from M. communis significantly differ from the molecular structure of hyperforin. Hyperforin represents a monomeric prenylated derivative whereas MS and S-MC are non-prenylated oligomeric compounds. To date, the anti-inflammatory potential of SM and S-MC has not been investigated in detail. So far, solely antioxidant activity was attributed to MC and S-MC that indeed might qualify them as anti-inflammatory drugs. The phloroglucinols MC, S-MC and hyperforin are potent inhibitors of ROS formation and HLE release. However, any inhibitory potential of these compounds was only observed when cells were activated by GPCR agonists such as fMLP or PAF. In contrast, when cells were stimulated under circumvention of G protein-associated signaling cascades, the abovementioned inhibitors were not effective at all. In leukocytes, [Ca2+]i plays a pivotal role in signal transduction and regulation of the indicated pro-inflammatory cellular functions. We were able to show that MC, S-MC and hyperforin inhibited GPCR-mediated Ca2+ mobilization with approximately the same potency as the above-mentioned leukocyte responses. However, all of the indicated phloroglucinols were ineffective when cells were stimulated with ionomycin. Since ionomycin as well as GPCR agonists exert their effects by mobilizing Ca2+ i, it seems conceivable that MC, S-MC and hyperforin somehow interfere with G protein-associated signaling pathways. In order to investigate PLC as a potential target of hyperforin, the effects of hyperforin were compared to those of the broad spectrum PLC inhibitor U-73122. We found that both inhibitors acted in a comparable manner in terms of agonist-induced Ca2+ mobilization and in regard of the manipulation of basal Ca2+ levels in unstimulated cells. In this respect, significant differences between hyperforin and U-73122 were obvious for inhibition of total PLC activity in vitro. Thus, U-73122 blocked PLC activity whereas hyperforin was ineffective in this respect. This might indicate that only certain PLC isoenzymes are affected by hyperforin. Alternatively, other components within G protein-associated signaling pathways such as G proteins itself or the Ins(1,4,5)P3 receptor must be taken into account as putative targets of hyperforin. We were able to introduce MC and S-MC as novel dual inhibitors of 5-LO and COX-1. Interestingly, such a pattern was also described for hyperforin. MC and S-MC turned out to be direct inhibitors of 5-LO, based on the fact that they inhibit 5-LO not only in intact cells but also as purified enzyme in vitro. For MC and S-MC, great discrepancies were observed between the IC50 values concerning 5-LO inhibition and the concentrations that exert the antioxidative effects. It seems probable that 5-LO inhibition is not related to reduction of the active site iron as a result of the antioxidant activity of MC and S-MC but rather to direct interference with the 5-LO enzyme. The capability of MC and S-MC to suppress COX-1 activity seems not to be a unique effect of these phloroglucinols because for COX-1, the IBPC, present in both MC and S-MC, turned out to be the most active compound. ....
Die Ursache von Adipositas liegt im übermäßigen Wachstum von Fettgewebe, welches hauptsächlich aus Fettzellen, den Adipozyten, besteht. Die Zellen der stroma-vaskulären Fraktion, welche Vorläuferzellen, Makrophagen und Zellen des lokalen Gefäßnetzwerks enthält, sind außerdem an der Homöostase des Fettgewebes beteiligt. Insbesondere spielt das Gefäßsystem des Fettgewebes in Nagetieren eine wichtige Rolle im Fettgewebewachstum, da die Hemmung der Angiogenese in genetisch- und diät-induzierten fettleibigen Mäusen die Entstehung von Adipositas verhindert. Dennoch wurde das Gefäßsystem des menschlichen Fettgewebes bis heute nicht erforscht. Durch immuno-histochemische Analysen am subkutanen menschlichen Fettgewebe konnten wir zwei verschiedene Gefäßsysteme identifizieren: das vaskuläre Netzwerk des Bluts und das lymphatische vaskuläre Netzwerk. Während die Endothelzellen von beiden Gefäßsystemen die gemeinsamen Endothelzellmarker von Willebrand factor (vWf) und CD31 (PECAM, Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule) exprimierten, konnten die Endothelzellen der Blutgefäße an der Expression des Markers CD34 (Stamm/Blutgefäß-Endothel-Zell-Marker) und die Endothelzellen der Lymphgefäße an der Expression der beiden lymphatischen Marker Podoplanin und VEGFR3 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3) spezifisch erkannt werden. Ausschließlich für den Marker CD34-positive Zellen und in Rosetten angeordnete CD31-positive Zellen, welche als residente Makrophagen wurden auch charakterisiert. Um die beiden Gefäßsystemen des menschlichen Fettgewebes weiterhin zu erforschen, haben wir ein auf Immunoselektion basiertes Protokoll entwickelt. Es ermöglicht, Blut- (BEC) und lymphatische (LEC) Endothelzellen aber auch Makrophagen und CD34-positive Zellen spezifisch zu isolieren. Sowohl BEC als auch LEC exprimierten VEGFR1, VEGFR2, vWf und Notch4 und nehmen acetyliertes LDL auf. Darüber hinaus konnte in LEC die Expression von Genen, welche spezifisch für das Lymphgefäßsystem sind, wie Podoplanin, Reelin, VEGFR3, Desmoplakin, LYVE-1 nachgewiesen werden. Durch fluss-cytometrischen Analysen des Anzahls von BEC und LEC im Fettgewebe von Patienten mit unterschiedlichen Body Mass Indices (BMI) wurde entdeckt, dass Fettleibigkeit von einer Erweiterung des vaskulären Netzwerks des Bluts im Fettgewebe begleitet wird, jedoch nicht von einer Erweiterung des lymphatischen vaskulären Systems. Flusscytometrische Analysen belegen, dass es in der CD34-positive Stroma-Zellpopulation Zellen gibt, die den endothelialen Progenitor-Zellmarker CD133 und den primitiven Stammzellmarker ABCG2 exprimieren. Außerdem zeigten die CD34-positive Zellen eine signifikant stärkere Proliferation und Expression von Endothelzellmarkern wie CD31 und vWf, wenn dem Kulturmedium zuvor die Faktoren Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF A) und Insulin-Like Growth Factor-1 zugefügt worden waren. Wurden Mäusen mit Hinterbeinischämie CD34-positive Zellen in vivo injiziert, beteiligten sich diese Zellen an der Neovaskularisation des ischämischen Hinterbeins. Eine signifikante Zunahme des Blutflusses im ischämischen Bein, gekoppelt an einer erhöhten Kapillardichte im ischämischen Muskel und einer Integration der menschlichen Zellen in die Vaskulatur der Maus waren erkennbar. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass es unter den CD34-positive Zellen eine Population von endothelialen Progenitorzellen gibt, die -bei geeigneter Stimulation- zu Endothelzellen differenzieren. Parallel dazu wurden die lokalen Faktoren untersucht, die potentiell an der Wachstumskontrolle, der Migration und der Organisation der ruhenden, aus dem Fettgewebe stammenden, BEC und LEC beteiligt waren. Sekrete der Adipozyten, jedoch nicht der CD34-positive Zellen, induzierten eine signifikante BEC- und LEC-Proliferation. Außerdem induzierte die Kombination von Leptin und VEGF A oder des basic Fibroblast Growth Factor eine signifikante Zunahme der BrdU-Inkorporation in BEC während Adiponectin, VEGF C und VEGF D bereits alleine konzentrationsabhängig die Proliferation von LEC induzierten. Leptin, und nicht Adiponectin, führte zu signifikant höherer BEC-Migration und Röhrenformung, während Adiponectin, und nicht Leptin, die LEC-Migration und -Organisation förderte. Dabei führte Leptin in BEC und Adiponectin in LEC zeitabhängig zu einer signifikanten Zunahme der Phosphorylierung der Kinase Akt. Diese Ergebnisse belegen, dass die beiden aus Adipozyten stammenden Adipokine Leptin und Adiponectin eine tragende Rolle in der Umverteilung von BEC bzw. LEC spielen. Im Rahmen der Adipositas steigt die Plasmakonzentration von Leptin an während die Plasmakonzentration von Adiponectin sinkt. Unsere Ergebnisse deuten daraufhin, dass Leptin als lokaler pro-angiogenetischer Faktor identifizieren und Adiponectin als neuer lymphangiogenetischer Faktor im menschlichen Fettgewebe beschreiben konnte. Demnach könnten Veränderungen, in der Adipositas, der Adipokinfreisetzung durch Adipozyten am Umbau des vaskulären Netzwerks des Bluts und am ausbleibenden Wachstum des lymphatischen vaskulären Systems innerhalb des Fettgewebes beteiligt sein. Schließlich belegen die vorliegenden Ergebnisse das Vorhandensein einer Progenitor-Zell-Population in der Stroma-Fraktion des menschlichen Fettgewebes. Diese Progenitor-Zellen sind in der Lage sich an der Neovaskularisation ischämischen Gewebes zu beteiligen. Diese Population könnte im Hinblick auf zelltherapeutische Strategien eine interessante Alternative zu Stammzellen aus dem Knochenmark darstellen.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes, converting arachidonic acid to 5-HPETE, and in a second step 5-HPETE to leukotriene A4. Although the 5-LO promoter possesses characteristics of so called housekeeping genes, such as lack of TATA/CCAAT boxes and existence of several Sp1 binding sites, the 5 -LO gene is tissue specifically expressed in primarily immune competent cells of myeloid origin including granulocytes, monocytes, macrophages, mast cells and B-lymphocytes. 5-LO gene expression in MM6 and HL-60 cells is strongly induced after differentiation of the cells with TGF-beta and 1,25(OH)2D3. In some monocytic cancer cell lines, such as HL-60 TB and U937, TGF-beta and 1,25(OH)2D3 treatment are not able to activate 5-LO gene transcription. It was demonstrated, that in these cell lines the 5-LO core promoter is heavily methylated and that only demethylation by the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2 deoxycytidine (Adc) upregulated the 5-LO mRNA levels. It was also shown that the histone deacetylase inhibitor TsA could induce 5-LO mRNA levels, but only in 1,25(OH)2D3/TGF-beta inducible MM6 cells. Interestingly the 1,25(OH)2D3/TGF-beta effect on 5-LO expression is reduced, when combined with TsA. Reporter gene assays revealed that 5-LO promoter activity is strongly induced after 24 h treatment with 330 nM TsA (construct N10 up to 35 fold in HeLa cells). The effect is dependent on the presence of the proximal Sp1 binding site GC4 (-53 bp to –48 bp in relation to the major TIS) in both HeLa and MM6 cells. In vitro binding of the transcription factor Sp1 to this site has been demonstrated in gel shift assays and DNase I footprints. Mutation of the binding site resulted in a loss of basal promoter activity in both 5-LO negative HeLa cells and in 5-LO positive MM6 cells, as well as in the loss of TsA inducibility. The mutational study of different Sp1 binding sites in a larger promoter context revealed the interaction or respectively the additive effect of the multiple Sp1 binding sites of the 5-LO promoter on basal as well as on TsA upregulated promoter activity. However, GC4 seems to be of special relevance for both the basal promoter activity, possibly recruiting the basal transcription machinery, as well as for the TsA induced upregulation of 5-LO promoter activity. TsA does not alter the protein expression levels of Sp1 and Sp3 as investigated in Western blot analysis, neither in HeLa nor in MM6 cells. DNA affinity purification assays revealed that TsA had no effect on the DNA affinity of Sp1 or Sp3. In vitro binding of both Sp1 and Sp3 to the 5-fold GC box, GC4 and GC5 was demonstrated by DAPA analysis, but histone deacetylase inhibition did not change the associated protein amounts. Finally, in vivo binding of Sp1 and Sp3 was investigated in chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) in MM6 cells. TsA clearly induced the association of both proteins to the promoter area surrounding the TIS. Upon TsA treatment also RNA polymerase II binding to the area surrounding the TIS (-318 to +52 bp) was increased and even initiated in the more distal promoter parts –1049 to –292 bp, which are negatively regulated in reporter gene assays. Interestingly histone H4 is already highly acetylated without TsA treatment and the acetylation status of H4 remains unchanged after histone deacetylase inhibition, indicating an open chromatin structure of the 5-LO gene in MM6 cells. In a cotransfection study with Sp1 and Sp3, the transactivating potential of factors was investigated and in accordance with the ChIP data, Sp1 and Sp3 increased the promoter activity, but only after TsA treatment. In gel shift assays, the influence of DNA methylation on Sp1 binding was investigated. The results indicate different roles for the three proximal promoter sites. Whereas Sp1 binding to the 5-fold GC box and GC4 is impaired by DNA methylation, binding to GC5 is even increased. A cotransfection study with methylated 5-LO promoter constructs and the murine methyl-CpG binding proteins suggest MBD1 involvement in the regulation of the 5-LO promoter. Since in gel shifts Sp1 binding is inhibited by DNA methylation, at least to the 5-fold GC box and the activating element GC4, and similarly the mutation/deletion of the same sites strongly reduces or inhibits promoter activity, it is likely to assume, that the loss of promoter activity after in vitro methylation is in the first place due to impaired Sp1/Sp3 binding. Together the data underline the importance and complexity of Sp1/Sp3 binding to the GC rich sites in the regulation of 5-LO promoter activity in response to the histone deacetylase inhibitor TsA as well as in respect to DNA methylation.
Für das Verständnis der Proteinfaltung ist es von Interesse, die phi,psi-Torsionswinkelverteilung und deren Abhängigkeiten innerhalb einer Polypeptidkette zu kennen. Mit der in dieser Arbeit verwendeten Kombination aus MD-Simulation und NMR-Spektroskopie wird die Abhängigkeit der Konformationsverteilung kurzer alaninbasierter Modellpeptide mit einer Genauigkeit von 5 % bestimmt. Die Berechnung der thermischen Populationen der einzelnen Konformationen beruht auf einer Minimierung der Differenz aus experimentellen und berechneten skalaren Kopplungskonstanten. Trialanin populiert überwiegend den Bereich der Polyprolin Typ II Helix (~ 90 %) und daneben den beta-Faltblattbereich mit ca. 10%, jedoch nicht den alphaR-helicalen Bereich. Diese Konformationsverteilung ändert sich nicht signifikant mit zunehmender Kettenlänge in der Peptidreihe Ala3 bis Ala7. Das in der Seitenkette verzweigte Trivalin populiert dagegen alle drei Konformationsbereiche signifikant. Aufgrund der Periodizität der Torsionswinkel populiert Triglycin einen zusammenhängenden Bereich, der sich an den vier Ecken des Ramachandran-Diagramms befindet. Zudem befindet es sich in einem langsamen konformationellen Gleichgewicht zwischen der cis- und trans-Konformation der Peptidbindung. Die Temperaturabhängigkeit der Konformationsverteilung wird am Beispiel von Trialanin untersucht. Die 3J(HN,Ha) Kopplungskonstanten nehmen linear mit der Temperatur zu. Dies ist auf eine Zunahme des beta-Faltblattanteils zurückzuführen und kann theoretisch beschrieben werden. Die Konformationsverteilung der Trialaninsequenz innerhalb einer heteropolymeren Aminosäuresequenz ist von der Kettenlänge der an dem N- und C-Terminus angefügten heteropolymeren Aminosäuresequenz abhängig. Dies wird an zwei Peptiden, abgeleitet von der Sequenz des Proteins Lysozym aus Hühnereiweiß, gezeigt. Das kürzere Peptid hat an beiden Enden jeweils drei Aminosäurereste angefügt, das längere jeweils acht Aminosäurereste. Die Konformationsverteilung der Trialanisequenz des kürzeren Peptids entspricht nahezu der in der Peptidreihe Ala3 bis Ala7. Die Verteilung des längeren Peptids ist dagegen deutlich verschieden (~ 35% alphaR-helicaler Anteil). Die 1HN und 15N chemischen Verschiebungen der Trialaninsequenz des längeren Peptids sind mit denen des entfalteten Lysozym-Proteins identisch und demzufolge aller wahrscheinlichkeit nach auch die Konformationsverteilung. Kurze homopolymere Peptide eignen sich deshalb nicht als Modell für Aminosäuresequenzen in längeren heteropolymeren Peptiden.
The mitochondrial respiratory chain consists of NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex-I), succinate:ubiquinone reductase (Complex-II), ubiquinol:cytochrome c reductase (Complex-III), cytochrome c oxidase (Complex-IV) and cytochrome c as an electron mediator between Complex-III and Complex-IV. Paracoccus denitrificans membranes were used as a model system for the association of the mitochondrial respiratory chain. More than 50 years ago, a model was given for a supercomplex assembly formed by stable associations between these complexes. This model gradually shifted by the model of random diffusion given by Hackenbrock et al. 1986 Different independent approaches were used to further analyze this situation in a native membrane environment, thus avoiding any perturbation caused by detergent solubilization: (a) measuring the distance and orientation of the different complexes by multi-frequency EPR Spectroscopy we started to analyze simple system, the interaction between CuA fragment derived from P. denitrificans and various c type cytochrome by Pulsed X band and G band (180 GHz) EPR. Partner proteins for the CuA (excess negative surface charge) were (i) horse heart cytochrome c which contain a large number of positive charges in heme crevice,(ii) the cytochrome c552 soluble fragment (physiological electron donor and have positive charges), and as a control (iii) the cytochrome c1 soluble fragment (negative surface potential, derived from bc1 complex) The measurements were performed at several magnetic field positions varying temperature between 5 to 30 K. Both the X band and the high-field measurements show the existence of a strong relaxation enhancement of the CuA by the specific binding of the P. denitrificans cytochrome c552 and horse heart cytochrome c. This relaxation enhancement is dependent on temperature and provides information about the distance and relative orientation of the two interacting spins within this protein-protein complex. (b) For quantitative information about lateral diffusion of cytochrome c oxidase in the native membrane Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) was used. In this experiment, diffusion coefficients for oxidase differ in the case of supercomplex for wild type membrane and for two deletion mutants lacking either Complex-I or Complex-III. (c) The optical absorption spectroscopy at microsecond level resolution was tried for the translational mobility of oxidase in membrane vesicles. Due to the presence of different hemes in the native membrane, carbon monoxide (CO) used as a probe for the experiment. The optimization of the experimental conditions were carried out to get the optimal signal.
Although in general cells are genetically identical in multicellular organisms, the differential expression of genomic information enables cell type definition and specific organ function. In eukaryotic cells, the DNA is associated with histone and non-histones proteins into a restrictive structure called chromatin. Assembly into chromatin does not only protect and package the linear double stranded DNA into the nucleus but is fundamental for the execution of diverse genetic programs. Posttranslational modifications of histones regulate the accessibility of the DNA to transcription factors and serve as scaffold for binding of regulatory proteins. Nuclear receptors are transcription factors that bind specific target sequences on the DNA and recruit transcriptional coregulators at the promoter. These are able to modify the chromatin structure in an activating or repressing manner. The contribution of corepressors to the biological actions of nuclear receptors has turned out to be essential. Impaired corepressor function can be the cause of endocrine malfunctions, neoplastic diseases or severe developmental abnormalities. To better understand the role of the nuclear receptor corepressor N-CoR the unknown function of the extreme C-terminus was investigated. In this thesis the interaction of N-CoR with the non-POU-domain containing octamer-binding protein Non0/p54nrb, that was found tobe a potential interaction partner in a yeast-two-hybrid screen, was confirmed. This protein contains two RNA recognition motifs (RRM) and is described as a multifunctional protein since it is involved in transcription Initiation as well as in pre-mRNA processing. The RRM1 motif was determined to be essential and sufficient for the interaction with N-CoR. Obtaining dominant negative effect with the Non0/p54nrb RRM1 deletion mutant in functional reporter assays, data support that NonO modulates the capacity of N-CoR to repress and alters the recruitment of N-CoR by nuclear receptors to targeted Promoters. Additional analyses suggest that the N- and C- terminus of N-CoR are involved in intramolecular interactions and that they regulate each other. Taken results together a functional model is proposed that supports the biological relevance of the interaction of N-CoR with NonO and the function of N-CoR C-terminus acting as asensor that evaluates the ratio of corepressors and coactivators in the nuclear receptor environment. N-CoR repressive capacity would be altered by modulating factors like NonO that interacts with N-CoR C-terminus. The mechanism support that splicing and transcription regulation are physically and functionallylinked to ensure the appropriate amount of messager RNA to be transcript and process in response to stimulation intensity and cell context.
Replizierende Murine Leukämieviren (MLV) können wertvolle Werkzeuge für die humane Krebsgentherapie werden, da sie das Transgen innerhalb des gewünschten Gewebes verteilen, ihr Genom stabil integrieren und einen natürlichen Tumortropismus aufweisen. In vorliegender Arbeit wurde ein System zur visuellen Analyse der MLV‐Replikation sowie der Virusbindung an Zielzellen mittels Einfügung fluoreszierender Proteine etabliert und als Werkzeug für dasDesign und die Optimierung dieser Viren als Gentherapievektoren benutzt. Zuerst wurde die Kodierungskapazität dieser Retroviren durch Aufteilen der viralen Gene auf zwei semireplikative Vektoren vergößert. Die Kopplung der Genome mit fluoreszierenden Proteinen ermöglichte ebenfalls in diesem Zusammenhang die Beobachtung der Repliktion aber auch die einfache Aufdeckung von Rekombinationsereignissen. Die Ergebnisse zeigten den Bedarf weiterer Optimierungen, stellten allerdings einen Vorreiter auf diesem Forschungsgebiet dar und zeigten das Potential dieses Systems auf (Sliva et al., 2004a). Zusätzlich zum natürlichen Tumortropismus sollte die Sicherheit von replizierenden Retroviren für die Tumortherapie erhöht werdn. Gezielte Veränderungen des ecotropen Hüllproteins zu EGFR‐exprimierenden Zellen mittels gerichteter Evolution sowie der Versuch, den Wirtstropismus des Env mit der Insertion des Liganden SDF‐1α auf humane CXCR4‐exprimierende Zellen auszuweiten, sind jedoch gescheitert. Diese Daten müssen sich in die Reihe der erfolglos gebliebenen Versuche, den Wirtstropismus des ecotropen Env auf humane Zellen auszuweiten, einreihen (Sliva et al., 2004b). Abschließend wurde shRNA als therapeutisches Effektormolekül erfolgreich mittels replikationskompetenter MLV in Zielzellen überragen, was zur deutlichen Herabsetzung des Proteinlevels des Zielproteins der siRNA führte (Sliva et al., 2006). Diese modifizierten Viren sind ein gutes Werkzeug zur einfachen in vitro Untersuchung von Genfunktionen, und könnten auch eine Erleichterung für die Untersuchung von Genfunktionen innerhalb von proliferierendem Tumorgewebe darstelln. Des Weiteren präsentieren die Ergebnisse und Beobachtungen dieser Arbeit einen großen Schritt in Richtung Anwendung dieser Virn für die humane Gentherapie. Denn gekoppelt mit z.B. einer tumorspezifischen Expression der shRNA‐Expressionskassette und der intelligenten Wahl der siRNA‐(Ziel)Sequenz, die nach Applikation zum Tod von malignen Tumorzellen führt, wären sie die perfekte Waffe gegen solide Tumoren.
Am Anfang dieser Arbeit wurde die CE als hervorragende Methode zur Identifizierung und Charakterisierung von Nukleinsäuren und Nukleinsäure-Analoga etabliert. Die Anwendung der kommerziell erhältlichen Gelkapillaren führte zwar zu guten Trennergebnissen, zeigte jedoch erhebliche Mängel im praktischen Umgang (Giftigkeit der Agentien), eingeschränkte Lebensdauer der Gele aufgrund von Degradations-prozessen, in der Sensitivität sowie in der Reproduzierbarkeit der erhaltenen Ergebnisse. Aus diesem Grund wurde die Methode im Bezug auf die Gelbildner und die verwendete Detektionsmethode erheblich verbessert. Die Verwendung von Cellulosederivaten als Gelbildner führte zu einer extrem robuster, sensitiven, preiswerten und ungiftigen Methode zur Trennung von komplexen Nukleinsäuregemischen. Die Möglichkeit die Trennmatrix für jeden Lauf zu erneuern, verbesserte die Reproduzierbarkeit der Methode enorm. Für verschiedene Trennprobleme kann durch einfache Veränderung der Viskosität oder der Konzentration des Gelbildners die Methode einfach und schnell optimiert werden. Die etablierte Standardmethode konnte zur Detektion und Charakterisierung unterschiedlichster DNA Fragmente herangezogen werden. So konnte eine Reinheitsprüfung für Oligonukleotide eingeführt werden, Mutationen detektiert werden oder ein weiterer Parameter zur Charakterisierung von Antisense Oligonukleotide etabliert werden. Die zusätzliche Einführung der laserinduzierten Detektion (LIF) in die Standardmethode führte zu einer enormen Steigerung der Sensitivität der Methode. Hiermit können 100-fach kleinere Konzentrationen von Nukleinsäuren detektiert werden, als mit der herkömmlichen UV-Detektion. Basierend auf diesen Optimierungen ist es gelungen die entwickelte CE Methode als ein wesentlichen Bestandteil eines hochselektiven und spezifischen zellbasierten Modells zur Detektion von apoptotischen Vorgängen zu etablieren. Dieses Modell hat, im Gegensatz zu den zahlreichen, existierenden Cytotox-Assays, den entscheidenden Vorteil, dass es auf Wirkebene detektiert und nicht nur Surrogatparameter, wie zum Beispiel Zellmembranschäden, erfasst. Trotzdem ist es einfach und schnell durchführbar. Dadurch ist das etablierte Modell zur klaren Unterscheidung von Apoptose und Nekrose in der Lage. Diese klare Unterscheidung macht ein Wirkstoff-Screening von potentiell apoptose-induzierenden Wirkstoffen einfach und schnell möglich. Wie gezeigt wurde, kann durch die Verwendung von Tumorzelllinien mit verschiedenen Prädispositionen die Unterscheidung von unspezifisch induzierter Apoptose, wie z.B. durch Serumentzug, und von spezifisch induzierter Apoptose, wie z.B. durch Etoposid bei Caspase-3 enthaltenden Zelllinien und Vitamin-D-Analoga bei Vitamin-D3-Rezeptor tragenden Tumorzelllinien, möglich gemacht werden. Das Potential des etablierten Modells kann durch Einsatz verschiedenster Tumorzellen erweitert werden. So kann man die Wirksamkeit sowie die Resistenz der Tumorzellen gegenüber vorhandenen und neuen Tumortherapeutika ohne größere Probleme zeigen.
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Interaktionspartner des einwärtsrektifizierenden, renalen ROMK-Kaliumkanals identifiziert und funktionell in Xenopus Oozyten untersucht. Zunächst wurde mit Hilfe eines modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-Systems und dem zytosolischen C-Terminus von ROMK als Köderprotein eine cDNS-Bibliothek der humanen Niere durchmustert. Eine Besonderheit hierbei war, daß das Köderprotein im Gegensatz zu dem herkömmlichen Hefe-Zwei-Hybrid-System in der nativen, tetrameren Konformation vorlag. Die Interaktion der isolierten Proteine mit dem ROMK-C-Terminus wurde anschließend in der Hefe in direkten Bindungsstudien bestätigt. Auf diese Weise konnten 25 neue Interaktionspartner für ROMK gefunden werden. Aufgrund ihrer teilweise bekannten Funktionen und Strukturen wurden einige, insbesondere das Golgi-Protein Golgin-160, das Adapterprotein GRB7 und die Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Untereinheit PP2A B56β, für eine weitergehende Charakterisierung ausgewählt. Die vermutete Beteiligung von Golgin-160 am vesikulären Membrantransport machte die gefundene Interaktion mit ROMK besonders interessant, da über den Transport des Kanals vom Endoplasmatischen Retikulum über den Golgi-Apparat bis an die Zelloberfläche nur wenig bekannt ist. Zunächst konnte die Bindung von Golgin-160 an das ROMK Kanalprotein durch Koimmunpräzipitation beider Proteine aus Lysaten transfizierter Säugerzellen unterstützt werden. Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen bestätigten weiterhin, daß beide Proteine tatsächlich und ausschließlich im Bereich des Golgi-Apparats kolokalisiert sind. Dies verstärkte die Vermutung, daß Golgin-160 am Membrantransport von ROMK beteiligt ist. Funktionelle Untersuchungen in Xenopus Oozyten mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme ergaben nach Koexpression beider Proteine reproduzierbar eine Verdopplung der ROMK-Stromamplitude. Mittels einer Chemolumineszenz-Oberflächenexpressionsanalyse konnte dies auf eine Zunahme der Dichte des Kanalproteins in der Plasmamembran zurückgeführt werden. Ähnliche Resultate wurden auch für das nahe verwandte Kir2.1-Kanalprotein erhalten. Diese Untersuchungen zeigten zudem, daß nur das Kanalprotein an der Zelloberfläche, nicht aber die Gesamtmenge des Proteins in der Zelle erhöht war. Dementsprechend waren auch die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften des ROMK-Kanals durch das koexprimierte Golgin-160 nicht verändert. Um die Bedeutung der gefundenen Interaktion näher zu untersuchen, wurden Bindungsstudien mit C-terminalen Bartter-Mutanten von ROMK durchgeführt. Alle untersuchten Punkt- und Trunkationsmutanten waren noch zur Bindung von Golgin-160 fähig, und zwei Punktmutanten konnten durch Golgin-160 auch funktionell stimuliert werden. Daraus kann geschlossen werden, daß diese hochkonservierten Aminosäurereste des Kanalproteins nicht an der Bindung von Golgin-160 beteiligt sind, und daß der defekte Membrantransport dieser krankheitsverursachenden Mutanten nicht auf einer gestörten Interaktion mit dem untersuchten Golgi-Protein beruht. Mit diesen Untersuchungen wurde erstmalig gezeigt, daß Golgin-160 am Golgi-Apparat selektiv mit transportierten Membranproteinen interagiert und dadurch deren Zelloberflächenexpression reguliert. Eine spezifische Rolle beim Transport von Oberflächenproteinen zur Plasmamembran wird durch das Ergebnis unterstrichen, daß auch die Oberflächenexpression der entfernt verwandten Kv1.5- und Kv4.3-Kanalproteine stimuliert wird, aber nicht die des HERGKaliumkanals. In weiteren funktionellen Untersuchungen konnten auch für GRB7 und PP2A B56β erstmalig Einflüsse auf die ROMK-Kanalaktivität gezeigt werden. Die Koexpression von GRB7 führte sowohl bei ROMK als auch bei verwandten Kir2-Kanalproteinen zu einer Verringerung der Stromamplitude. Bei PP2A B56β war der Effekt von der Expressionshöhe dieser regulatorischen Phosphatase- Untereinheit abhängig. So waren die ROMK-Ströme bei geringen Mengen an injizierter PP2A B56β erhöht, nach Injektion größerer Mengen dagegen reduziert. Die Regulation der ROMK-Kanalaktivität wird größtenteils durch die Kontrolle der Kanaldichte an der Zelloberfläche erzielt. Da unterschiedliche Signalwege die Häufigkeit des Kanalproteins an der Zelloberfläche modulieren können, kann vermutet werden, daß nicht nur Golgin-160 sondern auch GRB7 und PP2A B56β an der Regulation der Oberflächenexpression von ROMK beteiligt sind (Abb. 36). Die Identifizierung dieser neuen Interaktionspartner stellt deshalb einen ersten wichtigen Schritt bei der Aufklärung der dieser Regulation zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dar.
The goal of this thesis was the development, evaluation and application of novel virtual screening approaches for the rational compilation of high quality pharmacological screening libraries. The criteria for a high quality were a high probability of the selected molecules to be active compared to randomly selected molecules and diversity in the retrieved chemotypes of the selected molecules to be prepared for the attrition of single lead structures. For the latter criterion the virtual screening approach had to perform “scaffold hopping”. The first molecular descriptor that was explicitly reported for that purpose was the topological pharmacophore CATS descriptor, representing a correlation vector (CV) of all pharmacophore points in a molecule. The representation is alignment-free and thus renders fast screening of large databases feasible. In a first series of experiments the CATS descriptor was conceptually extended to the three-dimensional pharmacophore-pair CATS3D descriptor and the molecular surface based SURFCATS descriptor. The scaling of the CATS3D descriptor, the combination of CATS3D with different similarity metrics and the dependence of the CATS3D descriptor on the threedimensional conformations of the molecules in the virtual screening database were evaluated in retrospective screening experiments. The “scaffold hopping” capabilities of CATS3D and SURFCATS were compared to CATS and the substructure fingerprint MACCS keys. Prospective virtual screening with CATS3D similarity searching was applied for the TAR RNA and the metabotropic glutamate receptor 5 (mGlur5). A combination of supervised and unsupervised neural networks trained on CATS3D descriptors was applied prospectively to compile a focused but still diverse library of mGluR5 modulators. In a second series of experiments the SQUID fuzzy pharmacophore model method was developed, that was aimed to provide a more general query for virtual screening than the CATS family descriptors. A prospective application of the fuzzy pharmacophore models was performed for TAR RNA ligands. In a last experiment a structure-/ligand-based pharmacophore model was developed for taspase1 based on a homology model of the enzyme. This model was applied prospectively for the screening for the first inhibitors of taspase1. The effect of different similarity metrics (Euc: Euclidean distance, Manh: Manhattan distance and Tani: Tanimoto similarity) and different scaling methods (unscaled, scaling1: scaling by the number of atoms, and scaling2: scaling by the added incidences of potential pharmacophore points of atom pairs) on CATS3D similarity searching was evaluated in retrospective virtual screening experiments. 12 target classes of the COBRA database of annotated ligands from recent scientific literature were used for that purpose. Scaling2, a new development for the CATS3D descriptor, was shown to perform best on average in combination with all three similarity metrics (enrichment factor ef (1%): Manh = 11.8 ± 4.3, Euc = 11.9 ± 4.6, Tani = 12.8 ± 5.1). The Tanimoto coefficient was found to perform best with the new scaling method. Using the other scaling methods the Manhattan distance performed best (ef (1%): unscaled: Manh = 9.6 ± 4.0, Euc = 8.1 ± 3.5, Tani = 8.3 ± 3.8; scaling1: Manh = 10.3 ± 4.1, Euc = 8.8 ± 3.6, Tani = 9.1 ± 3.8). Since CATS3D is independent of an alignment, the dependence of a “receptor relevant” conformation might also be weaker compared to other methods like docking. Using such methods might be a possibility to overcome problems like protein flexibility or the computational expensive calculation of many conformers. To test this hypothesis, co-crystal structures of 11 target classes served as queries for virtual screening of the COBRA database. Different numbers of conformations were calculated for the COBRA database. Using only a single conformation already resulted in a significant enrichment of isofunctional molecules on average (ef (1%) = 6.0 ± 6.5). This observation was also made for ligand classes with many rotatable bonds (e.g. HIV-protease: 19.3 ± 6.2 rotatable bonds in COBRA, ef (1%) = 12.2 ± 11.8). On average only an improvement from using the maximum number of conformations (on average 37 conformations / molecule) to using single conformations of 1.1 fold was found. It was found that using more conformations actives and inactives equally became more similar to the reference compounds according to the CATS3D representations. Applying the same parameters as before to calculate conformations for the crystal structure ligands resulted in an average Cartesian RMSD of the single conformations to the crystal structure conformations of 1.7 ± 0.7 Å. For the maximum number of conformations, the RMSD decreased to 1.0 ± 0.5 Å (1.8 fold improvement on average). To assess the virtual screening performance and the scaffold hopping potential of CATS3D and SURFACATS, these descriptors were compared to CATS and the MACCS keys, a fingerprint based on exact chemical substructures. Retrospective screening of ten classes of the COBRA database was performed. According to the average enrichment factors the MACCS keys performed best (ef (1%): MACCS = 17.4 ± 6.4, CATS = 14.6 ± 5.4, CATS3D = 13.9 ± 4.9, SURFCATS = 12.2 ± 5.5). The classes, where MACCS performed best, consisted of a lower average fraction of different scaffolds relative to the number of molecules (0.44 ± 0.13), than the classes, where CATS performed best (0.65 ± 0.13). CATS3D was the best performing method for only a single target class with an intermediate fraction of scaffolds (0.55). SURFCATS was not found to perform best for a single class. These results indicate that CATS and the CATS3D descriptors might be better suited to find novel scaffolds than the MACCS keys. All methods were also shown to complement each other by retrieving scaffolds that were not found by the other methods. A prospective evaluation of CATS3D similarity searching was done for metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) allosteric modulators. Seven known antagonists of mGluR5 with sub-micromolar IC50 were used as reference ligands for virtual screening of the 20,000 most drug-like compounds – as predicted by an artificial neural network approach – of the Asinex vendor database (194,563 compounds). Eight of 29 virtual screening hits were found with a Ki below 50 µM in a binding assay. Most of the ligands were only moderately specific for mGluR5 (maximum of > 4.2 fold selectivity) relative to mGluR1, the most similar receptor to mGluR5. One ligand exhibited even a better Ki for mGluR1 than for mGluR5 (mGluR5: Ki > 100 µM, mGluR1: Ki = 14 µM). All hits had different scaffolds than the reference molecules. It was demonstrated that the compiled library contained molecules that were different from the reference structures – as estimated by MACCS substructure fingerprints – but were still considered isofunctional by both CATS and CATS3D pharmacophore approaches. Artificial neural networks (ANN) provide an alternative to similarity searching in virtual screening, with the advantage that they incorporate knowledge from a learning procedure. A combination of artificial neural networks for the compilation of a focused but still structurally diverse screening library was employed prospectively for mGluR5. Ensembles of neural networks were trained on CATS3D representations of the training data for the prediction of “mGluR5-likeness” and for “mGluR5/mGluR1 selectivity”, the most similar receptor to mGluR5, yielding Matthews cc between 0.88 and 0.92 as well as 0.88 and 0.91 respectively. The best 8,403 hits (the focused library: the intersection of the best hits from both prediction tasks) from virtually ranking the Enamine vendor database (ca. 1,000,000 molecules), were further analyzed by two self-organizing maps (SOMs), trained on CATS3D descriptors and on MACCS substructure fingerprints. A diverse and representative subset of the hits was obtained by selecting the most similar molecules to each SOM neuron. Binding studies of the selected compounds (16 molecules from each map) gave that three of the molecules from the CATS3D SOM and two of the molecules from the MACCS SOM showed mGluR5 binding. The best hit with a Ki of 21 µM was found in the CATS3D SOM. The selectivity of the compounds for mGluR5 over mGluR1 was low. Since the binding pockets in the two receptors are similar the general CATS3D representation might not have been appropriate for the prediction of selectivity. In both SOMs new active molecules were found in neurons that did not contain molecules from the training set, i. e. the approach was able to enter new areas of chemical space with respect to mGluR5. The combination of supervised and unsupervised neural networks and CATS3D seemed to be suited for the retrieval of dissimilar molecules with the same class of biological activity, rather than for the optimization of molecules with respect to activity or selectivity. A new virtual screening approach was developed with the SQUID (Sophisticated Quantification of Interaction Distributions) fuzzy pharmacophore method. In SQUID pairs of Gaussian probability densities are used for the construction of a CV descriptor. The Gaussians represent clusters of atoms comprising the same pharmacophoric feature within an alignment of several active reference molecules. The fuzzy representation of the molecules should enhance the performance in scaffold hopping. Pharmacophore models with different degrees of fuzziness (resolution) can be defined which might be an appropriate means to compensate for ligand and receptor flexibility. For virtual screening the 3D distribution of Gaussian densities is transformed into a two-point correlation vector representation which describes the probability density for the presence of atom-pairs, comprising defined pharmacophoric features. The fuzzy pharmacophore CV was used to rank CATS3D representations of molecules. The approach was validated by retrospective screening for cyclooxygenase 2 (COX-2) and thrombin ligands. A variety of models with different degrees of fuzziness were calculated and tested for both classes of molecules. Best performance was obtained with pharmacophore models reflecting an intermediate degree of fuzziness. Appropriately weighted fuzzy pharmacophore models performed better in retrospective screening than CATS3D similarity searching using single query molecules, for both COX-2 and thrombin (ef (1%): COX-2: SQUID = 39.2., best CATS3D result = 26.6; Thrombin: SQUID = 18.0, best CATS3D result = 16.7). The new pharmacophore method was shown to complement MOE pharmacophore models. SQUID fuzzy pharmacophore and CATS3D virtual screening were applied prospectively to retrieve novel scaffolds of RNA binding molecules, inhibiting the Tat-TAR interaction. A pharmacophore model was built up from one ligand (acetylpromazine, IC50 = 500 µM) and a fragment of another known ligand (CGP40336A), which was assumed to bind with a comparable binding mode as acetylpromazine. The fragment was flexible aligned to the TAR bound NMR conformation of acetylpromazine. Using an optimized SQUID pharmacophore model the 20,000 most druglike molecules from the SPECS database (229,658 compounds) were screened for Tat-TAR ligands. Both reference inhibitors were also applied for CATS3D similarity searching. A set of 19 molecules from the SQUID and CATS3D results was selected for experimental testing. In a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay the best SQUID hit showed an IC50 value of 46 µM, which represents an approximately tenfold improvement over the reference acetylpromazine. The best hit from CATS3D similarity searching showed an IC50 comparable to acetylpromazine (IC50 = 500 µM). Both hits contained different molecular scaffolds than the reference molecules. Structure-based pharmacophores provide an alternative to ligand-based approaches, with the advantage that no ligands have to be known in advance and no topological bias is introduced. The latter is e.g. favorable for hopping from peptide-like substrates to drug-like molecules. A homology model of the threonine aspartase taspase1 was calculated based on the crystal structures of a homologous isoaspartyl peptidase. Docking studies of the substrate with GOLD identified a binding mode where the cleaved bond was situated directly above the reactive N-terminal threonine. The predicted enzyme-substrate complex was used to derive a pharmacophore model for virtual screening for novel taspase1 inhibitors. 85 molecules were identified from virtual screening with the pharmacophore model as potential taspase1- inhibitors, however biochemical data was not available before the end of this thesis. In summary this thesis demonstrated the successful development, improvement and application of pharmacophore-based virtual screening methods for the compilation of molecule-libraries for early phase drug development. The highest potential of such methods seemed to be in scaffold hopping, the non-trivial task of finding different molecules with the same biological activity.
Das Zytolysin ClyA von Escherichia coli ist der Prototyp einer neuartigen Familie von porenbildenden, bakteriellen Zytolysinen, welche in verschiedenen Vertretern der Enterobacteriaceae vorkommen. Es handelt sich bei diesem Toxin um ein Protein von 34 kDa, das hämolytische und zytotoxische Aktivität aufweist und das in Zellmembranen stabile Poren einführt, indem es sich zu ringförmigen ClyA-Oligomeren zusammenlagert. Die vorliegende Dissertation sollte einen Beitrag zur funktionalen Charakterisierung des ClyA-Proteins von E. coli K12 liefern. Insbesondere sollte die Bedeutung der N-terminalen Region für den Sekretionsmechanismus, für die hämolytische und porenbildende Aktivität, für die Interaktion mit Zielmembranen und für die Fähigkeit zur Oligomerisierung des Proteins analysiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden hierzu ClyA-Derivate mit spezifischen Mutationen innerhalb des N-terminalen Bereiches hergestellt und auf ihre Funktions-tüchtigkeit überprüft. Diese Untersuchungen gingen von den bestehenden Erkenntnissen aus, dass die Sekretion von ClyA über eine periplasmatische Zwischenstufe verläuft und keine N-terminale Prozessierung des Toxins erfolgt. Es wurde festgestellt, dass bereits kurze, sukzessive Deletionen innerhalb der beginnenden N-terminalen Region, wie die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf (ClyA∆2-5) und sechs bis zehn (ClyA∆6-10), einen deutlich hemmenden Effekt auf den Transfer von ClyA über die zytoplasmatische Membran zur Folge hatte, welcher durch die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis zehn (ClyA∆2-10) weiter verstärkt wurde. Größere N-terminale Mutationen, wie die Deletionen der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn (ClyA∆2-15) und zwei bis zwanzig (ClyA∆2-20) sowie interne Deletionen, die Aminosäuren jenseits von Aminosäureposition zehn betrafen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20), führten zur fast vollständigen Inhibierung (ClyA∆6-15) oder totalen Blockierung (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) des Transports von ClyA in den periplas-matischen Raum. Während die hämolytische Aktivität der ClyA-Mutanten ClyA∆2-5, ClyA∆6-10 und ClyA∆2-10 zwar abnahm, jedoch im Vergleich zu der des wildtypischen ClyA-Proteins noch verhältnismäßig hoch war, beeinflussten die weiteren Deletionen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-15, ClyA∆2-20) die hämolytische Eigenschaft des Toxins ganz erheblich. So verursachten diese Mutationen eine massive Abnahme (ClyA∆6-15) bzw. einen kompletten Verlust (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) der zytolytischen Aktivität des ClyA-Proteins gegenüber Erythrozyten. Untersuchungen an künstlichen Lipidmembranen ergaben, dass die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf, sechs bis zehn und zwei bis zehn die porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins nur unwesentlich beeinträchtigt. Dagegen störte die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn und zwei bis zwanzig die porenbildende Eigenschaft von ClyA so tiefgreifend, dass keine (ClyA∆2-20) oder nur Transmembranporen mit extrem geringem Innendurchmesser (ClyA∆2-15) erzeugt wurden. Daneben spiegelten instabile Membranporen, die durch die ClyA-Mutanten ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20 und ClyA∆16-20 im künstlichen Lipid-Bilayer gebildet wurden, die negativen Auswirkungen dieser Mutationen auf die porenbildende Aktivität des Toxins wider. Die gesammelten Daten unterstreichen somit nicht nur die essentielle Bedeutung der N-terminalen Region des Zytolysins ClyA von E. coli K12 für den Transport in den periplasmatischen Raum, sondern auch für die hämolytische und porenbildende Eigenschaft des Toxins. Allerdings wurde die hämolytische und porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins erst durch Mutationen ab Aminosäureposition zehn signifikant beeinträchtigt. Demgegenüber verdeutlichten Untersuchungen zum Bindungsverhalten an Zielzellen sowie Crosslinking-Experimente, dass die N-terminale Aminosäuresequenz von Position zwei bis zwanzig von ClyA weder für die Bindung an Erythrozyten noch für die Oligomerisierung des Toxins einen wesentlichen Faktor darstellt.