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Die Begegnung mit dem Fremden : europäische Einflüsse auf die indigene Kunst Nordwestamerikas
(2002)
Für die indigene Bevölkerung der Nordwestküste Nordamerikas bedeutete die Ankunft des fremden, weißen Mannes eine unfassbare Neuigkeit, die erst in das autochthone Weltbild eingeordnet werden musste. Die anfänglich als übernatürlich eingestuften Wesen konfrontierten die Einheimischen mit einer fremden Lebensweise. Während des 18. und 19. Jahrhunderts hatten in diesem Kulturareal Kontakte mit Forschungsreisenden, Handelsleuten, Missionaren, Siedlern, Regierungsbeauftragten, Wissenschaftlern und Touristen Veränderungen in allen Lebensbereichen bewirkt. Von diesem Kulturwandel gingen Einflüsse aus, die sich auch auf die Kunst der indigenen Bevölkerung Nordamerikas auswirkten.
Schon in der frühen Kontaktperiode experimentierten indigene Künstler mit neuen Materialien, Stilelementen sowie europäischen Werkzeugen und fanden neue Absatzmärkte für ihre Produkte. Die Nachfrage der Fremden nach "Souvenirs" führte zur Ausbildung einer eigenen Gattung von Objekten, die für den Handel bestimmt waren und sich auch an europäischen Gebrauchsgütern orientierten. Die Objekte, die sich heute in zahlreichen Ländern befinden, zeugen von den regen Beziehungen zwischen der Nordwestküste Nordamerikas und Europa.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll am Beispiel der nördlichen Gruppen dieses Areals, vor allem der Tlingit und Haida, die Aufnahme des euro-amerikanischen Einflusses durch das indigene Kunstschaffen aufgezeigt und untersucht werden. Dabei soll vor Augen geführt werden, welche euro-amerikanischen künstlerischen Techniken, Materialien und Stilelemente adaptiert und in die indigene Kunst integriert wurden. Dieser Fremdeinfluss lässt sich an Kunstgattungen wie der Holzschnitzkunst, Textilkunst, Schmuckproduktion und Schamanenkunst nachweisen.
Primäres Anliegen der vorliegenden Arbeit ist, anhand ausgewählter Beispiele generelle Tendenzen und Entwicklungen innerhalb dieser Kunstbereiche aufzuzeigen. Im Rahmen dieser Untersuchungen soll eruiert werden: wie dem Fremden begegnet wurde, was die indigene Bevölkerung als fremd erlebte und welche Strategien sie im Umgang mit dem Fremden entwickelte. Des Weiteren soll aufgrund der komplexen Sozialorganisation dieser Gruppen sowohl geschlechterspezifisch als auch zwischen säkularer und Schamanenkunst differenziert werden. Außerdem soll der Versuch unternommen werden, die besondere Entwicklung dieser Fremdeinflüsse bei den verschiedenen ethnischen Gruppen nachzuvollziehen.
Ein zweiter Aspekt dieser Arbeit befasst sich mit dem Bild des Fremden im Spiegel des indigenen Künstlers. Ebenso wie europäische Reisende die indigene Bevölkerung in Reisetagebüchern und Gemälden festhielten, wurden umgekehrt auch Europäer von indigenen Künstlern bildlich dargestellt. Hierbei handelt es sich vor allem um Darstellungen von Seeleuten, Missionaren, Regierungsbeamten und Frauen. Aber auch das Umfeld des Fremden, d.h. vor allem seine materiellen Güter, wurden nachgebildet. Es stellt sich hier die Frage, in welchen Kunstbereichen, wie und warum der Fremde abgebildet wurde.
Ein weiterer Schwerpunkt der Untersuchung gilt der Auseinandersetzung mit der Frage, wie und wann das Zusammentreffen von europäischen und indigenen Einflüssen zur Entwicklung einer Handelskunst bzw. neuen Märkten führte. Hierbei gilt das Interesse den Marktformen und den am Prozess beteiligten Gruppen bzw. "vested interest groups". In der vorliegenden Arbeit wird auch untersucht, in welchem Rahmen kommerzielle Transaktionen mit Fremden stattfanden. Des Weiteren wird beleuchtet, wie die Kommerzialisierung von Nordwestküstenkunst und die neu entstandene Nachfrage das indigene Kunstschaffen beeinflussten.
Die Forschungsergebnisse ermöglichen zunächst eine Aussage über die Art der Objekte, die europäische Einflüsse aufgenommen haben und zeigen die Lebensbereiche, in denen diese Gegenstände auftreten. Darüber hinaus soll ermittelt werden, welche Kulturelemente - als Ergebnis eine Prozesses der selektiven Adaption - übernommen wurden. Die Resultate dieser Analyse sollen es möglich machen, eine Entwicklung von der Rezeption europäischer Einflüsse bis zur Ausbildung einer Handelskunst bzw. Sammlerkunst aufzuzeigen.
Neben der Untersuchung dieser Fragen ist jedoch das Hauptinteresse der vorliegenden Arbeit, eine in Europa kaum bekannte und außergewöhnliche Kultur bzw. bislang nicht oder nur partiell publizierte Sammlungen aus deutschen und estnischen Museen, die wissenschaftlich und kulturell von unschätzbaren Wert sind, der Öffentlichkeit zu präsentieren.
Die Leber spielt eine zentrale Rolle in der Entwicklung des Multiorganversagens nach Ischämie, Schock und Trauma. Hierbei nehmen die Veränderungen der Makrophagenaktivität, der Hepatozytenfunktion und der Mikrozirkulation eine besondere Stellung ein. Bisherige Untersuchungen zu dieser Thematik erfolgten meist mit Hilfe von in-vitro Methoden oder mittels der Intravitalmikroskopie. Ziel der vorliegenden Studie war, frühe Leberveränderungen nach hämorrhagischem Schock mit Hilfe der kontrastmittelverstärkten Magnetresonanztomographie zu erfassen. Im Kleintierexperiment wurde dazu die Makrophagenaktivität und die Gallesekretion der Leber 3 bzw. 24 Stunden nach hämorrhagischem Schock untersucht und mit den Ergebnissen der Intravitalmikroskopie bzw. der Gallesekretionmessung über den D. Choledochus verglichen. Zur Versuchsdurchführung wurden weibliche Sprague-Dawley Ratten mit 50 mg/kg Kg Pentobarbital narkotisiert. Zur kontinuierlichen Messung von Herzfrequenz, mittlerem arteriellen Blutdruck und zur Blutentnahme wurde den Tieren ein arterieller Katheter in die A. femoralis eingebracht. Über diesen erfolgte die Schockinduktion durch fraktionierte Blutentnahmen bis auf Werte von 40 ±5 mmHg. Diese hypotone Kreislaufsituation wurde über einen Zeitraum von 90 Minuten durch intermittierende Blutentnahmen konstant gehalten. Im Anschluß folgte eine dreistündige Reperfusionsphase mit Reinfusion von 60% des Shed-Blutes und Ringer-Laktat Lösung nach einem standardisierten Schema. Die randomisierte Aufteilung der Tiere erfolgte in 8 Gruppen: Zum einen wurden an zwei Sham und Schockgruppen kernspintomographische Untersuchungen im Anschluß an die Reperfusionsphase nach 3 bzw. 24 Stunden durchgeführt. Die Untersuchung erfolgte an einem Kleintierkernspintomographen mit einer 2,4T Magnetfeldspule (Bruker, Biospec, Germany). Mit Hilfe von ENDOREM (15µmol/kg KG i.v.) als Kontrastmittel wurde die Makrophagenaktivität der Leber untersucht, wobei Veränderungen der Signalintensität und Relaxationszeit in T2-gewichtetem Gewebe gemessen wurden. Gd-EOB-DTPA (200µmol/kg KG i.v.) diente zur kernspintomographischen Darstellung der Gallesekretion durch Signalintensitätsmessung in T1-gewichtetem Gewebe. Die Untersuchungssequenzen folgten dabei einem festgelegten Zeitablauf. Im Anschluß an die MRT wurden die Tiere laparotomiert und der linke Leberlappen auf einem speziellen Plexiglastisch zur intravitalmikroskopischen Untersuchung horizontal ausgelagert. Nach i.v. Gabe des Leukozytenfluoreszenzfarbstoffes Acridine Orange (1 µmol/kg KG) begann die Epifluoreszenzmikroskopie. Pro Versuchstier wurden fünf Lobuli für jeweils 30 Sekunden und fünf Zentralvenen als Standbilder aufgezeichnet. Diese Untersuchung diente der Auswertung der Leukozyten-Endothel-Interaktion und der Beurteilung der Mikrozirkulationsveränderungen nach hämorrhagischem Schock. In einer weiteren Versuchsreihe wurde an zwei Sham und Schockgruppen die Makrophagenaktivität mit Hilfe der Intravitalmikroskopie und die Gallesekretion durch quantitative Messung bestimmt. Hierzu wurden die Tiere 3 bzw. 24 Stunden postischämisch laparotomiert und ein spezieller Kunststoffkatheter in den D. Choledochus eingebracht. Über diesen wurde die Galle für eine Stunde abgeleitet und das Volumen bestimmt. Anschließend wurde wie in den vorherigen Gruppen, der linke Leberlappen zur Intravitalmikroskopie ausgelagert. Zur Darstellung der Makrophagenaktivität wurden Latexpartikel (3x108 Beads/kg KG) über einen Schwanzvenenzugang injiziert und fünf Lobuli nach 12 Minuten als Standbilder aufgezeichnet. Die Auswertung der makrohämodynamischen und klinischchemischen Parametern zeigte keine signifikanten Unterschiede, so daß von vergleichbaren Versuchsbedingungen ausgegangen werden kann. Hingegen zeigte die postischämische intravitalmikroskopische Auswertung nach dreistündiger Reperfusion eine signifikante Erhöhung der Makrophagenaktivität im periportalen und perizentralen Bereich gegenüber der Schockgruppe, wobei die Kernspintomographie im Gegensatz dazu nach Applikation von ENDOREM keine signifikanten Unterschiede bezüglich Signalintensität und T2-Relaxationszeit aufzeigte. 24 Stunden postischämisch konnten weder mittels Kernspintomographie noch mittels der Intravitalmikroskopie Veränderungen der Makrophagenaktivität nachgewiesen werden. Demgegenüber zeigte sich in der Schockgruppe mit Hilfe der MRT nach 24 Stunden eine signifikant verminderte Ausscheidung von Gd-EOB-DTPA, die mit Hilfe der quantitativen Gallesekretionsmessung über den D. Choledochus ebenfalls dargestellt werden konnte. Die Untersuchung der Mikrohämodynamik zeigte postischämisch eine signifikante Zunahme der temporären sowie der dauerhaft adhärenten Leukozyten im Reperfusionsverlauf. Ebenso wurde 24 Stunden nach Reperfusionsbeginn eine signifikante Verengung der Sinusoiddurchmesser, eine Abnahme des volumetrischen Blutflusses und eine Verminderung der Leukozytengeschwindigkeit gemessen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, daß mit Hilfe der kontrastmittelverstärkten, nichtinvasiven Magnetresonanztomographie Funktionsstörungen der Hepatozyten nach hämorrhagischem Schock dargestellt werden können. Demgegenüber zeigte die Makrophagenaktivität kernspintomographisch keine Veränderungen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Obschon sublobuläre Veränderungen nicht erfaßt werden können, ermöglicht die non-invasive Magnetresonanztomographie klinisch anwendbare Verlaufsuntersuchungen. Mit der weiteren Entwicklung spezifischer Kontrastmittel und Verbesserung der technischen Ausstattung kann diese klinisch etablierte Untersuchungstechnik weiter ausgedehnt werden.
Weltweit stellen primäre und sekundäre metastatische Leberneoplasien die häufigste Todesursache onkologischer Patienten dar. Die Kontrolle eines Leberbefalls ist ein für das Überleben und die Lebensqualität dieser Patienten wichtiger Aspekt. Die chirurgische Leberresektion stellt z.Z. die einzige potentiell kurative Behandlung dar. In vielen Fällen jedoch ist eine Resektion nicht möglich. Bei diesen Patienten mit nicht resektablen Lebertumoren muß das Ziel eine maximal mögliche Kontrolle dieser Läsionen bei guter Lebensqualität sein. Hier kommen dann hauptsächlich chemotherapeutische sowie verschiedene lokoregionäre Therapiestrategien zur Anwendung. Diese Arbeit widmet sich der Untersuchung eines neu entwickelten Verfahrens im Rahmen einer prospektiven, offenen, multizentrischen Phase-II-Studie. Die hier zu untersuchende direkte selektive intratumorale Chemotherapie bietet die Möglichkeit höhere lokale Chemotherapeutikakonzentrationen bei geringerer systemischer Toxizität zu erreichen. Hierbei wird ein Cisplatin-haltiges lokal applizierbares Gel (Matrix Parmaceutical Inc., Fremont, CA) unter CT-Steuerung direkt in die Lebertumore injiziert. Adrenalin als vasokonstriktorisches Adjuvans erhöht desweiteren die langanhaltende Konzentrationssteigerung vor Ort gegenüber der systemischen Applikation. Im Rahmen dieser Studie wurden 17 Patienten mit nicht resektablen Lebermalignomen behandelt, hiervon 9 Patienten mit primärem HCC und 8 mit kolorektalen Lebermetastasen. Es handelte sich, besonders bei den Patienten mit kolorektalen Lebermetastasen, um unter Therapie progredientes oder rezidivierendes Tumorleiden. Die Behandlung bestand aus mehrfachen Gelapplikationen in etwa wöchentlichem Abstand. Zur Therapiekontrolle wurden vor und zu bestimmten Zeitpunkten nach den Behandlungen kontrastverstärkte Spiral-CT-Untersuchungen zur volumetrischen Messung von Tumor und Nekrose durchgeführt. Die Behandlung mit dem injizierbaren IntraDose® Gel wurde von den Patienten insgesamt gut toleriert und ist auch ambulant möglich. Zeichen einer Cisplatin-induzierten Toxizität traten nicht auf. In zwei Fällen zeigte sich jedoch eine weitere Verschlechterung der Leberfunktion, wenn diese initial bereits eingeschränkt war. Die Ergebnisse unserer Untersuchung unterschieden sich für die beiden Patientengruppen. Die Entwicklungen von Tumor- und Nekrosevolumen und die sich hieraus ergebenden Ansprechraten für die Patienten mit HCC deutlich vielversprechender. 75% der Patienten mit HCC zeigten ein Ansprechen auf die Therapie, hiervon wiesen 25% eine komplette, 50% eine partielle Remission auf; jeweils 12,5% zeigten einen Status idem bzw. eine Progression der behandelten Tumoren. Bei den Patienten mit kolorektalen Lebermetastasen ließ sich eine Ansprechrate von 28,6% (partielle Remission) erzielen, 71,4% der Patienten jedoch zeigten einen Tumorprogreß. Die ermittelten Überlebensdaten weisen auf einen möglichen Vorteil gegenüber nicht oder nur symptomatisch behandelten Patienten hin. Dieser Vorteil ist bei den Patienten mit den kolorektalen Metastasen stärker ausgeprägt als bei den Patienten mit HCC. Mit dem direkt intratumoral zu applizierenden IntraDose® Gel bietet sich eine minimal invasive, ambulant durchführbare Behandlungsoption für maligne nicht resektable Lebertumoren. Eine Wirksamkeit zur Behandlung maligner Lebertumoren bei guter Verträglichkeit konnte durch die vorgestellte Studie nachgewiesen werden. Hierbei waren die Ergebnisse bei den behandelten hepatozellulären Karzinomen besser als bei den kolorektalen Lebermetastasen. Die Ergebnisse, sollten in weiteren Studien mit größeren Patientenkollektiven überprüft werden, erst dann können mögliche Indikationen für die vorgestellte Therapie gefunden werden. Entsprechende Studien sind in Planung.
Verfahren zur elektrochemischen Messung von Stickstoffmonoxid und S-Nitrosothiolen in Flüssigkeiten
(2001)
Stickstoffmonoxid (NO) ist in den letzten Jahren als Kreislaufregulator und biologischer Botenstoff in den Mittelpunkt des Interesses gerückt. Inzwischen gilt als sicher, dass NO an vielen Schlüsselstellen, nicht nur in der Kreislaufregulation, aber dort besonders, eine prominente Rolle spielt. Das Endothel als disseminiertes Organ betrachtet ist als Produktionsort des zu Beginn der Forschungen phänomenologisch ,,endothelium derived relaxing factor" genannten NO scheinbar von größerer Bedeutung, als zunächst angenommen. Anstelle einer einfachen Gefäßauskleidung ist das Endothel Regulator vieler wichtiger Prozesse. Diskutierte Wirkungen reichen vom septischen Kreislaufversagen bei überschießender NO-Produktion, bis zur Atherosklerose bei gestörter Endothelfunktion mit verminderter NO-Produktion. Es gibt hier ,,gute" und ,,böse" Wirkungen, so das hier von einer Janusköpfigkeit, also Doppelgesichtigkeit, gesprochen wird. NO wird hier jeweils eine Schlüsselrolle als Botenstoff und Effektor zugewiesen. Bisher gibt es aber keine praktikablen Verfahren, um die effektive NO-Produktion zeitnah und in vivo zu quantifizieren. In der vorliegenden Arbeit ist im Anschluß an vorbestehenden Überlegungen und Verfahren eine Methode entwickelt worden, mit deren Hilfe Rückschlüsse auf die jeweilige Produktion und den Plasmaspiegel von NO gezogen werden können. Stickstoffmonoxid hat eine Halbwertszeit von wenigen Sekunden im Plasma. Ein wichtiges Stoffwechselprodukt aus dem Abbau des freien NO sind S-Nitrosothiole. Freies NO geht eine Verbindung mit Thiolgruppen von Plasmaproteinen ein. Diese gebundene Form von NO ist relativ stabil und gilt als Plasmaspeicher von NO. Es kann aus dieser Verbindung wieder herausgelöst werden und liegt dann wieder als freies NO vor. In der vorliegenden Arbeit werden die Grundlagen geschaffen für ein Verfahren, mit dem der Plasmaspiegel von S-Nitrosothiolen bestimmt, und Rückschlüsse auf die NO Produktion gezogen werden können. Die Methode basiert auf dem Umstand, dass man mittels Metallionen, wie beispielsweise Kupferionen, S-Nitrosothiole zur Dekomposition bringen kann. Das freigesetzte NO wurde dann mittels einer amperometrischen NO-selektiven Sonde gemessen. Die zu erwartenden Konzentrationen sind sehr gering und einer verlässlichen Messung nur bedingt zugänglich, da die Abspaltung von NO aus hochmolekularen S-Nitrosothiolen, wie dem S-Nitrosoalbumim, nur sehr langsam abläuft. Günstiger ist die Zerfallskinetik von niedermolekularen S-Nitrosoverbindungen. Daher wird der Zwischenschritt der Transnitrosylierung, der Übertragung der Nitrosylgruppe von Albumin auf einen niedermolekularen Baustein mit einer Nitrosogruppe, eingeschaltet. Die Konzentrationen des zu messenden NO bleiben aber sehr gering, so dass die Minimierung der Störeinflüsse der Methodik einen großen Teil der Arbeit einnimmt. Es konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass S-Nitrosoalbumin mittels des beschriebenen Verfahrens quantitativ bestimmbar ist. Eine Übertragung des Verfahrens auf Messungen im Blutplasma wird der Gegenstand weiterer Forschungen sein.
Die Dissertation wurde im Rahmen des von der Deutschen Forschungsgemeinschaft geförderten interdisziplinären Sonderforschungsbereiches 268 "Kultur- und Sprachentwicklung im Natrurraum Westafrikanische Savanne" angefertigt. Dabei war die Kartierung und Analyse von Landbedeckungs- und Landnutzungsveränderungen in einem Ausschnitt des nigerianischen Tschadbeckens Zielsetzung vorliegender Arbeit. Trotz eines recht großen allgemeinen Interesses am Tschadsee, dem größten See Westafrikas, fällt es schwer, topographische und thematische Information über diese Region zu erlangen. Viele Zusammenhänge bezüglich seiner Vergangenheit und seiner zukünftigen Entwicklung sind bis heute nicht geklärt. Soweit Daten zur Landbedeckung und Landnutzung bereits verfügbar waren, wurden sie aufbereitet und im Rahmen des regionalen geographischen Informationssystems FirGIS strukturiert gegliedert aufgenommen. Als hauptsächliche Datenquelle wurde jedoch auf Fernerkundungsdaten der Region zurückgegriffen. Sie liefern meist die einzige großflächig vorhandene, aktuelle und vor allem multitemporale Information über das Untersuchungsgebiet. Die Auswertung der Fernerkundungsdaten erfolgte mit Methoden der digitalen Bildverarbeitung. Aktuelle und historische Luftbilder wurden visuell interpretiert und anschließend vektoriell digitalisiert. Satellitenszenen wurden vorwiegend digital direkt im Rasterdatenmodell bearbeitet. Nach der Datenaufbereitung mit verschiedenen Techniken der Bildverarbeitung erfolgte die Auswertung mittels digitaler Klassifizierung. Weitere wichtige Bearbeitungsschritte bei der Ergebnisfindung waren unterschiedliche multitemporale Darstellungsweisen, die Berechnung von Vegetationsindizes sowie Verschneidungstechniken zur Aufdeckung von Veränderungen. Die Auswertung aller Daten erfolgte nach einem einheitlichen mehrstufigen Klassifizierungssystem, das für die Verhältnisse im Tschadbecken entwickelt wurde. Die aus den Fernerkundungsdaten abgeleiteten Ergebnisse gliedern sich nach vier verschiedenen Dimensionen der Zeit. Die Ausgangsbasis bildet eine digitale aktuelle Kartierung der Landbedeckung und Landnutzung eines mehr als 3500 km² großen Ausschnittes des nigerianischen Tschadbeckens im Maßstab 1 : 25 000. Aufbauend auf der aktuellen Landnutzungskartierung wurde für einen etwa 1100 km² großen zentralen Teilausschnitt aus dem Gesamtuntersuchungsgebiet das dynamische Verhalten der Landbedeckungs- und Landnutzungseinheiten im Jahresverlauf untersucht. Dazu konnten fünf SPOT-XS-Satellitenszenen der Vegetationsperiode 1995/96 herangezogen werden. Als Zusammenfassung aus den phänologischen Analysen aller im Untersuchungsgebiet auftretenden Objekte und ihrem entsprechenden unterschiedlichen Spektralverhalten zu verschiedenen Zeitpunkten wurde eine detaillierte Landbedeckungs- und Landnutzungskartierung der Saison 1995/96 angefertigt. Sie ging aus einer komplexen hierarchischen Satellitenbildklassifizierung mit differenzierten Zuweisungsregeln hervor. Mit den Erfahrungen aus der Untersuchung zur saisonalen Dynamik wurden in einem weiteren Schritt alle für das Teiluntersuchungsgebiet zur Verfügung stehenden Satellitenszenen ausgewertet, um Erkenntnisse über interannuelle Unterschiede der zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommenen Satellitenszenen zu gewinnen und deren Ursachen aufzudecken. Als ideale Grundlage wurden multitemporale Vegetationsindizes verglichen, Veränderungskarten abgeleitet und Niederschlagsdaten zur Interpretation hinzugezogen. Eine 24jährige Zeitreihe der klassifizierten Vegetationsindizes ermöglicht eine zusammenfassende Interpretation. Die Auswertung historischer Luftbilder von 1957 und der Vergleich mit den Luftbildern von 1990 ermöglichte schließlich die Beurteilung langfristiger Entwicklungen im engeren Untersuchungsgebiet. Die Ergebnisse sind in Form einer historischen Karte, als Veränderungskarten und quantitativ festgehalten. Ein wichtiges Ergebnis der vorliegenden Arbeit besteht in der Strukturierung aller verwendeten Grundlagendaten zum Thema Landbedeckung und Landnutzung im Tschadbecken einschließlich seiner Nachbargebiete innerhalb des regionalen geographischen Informationssystemes FirGIS. In ihm sind neben den Ausgangsdaten alle Ergebnisse und die zum Thema gehörigen Zusatzinformationen enthalten. Es ermöglicht damit eine zukünftige Fortschreibung durch thematische, räumliche oder zeitliche Ausdehnung. Das Geoinformationssystem FirGIS bietet außerdem die Möglichkeit, bereits vorhandene wie auch zukünftige Information anderen Interessenten vor allem auch vor Ort zur Verfügung zu stellen.
Dihydrocodein wird im wesentlichen zu Dihydrocodein-6-O-43-ß-glucuronid (DHC6G), Dihydromorphin (DHM), Dihydromorpbin-3-O-ß-D-glucuronid (DHM3G), Dihydromorphin-6-O-ß-D-glucuronid (DHM6G) und Nordihydrocodein (NDHC) biotransformiert. In Analogie zu Codein wird vermutet, dass die Metaboliten DHM und DHM6G pharmkologisch deutlich aktiver als die Muttersubstanz sind und somit zur Wirkung von DHC wesentlich beitragen können, auch wenn sie nur in geringen Mengen gebildet werden. Da die O-Demethylierung von Dihydrocodein zu Dihydromorphin durch das polymorphe Cytochrom P450-Enzym CYP2D6 katalysiert wird, sind in EM (schnelle Metabolisierer) und PM (langsame Metabolisierer, weisen kein funktionelles CYP2D6-Enzym auf) unterschiedliche Metabolitenprofile zu beobachten. In etwa 5-10% der Kaukasier, die PM für CYP2D6 sind, könnte sich somit ein Therapiemisserfolg nach Gabe von therapeutisch empfohlenen Standarddosen an DHC einstellen. Es war daher Ziel der vorliegenden Arbeit, die Bedeutung der Biotransformation für die Wirkung von Dihydrocodein beim Menschen zu untersuchen. Im Rahmen dieser Untersuchung wurden Affinitätsprofile an Hirnmembranpräparationen und Affinitäts- und Aktivitätsprofile an humanen Neuroblastomzellen für DHC und seine Metaboliten erstellt. Des weiteren wurden pharmakokinetische und pharmakodynamische Parameter (und deren Zusammenhang) von Dihydrocodein und seinen Metaboliten beim gesunden Menschen unter Berücksichtigung des CYP2D6-Phänotyps mit Hilfe einer Pilot-Probandenstudie bestimmt. Zuletzt wurden die Ergebnisse der Affinitäts- und Aktivitätsversuche mit den Ergebnissen der Probandenstudie unter Berücksichtigung der verfügbaren Literaturdaten in Zusammenhang gebracht. Di in vitro-Untersuchungen zeigten, dass alls Prüfsubstanzen mit Ausnahme des unwirksamen DHM3G vorwiegend u-selektive Agonisten waren und dass das prinzipielle Verhältnis der Affinitäten bzw. Aktivitäten der einzelnen aktiven Prüfsubstanzen zueinander in allen Untersuchungen annähernd gleich war. Auf Grundlage dieser Daten konnte folgender Grundsatz formuliert werden; Die Affinitäten/Aktivitäten von DHM und DHM6G waren etwa um den Faktor 100 größer als die von DHC, während die anderen Metaboliten (mit Ausnahme des unwirksamen DHM3G) vergleichbare Affinitäten/Aktivitäten besaßen. Die im Rahmen der Probandenstudie ermittelten pharmakokinetischen Werte bestätigten verfügbare Literaturdaten, insbesondere dass CYP2D6 wesentlich für die Bildung von DHM war. So konnten weder DHM, DHM3G noch DHM6G in Plasma und Urin von PM detektiert werden. Die pharmakodynamischep Untersuchungen mittels Pupillometrie zeigten einen signifikanten Unterschied im ursprünglichen Pupillendurchmesser an den Zeitpunkten 1 bis 6 Stunden zwischen Placebo einerseits und EM bzw. PM andererseits. Damit konnte zunächst eine eigene in vivo-Wirkung von DHC beim Menschen nachgewiesen werden. Jedoch ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen EM und PM. Im zweiten pharmakodynamischen Modell (Schmerzmodell) konnten bezüglich der Parameter R-III-Reflexschwelle und VAS-EC30 keine Unterschiede sowohl zwischen EM und PM als auch zwischen Placebo und EM bzw. PM festgestellt werden, so dass 60 mg DHC keine analgetische Wirkung hatte oder das Modell für die Ermittlung der analgetischen Potenz von 60 mg DHC ungeeignet war. Einschränkend muss jedoch hier erwähnt werden, dass die Studie aufgrund der kleinen Fallzahl nur Pilotcharakter aufwies. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit in Zusammenhang mit den verfügbaren Literaturdaten lassen die Schlussfolgerung zu, dass die pharmakologisch wesentlich aktiveren Metaboliten DHM und DHM6G nicht oder nur geringfügig zur Wirkung von DHC nach oraler Einzelgabe von 60 mg DHC beitragen. Gründe hierfür könnten die geringe Bildung von DHM und seinen Metaboliten (ca. 9%) und/oder durch Verteilung und Ausscheidung bedingte niedrige Konzentrationen am Rezeptor in vivo sein. Somit scheint die Biotransformation keine Bedeutung für die Wirkung von DHC zu haben. Entsprechend sind keine Unterschiede in der Therapie von EM und PM mit niedrigen therapierelevanten DHC-Dosen zu erwarten.
Mikroentladungen bei hohem Druck und mit Gasfluss stellen eine vielseitig nutzbare Quelle für Ionen und kalte metastabile Atome dar. In dieser Arbeit werden grundlegende Untersuchungen an dieser neuen Hochdruckentladung zur Erzeugung von metastabilen Atomen und einfachgeladenen Ionen vorgestellt. Der innovative Ansatz ist die Nutzung mikrostrukturierter Elektroden (MSE) zur Erzeugung von nichtthermischen Entladungen mit Gleichspannung. Die spezielle porenförmige Geometrie erlaubt die Erzeugung von Entladungen bei einem Druck > 1000 hPa. Die Mikroentladung produziert metastabile Atome und Ionen in einem lokalisierten Volumen durch Stöße mit energiereichen Elektronen, wobei das Neutralgas in der Entladung im Vergleich zu den Elektronen kalt ist. Außerdem kann die Entladung mit erzwungenem Gasfluss durch die Pore betrieben werden, so dass die Plasmabestandteile (neutrale/angeregte Atome, Radikale, Ionen, etc.) extrahiert werden. Mit dieser neuen Methode kann bei der adiabatischen Expansion des Gases ins Vakuum ein gerichteter Gasstrahl, mit geringer interner Temperatur, im Bereich von einigen K erzeugt werden. Die Verweildauer des Gases in der Mikropore ist < 0,1 µs, so dass auch Zustände mit kurzer Lebensdauer extrahiert werden können. Die MSE lässt sich aufgrund der kleinen Abstände im µm Bereich als Mehrschichtsystem, aus zwei metallischen Elektroden, die durch einen Isolator getrennt sind, realisieren. Dieses Grundmaterial wird mit einzelnen oder einer Vielzahl von Poren mit typischerweise 100 µm Durchmesser versehen. Mit Hilfe dieser Mikrostrukturen lassen sich stabile, nicht filamentre, homogene Entladungen mit Gleichspannung in allen Gasen als auch Gasgemischen in einem weiten Druckbereich von 600 hPa bis 4000 hPa erzeugen. Die Druckverhältnisse in der Pore lassen sich durch den Gasfluss zwischen einigen ml/min bis l/min variieren. Die Verweildauer des Gases in der Pore kann durch den Gasfluss gesteuert werden. Zur Diagnose werden die Bestandteile des Plasmas mit dem Gasstrom extrahiert und expandieren adiabatisch ins Vakuum. Der Einfluss von Vordruck, Gasfluss, Entladestrom und Gaszusammensetzung auf die Eigenschaften des Plasma-Jets konnte auf diese Weise bestimmt werden. Durch die Kühlung der Mikroentladung konnte die interne Temperatur des Targets nochmals gesenkt und die Geschwindigkeit gezielt reduziert werden. Die Messung des Geschwindigkeitsprofils, die Zusammensetzung, etc. geben einen indirekten Einblick in die komplexen Prozesse der Mikroentladung, die mit konventionellen Analysemethoden nur schwer zugnglich sind. Die gemessenen Eigenschaften der MSE- unterstützten Hochdruckentladung sind vergleichbar mit klassischen Glimmentladungen, jedoch ist die Anregungs- und Ionisationswahrscheinlichkeit aufgrund der Geometrie größer. Unter definierten Rahmenbedingungen erlaubt diese neue Technik die Erzeugung eines gerichteten Plasma-Jets bestehend aus kalten metastabilen Atomen, Ionen, etc. Basierend auf diesem Prinzip wurde eine Quelle für metastabile Heliumatome aufgebaut und mit verschiedenen Methoden analysiert. Der 23S1- Zustand wird aufgrund seiner atomaren Struktur effektiv durch die energiereichen Elektronen in der Entladung angeregt. Die Gasströmung bestimmt den Druck und die Verweildauer im aktiven Volumen. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass mit diesem Aufbau kalte, metastabile Atomstrahlen mit einer Intensität von 6 mal 10 hoch 13 (s mal sr) hoch minus 1 und Geschwindigkeiten von 900-1800 m/s erzeugt werden können. Bei den gemessenen Dichten in der Pore von 6 mal 10 hoch 12 (cm) hoch minus 3 ist die Ausbeute durch das Quenching der metastabilen Atome beschränkt. Die Eigenschaften dieses exotischen Atomstrahls sind hinsichtlich der absoluten Geschwindigkeit und der Geschwindigkeitsverteilung identisch mit einem konventionellen Überschall-Gasstrahl. Die Qualität des Strahls, aufgrund seiner geringen internen Temperatur von einigen K, erlaubt die Trennung und Fokussierung des gewünschten Zustandes. In Kombination mit der Separationseinheit wurde die Mikroplasmaquelle zur Erzeugung eines metastabilen 2 3 S 1-Heliumtargets mit polarisiertem Elektronenspin verwendet. Bei der Separation wird durch den außermittigen Einschuss in den permanentmagnetischen Hexapol eine hervorragende räumliche Trennung der verschiedenen Zustände erreicht und die Ausdehnung des Targets im Fokus auf 1 mm hoch 2 reduziert. Die erreichte Targetdichte für den spinpolarisierten 2 3 S 1-Zustand liegt im Fokus bei 10 hoch 6 cm hoch -2. Die Charakterisierung des Strahlverlaufs als auch die Time-of-Flight-Messungen zeigen, dass es sich bei der MSE unterstützten Hochdruckentladung um eine nichtthermische Entladung mit vergleichbaren Eigenschaften wie Niederdruckglimmentladung handelt, d.h. neutrale/angeregte Atome und Elektronen sind nicht im Temperaturgleichgewicht. Die Gastemperatur wird somit in der Mikroentladung nicht erhöht. Die Messungen mit Düsentemperatur von 80 K haben dies ausnahmslos bestätigt. Mit dieser Quelle lassen sich auch feine Ionenstrahlen bei hohem Druck erzeugen. Bei erzwungener Gasströmung durch die Entladung werden die Ionen aus dem Bereich der Entladung extrahiert und können zur Diagnose der Hochdruckentladung ins Vakuum überführt werden. Die Ionenausbeute wurde für verschiedene Gase und Gasgemische in Abhängigkeit von Gasfluss, Entladestrom, Extraktionsspannung untersucht. Die Elektronenenergie reicht ausschließlich zur Produktion von einfachgeladenen Ionen bzw. Molekülen aus. Der Anteil an Metallionen zeigt deutlich, dass die Geometrie die Erzeugung von Sekundärelektronen an der Kathode unterstützt. Die Wechselwirkung der Ionen mit dem Überschall-Gasstrahl im Bereich zwischen Düse und Skimmer führt zu einer starken Energieverbreiterung. Dies kann jedoch durch eine modifizierte Extraktionsgeometrie reduziert werden, hierbei ist insbesondere auf die Raumladung im Bereich zwischen Düse und Skimmer zu achten. Die vorgestellten Messungen haben exemplarisch für Helium gezeigt, dass gerichtete, kalte, metastabile Atomstrahlen mit ausreichender Intensität für atomphysikalische Experimente erzeugt werden können. Auf Basis der grundlegenden Erkenntnisse lässt sich das spinpolarisierte Target im nächsten Schritt hinsichtlich der erreichten Ausbeute optimieren. Dazu ist es notwendig, die Bedingungen in der Expansionskammer zu verbessern, so dass die Plasmaquelle mit höherem Vordruck betrieben werden kann. In diesem Zusammenhang sollte auch der Abstand Düse Skimmer verringert und die Separationseinheit auf diese modifizierten Rahmenbedingungen angepasst werden. Durch diese Modifikation kann die Targetdichte für spinpolarisiertes, metastabiles Helium nochmals gesteigert werden. Mit der erreichten Targetdichte sind die grundlegenden Voraussetzungen für atomphysikalische Messungen an einem spinpolarisierten Target geschaffen. Durch Anpassung der Separationseinheit ist es prinzipiell auch möglich, andere exotische metastabile Targets mit polarisiertem Elektronenspin zu erzeugen.
Okamoto (Crypto 1992) hat die RSA-Repräsentation als Basis eines gegen aktive Angreifer sicheren Identifikationsschemas eingeführt. Eine RSA- Repräsentation von X E Z * N ist ein Paar (x; r) E Z e x Z * N mit X = g x r e (mod N) für vorgegebenes g E ZN , RSA-Modul N und primen RSA- Exponenten e. Das zugehörige Repräsentationsproblem, also das Auffinden eines Wertes X samt zweier verschiedener Darstellungen, ist äquivalent zum RSA-Problem, der Berechnung einer e-ten Wurzel von g modulo N . Von Brassard, Chaum und Crépeau (Journal Computing System Science, 1988) sowie Damgard (Journal of Cryptology, 1995) stammt eine analoge Konstruktion der Form X = g x r 2 t (mod N) mit x E Z 2 t für den Spezialfall der Blum-Zahlen als Modul N und gegebenes t größer gleich 1, wo die Möglichkeit, zwei verschiedene Repräsentationen zu berechnen, gleichbedeutend zur Zerlegung des Moduls in die Primfaktoren ist. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit verallgemeinern wir dieses Konzept systematisch auf beliebige (RSA-)Module durch die Einführung eines Anpassungsparameters r:= r (N ), so dass X = g x r 2 r t (mod N) mit x E Z 2 t. Basierend auf dieser als Faktorisierungsrepräsentation bezeichneten Darstellung leiten wir Identifikations-, Signatur- und Blinde-Unterschriften-Verfahren her. Im zweiten Teil verwenden wir sowohl RSA- als auch Faktorisierungsrepräsentation als Grundlage sogenannter non-malleable Commitment-Schemata zur Hinterlegung (Verbriefung) einer geheimen Nachricht. Bei dem von Dolev, Dwork und Naor (SIAM Journal on Computing, 2000) eingeführten Begriff der Non-Malleability soll ein Angreifer außer Stande sein, die Hinterlegung einer Nachricht m so abzuändern, dass er diese später dann mit einem in Relation zu m stehenden Wert, man denke zum Beispiel an m 1, aufdecken kann. Von Dolev, Dwork und Naor stammt ein allgemeiner Ansatz zur Konstruktion von non-malleable Commitment-Schemata aufbauend auf einem sogenannten Knowledge-Extraktor. Für die RSA-Darstellung verfügt das von Okamoto entworfene Protokoll als Proof-Of-Knowledge über einen solchen Extraktor, bei dem im Fall der Faktorisierungsrepräsentation von uns entwickelten Verfahren fehlt allerdings der Extraktor. Aus diesem Grund stellen wir mit Hilfe des Chinesischen Restsatzes ein neues, auf Commitments zugeschnittenes Protokoll mit Knowledge-Extraktor vor, das in Verbindung mit der Faktorisierungsrepräsentation ein effizientes Hinterlegungsschema ergibt. Zum Abschluß wird bei einem Commitment- Verfahren mit abgeschwächter Non-Malleability-Eigenschaft von Di Crescenzo, Katz, Ostrovsky und Smith (Eurocrypt 2001) die RSA- durch die Faktorisierungsrepräsentation ersetzt und das Schema vereinfacht.
Diese Zusammenfassung ist in zwei Abschnitte gegliedert. Im Abschnitt 6.1. wird die physiologische Bedeutung der Glutamatrezeptoren (GluR) und ihr biologischer Hintergrund kurz erklärt. Am Ende dieses Abschnitts wird der Stand der Strukturanalyse des GluR-B Ionenkanals zu Beginn des Projektes zusammengefasst. Im nachfolgenden Abschnitt 6.2. sind die wesentlichen Ergebnisse der hier vorgelegten Arbeit zusammengefasst. 6.1. Die Bedeutung von Glutamatrezeptoren - Stand der Strukturanalyse zum Beginn dieser Arbeit Die Kommunikation zwischen Nervenzellen erfolgt vorwiegend an hochspezialisierten Kontaktstellen den chemischen Synapsen. Der enge Raum zwischen sendender und empfangender Nervenzelle wird auch als synaptischer Spalt bezeichnet. Der Prozess der synaptischen Übertragung beruht auf der präsynaptischen Freisetzung von chemischen Botenstoffen, sogenannten Neurotransmittern in den synaptischen Spalt. Die Aminosäure L- Glutamat (Glu) ist der wichtigste erregende Neurotransmitter im menschlichen Gehirn und Rückenmark. Dementsprechend bedeutend ist die Rolle der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs), die sie bei der elektrochemischen Erregungsübertragung am synaptischen Spalt spielen (Seeburg, 1993), (Hollmann and Heinemann, 1994), (Dingledine et al., 1999). Die Freisetzung von Neurotransmittern wird durch ein elektrisches Signal (Aktionspotential) ausgelöst, das sich entlang der Nervenfaser, dem Axon, bis zur Nervenendigung, der Synapse, fortpflanzt. Nach der Freisetzung diffundieren die Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und binden an sogenannte Rezeptoren. Ionotrope Glutamatrezeptoren sind Ionenkanäle, die in die Membran der nachgeschalteten (postsynaptischen) Nervenzelle eingebaut sind. Sie zählen deshalb zu den Membranproteinen. Als ligandgesteuerte kationenselektive Ionenkanäle machen Glutamatrezeptoren (GluRs) die postsynaptische Membran nach Aktivierung durch Ligandbindung für bestimmte Kationen durchlässig. Der Einstrom von Ionen bewirkt eine Änderung des Membranpotentials. Die Stärke der synaptischen Übertragung ist lebenslang modulierbar; die sogennante synaptische Plastizität wird als eine entscheidende Grundlage für die Erklärung von Lernen und Gedächtnis angesehen. Drei synthetische Agonisten aktivieren die GluRs selektiv und wurden deshalb für die Klassifizierung der ionotropen Glutamatrezeptoren herangezogen. Bei den Agonisten handelt es sich um -Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-4-propionat (AMPA), Kainat and N- Methyl-D-Aspartat (NMDA). Die ersten beiden Subtypen werden auch als non-NMDA- Rezeptoren zusammengefasst. Die Aktivierung und Desensitivierung der non-NMDA Rezeptoren ist schneller als die der NMDA-Rezeptoren. Aus molekularbiologischer Sicht (siehe Kapitel 1.3.2.) zeigen die drei Klassen der ionotropen Glutamatrezeptoren eine beträchliche Diversität. So gibt es vier verschiedene Unterheiten vom AMPA-Subtyp, nämlich GluR-A, GluR-B, GluR-C und GluR-B. In dieser Arbeit steht die Strukturanalyse eines aus GluR-B Untereinheiten bestehenden AMPA-Rezeptors im Vordergrund. (Die weitere Unterteilung der NMDA- und Kainatrezeptoren kann dem Kapitel 1.3.2. auf Seite 6 entnommen werden.) Bestimmte Abschnitte der Aminosäurensequenz von Glutamatrezeptoren sind durch hydrophobe Bereiche gekennzeichnet ((M1-M4) in Abbildung 6.1.A (A.)). Das durch verschiedene Untersuchungen etablierte Modell der Glutamatrezeptor-Topologie zeigt 3 Transmembrandomänen (M1, M3 und M4) und eine Membranschleife (M2) (Hollmann et al., 1994), (Kuner et al., 1996). Der Aminoterminus ist extrazellulär, der Carboxyterminus hingegen intrazellulär. Daraus ergibt sich die in Abbildung 6.1.A (B.) abgebildete Topologie (Paas, 1998). S1 und S2 kennzeichnen die Ligandbindungsdomäne. Glutamatrezeptoren (GluR) sind Oligomere, die sich mit grosser Wahrscheinlichkeit aus vier Untereinheiten (Rosenmund et al., 1998), (Ayalon and Stern-Bach, 2001) zusammensetzen (siehe Kapitel 1.3.3.). Die Zusammenlagerung verschiedener Untereinheiten zu einem funktionellen Kanal setzt voraus, dass die Untereinheiten zum gleichen Subtyp gehören, d.h. AMPA Untereinheiten können nur mit anderen AMPA Untereinheiten einen Ionenkanal bilden. Das gleiche gilt für die Zusammensetzung von NMDA und Kainat-Rezeptoren. Das Modell eines tetrameren Glutamatrezeptors ist im Bild C. der Abbildung 6.1.A zu sehen. Die Bestimmung der Quartärstruktur eines vollständigen Glutamatrezeptors ist bislang nicht veröffentlicht. Die strukturelle Analyse von Proteinen erfordert die Isolierung von reinem und funktionellem Protein. Im Vergleich zu den meisten löslichen Proteinen erfordert die Isolierung von Membranproteinen oft besonderer Optimierung. Falls das Vorkommen des Proteins in natürlichem Gewebe gering ist, so kann die strukturelle Analyse durch rekombinante Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus zugänglich gemacht werden. Die Isolierung von Milligramm-Mengen eines rekombinanten homomeren GluR-B Rezeptors aus dem entsprechenden Baculovirusexpressionssystem (Keinänen et al., 1994) wurde in unserem Labor etabliert (Safferling et al., 2001) und wurde im ersten Jahr dieses Projektes fortgeführt. Durch zonale Ultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass die molekulare Masse des GluR-B Proteinkomplexes ca. 495 kD beträgt. Dieser Wert liegt in der Nähe des theoretischen Molekulargewichts eines tetrameren Ionenkanals, dessen Molmasse sich aus vier GluR-B Untereinheiten (104 kD) und einer Detergenzmizelle von ca. 63-97 kD zusammensetzt (Safferling et al., 2001). Die elektronenmikroskopische Analyse des Proteinkomplexes von W. Tichelaar aus unserer Gruppe erfolgte 1999 durch Negativfärbung. Für die Strukturanalyse mit Hilfe der Software IMAGIC wurden 10 000 Proteinteilchen selektiert. Das Ergebnis der Bildrekonstruktion ist in der folgenden Abbildung 6.1.B gezeigt. Die projezierten Dimensionen des Models entsprechen einem Molekül mit den Dimensionen 17 nm × 11 nm × 14 nm. Das Model zeigt keine ausgezeichnete Symmetrie, die auf die Stöchiometrie des GluR hinweisen könnte. Das Molekül zeigt mit Färbemittel gefüllte Vertiefungen und innere Strukturen, die vielleicht an der Ionenleitung beteiligt sind. 6.2. Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des GluR-B Ionenkanals In der Fortsetzung des oben beschriebenen Projektes wurden für die rekombinante Expression desselben Rezeptors (GluR-B homomer) stabil transformierte Insektenzellen eingesetzt. Dazu wurde die für die GluR-B Untereinheit kodierende und in Plasmiden enthaltene DNA in Insektenzellen transformiert (siehe APPENDIX A.2.2.). Im Vergleich zu dieser auf Dauerhaftigkeit angelegten Integration der Rezeptor DNA wird die Proteinexpression beim Baculovirusexpressionssystem durch Infektion mit rekombinanten Baculoviren initiiert. Der Vergleich zeigte, dass die mit Baculoviren erzielten Ausbeuten bei GluR-B etwa doppelt so hoch waren als bei stabil transformierten Zellen. Allerdings fallen bei stabil transformierten Zellen die eventuellen Nachteile der viralen Belastung auf die zellulären Sekretionsprozesse weg. Im Verlauf der elektronenmikroskopischen Analyse von baculoviral erzeugtem GluR-B Protein hat sich gezeigt, dass Proteine viralen Ursprungs unter Umständen selbst doppelt aufgereinigte GluR-B Proben verunreinigen können (siehe APPENDIX A.2.1.). Dieser Punkt ist bei einer Einzelbildverarbeitung von grosser Relevanz, falls die virusspezifischen Proteinverunreinigungen eine ähnliche Grösse haben wie das eigentliche Zielprotein. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, das Potenzial stabil transformierter Insektenzellen für die Expression von homomeren GluR-B Ionenkanälen zu bewerten und dabei die Stöchiometrie der Untereinheiten in diesem Ionenkanal aufzuklären. Zu diesem Zweck wurden biochemische und elektronenmikrosopische Techniken eingesetzt. Zur Isolierung des GluR-B Ionenkanals aus stabil transformierten Insektenzellen wurde das bestehende Aufreinigungsprotokoll für die Affinitätchromatographie an immobilisierten Metallionen (IMAC) (Safferling et al., 2001) optimiert, indem das Chargenverfahren durch das Durchflussverfahren ersetzt wurde (zur genaueren Erklärung der Optimierung siehe RESULTS 4.1.2.). Abbildung 6.C zeigt ein silbergefärbtes Gel mit den Eluaten der IMAC und Eluaten der abschliessenden Affinitätschromatographie mit immobilisiertem M1-Antikörper. Die auf den Bahnen 5-8 aufgetragen GluR-B Proben wurden auch für die Einzelteilchenanalyse mittels Elektronenmikroskopie verwendet. Die Ligandbindungsaktivität von GluR-B wurde durch Filterbindungsexperimente mit dem Radioliganden [3H]-AMPA vor und nach der Isolierung aus den Membranfragmenten bestimmt. Die KD-Werte sind für beide Proben ähnlich gross. Der Bmax-Werte ist für die aufgereinigte Probe wie erwartet sehr viel (mehr als 200×) höher. Die Ergebnisse der Ligandbindungsexperimente sind im Kapitel 4.2.1 tabellarisch zusammengefasst. Die oligomere Struktur des isolierten Ionenkanals wurde durch Quervernetzungsexperimente (Cross-linking) und Einzelteilchenanalyse von negativ gefärbten Proteinmolekülen bewertet. Die Quervernetzungsexerimente selbst erbrachten kein eindeutiges Ergebnis im Hinblick auf oligomere Struktur des komplett zusammengesetzten Rezeptors. Kontrollexperimente mit dem Lysat vom Rattenhippocampus zeigten, dass mit DTSSP ein geeigneter Cross-Linker verwendet wurde (siehe RESULTS 4.3.2.). Neben einem aus 4 Banden bestehenden Muster (siehe RESULTS 4.3.1.) lieferten die Quervernetzungsexperimente mit isoliertem GluR-B aber einen deutlichen Hinweis auf die Stabilität von dimeren GluR-B Strukturen, die im Einklang mit einer jüngst veröffentlichten Arbeit stehen (Ayalon and Stern-Bach, 2001). Diese Veröffentlichung liefert zusätzliche (Armstrong et al., 1998) Hinweise auf die Bedeutung von Dimeren in der Glutamatrezeptorstruktur und postuliert, dass sich ein kompletter Glutamaterezeptor aus einem Dimer-Paar zusmmensetzt, wobei die Dimere zuerst gebildet werden. Die nachfolgende Abbildung 6.2.B zeigt negativ gefärbte GluR-B Ionenkanäle bei einer 46000× Vergrösserung. Die Aufnahme stammt von einem Philips EM 400 Elektronenmikroskop. Für die 3D Rekonstruktion wurden 500 der in Abbildung 6.2.B gezeigten Rezeptormoleküle ausgewählt. Dieser relativ kleine Datensatz besteht aus GluR-B Ionenkanälen deren Präservierung in Uranylacetat als besonderes vielversprechend eingeschätzt wurde. Dieser positive Effekt wurde auf die Verwendung frisch von einer Wasseroberfläche aufgefischter Kohlefilme zurückgeführt (siehe RESULTS 4.4.3.3.). Während der Klassifizierung dieses Datensatzes fiel auf, dass die beim Band-Pass-Filtern für die niedrigen Frequenzen gesetzten Cut-offs einen deutlichen Einfluss auf die erste Klassifizierung der unterschiedlichen zweidimensionalen Ansichten des Proteinkomplexes haben (siehe RESULTS 4.4.3.4.). Aus diesem Grund wurde der gleiche Datensatz mit 5 verschiedenen low-frequency cut-offs (LFCO) gefiltert (siehe Table 4.4.3.4.) und getrennt klassifiziert. Von den 5 resultierenden Klassifikationen wurden 3 (LFCO 0,005, 0,03 und 0,05) für die weiterführende 3D Rekonstruktion ausgewählt. Die Evaluierung der resultiernden 3D Modelle ergab, dass der mit einem LFCO von 0,03 gefilterte Datensatz eine Klassifikationen erlaubte, die zu einem 3D Modell (Modell GluR-BII/a siehe RESULTS Figure 4.4.3.4.H) führte, das im Vergleich zu den beiden anderen Rekonstruktionen konsistenter war. Am stärksten spricht für dieses Modell die Übereinstimmung der Input-Projektionen mit den Reprojektionen der 3D Rekonstruktion (siehe siehe RESULTS Figure 4.4.3.4.H). Zur Verfeinerung des Modells GluR-BII/a wurden die beiden Projektionen mit der höchsten Standardabweichung vom Klassendurchschnitt (class average) eliminiert. Die verbleibenden 11 Projektionen bildeten die Input-Projektionen für die Berechung eines verfeinerten Modells, GluR-BII/b, das auf einer neuen Zuordnung der Euler-Winkel beruht. Das Ergebnis dieser Berechung ist in der nachfolgenden Abbildung gezeigt. Das Modell in Abbildung 6.2.C zeigt einen zentralen Kanal und hat die Dimensionen 18 nm × 14 nm × 11 nm. Die Stöchiometrie der Untereinheiten ist aus dem Modell, das mit grosser Wahrscheinlichkeit einen komplett zusammengesetzten GluR darstellt, nicht ablesbar. Ebensowenig zeigt das Modell eine eindeutig vierzählige oder fünfzählige Symmetrie. Allerdings ist die erkennbare zweizählige Symmetrie im Einklang mit dem vorgeschlagenen Pair-of-Dimer Modell (Ayalon and Stern-Bach, 2001), das auf eine teramere Struktur des oligomeren Ionenkanals schliessen lässt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass stabil transifzierte Insektenzellen eine durchaus geeignete Quelle für GluR-B Ionenkanäle sind. Nachteilig sind die geringen Ausbeuten. Allerdings kann durch weitere Selektion der Zellen die GluR Expression noch gesteigert werden (siehe APPENDIX A.2.2.). Bei höheren GluR-B Ausbeuten könnte zukünftig auch die Detektion des Rezeptors in vitrifizierten Proben in Verbindung mit Kryo-Elektronen- mikroskopie und auch die 2D-Kristallisation gelingen. Die während dieses Projekts gemachten Kristallisationsexperimente (siehe APPENDIX A.3.) und Kryo-Experimente mit GluR-B Protein aus dem Baculovirusexpressionssystem (siehe RESULTS 4.4.1. und 4.4.2.) ergaben negative Ergebnisse. Das Potential der Kryo-Methode konnte allerdings in Kontrollexperimenten mit Tabak-Mosaik-Virus (TMV) gezeigt werden. Kryo-Daten von GluR-B würden die Berechnung eines genaueren Strukurmodells erlauben. Die Reprojektionen des hier besprochenen Strukturmodells GluR-BII/b aus der Abbildung 6.2.C könnten als Referenzen für das Alignment der vitrifizierten GluR Ionenkanäle dienen. Für das langfristige Ziel der Rekonstituition des Rezeptors in Liposomen sollte die Delipidierung des Membranproteins während der Aufreinigung möglichst reduziert werden. Hier erscheinen zwei Ansätze sinnvoll. Die Aufreinigung des Proteins in einem Schritt durch die Erweiterung des tags am Carboxyterminus von nur 6 auf 10 Histidin-Reste. Ausserdem gibt es Hinweise, dass die Anwesenheit von Lipiden während der Aufreinigung für seine Rekonstituierbarkeit förderlich ist (Huganir and Racker, 1982).
Seit langem gibt es ein großes Interesse daran, den zeitlichen Ablauf von chemischen Reaktionen zu untersuchen. Ein wichtiges Instrument hierfür ist die Kurzzeitspektroskopie, die in jüngerer Vergangenheit parallel zum rasanten technischen Fortschritt mit immer kürzeren Laserpulsen bis hinein in den Femtosekunden-Bereich einen neuen Boom erlebt hat. Durch die extrem hohe Zeitauflösung ist es heutzutage möglich geworden, die Reaktionsdynamik eines Moleküls quasi in Echtzeit zu verfolgen, weil man durch die Femtosekunden-Pulse die Bewegung der Atomkerne wie mit einer schnellen Kamera beobachten kann. Mit wachsender Anzahl der Experimente gibt es gleichzeitig einen steigenden Bedarf, die Vielzahl der gemessenen und in vielen Aspekten noch unverstandenen Signale auf mikroskopischer Ebene theoretisch zu beschreiben und zu erklären. Besonders interessant dabei ist, dass dies u.a. für komplexe Systeme möglich wird, weil auf den extrem kurzen Zeitskalen auch in sehr großen Molekülen nur einige wenige Freiheitsgrade eine Rolle spielen. Thema dieser Arbeit war die überwiegend klassische Modellierung von nicht-adiabatischer Kurzzeitdynamik in molekularen Quantensystemen, deren Beschreibung über die Born-Oppenheimer-Näherung hinausgeht. Dabei wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit neue Methoden und Rechenverfahren entwickelt, die einerseits eine verbesserte. physikalisch intuitive Anschauung vermitteln und andererseits aufgrund geeigneter Näherungen deutlich Rechenzeit einsparen und dadurch den Zugang zu Modellen größerer Moleküle ermöglichen können. Zunächst wurde die Simulation von zeitaufgelösten Pump-Probe-Spektren mit Hilfe der Franck-Condon-Approximation durchgeführt, bei der die nukleare. Dynamik während des Laserpulses vernachlässigt wird. Diese bekannte Näherung konnte im Rahmen der Arbeit erstmals auf nichtadiabatisch gekoppelte Potentialflächen angewandt werden. Anschließend wurde für das interessierende Quantensystem mit Hilfe des Mapping-Formalismus ein klassisches Analogon eingeführt und dessen Dynamik eingehend studiert. Dies ist deshalb bemerkenswert, weil dadurch erstmals eine Anwendung von klassischen Methoden aus dem Bereich der nichtlinearen Dvnamik auf nichtadiabatische Quantensvsteme möglich wurde. Schließlich konnten klassische periodische Bahnen des Systems identifiziert werden. Dabei handelte es sich im hier betrachteten Fall nichtadiabatisch gekoppelter Potentiale um eine völlig neue Art von vibronischen periodischen Orbits, die sowohl aus einem nuklearen als auch einem elektronischen Freiheitsgrad bestehen. Dadurch konnte in einem nächsten Schritt mit Hilfe einiger weniger Orbits die Kurzzeitdynamik des Systems modelliert werden. Den Schlusspunkt dieser Untersuchungen bildete die klassische Simulation von zeitaufgelösten Pump-Probe-Spektren. Nachdem diese neue Methode mit periodischen Orbits an einem einfachen, stark idealisierten Modell erfolgreich getestet werden konnte, stellte sich jedoch schnell heraus, dass es in mehrdimensionalen Modellen mit einer Torsionsmode zur Beschreibung von Photoisomerisierungs-Prozessen nicht mehr so leicht möglich ist, solche einfachen periodischen Bahnen zu finden, weil die Zeitskalen von nuklearer und elektronischer Bewegung in diesen Systemen sehr unterschiedlich sind. Es ist deshalb in diesem Fall sinnvoll, das Konzept periodischer Orbits dahingehend zu erweitern, die klassische Dynamik in unterschiedliche allgemeine Bewegungstypen einzuteilen, die dann zur Interpretation von quantenmechanischen Ergebnissen herangezogen werden können. Dies stellt eine neue Möglichkeit dar, die komplizierte Wellenpaketdynamik auf physikalisch intuitive Weise zu veranschaulichen. Zusammenfassend kann man sagen, dass diese Arbeit Beiträge für das Verständnis nichtadiabatischer Quantendynamik liefert: Zum einen werden Fragestellungen von prinzipiellem Interesse diskutiert, wie z.B. der klassische Limes von Quantensystemen insbesondere bei chaotischem Verhalten, zum anderen werden durch die Anwendung von Analyseverfahren der klassischen nichtlinearen Dynamik auf vibronisch gekoppelte Molekülmodelle neue Gebiete erschlossen, die ein verbessertes theoretisches Verständnis experimenteller Ergebnisse im Bereich der Kurzzeitspektroskopie ermöglichen.
Flußlandschaften galten lange Zeit als nur bedingt besiedelbar aufgrund unkalkulierbarer Hochwasser- und Gesundheitsgefahren. Überdies stellten sie Hemmnisse für Verkehr und Kommunikation dar. Es waren vornehmlich ingenieurtechnische Errungenschaften, die den Nutzwert der Flußlandschaften erschlossen (Hey 1997). Durch Hochwasserschutzkonzepte, Wasserkraftwerke und Flußregulierungen wurden u.a. eine geregelte Trinkwasserversor- gung gewährleistet, die Schiffbarkeit verbessert sowie die landwirtschaftliche und gewerbliche Nutzung der fruchtbaren und flachen Auenbereiche ermöglicht. Das fluviale System und dessen nutzbare Ressourcen stehen weiterhin unter einem steigenden ökonomischen Druck. Zusätzlich wird der erwartete Klimawandel der nächsten Jahrzehnte die Stoffflüsse der fluvialen Systeme einerseits direkt und andererseits, mittels veränderter Landnutzungsmuster, indirekt verändern. Die Beispiele aus der jüngeren Erdgeschichte belegen, wie empfindlich fluviale Systeme auf Änderungen der externen Steuergrößen reagieren (s. Kap. 2.2., 2.3.). Die ingenieurtechnischen Planungen berücksichtigen i.d.R. zeitliche Größenskalen von ±100 Jahren, jedoch werden die erwarteten Änderungen der Klimaelemente das Ausmaß der Klimafluktuationen der letzten beiden Jahrhunderte übertreffen (z.B. Houghton et al. 2001). Zudem sind die Reaktionen des fluvialen Systems auf Änderungen externer Steuergrößen als physiographisch spezifisch, nicht- deterministisch und nicht-linear einzustufen, was sich in der räumlich und zeitlich veränderten Reaktion fluvialer Stofftransporthaushalte widerspiegelt (Kap. 2.2.). Zum einen erschwert das die technische Planbarkeit der nutzbaren Ressourcen des fluvialen Systems, zum anderen wächst mit der intensiveren Nutzung das wirtschaftliche Gefähr- dungspotential durch natürliche oder quasi-natürliche fluvialmorphologische Prozesse. Der wohlüberlegte Umgang mit den Ressourcen des fluvialen Systems hängt somit zu einem gewissen Grad von der kurz- bis mittelfristigen Vorhersagbarkeit der Sensibilität ab, die dessen funktionale und räumliche Komponenten gegenüber externen Impulsen aufweisen. Beispiele für variable Reaktionen lassen sich aus der Untersuchung des fluvialen Wandels in der Vergangenheit gewinnen. So zeigen die Ergebnisse der fluvialmorphologischen Forschung in der Hessischen Senke eine räumlich und zeitlich differenzierte Veränderlichkeit der fluvialen Reaktion gegenüber Klimaänderungen. In der Fluvialmorphologie haben sich in jüngerer Zeit Forschungsansätze etabliert, die komplexe und räumlich disparate Rückkopplungsmechanismen zwischen Prozeß und Form in den Mittelpunkt der fluvialen Entwicklung rücken (z.B. Schumm 1977, Philipps 1992b, Lane
Ausgangspunkt dieser Doktorarbeit ist die dominant erbliche hypertrophische Kardiomyopathie, eine Herzkrankheit, die mit Funktionseinschränkungen des Myokards und einem relativ hohen Risiko für einen plötzliche Herztod assoziiert ist. Als Ursachen wurden ca. 160 Mutationen in bisher zehn verschiedenen Genen nachgewiesen, die - mit einer möglichen Ausnahme - für Proteine des kardialen Sarkomers kodieren. Am häufigsten betroffen sind das ventrikelspezifische -Myosin (schwere Kette) sowie das kardiale Myosin-Bindungsprotein C. Ein in Bad Nauheim initiiertes Projekt hat zum Ziel, die Wirkungen einer Mikrodeletion im - Myosingen (Deletion des Codons 927, E927) auf die Struktur und Arbeitsweise des Herzens in transgenen Mäusen zu untersuchen. Es ist bei diesem Projekt beabsichtigt, die Expression des mutierten Myosin-Transgens so zu steuern, dass es nicht unkontrolliert dauernd (konstitutiv), sondern zeitlich kontrolliert (induzierbar) im Herzen exprimiert wird. Als Induktionssystem der Wahl ist dabei das bakterielle Tetrazyklinrepressor-System vorgesehen. Dieses besteht aus dem Repressor tetR, einer DNA- Repressor-Bindungssequenz tetO und einem von außen zugeführten Induktor (Tetrazyklin, tet, oder Doxyzyklin, DOX, einem tet-Derivat). Da dieses Regulationssystem vor dem aufwändigen Einsatz an transgenen Mäusen zunächst in vitro an Zellkulturen zu testen war, wurden für die transiente Transfektion von Zellen in Kultur zwei Plasmide (mit jeweils zwei verschiedenen Promotoren, also insgesamt vier Plasmide) hergestellt. Ein Plasmid enthielt den Repressor und das zweite die tetO-Sequenz mit einem nachgeschalteten Reportergen (lacZ für -Galactosidase). Die beiden Promotoren waren der ubiquitäre virale CMV-Promotor (hCMV-Promotor) einerseits und der herz- und mäusespezifische -Myosin-Promotor (-MHC Promotor) andererseits. Getestet wurde die Regulierbarkeit des Reportergens in transient transfizierten COS1-Zellen, L6 Myoblasten sowie an neonatalen Kardiozyten von Ratten. Für die Kotransfektion von jeweils einem Paar der Plasmide (mit dem tetR-Gen, bzw. dem tetO/lacZ-Gen) wurde ein modifiziertes und in dieser Arbeit optimiertes ballistisches System (Gene Gun von BioRad) benutzt. Die Versuchsanordnung bestand aus Anzüchtung der Zellen, Transfektion, Induktion und Nachweis des Reporterenzyms. Mit dem hCMV-Promotor wurde in allen drei getesteten Zelltypen eine von DOX abhängige Expression der -Galaktosidase nachgewiesen. Mit dem -MHC Promotor, der wegen seiner Herzspezifität nur an kardialen Rattenmyozyten getestet werden konnte, waren in der Standardversuchsanordnung (nach DOX Induktion) nur sehr geringe Mengen an - Galaktosidase nachweisbar. Um die Regulierbarkeit des lacZ-Gens eindeutig zu demonstrieren, wurden als Stimulatoren des -MHC Promotors die Hormone Trijodthyronin, Insulin und Dexamethason einzeln und in Kombination verwendet. Die höchste Stimulierung (ca. 5-fach) wurde mit einer Kombination aller drei Hormone erreicht. In dieser Anordnung wurde damit gezeigt, dass das binäre tetR/tetO-System in vitro nach Induktion auch mit dem -MHC Promotor funktioniert. Mit diesem Resultat war - im Prinzip - der Weg für Experimente mit transgenen Mäusen vorgegeben. In Transgen-Linien mit Einzeltransgenen (entweder mit dem tetR-Gen oder dem lacZ-Gen, beide unter Kontrolle des -MHC Promotors, letzteres zusätzlich mit der tetO- Sequenz für den Repressor) wurde die herzspezifische Expression der -Galaktosidase eindeutig nachgewiesen, nicht jedoch die des tet-Repressors. Die Gründe dafür können gegenwärtig nur vermutet werden. Die Zahl der Genkopien könnte unzureichend gewesen sein. Da es sich um ein bakterielles Gen handelt, könnte auch eine ungünstige Codon-Verwendung einer effizienten Expression entgegenstehen. Zur Klärung dieser Umstände sind weitere Versuche (die nicht mehr Gegenstand dieser Doktorarbeit sind) inzwischen initiiert worden. Das hier in Zellkultur getestete Regelsystem wird als tetON-System charakterisiert, bei dem das Transgen, dessen Expression kontrolliert werden soll (jetzt das Gen für -Galktosidase, später ein mutiertes ventrikelspezifisches Myosingen), erst nach Zugabe des Induktors (Doxyzyklin, bei Mäusen im Trinkwasser) aktiviert wird. Damit unterscheidet sich dieses System von vielfach benutzten tetOFF-Systemen. Diese bestehen aus einem hybriden Protein, das aus zwei verschiedenen Struktur/Funktionsdomänen besteht: der tet-Bindungsdomäne des bakteriellen tet-Repressors und einem viralen ubiquitären Transkriptionsaktivator (das Hybridprotein hat die Bezeichnung tTA). Die zu regulierenden Zielgene enthalten die tetO- Sequenz. Bindung von tet an tTA führt zur Dissoziation des tTA/tetO-Komplexes und damit zur Deaktivierung des Zielgens. Entzug von tet erlaubt die Bindung von tTA an den Promotor des Zielgens und ermöglicht damit dessen Transkription. Dieses System, dessen Funktionalität an Modellversuchen nachgewiesen wurde, hat gleichwohl Nachteile. Diese sind erstens auf eine gewisse Toxizität des Transkriptionsaktivators tTA und zweitens auf negative Wirkungen in Verbindung mit der Dauerzufuhr von Tetrazyklin (zur Unterdrückung der Expression des Zielgens) zurückzuführen. Da ein in der Literatur auch beschriebenes tTA-basiertes tetON- System als nicht ausreichend berichtet wird, erscheint der Aufwand für die Herstellung eines einfachen (nicht-viralen) und ggf. genetisch modifizierten tetON-Systems für die Anwendung an Mäusen sinnvoll und notwendig.
Im Rahmen einer genomumfassenden Suche nach biologisch aktiven Proviren des Typs HERV-K konnten insgesamt zwei Genorte den humanen Chromosomen C7 bzw. C19 zugeordnet werden. Beide Proviren weisen ORF für die retroviralen Gene gag, pol und env auf. Während der Genort HERV-K(C19) infolge eine Punktmutation ein defektes Proteasegen trägt und durch eine Deletion der 5´LTR transkriptionell inaktiv ist, besitzt der Genort HERV- K(C7) zwei intakte LTRs, deren Homologiegrad auf ein phylogenetisch junges Alter hindeutet. Mit Ausnahme eines Aminosäureaustausches innerhalb eines hochkonservierten Sequenzmotivs der reversen Transkriptase, der den Verlust der enzymatischen Aktivität zur Folge hat, kann der Genort HERV-K(C7) als das derzeit intakteste Provirus der Familie HERV-K angesehen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen für eine HTDV- Partikelproduktion durch Komplementation unterschiedlicher Genorte und gegen die Existenz eines funktionellen und vermehrungsfähigen HERV-K Provirus mit allen retroviralen Charakteristika im menschlichen Genom. Desweiteren wurden mit HERV-K10 und HERV-K18 zwei bekannte Vertreter der Familie HERV-K eingehend untersucht. Zusätzlich zu der chromosomalen Zuordnung der Proviren gelang der experimentelle Nachweis eines intakten gag Genes für HERV-K10. Für HERV- K18 konnten ausgeprägte Homologien zu dem Superantigen-kodierenden Provirus IDDMK1,222 festgestellt werden. Bei den in dieser Arbeit vorgestellten Klonen pPERV-B(33), pPERV-A(42) und pPERV- B(43) handelt es sich um die ersten intakten Proviren der xenotropen Klassen PERV-A und PERV-B. Die vollständige Sequenzierung ermöglichte eine eingehende molekularbiologische Charakterisierung dieser C-Typ Viren. Computergestützt konnte eine PBS für eine tRNAGly4 sowie das Polyadenylierungssignal identifiziert werden. Der Sequenzvergleich offenbarte ein repetitives 39 bp Motiv, welches in unterschiedlicher Anzahl in den jeweiligen LTRs vorzufinden ist. Experimentell wurden der Transkriptionsstart und die verwendeten Spleißstellen identifiziert. Durch Rekombination konnten die molekularen Klone pPERV- B(33)/ATG und pPERV-B(43)/LTR generiert werden, die nach Transfektion in 293 Zellen zur Produktion infektiöser Partikel führten, welche sich seriell passagieren liessen. Mit Kenntnis der Genomorganisation und der RNA Expressionscharakteristika von PERV wurde eine RT PCR Virusdiagnostik etabliert mit deren Hilfe hochsensitiv differentiell PERV-A und PERV-B Transkripte detektiert werden können.
Der erste Teil dieser Promotionsarbeit umfasste die Etablierung und Validierung eines in vitro Testsystems zur Auffindung von Substanzen, die selektiv die Interaktion der mitogenen Signalmoleküle Ras und Raf inhibieren können. Die Deregulation der Ras-Signalkaskade spielt in einer Vielzahl maligner Transformationen eine bedeutende Rolle. Daher besteht in der pharmazeutischen Forschung großes Interesse an der Auffindung von Inhibitoren, die in der Lage sind, solche proliferativen Signale zu unterbinden und möglicherweise Ras- vermittelte Malignität einzudämmen. Das im Rahmen dieser Promotionsarbeit entwickelte Testsystem zur Detektion von Inhibitoren der Ras-Raf-Proteininteraktion basiert auf der intracistronischen ß-Galaktosidase Komplementation. Hierbei werden zwei sich nicht komplementierende Deletionsmutanten der ß-Galaktosidase, deren Affinität zueinander sehr niedrig ist, mit interagierenden Proteinpaaren fusioniert, wodurch es zur Ausbildung eines aktiven Enzymkomplexes kommen kann, dessen Aktivität sich über die Umwandlung eines fluorogenen Substrats nachweisen lässt. Bei Expression der interagierenden Fusionsproteine im E.coli Stamm ER2507 zeigte sich in intakten Zellen eine spezifische Komplementation der Interaktionspartner. Eine in vitro Komplementation der Fusionsproteine konnte trotz nativer Aufreinigung nicht beobachtet werden, da die Proteine im zellfreien System unter den gegebenen Versuchsbedingungen nur sehr schwach miteinander interagierten. Das zelluläre Testsystem ließe sich in dieser Form für die Wirkstoffsuche nach Inhibitoren der Ras-Raf-Proteininteraktion einsetzen. Die Evaluierung und Validierung muss aber für jedes interagierende Proteinpaar gesondert erfolgen. Der zweite Teil dieser Promotionsarbeit umfasste die Entwicklung und Charakterisierung zellulärer Systeme zur Validierung von PKB/Akt als Zielstruktur für die Entwicklung neuartiger anti-tumoraler Strategien. PKB/Akt wird in der Literatur als zentraler Mediator von zellulären Überlebenssignalen beschrieben. Zudem weisen verschiedene Tumore eine konstitutive Aktivierung und/oder eine Überexpression von PKB/Akt auf, was möglicherweise mit dem Auftreten von Chemoresistenz korreliert. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit konnte durch die Etablierung eines geeigneten zellulären Modells die Bedeutung von PKB/Akt bei der Verhinderung des Auftretens von Anoikis herausgestellt werden. Darüber hinaus gelang es erstmals, einen kausalen Zusammenhang zwischen konstitutiver Aktivierung von PKB/Akt und der Vermittlung von Chemoresistenz in vitro als auch in vivo darzulegen. Bei der molekularen Untersuchung der PKB/Akt- vermittelten Desensitivierung von Lungenkarzinomzellen gegenüber Zytostatika zeigte sich, dass PKB/Akt Chemoresistenz durch breit gefächerte Eingriffe in die apoptotischen Hauptsignalwege über eine Vielzahl von Mechanismen wie beispielsweise die verstärkte Phosphorylierung der Initiator-Caspase 9, die erhöhte Expression des anti-apoptotischen Proteins Bcl-xL oder die verlangsamte Induktion von p53 vermittelt. Die selektive Inhibition der Kinaseaktivität von PKB/Akt stellt somit einen interessanten Ansatz für neuartige therapeutische Strategien dar, die darauf abzielen, Tumorzellen, die Chemoresistenz aufgrund einer hohen intrinsischen Aktivität von PKB/Akt aufweisen, durch Applikation eines PKB/Akt-Inhibitors gegenüber Standard-Chemotherapeutika zu resensitivieren und auf diese Weise eine Vielzahl von chemoresistenten Tumoren einer Therapie zugänglich zu machen.
Termiten (Insecta: Isoptera) sind soziale Insekten und ein wichtiger Bestandteil der Fauna terrestrischer Ökosysteme der Tropen. Dort stellen sie bis zu 25 Prozent der Bodenfauna und sind als Ökosystem-Ingenieure eine sogenannte Keystone-Gruppe (Abe & Higashi, 1997). Untersuchungen zur Rolle in Stoffkreisläufen wurden bisher hauptsächlich in den Savannen Afrikas oder Asiens durchgeführt. Bis heute sind auffallend wenig Daten aus tropischen Wälden vorhanden. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit mehreren Teilaspekten der Termitenökologie in einem amazonischen Festlandregenwald. Die Atmungsaktivität von 24 Termitenarten wurde mittels Infra-Rot-Gas-Absorptions-Messungen (IRGA-Messungen) bestimmt. Hierbei wurde nach Kasten (Arbeiter und Soldaten) differenziert. Das Verhältnis von Körpermasse und CO2-Produktion folgt einem ubiquitären biologischen Gesetz, nach dem die Metabolismusrate mit zunehmender Köpergröße abnimmt. Die untersuchten Termiten konnten in vier verschiedene Nahrungsgilden eingeteilt werden: Holzfresser, OM-Fresser (OM=organisches Material), Interfacefresser und Spezialisten. In Übereinstimmung mit der taxonomischen und funktionellen Einteilung konnte gezeigt werden, dass Holzfresser mit 0,87 g [CO2 g Biomasse -1] signifikant mehr CO2 als OM-Fresser (0,47 g [CO2 g Biomasse -1]) und Spezialisten (0,42 g [CO2 g Biomasse -1]) produzieren. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden verschiedene Einflüsse unterschiedlicher Waldsysteme auf die Termitenaktivität untersucht. Die Präsenz von Termiten an Köderfallen wurde dazu in drei verschiedenen Waldsystemen (Primärwald, Sekundärwald und verschiedene agroforstwirtschaftliche Anbausysteme) für den Zeitraum eines Jahres beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Termitenaktivität mit dem Komplexitätsgrad der untersuchten Systeme und der Bodenfeuchte korreliert. Die meisten mit Termiten besetzten Fallen fanden sich im Primärwald. Es war außerdem möglich den Nachweis zu liefern, dass der Vegetationstyp forstwirtschaftlich genutzter Flächen die Termitenaktivität beeinflusst. In vier verschiedenen agroforstwirtschaftlichen Polykulturen wurden sowohl in der Trocken- als auch in der Regenzeit mehr besetzte Köderfallen gezählt als in Monokulturen der untersuchten amazonischen Nutz-Baumarten (Citrus sinensis, Theobroma grandiflorum, Hevea brasilensis, Bactris gasipaes und Cocos nucifera). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Termiten auf Feuchtigkeitsunterschiede im Boden reagieren indem sie zu feuchte (> 28% volum. Wassergehalt) oder zu trockene Standorte (< 23% volum. Wassergehalt) meiden. Auf der Basis der ermittelten Atmungsdaten wurde die Rolle der Termiten im lokalen und globalen Kohlenstoffkreislauf mit Hilfe von Modellen spezifiziert. Erstmalig konnten hierbei die Daten der neotropischen Termiten in ökologische Modelle integriert werden. Zum einen ergab die Modellierung der CO2-Produktion der untersuchten Arten aus Teil A mit dem Makrofaunamodell NEOMITES, dass Termiten in einem tropischem Regenwald in der Lage sind, bis zu 28 Prozent des Bodenkohlenstoffes zu mobilisieren. Zum anderen wurde mit einem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Modell die Nettomenge der Treibhausgase Kohlendioxid und Methan die durch Termiten produziert wird, berechnet. Demnach tragen Termiten tropischer Regenwälder zwischen 0,52 und 2,75 Prozent zur globalen jährlichen Nettoproduktion des Kohlendioxids bei und liegen damit über dem bisher vermuteten Anteil von 0,22-1,56 Prozent. In bezug auf Methan liegen die Ergebnisse der globalen jährlichen Nettoproduktion im Bereich bisheriger Schätzungen (zwischen drei und 19 Prozent). Die durchgeführten Untersuchungen konnten zeigen, dass Termiten auf Bodenqualitätsmerkmale wie Feuchtigkeit reagieren und somit als Monitororganismus bei der nachhaltigen Nutzung tropischer Böden eingesetzt werden können. Durch die Ermittlung der Atmungswerte und der darauf basierenden Modellierung konnte ihre zentralen Rolle im Kohlenstoffkreislauf der Böden tropischer Regenwälder demonstriert werden. Die Modellvorhersagen ihres Beitrags zur Nettoproduktion von Kohlendioxid und Methan zeigen, dass Termiten tropischer Regenwälder keine primäre Quelle des atmosphärischem Kohlendioxids und Methans darstellen. Allerdings liegt ihr Beitrag - insbesondere im Fall von Kohlendioxid - über den bisherigen Annahmen.
Für verschiedene gentherapeutische Ansätze zur Behandlung der HIV-Infektion oder anderer erworbener oder angeborener Krankheiten wie z. B. der angeborenen Immunschwäche SCID ist ein hocheffizienter Gentransfer in CD4-positive T- Lymphozyten erforderlich. In der vorliegenden Arbeit wurden daher geeignete retrovirale Pseudotypvektoren weiterentwickelt. Unter Einsatz von Markergenen wurden Methoden der Transduktion primärer humaner Lymphozyten optimiert. Schließlich wurden verschiedene potentielle therapeutische anti-HIV-Gene durch retroviralen Gentransfer in humane T-Zelllinien übertragen und hinsichtlich der Hemmung der in-vitro Replikation verschiedener HIV-Stämme verglichen. Zunächst wurden stabile Verpackungszelllinien zur Herstellung von [MLV(HIV-1)]- und [MLV(GaLV)]-Pseudotypvektoren entwickelt, die ein für die Analyse der Transduktionseffizienz geeignetes Markergen übertragen. [MLV(HIV-1)]-Vektoren konnten mit Titern bis zu 2 x 10 hoch 5 i.E. / ml hergestellt werden. Die Optimierung der Kultivierung primärer humaner T-Lymphozyten vor dem ex- vivo Gentransfer ergab, dass eine 24-stündige PHA/IL-2 Stimulation mit anschließender 48-stündiger Kultivierung in IL-2 Medium optimal für die Transduktion primärer CD4-positiver T-Lymphozyten unter weitgehender Erhaltung des Expressionsmusters der Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR5 ist. Bei längerer Stimulation mit PHA und IL-2 verändert sich sowohl das CD4/CD8-Verhältnis als auch die CCR5-Expression gegenüber nativem Blut signifikant. Die Analyse der Expression des übertragenen Markergens und anderen Oberflächenmarkern der Zellen nach der Transduktion zeigte eine strikte Abhängigkeit der Transduktion der [MLV(HIV-1)]-Vektoren vom HIV-Rezeptor CD4, während herkömmliche [MLV(GaLV)]-Vektoren sowohl CD4-positive als auch CD4-negative Zellen transduzierten. Die Effizienz von [MLV(HIV-1CXCR4)]- Vektoren für CD4-positive Zellen war signifikant höher als die der [MLV(GaLV)]-Vektoren, während die Transduktionseffizienz der [MLV(HIV-1CCR5)]-Vektoren aufgrund der geringen Anzahl CCR5-positiver CD4-T-Zellen am niedrigsten war. Zwei Tage nach der Transduktion wurde eine reduzierte Korezeptorexpression in den Zellen nachgewiesen. Gründe hierfür könnten die Internalisierung der Korezeptoren nach der Transduktion oder eine durch die Kultivierung der Zellen bedingte Änderung der Expression sein. Nach weiterer Optimierung des retroviralen Gentransferprotokolls, u.a. durch Verwendung autologen Plasmas, konnten schließlich bei einmaliger Transduktion mit einer m.o.i. von 5 mit den [MLV(HIV-1CXCR4)]-Vektoren Transduktionsraten von bis zu 80 % erreicht werden. Zum Vergleich der Wirkung potentieller anti-HIV-Gene, die mit den neuen Vektoren in der Gentherapie des Immunschwächesyndroms AIDS eingesetzt werden könnten, wurden fünf verschiedene HIV-Inhibitoren (zwei intrazellulär exprimierte Antikörperfragmente (scFv) gegen HIV-1 Integrase und Reverse Transkriptase, zwei Ribozyme, die die HIV-1 RNA in der 5´-LTR oder im Pol- Leserahmen spezifisch spalten, sowie Interleukin-16) in den gleichen Transfervektor kloniert und durch retroviralen Gentransfer in die T-Zelllinie SupT1 übertragen. In Infektionsversuchen mit zwei unterschiedlichen HIV-1 Stämmen vermittelte jedoch keiner der potentiellen Inhibitoren eine signifikante Resistenz gegenüber HIV-1. Erst nach Sortierung der Kulturen auf starke Expression der übertragenen Gene konnte in den sortierten Zellen eine geringe Hemmwirkung des 5´-LTR-spezifischen Ribozyms auf die in-vitro Replikation des Stammes HIV-1IIIB, nicht jedoch auf die des Stammes HIV-1NL4-3 gezeigt werden. Die Signifikanz dieser Beobachtung muß über den Vergleich der Hemmwirkung weiterer Inhibitorgene geklärt werden.
In bestimmten methanogenen Archaea wurde vor einigen Jahren eine metallfreie Hydrogenase gefunden, die den reversiblen und stereoselektiven Transfer eines Hydridions von Wasserstoff auf die an den C1-Carrier Tetrahydroniethanopterin (H4MPT) gebundene Methenyl-Gruppe katalysiert. Damit stellt dieses Enzym den ersten und einzigen rein organischen Hydrogenierungskatalysator dar, den man in der Natur kennt. Ziel der vorgelegten Arbeit war die kristallographische Bestimmung der Enzymstruktur. Versuche zur Strukturlösung des in aktiver Form aus M. marburgensis isolierten Enzyms durch mehrfachen isomorphen Ersatz, über die anomale Dispersion an nicht-isomorphen Quecksilberderivaten und die des Selens an mit Selenomethionin markiertem Enzym verliefen nicht erfolgreich. Ursächlich hierfür war die perfekte meroedrische Zwillingsbildung der Kristalle. Für die beiden heterolog produzierten, inaktiven Apoenzyme aus den Hyperthermophilen M. jannaschii und M. kandleri wurden in dieser Arbeit effektive Expressions- und Reinigungsprotokolle entwickelt. Für das Enzym aus M. jannaschii wurden Mikrokristalle erhalten, die lediglich ein Proteolysefragment von etwa der halben Masse des Vollängenproteins enthalten. Kristalle des Enzyms aus M. kandleri konnten durch serielles Microseeding so weit verbessert werden, daß die Durchführung eines MAD-Experiment möglich wurde. Erst unter Verwendung vor kurzem entwickelter direkter Methoden (Shake-and-Bake) gelang die Strukturlösung bei einer Auflösung von 2.8 Å. Die Monomere bilden ein sehr eng assoziiertes Homodimer; zwei dieser Dimere sind zu einem locker assoziierten Tetramer verbunden. Jedes Monomer besitzt zwei Domänen. Die N-terminale Domäne von etwa 255 Resten besitzt eine Faltung, wie sie für Dinukleotid-bindende Enzyme typisch ist, mit einem zentralen, verdrehten achtsträngigen beta-Faltblatt. Die C-terminale Domäne von etwa 100 Resten besitzt dagegen weitgehend alpha-helikale Struktur und ist für die außerordentlich enge Assoziation des Homodimers verantwortlich. Beide Domänen sind durch eine gestreckte, flexible Verbindung verknüpft. Im Dimer entstehen dadurch zwei tiefe Spalten, die von Anteilen der N-terminalen Domäne eines und der C-terminalen Domäne des jeweils anderen Monomers begrenzt werden. Das aktive Zentrum liegt wahrscheinlich in dieser Spalte, wobei postuliert wird, daß der fest gebundene Cofaktor eher mit der größeren N-terminalen Domäne assoziiert ist und das Substrat zwischen den Domänen bindet. An der Bindung dürfte die C-terminale Domäne und möglicherweise auch direkt der Cofaktor beteiligt sein. Die Struktur zeichnet sich durch außergewöhnlich hohe Tenmperaturfaktoren ans. Für das Enzym aus M. marburgensis konnte eine Lösung durch molekularen Ersatz erhalten werden. Da der für die Katalyse benötigte, noch unbekannte Cofaktor nicht in der Struktur enthalten ist, ist eine weitergehende Diskussion des enzymatischen Mechanismus noch nicht möglich. Die Verfügbarkeit eines ersten Strukturmodells der metallfreien Hydrogenase stallt aber bereits einen entscheidenden Schritt auf dem Weg zum Verständnis dieses ungewöhnlichen Hydrogenierungskatalysators dar.