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Es ist seit ein paar Jahren bekannt, dass es bei amblyopen Patienten neben Vi-susverlusten, einer exzentrischen oder unruhigen Fixation und einer ganzen Reihe weiterer Phänomene, zu einer gestörten Lokalisation (Verzerrung und Unsicher-heit) im amblyopen Auge kommt. Lokalisationsstörungen behindern die visuelle Wahrnehmung und die Visuomotorik der Betroffenen. Darüber hinaus gibt ihr ge-naues Studium Informationen über die Ausprägung der Amblyopie und erlaubt Überlegungen zur Amblyopieentstehung. Die Forschungseinheit „Sehstörungen des Kindesalters“ an der Augenklinik der Universität Frankfurt am Main, in der die-se Doktorarbeit durchgeführt wird, beschäftigt sich u. a. mit der visuellen Lokalisa-tion bei Kindern. Mit einer für diesen Zweck entwickelten Methode [Fronius et al. 1995] wird die visuelle Lokalisation bei normalsichtigen und amblyopen Kindern erfasst [Fronius et al. 2000, 2004]. Ziel dieser Arbeit ist die Ergänzung der vorhandenen Daten und die Auswertung nach neuen Gesichtspunkten. Die Studie untersucht Lokalisationsstörungen im Führungsauge und befasst sich erstmalig damit, ob und inwiefern solche Lokalisa-tionsstörungen auch bei der binokularen Lokalisation vorkommen. Sie präsentiert die Ergebnisse, die schielamblyope (n=32) sowie normalsichtige Kinder (n=35) im Alter von 4,5 bis 10 Jahren bei der vertikalen relativen Lokalisation monokular und binokular erzielen. Verwendet wird die durch Fronius und Mitarbeiter 1995 entwor-fene –aktive– Testmethode, die aus einer Kombination von zwei früheren Testver-fahren für Erwachsene [Bedell & Flom 1981, Fronius & Sireteanu 1989] hervorge-gangen ist. Darüber hinaus wird analysiert, inwieweit der Visus, Faktoren aus der klinischen Geschichte (Zeitpunkt der Brillenverordnung, Vorbehandlung durch Okklusionstherapie) und Begleitphänomene wie ein latenter Nystagmus eine Rolle spielen. Dabei ergibt sich, dass die Führungsaugen der hier untersuchten amblyopen Kin-der eine ähnlich genaue relative vertikale Lokalisation zeigen wie die normalsichti-ge Kontrollgruppe. Dagegen ist der Visus in den Führungsaugen signifikant niedri-ger als der der Kontrollkinder (Einzeloptotypenvisus: p=0,0007, Reihenvisus: p=0,005). Die Führungsaugen sind demnach keine „normalen“ Augen, was den Visus betrifft, zeigen jedoch keine messbar gestörte Positionswahrnehmung. Möglicherweise handelt es sich hier um zwei von einander unabhängige Phänomene – Lokalisationsstörungen und Visusminderung – , die im amblyopen Sehsystem an-zutreffen sind. Eventuell spielen aber auch die verwendete Testmethode und das junge Alter der Probanden eine Rolle. Laut Krieter [2000] machen Kinder in die-sem Test signifikant größere Fehler als Erwachsene, was das Herausstellen von eventuell vorhandenen Effekten erschweren könnte. Der Vergleich der monokularen und der binokularen Lokalisation ergibt unter den vorhandenen Untersuchungsbedingungen bei der normalsichtigen Kontrollgruppe keine signifikanten Unterschiede. Ein binokularer Summationseffekt liegt nicht vor. Auch bei den Schielamblyopen entspricht die monokulare der binokularen Lokali-sationsgenauigkeit. Allerdings ist die binokulare Lokalisation bei den Amblyopen wesentlich ungenauer als bei der Kontrollgruppe, die Unsicherheit ist bei ihnen signifikant (p=0,009) und die Verzerrung tendenziell (p=0,07) größer. Es werden also bei Mitgebrauch des amblyopen Auges, binokular, Unterschiede zwischen den amblyopen Kindern und der Kontrollgruppe deutlich. Dies spricht für eine leichte Störung durch das amblyope Auge bei der binokularen Lokalisation. Ein Vorteil ergibt sich nach den Ergebnissen dieser Arbeit für die Kinder mit Okklusionstherapie in der Vorgeschichte (n=7) betrachtet man den Visus im amblyopen und im Führungsauge. Ein Einfluss der Okklusionstherapie auf die Lo-kalisation stellt sich nicht heraus. Der Zeitpunkt der Brillenverordnung (Brille vor dem 2. Lebensjahr: n=10, Brille nach dem 2. Lebensjahr: n=20) beeinflusst nach unseren Ergebnissen weder den Visus noch die Lokalisationsergebnisse der un-tersuchten Kinder. Diese Arbeit erweitert das Wissen über die Leistungen von schielamblyopen und normalsichtigen Kindern bei Lokalisationsaufgaben und zeigt erstmals Daten der binokularen Lokalisation.
Einleitung: In der vorliegenden Studie wurde die laparoskopisch durchgeführte Thermoinzision der Ovarialoberfläche, eine operative Behandlungsmöglichkeit des polyzystischen Ovarsyndroms (PCOS), im Hinblick auf die Auswirkungen auf Zyklustempus und Fertilität untersucht.
Material und Methode: Zwischen März 1999 und April 2002 unterzogen sich 55 PCOS-Patientinnen, mittleres Alter 30,4 Jahre, im Zentrum für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Universitätsklinik Frankfurt am Main und in der Abteilung für gynäkologische Endokrinologie und Fertilitätschirurgie im Bürgerhospital Frankfurt am Main einer Thermoinzision der Ovarialoberfläche. Alle Patientinnen litten an unerfülltem Kinderwunsch, 20 von ihnen hatten zusätzlich einen unregelmäßigen Menstruationszyklus, 7 gaben eine vermehrte Behaarung. 16 Patientinnen hatten sowohl einen unregelmäßigen Menstruationszyklus als auch Hirsutismus. 37 Patientinnen hatten bereits vor der Operation frustrane Hormonbehandlungen hinter sich. Bei 18 Patientinnen wurde die Thermoinzision der Ovarialoberfläche als primärer Therapieansatz im Rahmen einer Laparoskopie zur Sterilitätsdiagnostik gewählt. Die Nachbeobachtung fand durch schriftliche Befragung und das Einsehen der Krankenblätter und der Operationsberichte statt. Der Fragebogen umfasste im Wesentlichen drei Punkte: 1) Die allgemeine Zufriedenheit mit der Behandlung 2) Den Behandlungserfolg zum Zeitpunkt der Befragung im Vergleich zu vor der Operation (Schwangerschaften, Zyklusregelmäßigkeit, Hirsutismus) 3) Die zusätzlich zur Thermoinzision der Ovarien in Anspruch genommenen Behandlungen (z.B. Medikamente) Die mittlere Nachbeobachtungszeit betrug 31 Monate.
Ergebnisse: Die Schwangerschaftsrate nach durchgeführter Thermoinzision betrug in dieser Studie 51%. Davon traten 90% innerhalb des ersten postoperativen Jahres auf. Der Anteil der Patientinnen mit regelmäßigem Zyklus stieg von 35% auf 58%. Damit war der Einfluss der Thermoinzision auf den Menstruationszyklus signifikant Bei 39% kam es zur Verbesserung des Hirsutismus. Die Abortrate nach Thermoinzision lag in dieser Studie bei 21%. Insgesamt waren 85% der operierten Patientinnen zufrieden bis sehr zufrieden mit dieser Behandlungsmethode. In der Gruppe der Patientinnen mit Nikotinkonsum sind 36% schwanger geworden, im Gegensatz zur Nichtrauchergruppe mit einer Schwangerschaftsrate von 57%. Zwischen Body Mass Index und postoperativer Zyklusregelmäßigkeit / Schwangerschaftsrate, sowie zwischen Alter und postoperativer Zyklusregelmäßigkeit / Schwangerschaftsrate bestand kein Zusammenhang.
Diskussion und Schlussfolgerung: Die Thermoinzision der Ovarialoberfläche ist eine effektive Methode zur Behandlung von Zyklusunregelmäßigkeiten und Sterilität bei PCOS-Patientinnen. Zudem zeigt sie auch Erfolg in der Behandlung des Hirsutismus bei diesen Patientinnen. Da es sich um einen operativen Therapieansatz handelt, sollte die Thermoinzision als Therapie der zweiten Wahl, nach versuchter medikamentöser Therapie, eingesetzt werden.
Hintergrund: Frequenzkontrolle ist die Therapie der ersten Wahl bei Patienten mit permanentem Vorhofflimmern. Jedoch es ist unklar, welche spezifischen Zielgrößen für die Optimierung einer medikamentösen Therapie herangezogen werden können. Spiroergometrie und 6-Minuten-Gehtest, die zusätzliche Informationen zur Belastbarkeit liefern können, wurden diesbezüglich bislang nur unzureichend untersucht. Methoden: In einer prospektiven Studie wurde bei konsekutiven Patienten mit permanentem Vorhofflimmern und tachyarrhythmischer Überleitung ohne Medikation eine Spiroergometrie, ein 24-h Langzeit-EKG und der 6-Minuten-Gehtest durchgeführt. Danach wurden die Patienten im „cross-over“ Design randomisiert und mit Bisoprolol (5 mg/Tag) sowie Verapamil (3x80 mg/Tag) zur Frequenzregularisierung über jeweils 14 Tage behandelt. Im Anschluss wurden die o.g. Untersuchungen wiederholt. Die Lebensqualität wurde bei allen Patienten vor und unter medikamentöser Therapie mittels SF-36 Fragebogens und der Symptomen-Checkliste evaluiert. Nach 3 bis 6 Monaten durchgehender frequenzregularisierender Therapie wurden alle Untersuchungen erneut durchgeführt. Ergebnisse: 22 Patienten schlossen das Untersuchungsprotokoll ab (Alter 64±7 Jahre; 59% männlich; mittlere EF 57±9%). Während der Kontrollphase lag die Ruheherzfrequenz bei 101±19 /min und mittlere Herzfrequenz im 24-h Langzeit-EKG bei 98±22 /min. Unter der Belastung zeigte sich ein Anstieg auf maximal 162±33 /min. Ohne frequenzregularisierende Medikation betrug die Gehstrecke im 6-Minuten-Gehtest 458±106 m und die maximale Sauerstoff-Aufnahme unter Belastung 16,6±4,1 ml/min*kg. Unter beiden Medikamenten reduzierte sich die mittlere Herzfrequenz im 24-h Langzeit-EKG signifikant um 15,2% unter Bisoprolol und 16,3% unter Verapamil. Auch die maximale Herzfrequenz im Langzeit-EKG verringerte sich signifikant um 15,1% und 14,2% unter Bisoprolol und Verapamil entsprechend. Weder Spiroergometrie noch 6-Minuten-Gehtest konnte eine Verbesserung der körperlichen Belastbarkeit unter der frequenzkontrollierenden Therapie zeigen. So veränderte sich zum Beispiel die maximal erreichte Leistung um 1,5% und -2,8% und Bisoprolol und Verapamil entsprechend. Auch die maximale Sauerstoff-Aufnahme lag mit 17,1±4,9 ml/min*kg (Bisoprolol) und 16,9±4,7 ml/min*kg (Verapamil) auf dem Niveau vor Frequenzkontrolle (p=ns). Keine der 8 Skalas des SF-36 Fragebogens konnte einen Einfluss der verwendeten Medikamente auf die Lebensqualität zeigen. Nach im Mittel 181 Tage durchgehender medikamentöser Therapie konnte eine anhaltende bradykardisierende Wirkung beobachtet werden. So war die mittlere Herzfrequenz im Langzeit-EKG um 20±12 /min niedriger als bei der Ausgangsuntersuchung. Auch nach 6 Monaten kam es zu keiner signifikanten Veränderung der körperlichen Belastbarkeit. Hier betrug die maximale Sauerstoff-Aufnahme 17,6±4,4 ml/min*kg und zurückgelegte Gehstrecke 451±112 m (p=ns). Die Untersuchung der Lebensqualität ergab lediglich eine signifikante Verbesserung der körperlichen Funktion (59±27 vs. 69±24, p < 0,05), summarischen körperlichen Gesundheit (40±11 vs. 45±12, p=0,05) und der Häufigkeit der mit Vorhofflimmern assoziierten Symptome (36±13 vs. 32±13, p < 0,05). Klinische Implikationen: 1. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigen, dass unter Therapie mit beiden Medikamenten (Bisoprolol 5 mg/die und Verapamil 3 x 80 mg/die) eine signifikante und vergleichbare Frequenzkontrolle erreicht werden kann. 2. Sowohl das Belastungs-EKG als auch das Langzeit-EKG können zur Überprüfung der erreichten Frequenzsenkung bei der Ersteinstellung der Patienten mit permanentem Vorhofflimmern mit gleichen Erfolgsaussichten angewendet werden. Das Belastungs-EKG hat den Vorteil einer gleichzeitigen Beurteilung der Leistungsfähigkeit und der Blutruckeinstellung, während das Langzeit-EKG bei Verdacht auf das Vorliegen nächtlicher Bradykardien vom Nutzen sein kann. Zur Verlaufskontrolle kann ein ambulant durchgeführtes Ruhe-EKG einen sinnvollen Ersatz von zeitaufwendigeren und teureren Methoden darstellen. 3. Der 6-Minuten Gehtest kann nicht zur Beurteilung der Herzfrequenzkontrolle bei Patienten mit Vorhofflimmern empfohlen werden. 4. Im Gegensatz zur Herzfrequenz kann die im Rahmen des 6-Minuten-Gehtests ermittelte Gehstrecke eine sinnvolle Information über funktionellen Status des kardio-pulmonalen Systems sowie körperliche Leistungsfähigkeit des Patienten liefern und somit die individuelle Optimierung der Herzfrequenzeinstellung erleichtern. 5. Eine Verbesserung der körperlichen Belastbarkeit bei Patienten mit permanentem Vorhofflimmern kann möglicherweise durch die pharmakologische Frequenzkontrolle nicht erreicht werden. 6. Unter der medikamentösen Frequenzkontrolle treten die Verbesserungen der Lebensqualität bei Patienten mit permanentem Vorhofflimmern erst verzögert auf.
Diese Dissertation versucht neue und andere Wege in der Diagnostik der fokalen Leberläsionen FNH und HCC zu beschreiten, indem unter anderem bislang in der Untersuchung der Leber selten genutzte Untersuchungstechniken wie die multiplanare Rekonstruktion einer Volume-interpolated-breath-hold T1-3d-GRE Sequenz zum Einsatz kommen. In dieser Arbeit ging es darum, die Anwendung von Resovist® in der MRT für die fokalen Leberläsionen FNH und HCC zu bewerten. Dazu wurden von 40 Patienten in der Screeningphase die 36 Patienten, die den Goldstandard erfüllten mittels folgender Sequenzen untersucht: T2-Haste, T2-TSE-FS und T1-GRE jeweils prä und post Kontrastmittelgabe und als dynamische Aufnahme T1-3DGRE als Volume-interpolated-breath-hold, die später multiplanar rekonstruiert wurde. 4 weitere Personen mußten, wegen durch Bewegungsartefakte nicht mehr zu bewertende Bilder, leider noch aus der Studie ausgeschlossen werden, so dass letztendlich noch 31 Personen in der Studie eingeschlossen waren (16 Patientinnen mit einer FNH und 15 Patienten mit einer HCC). Aus den mit Region -of -Interest (ROI) gemessenen Signalintensitäten wurden in Signal- intensity –Ratio (SIR) und Percentage –Signal- intensity –Loss (PSIL) für die Sequenzen T2-Haste, T2-TSE-FS und T1-GRE und in SIR, Percentage – Enhancement (PE) und Contrast- to- Noise- Ratio (CNR) für die T1-3D-GRE VIBE und MPR berechnet. Gemessen wurde die Signalintensität der jeweiligen Läsionen, des linken und rechten Leberlappens, je ein Wert aus dem oberen und unteren Milzviertel, die Aorta in Höhe der Leber, ebenso die Vena cava und die Vena porta. Die so erhaltenen Messwerte wurden mit Hilfe des t-Tests und des u-Tests auf ihre Signifikanz (p<0,05) überprüft. Des Weiteren wurden Spezifität und Sensitivität in der Diagnose der Läsion vor und nach Kontrastmittelapplikation bestimmt und ebenfalls auf ihre Signifikanz überprüft. Dabei läßt sich eine signifikante Steigerung beider Parameter durch die Anwendung des SPIO nachweisen. Als Erstes wurden die Werte der Strukturen auf ihre jeweiligen Änderungen nach bzw. im Verlauf der Kontrastaufnahme hin bewertet, danach erfolgte ein Abgleich, inwieweit die als Arbeitshypothesen aufgestellten Vermutungen, dass sich die Signalintensitäten der Milz, der Leberlappen und der Vena porta als zuführendes Gefäß der Leber im Mitteldruck bei Vorliegen einer Leberzirrhose (n=14) gegenüber dem Fehlen einer solchen (n=17) unterscheiden. Eine solche Veränderung konnte für die Leber bestätigt, musste für die Milz und die Vena porta jedoch abgelehnt werden. Für die VIBE und MPR erfolgte ein Vergleich der Werte auf signifikante Unterschiede, um zu überprüfen, inwieweit die Rekonstruktion, die optisch ansprechendere Bilder liefert als ihre Vorlage VIBE, diese auch in Punkto Validität der Signalmessungen zu ersetzen vermag. Wenn man eine generelle Signalerhöhung von ca. 20 akzeptiert, muss man diesen Versuch als gelungen ansehen. Für die grundsätzliche Unterscheidung zwischen HCC und FNH konnten die Literaturberichte bestätigt werden, dass die FNH auf Grund einer größeren Anzahl von kontrastmittelaufnehmenden Kupffer- Zellen und geringere Dysplasie sowie Fehlen von den Zellstoffwechsel beeinflussenden Atypien, ein dem normalen Lebergewebe ähnlichere, wenn auch weit geringere, Signalintensität und –änderung aufwiesen als die HCC. Dennoch waren die Unterschiede in den Signalintensitäten und ihren Veränderungen zwischen FNH und normalem Parenchym groß genug, um auch hier eine sichere Abgrenzung zu bieten. Insgesamt boten die HCC einen stärkeren Läsion-zu-Leber-Kontrast (CNR) als die FNH. Die FNH wurden nach ihrer Morphologie in FNH mit und ohne Nidus eingeteilt und auf Unterschiede innerhalb dieser beiden Gruppen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die SIR in allen Sequenzen für die FNH mit Nidus signifikant gegenüber den FNH ohne zentrale Narbe erhöht war, in der PSIL ließ sich dieser Trend ebenfalls als signifikant beweisen. In der dynamischen Bildgebung mittels VIBE und MPR konnte für SIR, PE und CNR eine Erhöhung der Werte ebenfalls für die FNH mit Nidus festgestellt werden. Auch zeigte sich, dass die gemessenen und errechneten Werte auch für das jeweils umgebende Lebergewebe analog zu den Läsionen erhöht war, allerdings nur soweit, dass immer noch eine genügend hohe CNR gemessen werden konnte. Innerhalb der Gruppe der HCC erfolgte eine Aufteilung in solitär gegen multifokal vorliegende HCC, diese beiden Einheiten wurden ebenfalls wie die FNH auf Unterschiede und Gemeinsamkeiten überprüft. Leider waren auf Grund der Aufteilung der HCC in solitär und multifokal keine Vergleiche mit bisherigen Arbeiten möglich, da diese Unterscheidung bisher noch nicht gewählt worden war.
5.1.1 Hintergrund und Ziele Zyklusunregelmäßigkeiten im Sinne von Hypermenorrhoen, Menorrhagien, Metrorrhagien oder Dysmenorrhoen bedeuten für viele Frauen eine deutliche Einschränkung der Lebensqualität. Derzeit kommen zur Therapie der Blutungsstörungen hauptsächlich drei im Ansatz unterschiedliche Methoden zum Einsatz. Dazu zählen medikamentöse Therapien, die seit langem praktizierte Hysterektomie und organerhaltende oder minimal-invasive Verfahren. Zu den organerhaltenden, minimal-invasiven Behandlungsmethoden zählt die Ballonablation des Endometriums, deren langfristige Effektivität und Akzeptanz in der vorliegenden Arbeit an 30 Patientinnen untersucht wurde. 5.1.2 Material und Methode Zwischen Januar 1999 und Dezember 2002 befanden sich die 30 in die Studie einbezogenen Patientinnen zur Durchführung einer Uterus-Ballon-Therapie im Zentrum für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Universitätsklinik Frankfurt am Main in stationärer Behandlung. In dieser retrospektiven Fallanalyse wurden die Patientinnen mit einem Fragebogen angeschrieben. Der Fragebogen umfasste im Wesentlichen drei Punkte: 1) Die allgemeine Zufriedenheit mit der Behandlung; 2) Den Behandlungserfolg zum Zeitpunkt der Befragung im Vergleich zu vor der Operation (Blutungsstärke, Blutungsregelmäßigkeit und Regelschmerzen) 3) Die zusätzlich zur Ballonablation in Anspruch genommenen Behandlungen (z.B. Medikamente, Kürettage) und deren Wirkung auf das Ergebnis. Die mittlere Nachbeobachtungszeit betrug 29,6 Monate (7 bis 65 Monate). 5.1.3 Ergebnisse Zum Beobachtungszeitpunkt waren 16 Patientinnen (53 %) mit der Behandlung insgesamt sehr zufrieden. 8 Patientinnen (27 %) zeigten sich zufrieden und 6 Patientinnen (20 %) waren mit der Behandlung insgesamt unzufrieden. In der vorliegenden Untersuchung lag der Anteil der Patientinnen mit postoperativer Amenorrhoe oder abgeschwächter Blutung bei 83 %, die Amenorrhoerate betrug 33 %. Die Verringerung des maximalen täglichen Verbrauchs von Binden/Tampons nach der Ballonablation war signifikant. Innerhalb der ersten 36 Monate nach der Koagulation des Endometriums kam es zu keiner signifikanten Verschlechterung des Behandlungserfolges. Die Uterus-Ballon-Therapie zeigte einen positiven Einfluss auf die Dysmenorrhoe und auf die Blutungsregelmäßigkeit. Medikamentöse Vorbehandlung oder eine Vorbehandlung mittels Kürettage vor der Ballonablation hatten keinen signifikanten Einfluss auf den Behandlungserfolg. 5.1.4 Diskussion und Schlussfolgerung Als Goldstandard der Endometriumablation wird derzeit die transzervikale Resektion des Endometriums in Kombination mit dem gezielten Einsatz des Rollerballs gesehen. Die Uterus-Ballon-Therapie stellt eine technisch einfache und schnell durchführbare Behandlungsalternative bei Menorrhagien dar. Bezüglich der Patientenzufriedenheit und der Reduktion verstärkter Menstruationsblutungen ist das Verfahren den Methoden der ersten Generation ebenbürtig.
Im Zeitraum von Januar 1993 bis Dezember 2003 wurden in der Klinik für Unfall- und Wiederherstellungschirurgie des Klinikums Darmstadt 62 Patienten bei metastatischem Befall der Wirbelsäule mit drohender oder manifester Instabilität im thorakalen und lumbalen Bereich unter palliativen Gesichts-punkten mit einem Fixateur interne dorsal stabilisiert. Insgesamt wurden 65 Segmente operativ versorgt. Bei den Patienten handelte es sich um 36 männliche (58%) und 26 weibliche (42%) Personen mit einem Durchschnittsalter von 64 Jah-ren (40-89 Jahre). Durchschnittlich 1,8 Jahre seit Diagnosestellung waren bis zur Operation vergangen, es handelte sich hauptsächlich um Primärtumoren der Mamma, des Bronchialsystems, der Prostata und Niere, sowie um Plasmozyto-me, welche alle zusammen für 70% der Primärdiagnosen verantwortlich waren. Bei 42 (67,74%) Patienten lag ein Stadium 3 nach Askin vor, bei 20 (32,26%) Patienten ein Stadium 4. Von den Patienten mit neurologischen Defiziten waren 2 (3,22%) paraplegisch mit minimaler motorischer Restfunkti-on, damit Frankel Stadium B zuzuordnen, 7 (11,29%) dem Stadium C mit motorischen Defiziten bei erhaltener Rest-funktion. 11 Patienten (17,74%) hatten lediglich sensible Defizite, waren jedoch alle mobil (Stadium D). Insgesamt hatten damit 20 Patienten (32,25%) präoperativ neurologische Defi-zite. Präoperativ betrug die geäußerte Schmerzintensität durchschnittlich 6,91 nach VAS. Intraoperativ kam es bei durchschnittlich 118,8 Minuten Ein-griffsdauer und im Mittel 913ml Blutverlust zu einer einzigen Komplikation, einer Duraverletzung. Postoperativ kam es bei 8 Patienten zu Komplikationen (12,9%). Eine Blasenlähmung mit Parästhesien nach Duralä-sion bildete sich vollständig zurück. Eine einzige Pedikelfehlplatzierung wurde erfolgreich revidiert, eine Dislokation einer Längsstange wurde nach 3 Monaten klinisch auffällig und gleichermaßen komplikationslos korrigiert. Ein postope-rativ aufgetretenes Serom war nach Revision saniert. Drei Patienten in reduziertem Allgemeinzustand verstarben innerhalb von 2 Wochen postoperativ an Herz-Kreislauf-Versagen, ein Patient überstand unter Intensivtherapie eine Sepsis bei reiz-losem Zugangsbereich. Die postoperative Schmerzintensität betrug durchschnittlich 0,30 Punkte nach VAS. Neurologisch kam es bei 10 der Patienten (50%) mit einem präoperativ be-stehenden neurologischen Defizit zu einer Verbesserung der Symptomatik. Bei 18 von 62 Patienten (29,03%) verblieben neurologische Defizite, wovon 14 sensorischer (22,58%) und 4 motorischer (6,45%) Qualität waren. 58 von 62 Patienten (93,55%) waren postoperativ wieder mobil. Die mittlere Überlebenszeit betrug 3,53 Jahre postoperativ.
Die Nutzung von Computern hat in unserer Gesellschaft während der letzten Jahre stark zugenommen und eine Umkehrung dieses Trends ist derzeit nicht denkbar. Auch in zunehmend mehr Feldern der Medizin wird Computertechnik genutzt, wobei nicht nur die im medizinischen Sektor Beschäftigten, sondern auch die Patienten immer häufiger mit dem Computer als diagnostischem Hilfsmittel konfrontiert werden. Es erscheint naheliegend, daß psychiatrisch kranke Menschen besonders sensibel hierauf reagieren könnten. Menschen richten ihr Handeln an individuellen Leitschienen aus, sie handeln auf der Grundlage von Einstellungen (englisch: attitude). Akzeptanz beschreibt hingegen einen kurzfristigen Prozeß, die Bereitschaft, etwas Neues anzunehmen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, welche Rolle die Einstellung zu Computern (‚computer attitude‘) und die Akzeptanz von Computeruntersuchungen bei deren Anwendung an psychiatrischer Patienten spielen. Sie untersucht, ob und wie sich Einstellung und Akzeptanz messen lassen und wodurch sie beeinflusst werden. 160 stationär behandelte psychiatrische Patienten der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie I der J.W. Goethe-Universität beantworteten einen Fragebogen zur Messung der Einstellung gegenüber Computern (GCAS). Ein Teil (N=78) dieser 160 Patienten absolvierte zusätzlich eine umfangreiche Test- und Fragebogenbatterie am Computer und mit herkömmlichen ‚Papierund-Bleistift‘-Verfahren, in deren Verlauf die Akzeptanz der Untersuchung erfaßt wurde. Die Untersuchungszeitpunkte lagen jeweils in enger zeitlicher Nähe zur Aufnahme und zur Entlassung aus der stationären Behandlung. Wiederum ein Teil (N=22) dieser 78 Patienten hatte zwischen Erst- und Zweituntersuchung Gelegenheit, den Computer in einer spielerisch gestalteten Weise als Freizeitinstrument zu nutzen. Die Auswertungen berücksichtigten die Zugehörigkeit zu drei diagnostischen Subgruppen (‚psychotische Störung‘, ‚affektive Störung‘ und ‚andere Störungen‘). Zunächst wurden die Testgütekriterien der selbst entwickelten Instrumente geprüft. Es zeigte sich eine generell positive Einstellung der untersuchten Patienten gegenüber dem Computer (GCAS-Score > 48 bei 76,9% der Patienten). Bezüglich der diagnostischen Subgruppen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Männliche (Z=2,4; p=0,02), jüngere (R=-0,22; p=0,002) und besser gebildete Patienten (R=0,34; p=0,00001) hatten jedoch eine bessere Einstellung gegenüber Computern. Es fanden sich Unterschiede in der Akzeptanz der Computeruntersuchung in Abhängigkeit von diagnostischer Subgruppe und Einstellung zu Computern. Die spielerische Kurzintervention erwies sich als nicht geeignet die Einstellung gegenüber Computern signifikant zu verändern. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, welchen Einfluß Einstellungen und Akzeptanz auf die Interaktion von Patient und Computer haben. Die Kenntnis dieses Einflusses ist für die Bewertung der am Computer erzielten Testergebnisse eine wesentliche Information.
Zentrale Konzepte der Tourismusforschung : unter besonderer Berücksichtigung des Sporttourismus
(2006)
Die Arbeit gliedert sich insgesamt in vier Teile: einen Einführungsteil, zwei Hauptteile und einen Abschlussteil: Der einführende Teil A erläutert die theoretischen Grundlagen des Tourismus. Hier wird der Tourismus als komplexes Phänomen in seinen verschiedenen Facetten beschrieben. Dazu werden definitorische und explikative Beschreibungen des Phänomens herangezogen, seine Besonderheiten und seine Entstehung in der zeitlichen Perspektive dargestellt und seine aktuelle ökonomische und gesellschaftliche Bedeutung aufgezeigt. Teil B bildet den ersten Schwerpunkt der Arbeit und beschreibt die fünf bereits genannten zentralen touristischen Konzepte aus psychologischer Perspektive: Die „Reisemotivation“, die „Reiseentscheidung“, die „Reisezufriedenheit“ sowie die „Urlaubertypologien“ und die „Reisebiographien“. Alle Konzepte werden in ihren Grundlagen und Anwendungen auf den Tourismus dargestellt und mit Hilfe grundlegender psychologischer Erkenntnisse erklärt. Teil C thematisiert den zweiten Schwerpunkt der Arbeit. Eine besondere Teildisziplin des Tourismus, der Sporttourismus, wird als eigenständiges Phänomen vorgestellt. Darüber hinaus werden psychologische Erklärungsansätze für vielfältiges sporttouristisches Verhalten aufgezeigt. Ergebnisse empirischer Untersuchungen zeigen die besondere Situation des Sporttourismus auf, sie orientieren sich dabei an den in Teil B vorgestellten Konzepten. Der vierte Teil D stellt eine abschließende Würdigung der vorliegenden Arbeit dar.
P2X receptors are ligand (ATP)-gated ion channels that open an intrinsic cation permeable pathway in response to extracellular ATP released from both neuronal and non-neuronal cells. P2X receptors are abundantly distributed and mediate a wide variety of physiological functions, ranging from fast synaptic transmission in the central, peripheral, and enteric nervous system, to proinflammatory cytokine release from immune cells. The primary aim of this work was to elucidate the pathway that leads to the finally assembled trimeric P2X receptors, including the assessment of a possible role of ER chaperones and folding factors in this process. Additionally, the study was conducted to investigate the various ER quality control processes involved in the selection of “properly folded and assembled” P2X receptors that are suitable for the surface expression.
Das Genom des anaeroben ε-Proteobakteriums Wolinella succinogenes codiert überraschenderweise für Enzymkomplexe, die typisch für die aerobe Atmung sind. Die entsprechenden Gene werd en unter bekannten Wachstumsbedingungen nicht
exprimiert. Darunter findet sich ein Operon ( sdhABE) für eine putative „Succinat-Dehydrogenase“, die hohe Sequenzhomol ogien zu sog. „nicht-klassischen“ archaealen Succinat-Dehydrogenasen zeigt. In der vorliegenden Arbeit sollte die „Succinat-Dehydro genase“ mit Hilfe des etablierten genetischen Systems zur Modifikation und Produktion der Chinol:Fumarat-Reduktase(QFR) homolog in W. succinogenes produziert und charakterisiert werden. Das genetische System besteht aus der QFR- Deletions-mutante ΔfrdCAB und dem Vektor pFrdcat2, der aufgrund seiner zentralen Bedeutung im Rahmen dieser Arbeit sequenziert wurde.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Insektenzellen /Baculovirus-System für die heterologe Expression der NTPDase6 etabliert. Nach der Herstellung und Selektion des NTPDase6-positiven Baculovirus wurden drei Insektenzelllinien hinsichtlich der optimalen Expressions-bedingungen für die NTPDase6 analysiert. In Sf9(+Serum)-, Sf9(-Serum)- und High FiveTM-Zellen wurde eine Expression und Sekretion des aktiven Enzyms nachgewiesen. Ferner konnte durch die Analyse mit PNGaseF eine partielle N-Glykosilierung experimentell gezeigt werden. Die Aktivität im Kulturüberstand übertraf generell die Aktivität in der löslichen Zellfraktion. Die höchste GDPase-Aktivität war mit 22,96 nmol Pi /(106 Zellen x min) nach 6 Tagen im Kulturüberstand der SF9(-Serum)-Zellen zu verzeichnen. Nachdem die Erntequelle sowie der Erntezeitpunkt feststanden, wurden in den folgenden Experimenten verschiedene chromatographische Verfahren für eine Reinigung der NTPDase6 analysiert. Eine Bindung der NTPDase6 konnte für die Chromatographie mit Con A-Sepharose 4B, Q Sepharose Fast Flow, Reactive Red 120-Agarose, Reactive Green 19-Agarose, Cibacron Blue 3GA-Agarose und die Reactive Brown 10-Agarose verzeichnet werden. Hingegen wurde eine nur partielle Bindung der NTPDase6 für die Reactive Yellow 86-Agarose, Reactive Blue 4-Agarose und die Ni2+-NTA-Agarose nachgewiesen. Nicht oder kaum NTPDase6-bindend waren die CM Cellulose, GDP-Agarose, Protino Ni-TED und BD TALON. Ebenfalls analysiert wurde die Größenausschluss-Chromatographie mit Sephacryl S-100 HR unter verschiedenen Bedingungen. Für das finale Reinigungsschema wurde die Con A-Sepharose 4B-Chromato-graphie aufgrund der geringen Kosten und des großen Volumens als erster Reinigungsschritt eingesetzt. Als zweite Phase der sequentiellen Reinigung wurde die Cibacron Blue 3GA-Agarose ausgewählt, da in der Pilotstudie über die Reaktivfarbstoffe mit diesem Material die höchste Elution der GDPase-Aktivität beobachtet werden konnte. Für den dritten Schritt wurde aufgrund der hohen Trennschärfe die Ni2+-NTA-Agarose verwendet. Insgesamt wurde mit diesen drei Schritten eine 180 fache, partielle Reinigung der NTPDase6 erreicht. Es erwies sich, dass die erhaltene Proteinmenge für die geplanten Röntgenstrukturanalyse und die Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie nicht ausreichte. Als weitere Möglichkeit für die Untersuchung des angereicherten Enzyms stand die MALDI-TOF-Analyse zur Verfügung. In diesen Untersuchungen wurde die Aminosäuresequenz zu 43,9 % verifiziert und es ergaben sich Hinweise darauf, dass die potenzielle N256-Glykosilierungssstelle bei der heterologen Expression in Insektenzellen nicht genutzt wird. Weiterhin wurden die potenziellen N-terminale Signalpeptide und Spaltstellen der NTPDase6 in silico mit Hilfe des SignalP 3.0-Algorithmus analysiert. Diese Untersuchungen ergaben putative Spaltstellen an den Aminosäurepositionen L25 und A40 mit einer Wahrscheinlichkeit von 37 % und 7 %. Mit Triton X-114-Separationen wurde ferner nachgewiesen, dass 60,7 % der NTPDase6 in der Zelle in löslicher Form und 39,3 % in membrangebundener Form vorliegen. Die hier erbrachten Nachweise einer putativen N-terminalen Spaltstelle und der intrazellulären Spaltung des hydrophoben Signalpeptides deuten darauf hin, dass es sich bei der Sekretion des Proteins um einen physiologischen Vorgang handelt. Es ist wahrscheinlich, dass die gleichzeitige Lokalisation des Enzyms im Golgi-Apparat und im Kulturüberstand einen physiologisch relevanten Mechanismus darstellt und das Enzym extra- sowie intra-zellulär für die Hydrolyse von 5’-Nukleosid-Diphosphaten verantwortlich ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Lokalisation der NTPDase6 in vivo untersucht. Dazu wurden NTPDase6-Antikörper hergestellt und mit Hilfe von Immunoblots sowie in der Immunzytologie charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die NTPDase6-Antikörper nur in der Immunzytologie verwendet werden können. Zur Untersuchung der zellspezifischen Expression der NTDPase6 wurden anschließend immunhistologische Analysen am adulten Rattengehirn durchgeführt. Markierte Zellen präsentierten sich z.B. im gesamten Kortex des Gehirns, im Gyrus dentatus des Hippokampus, im Corpus striatum und im Septum. Die markierten Zellen zeigten eine organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns, die eine Markierung von Golgi-Stapeln vermuten lässt. Nur in Zellen mit einem großen Nukleus, bei welchen es sich um große Nervenzellen handeln dürfte, konnte die beschriebene Fluoreszenz nachgewiesen werden. Diese Markierungen als NTPDase6-spezifisch zu beurteilen ist jedoch schwierig, da die Präimmunkontrollen eine schwache, organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns von Zellen mit einem großen Nukleus aufwiesen. Insgesammt liefern die Untersuchungen einen neuen Beitrag zum Verständnis der Struktur und der Prozessierung der NTPDase6 sowie ein Verfahren zur heterologen Expression und zur anschließenden partiellen Aufreinigung des Enzyms.
Summary and Outlook The aim of this work was the investigation of the Mn2+ binding sites in hammerhead and the Diels-Alder ribozymes. This project consists of three main topics. In the first part quantification and structural characterization of Mn2+ binding sites in the m- and the tsHHRz using Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy are described. The second part summarizes the newest results obtained for the cleavage activity of both mand tsHHRzs in the presence of different Mg2+ and Mn2+ and Na+ ion concentrations using the new method with fluorescent-labeled RNAs. Here the influence of neomycin B on the structure of Mn2+ binding pockets and on the catalytic activity of both HHRzs is discussed. In addition, a possible role of Mn2+ ions is suggested from correlation of the EPR data with the kinetic results. The last chapter is devoted to quantification and differentiation of Mn2+ binding sites of the Diels-Alder ribozyme using continuous wave (cw) EPR experiments in solution. In this work EPR spectroscopy was used to study the binding of Mn2+ ions to the cis tsHHRz and to compare it with the binding to the trans mHHRz and to the Diels-Alder ribozyme. Cw EPR measurements showed that the tsHHRz possesses a single highaffinity Mn2+ binding site with a KD of < 10 nM at a NaCl concentration of 0.1 M. This dissociation constant is three orders of magnitude smaller than the KD determined for the single high-affinity Mn2+ site in the mHHRz (KD = 4.4 μM). The measurements of catalytic activity have been performed using fluorescent-labeled RNAs. Compared to the mHHRz, the cis tsHHRz cleaves up to 20-fold faster in the presence of Mg2+/Mn2+ ions with no saturation of the cleavage rates at high metal(II) ion concentrations. This is in good agreement with the last investigations on the trans tsHHRz (Nelson et al. 2005). Thus, the much stronger Mn2+ binding and higher cleavage activity were attributed to the interaction between the two external loops of the tsHHRz which reduces the RNA dynamics and traps the Mn2+ in the tightly folded conformation. Intriguingly, according to the EPR studies the binding constants for Mn2+ ions are several orders higher than the concentration of Mn2+ ions required for the catalytic activity (mHHRz: KD = 4.4 ± 0.5 μM and the Mn2+ concentration required to achieve half of the maximum cleavage rate [Mn2+]1/2 = 4.1 ± 0.6 mM respectively). Therefore, strongly bound Mn2+ ions seem to be needed for the folding of the HHRz, whereas weakly bound metal(II) ions are required to achieve full catalytic activity, and may be directly involved in catalysis. A comparison between the Electron Spin Echo Envelope Modulation (ESEEM) and Hyperfine Sublevel Correlation (HYSCORE) spectra of m- and tsHHRz demonstrates that both binding sites in HHRzs are structurally very similar. This suggests that the Mn2+ is located in both ribozymes between the bases A9 and G10.1 of the sheared G•A tandem basepair, as shown previously and in detail for the mHHRz (Vogt and DeRose 1998, Schiemann et al. 2003). However, the hyperfine spectra of the tsHHRz with 15N labeled G10.1 revealed no difference in comparison with the ones with 14N. This leads to an interpretation that the Mn2+ binding sites in both ribozymes are not identical. In addition, aminoglycoside antibiotic neomycin B inhibits the cleavage activity of both despite of the fact that it displaces the high-affinity Mn2+ ion only from the mHHRz. Hence, binding of neomycin B to the m- and the tsHHRzs probably occurs at different sites and neomycin B displaces only loosely bound Me2+ ions from the tsHHRs, whereas in the mHHRz both the high-affinity ion and the weakly bound ions are replaced. Therefore, it cannot be excluded that weakly bound Mg2+/Mn2+ ions, together with looploop interactions, induce a structural rearrangement which brings the high-affinity ion closer to the cleavage site. In the case of the Diels-Alder ribozyme it possesses five Mn2+ binding sites with KD = 0.6 ± 0.2 μM in solution under conditions where it is catalytically active. The competition experiment with Cd2+ allows to distinguish three different types of Mn2+ binding sites in the Diels-Alder ribozyme including inner-sphere monomeric Mn2+, monomeric Mn2+ bound through water-mediated contacts and electronically coupled dimeric Mn2+. Three Mn2+ ions are more strongly bound to the ribozyme via inner-sphere contacts, whereas two other Mn2+ ions form water-mediated outer-sphere contacts with the nucleotides of the ribozyme. The inner-sphere Mn2+ with the highest affinity and the fourth Mn2+ ions added to the ribozyme form a dimer with a Mn2+-Mn2+ distance of ~6 Å (as arises from simulations). Moreover, an addition of the product analog inhibitor (AMDA) to the [Diels-Alder ribozymes/ Mn2+] complex shows no conformational changes in the Mn2+ binding pockets. This is in good agreement with the recent studies which suggest that the Diels-Alder ribozyme is preorganized (Keiper et al. 2004). Some considerations on the evolution of the project (Outlook) There may be several venues of continuation of this project, which exploit on unique combination of EPR experiments and biochemical studies on RNA. This combination may allow us to significantly contribute to understanding of metal role in HHRz catalysis. Since the tsHHRz possesses the high affinity Mn2+ binding site (Kd < 10 nM) it creates a possibility to find conditions where the structural site is occupied by Mn2+, while catalytic sites are occupied by Mg2+ ions. If these conditions will be established by EPR titration, a set of standard biochemical experiments may be designed to look at the kinetic of cleavage and differentiate the “structural” and catalytic effects. The other experiment would be to look at the Mn2+ binding site in the tsHHRz in comparison with P1 and P1/P2 complexes and compare the results with the ones for the mHHRz. No matter the answer, P1 can be used as a simpler model to study the effect of tertiary structure on Mn2+ binding. A set of the tsHHRz mutants can be created to observe the mutations affect on Mn2+ binding sites, Mn2+ affinity and correlate the data with the kinetic analysis. FRET-based kinetic assay with fluorophore pairs on P1 and P2 can be designed for the kinetic experiments. Having this system one will be able to perform kinetic measurements 100-fold faster comparing to standard gel procedures (everything will be done in 96-wells). By manipulating the lengths and the sequence of P2 we most likely will be able to use FRET assay for the chemical step analysis (provided Kd > k2), and measure it using stop-flow system with time resolution of microseconds. And finally, one will be able to quantitatively measure the effect of neomycin B on the tsHHRz. Another interesting possibility would be to look at the state of metal(II) in the tsHHRz – enzyme alone (dissociated product) and in the enzyme-product complex and compare with the full-length tsHHRz. It will provide the information about the local rearrangements upon catalysis and the role of metal(II) ions. Furthermore, additional pulse-EPR experiments using 15N labeling have to be performed in order to reveal the location of the high-affinity Mn2+ binding site in the tsHHRz. Additionally, paramagnetic Mn2+ ions can be localized within the global fold of HHRzs using PELDOR and site-directed spin labeling. Further characterization of the high-affinity binding site in the tsHHRz can be performed using high-field ENDOR measurements in order to obtain the 14N and 31P tensors.
Traditionell-morphologisch begründete Hypothesen zur Großphylogenie der Metazoa sind im Verlauf der letzten Jahre durch molekularbiologische Untersuchungen grundsätzlich in Frage gestellt worden. Die molekularbiologisch begründete Metazoen-Großphylogenie wird seit einem Übersichtsartikel von ADOUTTE et al. (2000) meist als „New Animal Phylogeny“ bezeichnet (kurz: NAP); sie beinhaltet eine Restrukturierung des Stammbaumes (kladogenetischer Aspekt) und die Infragestellung einer morphologischen Komplexitätssteigerung nach dem Schema acoelomat-pseudocoelomat-coelomat (anagenetischer Aspekt). Hinsichtlich der Kladogenese steht die Neueinteilung der Bilateria in drei Superphyla Deuterostomia, Ecdysozoa und Lophotrochozoa im Vordergrund; die Genealogie innerhalb dieser drei Großgruppen ist aber z.Z. relativ schlecht aufgelöst, so daß sich Vergleichsmöglichkeiten mit morphologischen Vorgängermodellen schnell erschöpfen. Aus diesem Grunde wird in vorliegender Arbeit der anagenetische Aspekt als Ausgangspunkt für eine umfassende morphologische Interpretation der molekularbiologischen Resultate gewählt. Momentan wird auf molekularsystematischer und vergleichend-entwicklungsgenetischer Basis davon ausgegangen, daß die frühesten Bilaterier eine acoelomate Organisation aufwiesen, von hier aus eine relativ komplexe, polymer-coelomate Organisation erwarben, welche dann aber in zahlreichen Bilaterierlinien sekundär reduziert wurde. Die ursprünglich acoelomate Organisation wird rezent nur durch eine sehr isolierte Linie, die Acoela (ggf. auch Nemertodermatida) vertreten, während alle anderen Bilaterier von einem polymer-coelomaten „Urbilaterier“ abstammen sollen. In vorliegender Arbeit wird die Auffassung vertreten, daß die morphologische Deutung eines solchen anagenetischen Szenarios am ehesten anhand der Hydroskelett-Theorie von W. F. GUTMANN (1972 et mult.), sowie späteren auf diesem Entwurf aufbauenden Arbeiten (insbesondere der Gallertoid-Hypothese, BONIK et al. 1976) möglich ist, d.h. auf konstruktionsmorphologischer Grundlage. Um den Nachweis einer weitgehenden Übereinstimmung von NAP und Gallertoid-Hydroskelett-Theorie zu führen, werden für 36 Metazoenbaupläne (4 Nonbilaterier, 32 Bilaterier) aktuelle molekularphylogenetische Befunde den jeweiligen konstruktionsmorphologischen Interpretationen gegenübergestellt. Für die vier Nonbilateria-Linien ergibt sich eine Vereinbarkeit auf kladogenetischer Ebene insbesondere dann, wenn die Placozoa vor den Porifera abzweigen (z.Z. aufgrund von mtDNADaten anzunehmen); auf anagenetischer Ebene aufgrund von Studien, welche die „Diploblastica/ Triploblastica“-Unterteilung in Frage stellen (Mesoderm-Problem). Für die Bilateria ist u.a. festzuhalten, daß im Rahmen der Hydroskelett-Theorie kein Schwestergruppenverhältnis Annelida + Arthropoda angenommen wurde, so daß die umstrittene neue Großgruppe Ecdysozoa unproblematisch ist: Ecdysozoa werden durch Ableitung der „Aschelminthen“ von polymeren Vorformen einer Deutung zugänglich. Die Molekularsystematik der Annelida, aber auch der Deuterostomia ist mit konstruktionsmorphologischen Interpretationen vereinbar, bei den Deuterostomia v.a. der hochderivierte Status der Pterobranchia und Tunicata. Als kennzeichnendste Übereinstimmung ist die Einordnung der Tentaculata als hochabgeleitete Protostomier hervorzuheben, was sowohl als „Grundstein“ der NAP gilt (HALANYCH et al. 1995) als auch eine sehr spezifische Position der Hydroskelett-Theorie darstellt. Es wird gefolgert, daß die Gallertoid- Hydroskelett-Theorie zentrale Resultate der NAP besser zu integrieren vermag als andere Entwürfe. Konsequenzen für merkmalsmorphologische Deutungen werden aufgezeigt.
In dieser Arbeit werden Monozyten mit Hilfe der Ficoll-Trennung und Positivanreicherung durch das MACS-Magnetsystem gewonnen und durch die Zytokine GM-CSF und Interleukin 4 stimuliert. Nach zwei Tagen weisen die Zellen eine veränderte Morphologie auf, adhärieren zum Teil an Plastik und zeigen sowohl in der adhärenten als auch der nonadhärenten Fraktion charakteristische Merkmale dendritischer Zellen: In der Mikroskopie längliche, fädige Zytoplasmaausläufer sowie in der Durchflusszytometrie das Erscheinen der Oberflächenmarker CD1a und CD40. Die Zellen sind zu diesem Zeitpunkt zu ca. 90% unreife dendritische Zellen, wie die fehlende Ausprägung des Reifemarkers CD83 zeigt. Als unreife dendritische Zellen sind sie somit geeignet für die Antigenaufnahme; zur weiteren Ausreifung ist die Zugabe anderer Zytokine, z.B TNF α, notwendig. Als Mediengrundlage eignen sich sowohl RPMI+FCS als auch X-Vivo 15 und X-Vivo 20, wobei X-Vivo 15 und X-Vivo 20 aufgrund ihrer immunologischen Vorteile RPMI vorzuziehen sind. Ausblick Insgesamt sind schon vielversprechende Wege aufgezeigt worden, dendritische Zellen für die Immuntherapie zu gewinnen, und zwar sowohl aus CD34+ Stammzellen als auch aus CD14+ Monozyten. Wichtig wäre an dieser Stelle ein genauer Vergleich zwischen aus Monozyten und aus CD34+ Vorläuferzellen generierten Zellen in der Laborpraxis. Zum einen sollte hier untersucht werden, aus welcher Ausgangszelle sich größere Mengen an dendritischen Zellen generieren lassen. Die genaue Ermittlung der Zellzahl an jedem Kulturtag wäre hier von Bedeutung. Zum anderen sollte auch die Funktionalität der jeweiligen Zellen, etwa in der mixed-lymphocte-reaction, analysiert und miteinander verglichen werden, und zwar vor und nach zusätzlicher Gabe von TNF alpha. Die Mediengrundlagen X-Vivo 15 und X-Vivo 20 haben sich als gute Alternativen zu dem herkömmlich verwendeten RPMI 1640 gezeigt. An dieser Stelle wäre noch eine vergleichende Analyse der beiden Medien wichtig, und zwar im Hinblick auf die oben genannte Fragestellung der Zellzahl, Ausprägung der Oberflächenmarker und Funktionalität .
Seit der erstmaligen Beschreibung der MALDI (Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionisation) durch Michael Karas und Franz Hillenkamp, welche die massenspektrometrische Analyse auch großer Proteine über 100 kDa erlaubt, fand diese Technik sowohl unter den Massenspektrometrie-Gruppen als auch in Biochemischen Laboratorien rasche Verbreitung. MALDI kann inzwischen auf eine breite Palette von Biomolekülen angewendet werden und stellt heute - neben Elektrospray (ESI) -eine der beiden gebräuchlichsten massenspektrometrischen Methoden überhaupt dar. In ähnlicher Weise erlangte das Gebiet der Proteomics, der "systematischen Erforschung der zahlreichen und unterschiedlichsten Eigenschaften von Proteinen in paralleller Weise mit der Zielsetzung einer detaillierten Beschreibung der Struktur, Funktion und Steuerung biologischer Systeme im gesunden und krankhaften Zustand" eine Schlüsselstellung in der Biologie und damit einen erheblichen Einfluss auf alle Gebiete der Biologie, der Pharmazie und medizinisch verwandter Bereiche. In der Tat sind Proteine an allen biologischen Aktivitäten beteiligt und weisen die vielfaltigsten Eigenschaften auf, die in ihrer Gesamtheit zu unserem Verständnis biologischer Systeme beitragen. Die systematische Untersuchung dieser Eigenschaften macht das Gebiet der Proteomics aus und beinhaltet die Erforschung der Sequenz, Menge, Modifikationen, Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, der biologischen Aktivität, sub-zellulären Verteilung und dreidimensionalen Struktur. .... Letztlich wäre es für den Analytiker wünschenswert, aiie Schritte der MS-basierten Proteomics im Detail zu verstehen und damit vollständig zu beherrschen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb die drei entscheidenden Probenvorbereitungsschritte der MALDI-MS - gestützten Pmteomics näher untersucht. Proteinverdau: Der gebräuchliche Ansatz der MS-basierten Proteomics beinhaltet im ersten Schritt den (enzymatischen) Verdau der Proteinprobe, meist mit Trypsin aufgrund seiner sauber definierten Schnittstellen auf der C-terminalen Seite der basischen Aminosäuren Arginin (R) und Lysin (K) bei pH um 8. Dazu wurden in den vergangenen Jahrzehnten etliche Protokolle entwickelt, die auf eine möglichst vollständige Proteolyse und damit hohe Ausbeute an Spaltpeptiden abzielen. Probenaufreinigung: Als Bindeglied zwischen Proteinisolierung und MS-Analyse kommt der Aufieinigung des beim Verdau anfallenden Peptidgemischs entscheidende Bedeutung zu, da die Reinheit der Proben letzten Endes ausschlaggebend für die Qualität der Spektren ist. Auch hier sind kontinuierliche Anstrengungen zur Verbesserung im Gange, wobei in den letzten Jahren insbesondere auch spezielle Aufreinigungsmethoden für den Mikro-Maßstab beschrieben wurden, die den Bedürfnissen der Proteomics besonders entgegenkommen. Probenpräparation: Der letzte entscheidende Schritt vor der MALDI-Analyse besteht im ,,Spotting", dem Auftrag der zu analysierenden Probe zusammen mit der Matrix und deren Co-Kristallisation auf dem Probenteller. Hier bestimmen u.a. die Wahl der Matrix, der verwendeten Lösungsmittel sowie die Zugabe verschiedener Additive das Ergebnis. Obwohl der Einfluss der Matrix und Additiven auf den Desorptionsprozess einleuchtend und aus empirischen Erfahrungen seit langem bekannt ist, fehlt einem rationalen Vorgehen hier insofern die Grundlage, als dass leider noch immer kein Desorptions- und Ionisationsmechanismus gesichert ist. .... Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die vorliegenden Untersuchungen viele interessante Details und neue Ideen lieferten, die zur Verbesserung der MALDI-TOF-Analytik bei Proteomics beitragen können, so etwa: - die Portierung der einfachen, schnelle und preiswerten Probenaufreinigung mittels PVDF- und Nitrozellulosemembranen auf titerplattenbasierte Robotersysteme, bei denen eine automatisierte Zugabe der geeigneten Membranstücke, gefolgt von einfachen Wasch- und Extraktions-Schritten das Probenhandling wesentlich erleichtern sollten, - eine mögliche Verbesserung der Proteinidentifizierung durch Selektion eher hydrophiler Peptide durch neue Materialien wie HILIC, da die Mehrzahl der zur herangezogenen Peptide eher hydrophoben Charakter besitzt, - die weitere Verwendung und Erweiterung der im Rahmen dieser Arbeit erstellten Datenbanken zur Aufklärung der Zusammenhänge zwischen Peptidsequenz, der damit verbundenen physikochemischen Eigenschaften und Selektivitäts- / Unterdrückungseffekten bei der MALDI-MS.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine medikamentöse Therapie mit Atorvastatin bei Patienten mit stabiler KHK zur Steigerung kultivierter EPCs mit verbesserter funktioneller Aktivität führt. Die Daten zeigen des weiteren, dass die Statintherapie nicht die Zahl hämatopoetischer Progenitorzellen erhöht, sondern die Differenzierung in zirkulierende EPCs fördert. Ein Faktor, wie z.B. VEGF, GM-CSF oder TNF-alpha, der die erhobenen Ergebnisse reflektiert bzw. vermittelt, konnte nicht gefunden werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass Atorvastatin über den PI3K-Signaltransduktionsweg, unabhängig von NO, die Differenzierung von EPCs stimuliert. In einer zweiten Studie konnte gezeigt werden, dass auch der ACE-Inhibitor Ramipril vor allem eine Verbesserung der funktionellen Aktivität der EPCs induzierte und ebenfalls zu einer Steigerung der Zahl der kultivierten EPCs führte. Aufgrund der starken Schwankungen der FACS-Messungen bei kleinen Patientenkollektiven besteht eine Diskrepanz zwischen den kultivierten und zirkulierenden EPCs. Auch konnte gezeigt werden, dass die EPC-Zahl und -Funktionalität vor Therapie durch den HGF-Serumspiegel reflektiert wurde und positiv mit ihm korrelierte. Diese Korrelation blieb jedoch unter Ramipriltherapie nicht bestehen, so dass davon auszugehen ist, dass der Einfluss von Ramipril nicht durch HGF, sondern über einen noch zu untersuchenden Mechanismus vermittelt wird. So können Statine und potentiell einige Subgruppen der ACE-Inhibitoren neue Therapieoptionen der KHK eröffnen.
Die durch das humane Zytomegalievirus (HCMV) ausgelöste Retinitis kann bei HIV-Infizierten und immunsuppremierten Patienten zu einer Einschränkung der Sehfähigkeit bis hin zu Erblindung geführt. Die HCMV-Retinitis schädigt die Retina, diese Schäden sind in der Regel nicht reversibel. Stets besteht auch die Gefahr des Ausbrechens der Infektion im kontralateralen Auge. Die Therapie kann zu schweren Nebenwirkungen führen, jedoch konnte durch die Entwicklung des oral anwendbaren Valganciclovir eine deutliche Vereinfachung der Behandlung erreicht werden. Mit der Untersuchung der HCMV-Replikation in retinalen Pigmentepithel (RPE)-Zellen steht ein Versuchsmodell zur Verfügung, in welchem sowohl die Vermehrung des Virus in einer für die HCMV-Retinitis bedeutsamen Zelllinie untersucht werden kann, als auch Erkenntnisse über das Verhalten des Virus in immunprivilegierten Geweben gewonnen werden können. Über Valproinsäure (VPA) ist bekannt, dass dieses Medikament zu einer gesteigerten Replikation des HI-Virus führt, auch wurde für supertherapeutische Konzentrationen ein Einfluss auf die Replikation von HCMV beschrieben. Valproinsäure erfährt neben ihrer ursprünglichen Indikation als Antiepileptikum zunehmend eine Erweiterung des Indikationsspektrums. Neben der Verwendung bei psychiatrischen Erkrankungen, insbesondere bipolaren Erkrankungen und der Schmerztherapie stellt die Anwendbarkeit von VPA und Derivaten des Medikaments in der Therapie maligner Tumore eine interessante Entdeckung dar. Obwohl gezeigt werden konnte, dass VPA neben einer Beeinflussung des Neurotransmitter-Stoffwechsels unter anderem zu einer Hemmung der Histondeacetylase (HDAC), zu Veränderungen an intrazellulären Signaltransduktionskaskaden, dem NO-Stoffwechsel und peroxysomal Proliferator-aktivierten Rezeptoren führt, ist eine genaue Zuordnung der Wirkmechanismen zu den Effekten des Medikaments noch nicht vollständig möglich. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Valproinsäure auch in therapeutischen Konzentrationen und in einer für die HCMV-Retinitis wichtigen Zelllinie zu einer Replikationssteigerung des HCMV führt. Die Replikationssteigerung zeigte sich sowohl im vermehrten Auftreten von frühen und späten Virusproteinen als auch in der vermehrten Abgabe von infektionsfähigen Viren an das Kulturmedium. In Zellkulturen ist die Vorbehandlung mit VPA vor der Infektion mit HCMV entscheidend für die Steigerung der Replikation, es lässt sich eine Konzentrations- und Zeitabhängigkeit der Replikationssteigerung für den untersuchten Bereich zeigen. Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Ergebnisse lassen es unwahrscheinlich erscheinen, dass die Steigerung der HCMV-Replikation über eine Stimulation der an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligten Enzyme PKC, ERK1/2 und p38 vermittelt wird. Ebenso weisen vorliegende Ergebnisse darauf hin, dass die durch VPA bedingte HCMVReplikationssteigerung nicht durch eine Veränderung der iNOS- und der PPAR-Aktivität bedingt ist. Es ist publiziert, dass VPA die HDAC inhibiert und dass die Replikation von HCMV, wie auch die anderer Viren, zum Teil über die Acetylierung von Histonen reguliert wird. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass auch in RPE-Zellen VPA zu einer Hemmung der HDAC führt, welche im untersuchten Rahmen zeit- und konzentrationsabhängig ist. In dieser Arbeit werden zudem eine Reihe von Parallelen zwischen dem HDAC-Inhibitor TSA und VPA aufgezeigt. Auch TSA führt in RPE-Zellen zu einer Stimulation der HCMV-Replikation. Unterschiede zwischen VPA und TSA zeigten sich im früheren Auftreten und kürzeren Anhalten der Stimulation der Virusreplikation nach TSA-Vorbehandlung. Diese Unterschiede könnten jedoch Ausdruck einer unterschiedlichen Pharmakokinetik der beiden Wirkstoffe sein. Die Ergebnisse vorliegender Arbeit lassen die Hemmung der HDAC und eine hieraus folgende Hyperacetylierung von Histonen durch VPA als wahrscheinlichste Ursache für die stimulierende Wirkung des Medikamentes auf die HCMV-Replikation erscheinen.