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Entwicklung redoxaktiver para-Hydrochinonliganden und deren Anwendung in der Koordinationschemie
(2006)
Niedrigdimensionale Spinsysteme sind hinsichtlich ihrer magnetischen und elektronischen Eigenschaften von großem Interesse. Einen Zugang zu derartigen Systemen bieten Koordinationspolymere aus paramagnetischen CuII-Ionen (S = ½) und verbrückenden para-Hydrochinon-Liganden. CuII-Ionen eignen sich als Spinträger unter anderem deshalb, weil sie stabile quadratisch-planare Komplexe auszubilden vermögen, wodurch die Entstehung niedrigdimensionaler Strukturen begünstigt wird. Die Attraktivität para-Hydrochinon-basierter Brückenliganden beruht auf deren Redoxaktivität und der Tatsache, dass sie wegen ihrer starren π-konjugierten Struktur in der Lage sind antiferromagnetische Wechselwirkungen zwischen zwei paramagnetischen Metallzentren zu vermitteln. Darüber hinaus sind para-Hydrochinonderivate meist auch in der radikalischen Semichinonform stabil. Hieraus ergibt sich die Möglichkeit in para-Hydrochinon-verbrückte Koordinationspolymere durch elektrochemische Dotierung gezielt zusätzliche ungepaarte Spins zu injizieren. ...
Ziel der vorliegenden Arbeit sind Strukturuntersuchungen an geplant gezüchteten Einkristallen elektronenreicher Iod- und Schwefel-Verbindungen, ergänzt durch zugehörige Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen. Besonderes Augenmerk gilt insbesondere Molekülen mit Thiophenyl-Substituenten R-S-(C6H5) und ihren isovalenzelektronischen Derivaten vom Typ R-NH-(C6H5) sowie den bisher unbekannten Donator/Akzeptor-Komplexen des Iodanils. Durch optimierte Auswahl jeweils geeigneter Lösungsmittel und Kristallisationsbedingungen gelingt es, zahlreiche unterschiedliche Typen kristalliner Nichtmetall-Verbindungen zu züchten. Die Strukturen der isolierten Einkristalle werden durch Vergleich mit bereits literaturbekannten sowie anhand quantenchemischer Berechnungen diskutiert und vertiefen das Verständnis der experimentellen Befunde wesentlich. ... Insgesamt belegen die in der Dissertation detalliert beschriebenen Ergebnisse, daß Kombinationen von gezielter Kristallzüchtung, anschließender Strukturbestimmung und quantenchemische Berechnungen zahlreiche Informationen über Wechselwirkungen in Kristallen liefern. So verdeutlicht die anschauliche Betrachtung der I2-Komplexe durch zugehörige Einkristallstrukturen sowie quantenchemische Modellrechnungen, daß auch geringe Wechselwirkungen teils beträchtliche Einflüsse auf Stöchiometrien und Strukturparameter in Kristallen ausüben. Das Schlußbeispiel Tris(thiophenyl)methan-Dimer belegt durch alle notwendigen Messungen wie Kristallstrukturanalyse, quantenchemische hochkorrelierte Berechnungen und massenspektrokopische Messungen, wie sich durch das Zusammenwirken moderner Methoden unerwartete Ergebnisse für einen neuartigen Verbindungstyp festigen lassen. Die lohnenden Ergebnisse der Untersuchungen erweitern die Kenntnisse statischer Aspekte bei Selbstorganisations-Phänomenen.
In der vorliegenden Arbeit wurden festkörperunterstützte Membranen in Verbindung mit schnellen Lösungswechseln als Methode zur Messung von elektrogenen Transportvorgängen in biologischen Membranen untersucht und charakterisiert. Parallel zu einem manuellen Messsystem wurde eine Technologie auf der Basis eines Pipettierroboters mitentwickelt und charakterisiert, die es erlaubt, automatisierte Messungen mit erhöhtem Durchsatz durchzuführen. Die Sensoren wurden als Sensorarray auf der Basis einer standardisierten 96er Mikrotiterplatte realisiert. Zur Lösungshantierung kam ein Pipettierroboter zum Einsatz, der mit einer selbstentwickelten Injektionseinheit bestückt wurde. In dieser Injektionseinheit ließen sich die verwendeten Lösungen überschichten, wodurch ein Lösungswechsel von einer substratfreien zu einer substrathaltigen Lösung durchgeführt werden konnte. Mit dem beschriebenen System konnten die in dieser Arbeit behandeleten Proteine EAAC1 und NhaA erfolgreich aktiviert und charakterisiert werden. Hinsichtlich der Transportaktivität wurden mit beiden Proteinen vergleichbare Ergebnisse erzielt wie mit dem manuellen Messsystem. Aus kultivierten CHO-Zellen, die den neuronalen Glutamattransporter EAAC1 rekombinant und fuktional exprimierten, wurden EAAC1-haltigen Cytoplasmamembranen in einem Aufreinigungsschritt (Membranpräparation) gewonnen. Die derart vorliegenden Membranfragmente konnten erfolgreich auf der festkörperunterstützten Membran angelagert werden. In der Abwesenheit von Natriumionen war der EAAC1 nicht aktiv, und er konnte durch den spezifischen kompetitiven Inhibitor TBOA inhibiert werden (Inhibitionskonstante Ki = 1µM). Es wurde beobachtet, dass die Transportströme des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine andere Kinetik aufwiesen als in der Anwesenheit von Kaliumionen, und die Affinität für L-Glutamat war in der Abwesenheit von Kaliumionen verringert (K0,5 = 144 µM). Analysen der Signalformen ergaben eine reduzierte Relokationsrate, wobei es wahrscheinlich ist, dass der EAAC1 ohne Kaliumionen einen Single-Turnover durchführt. Eine weitere Eigenschaft des EAAC1 ist die Fähigkeit, bestimmte Anionen zu leiten. Diese Anionenleitfähigkeit ist strikt Natriumabhängig und wird durch die Bindung von L-Glutamat getriggert. Wenn bei einem Experiment zusätzlich bestimmte Anionen (z.B. Chlorid oder Thiocyanat) anwesend waren, wies der Transportstrom des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine negative Komponente auf. Diese Komponente konnte auf den Einstrom der Anionen entlang des durch den Glutamattransport aufgebauten elektrischen Gradienten zurückgeführt werden. Des Weiteren konnte die Anionenleitfähigkeit mit Anionensprüngen in der Anwesenheit von L-Glutamat und Natriumionen direkt induziert werden. Damit wurden erstmals kanalartige Ionenströme an der festkörperunterstützten Membran nachgewiesen. Der Anionenstrom wies dabei die gleiche Abhängigkeit von der Glutamatkonzentration auf (K0,5 = 31 µM) wie der Transportstrom. Der Übergang in den leitfähigen Zustand und der Transport hängt demnach von dem gleichen L-glutamatgebundenen Zustand des EAAC1 ab. Dies konnte auch unter Verwendung des Inhibitors HIP-B gezeigt werden. HIP-B wurde erstmals an EAAC1 getestet und wies eine Inhibitionswirkung auf den Transportstrom auf, die nicht auf eine kompetitive Bindung zurückzuführen war. Die Anionenleitfähigkeit ließ sich mit HIP-B hingegen nicht inhibieren. Der bakterielle Natrium-Protonen-Austauscher NhaA lag rekonstituiert in Liposomen vor, die auf der festkörperunterstützten Membran angelagert wurden. Bedingt durch die RSO-Orientierung des NhaA, konnte der Natriumtransport entgegen der natürlichen Transportrichtung (extrazelluläre Natriumbindung) untersucht werden. Der Transportstrom wies eine ausgeprägte Abhängigkeit vom pH-Wert auf. Bei neutralen bzw. sauren pH-Werten (pH <= 7) war die Aktivität des NhaA gegenüber dem alkalischen Bereich (7 < pH < 9) erheblich reduziert. Dieses Verhalten entspricht Literaturangaben für die Intrazellulärseite des NhaA. Dennoch war der NhaA bei einem neutralen pH-Wert nicht vollständig inaktiv. Die Affinität für Natriumionen konnte bei einem pH-Wert von 8,5 zu K0,5 = 11 mM und bei pH 7,0 zu K0,5 = 180 mM bestimmt werden. Neben einer Verringerung der Wechselzahl sinkt im neutralen/sauren Bereich also auch die Affinität für Natriumionen. Durch die Verwendung von Liposomen, in denen der NhaA mit verschiedenen Lipid- zu Protein-Verhältnissen rekonstituiert wurde, konnte gezeigt werden, dass die Messströme auf die Aufladung der Liposomen zurückführbar sind. Der Transportstrom konnte mit der amiloridähnlichen Substanz 2-Aminoperimidin inhibiert werden (Ki = 3 µM). Eine Inhibitionswirkung war nur zu beobachten, wenn der pH-Wert kleiner als pH 8 war. Zusammmen mit der ausgeprägten pH-Wertabhängigkeit kann dieses Phänomen auf eine pH-induzierte Konformationsänderung des NhaA zurückgeführt werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen aufzuklären, die im Rahmen inflammatorischer Erkrankungen zur Expression sogenannter Akute Phase Proteine führen. Der Fokus lag hierbei auf der Untersuchung von Signaltransduktionkaskaden, die aktiviert durch proinflammatorische Zytokine in der Leber die Bildung proatherogener Plasmaproteine wie C-reaktives Protein zur Folge haben. Zu diesem Zweck sollten verschiedene in vitro Zellmodelle etabliert und evaluiert werden. Neben Genexpressionsanalysen in zytokin-stimulierten primären humanen Hepatozyten, sowie in den Hepatoma-Zellinien HepG2 und Hep3B sollte die Manipulation der CRP-Expression durch gezielten Gentransfer und die Anwendung der siRNA-Technologie im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen. Zu diesem Zweck sollten Transkriptionsfaktoren der NFKB-Familie, sowie der Familie der „Signal transducer and activator of transcription“ (STAT) und der CCAAT/Enhancer-bindenden Proteine (C/EBP) überexprimiert werden, bzw. deren Expression durch die Transfektion mit entsprechenden siRNA-Oligonukleotide gehemmt werden. Ein weiteres wichtiges Ziel war es, ein zelluläres Modellsystem zu generieren und zu charakt-erisieren, das zur Identifizierung von Substanzen geeignet ist, die die CRP-Expression modu-lieren oder inhibieren.
Evaluation der Effektivität der kombinierten TACE von Bletilla striata (mit und ohne Ligatur) im Vergleich zur TACE ohne Bletilla striata als Therapie des hepatozellulären Karzinoms HCC im tierexperimentellen Modell an der ACI-Ratte. Material und Methoden: Insgesamt wurden 30 ACI-Ratten in drei Gruppen eingeteilt: In Gruppe A (Kontrollgruppe) dienten 10 ACI-Ratten als Kontrolltiere. In Gruppe G und H (Therapiegruppen) wurden jeweils 10 ACI-Ratten als Versuchstiere untersucht. Den Tieren wurde dazu zu Beginn des Versuches ein Tumor implantiert (2mm ³), der aus einem Tier (Spendertumor) außerhal b des eigentlichen Versuches entnommen wurde. Jedem Tier der Therapie- und Kontrollgruppe wurde dieser zwei Kubikmillimeter große Tumor unter die Lebe rkapsel des Lobus sinistra eingepflanzt (Intrahepatische Tumorimplantation, IHTI). Diese Tumorstücke wurden aus dem Spendertumor, der aus Tumorzellen des Morris- Hepatoms 3924A innerhalb von vierzehn Tagen im Spendertier heranwuchs, zugeschnitten. Dreizehn Tage nach der
Tumorimplantation erfolgte eine erste Kernspinuntersuchung (MRT1). Einen Tag später wurde bei den Tieren, durch eine retrograd e Injektion in die A. gastroduodenalis, die
Therapie mit Bletilla striata (BS) begonne n. Es wurde den Ratten mit Sandwichtechnik über einen Zeitraum von 20 Minuten Mitomy cin (0,1 mg) + Lipiodol (0,1 ml) + BS appliziert. In Therapiegruppe G wurde diese Therapie mit und in Gruppe H ohne
Ligatur der A. hepatica propria durchgeführt. In der Kontrollgruppe A wurde die TACE ohne BS und ohne Ligatur angewandt. Es wurden von jedem Tier zwei Kernspinaufnahmen gemacht (MRT 1 und MRT2). Vor der Applikation wurde die erste
(MRT1) und 13 Tage nach der Opera tion wurde eine zweite (MRT 2) der Tiere erstellt. Von jedem Tier wurden anschließend die Kernspinaufnahmen miteinander verglichen und die Volumenzunahmen festgestellt (MRT1 / MRT2 = V1 / V2).
Das Maßgebliche Tumorvolumen vor Applikation (V 1) war in Gruppe G 0,0374 cm 3, in Gruppe H 0,0573 cm 3 und in Kontrollgruppe A 0,0380 cm 3. Nach Applikation (V 2) war das Maßgebliche Tumorvolumen in Gruppe G 0,0355 cm 3 (BS mit Ligatur), in Gruppe H 0,2248 cm 3 (nur BS) und in Kontrollgruppe A 0,3674 cm 3. Das Maßgebliche Verhältnis (V 2 / V 1) war in Gruppe G 1,5324, in Gruppe H 6,2791 und in Kontrollgruppe A 9,1382. Nach Analyse der Daten durch den Dunnett ́s Test (1)(ANOVA), konnte für Therapiegruppe G eine signifikante Eindämmung des Tumorwachstums (P < 0,01) und für Gruppe H keine Eindämmung (P > 0,05) nachgewiesen werden. Nach Student-New man-Keuls Test gab es signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen G und A (P < 0,05). Die besten therapeutischen Ergebnisse konnten In Gruppe G erzielt werd en. Keines der Tiere starb während der Implantation bzw. der postoperativen Ph ase, es ließ sich jedoch die Bildung von intrahepatischen Metastasen bei zwei Tieren der Kontrollgruppe feststellen. Schlussfolgerung: Die Effektivität der TACE im tierexperimentellen Modell wird durch die kombinierte Applikation mit Bletilla striata und Ligatur der A.hepaticapropria im Vergleich zur klassischen Anwendung der TACE ohne Modifikation deutlich gesteigert. Bletilla striata ist in der Anwendung für die Chemoembolisation ein wirkungsvolles und verlässliches Embolisat . Es stellt sich nun die Aufgabe, experimentell und klinisch zu verifizieren, in welchem Maße der Einsatz einer Ligatur zum tragen kommt.
Die radikale Zystektomie in Kombination mit einer pelvinen Lymphadenektomie gehört zur Standardtherapie in der Behandlung des muskelinvasiven Harnblasenkarzinoms. Der Stellenwert der pelvinen Lymphadenektomie liegt nicht nur als Staging-Maßnahme vor, sondern erfolgt auch unter onkologischen Aspekten zur Verbesserung der lokoregionären Tumorkontrolle. Ob der Patient von der zeitaufwendigen und eventuell auch morbiditäsreichen extensiven Lymphknotendissektion profitiert, versuchen einige retrospektive Analysen zu beantworten. Seit den frühen achtziger Jahren, als Skinner berichtete, dass durch die pelvine Lymphadenektomie Patienten mit Lymphknotenmetastasen möglicherweise geheilt werden können, wird der therapeutische Nutzen der Lymphadenektomie im Rahmen der radikalen Zystektomie beim muskelinvasiven Urothelkarzinom der Harnblase kontrovers diskutiert. Es gibt Hinweise in der Literatur, dass Patienten von der pelvinen Lymphadenektomie profitieren, wenn der Lymphknotenbefall minimal ist und der Blasentumor die Organgrenzen noch nicht überschritten hat. Der tatsächliche Nutzen der Lymphknotenentfernung ist jedoch weiterhin umstritten. Bislang ist unklar, ob durch die Lymphadenektomie das Überleben von Patienten mit positiven Lymphknoten verlängert werden kann und ob eine erweiterte Lymphadenektomie die Ergebnisse verbessert. Es existieren bislang jedenfalls keine überzeugenden Daten, die beweisen , dass die systemische Ausbreitung eines malignen Tumorleidens tatsächlich mit einer lokalen Therapiemaßnahme kurativ behandelt werden kann. Der Stellenwert der Lymphadenektomie beim muskelinvasiven Harnblasenkarzinom ist noch lange nicht geklärt. Angefangen von der Durchführung, Ausdehnung, Verteilung bis zur Auswertung und die daraus resultierenden Konsequenzen, sind bis heute noch nicht standartisiert. Diese Faktoren spielen jedoch eine wesentliche Rolle zur Verbesserung der Behandlungsergebnisse beim lymphogen metastasierten Harnblasenkarzinom. In der folgenden retrospektiven Analyse haben wir anhand unseres Krankengutes das Überleben lymphknotenpositiver Patienten nach radikaler Zystektomie untersucht und in Subgruppen klassifiziert sowie miteinander verglichen. Die Lymphknotendichte als Prognosefaktoren für das fortgeschrittene Harnblasenkarzinom sollte daraus evaluiert werden.
In der vorliegenden Arbeit wird die Anwendung einer optischen Detektionsmethode zur Messung der magnetischen Eigenschaften eines verdünnten Systems angewandt und zur Untersuchung von High-Spin–Low-Spin-Komplexen etabliert. Die von uns angewandte MCD-Spektroskopie vereint eine optische Messtechnik, die auf die Messung ultraschneller Effekte erweiterbar ist, mit einer direkten Messmethode für die magnetischen Eigenschaften einer verdünnten Probe des LD-LISC-Komplexes Fe(stpy)4(NCSe)2 (stpy = 4-styrylpyridin). Der LD-LISC-Effekt ist ein licht-induzierter Spinübergang, der auftreten kann, wenn von einem Paar metallorganischer Komplexe eines einen thermischen Spinübergang aufweist und optisch zwischen den beiden Komplexes geschaltet werden kann, beispielsweise durch eine Photoisomerisation. Im Falle von Fe(stpy)4(NCSe)2 ist der cis-Komplex für alle Temperaturen im high-Spin-Zustand, während der trans-Komplex einen thermischen Spinübergang aufzeigt. Mit MCD-Spektroskopie wurde die Magnetisierung des Grundzustands des Fe(II)(stpy)4 (NCS)2-Komplexes in der trans- und der cis-Konfiguration in verdünnten dotierten Polymerfilmen untersucht. Diese magnetooptische Spektroskopie-Technik ermöglicht die Identifizierung von MLCT-Bändern des Eisen-Komplexes, die in optischen Spektren durch stärkere Ligandenabsorptionsbäder überlagert sind und sich nur schlecht auflösen lassen. Das untersuchte System dient als Beispiel für eine Reihe von Verbindungen, die photoschaltbare magnetische Eigenschaften besitzen. Für den Komplex in der cis-Form können bei tiefen Temperaturen durch die Messung von MCD-Daten bei variablem Feld und variabler Temperatur der Spinzustand, der g-Tensor und die Übergangspolarisierung M, sowie achsiale und rhombische Verzerrungen der oktaedrischen Geometrie des Moleküls bestimmt werden. Für den Komplex in der trans-Form konnte erstmals der Unterschied im Spinübergangsverhalten zwischen einer verdünnten Probe und einer konzentrierten Pulverprobe mit einem High-Spin–Low-Spin-Übergangskomplex gezeigt werden. Mit MCD-Spektroskopie konnten die Spinübergangsparameter bestimmt werden, die mit SQUID-Magnetometrie nur unzureichend untersucht werden können. Erste Messungen der MCD-Spektren während gleichzeitiger optischer Anregung zur Beobachtung des LD-LISC-Effekts auf langsamen Zeitskalen zeigen keine Änderung der MCD-Spektren trotz ausreichender Anregungsleistung, die zu einer deutlich messbaren Photoisomerisation geführt hat. Bei einer Temperatur von 120K der Messung ist der trans-Komplex bereits zu einem großen Teil im High-Spin-Zustand, so daß der Unterschied zwischen den Spinzuständen des cis- und des trans-Zustandes unterhalb der Auflösung des verwendeten Aufbaus liegt. Die in dieser Arbeit erzielten Resultate demonstrieren, daß die MCD-Spektroskopie eine geeignete Technik zur Messung des magnetischen Zustands von LD-LISC-Komplexen (oder anderen Komplexen) in verdünnten, zufällig orientierten Proben ist.
The dissertation collects four self-contained essays which contribute to the literature on wage structures, heterogeneous labor demand, and the impact of trade unions. The first paper provides a detailed description of the evolution of wage inequality in East and West Germany in the late years of the twentieth century. In contrast to previous decades, wage inequality has been rising in several dimensions during that period. The second paper identifies cohort effects in the evolution of both wages and employment. Observed structures are consistent with a labor demand framework that incorporates steady skill-biased technical change. Substitutability between skill and age groups in the German labor market is found to be relatively high. Simulations based on estimated elasticities of substitution illustrate that higher wage dispersion between skill groups would have contributed to a reduction in unemployment. The third paper estimates determinants of individual union membership decisions and studies the erosion of union density in East and West Germany. Using corresponding predictions of net union density, the fourth paper analyzes the link between union strength and the structure of wages. A higher union density is associated with lower residual wage dispersion, reduced skill wage differentials, and a lower wage level. This finding is in line with an insurance motive for union action. The thesis comprises the following articles: (1) “Rising Wage Dispersion, After All! The German Wage Structure at the Turn of the Century,” IZA Discussion Paper 2098, April 2006. (2) “Skill Wage Premia, Employment, and Cohort Effects: Are Workers in Germany All of the Same Type?”, IZA Discussion Paper 2185, June 2006, joint with Bernd Fitzenberger. (3) “The Erosion of Union Membership in Germany: Determinants, Densities, Decompositions,” IZA Discussion Paper 2193, July 2006, joint with Bernd Fitzenberger and Qingwei Wang. (4) “Equal Pay for Equal Work? On Union Power and the Structure of Wages in West Germany, 1985–1997,” translation of “Gleicher Lohn für gleiche Arbeit? Zum Zusammenhang zwischen Gewerkschaftsmitgliedschaft und Lohnstruktur in Westdeutschland 1985–1997,” Zeitschrift für Arbeitsmarkt-Forschung, 38 (2/3), 125-146, joint with Bernd Fitzenberger, 2005.
Die Person, deren Leben und Werk ich mich in dieser Arbeit zu nähern versuche, kann auch dreißig Jahre nach Erscheinen ihres institutikonenkritischen Werkes "Entschulung der Gesellschaft" in Deutschland 1972 noch immer als vergleichsweise rätselhaft bezeichnet werden. Ältester Sohn einer zum Protestantismus übergetretenen Jüdin und eines katholischen Kroaten aus Split an der Küste Dalmatiens, die Ehe steht unter keinem guten Stern. Der Nationalsozialismus hält in Wien Einzug, die Mutter flieht mit den drei Kindern nach Florenz. Weitere Einzelheiten aus der Kindheit, der Situation der Familie und vor allem zu den Schulerfahrungen, die tragfähig wären, waren nicht bekannt. Ivan Illich wurde Priester, er wirkte in New York und Puerto Rico, wurde später Leiter eines Zentrums für Sprachlernen in Cuernavaca/Mexiko mit dem Namen CIDOC. Fotos zeigen einen entschlossen wirkenden, hageren Mann mit aristokratischen Zügen. Illich forderte unter anderem dazu auf, das Bildungswesen, so wie es war, aufzulösen und radikal neu zu organisieren. Sein Buch über die Entschulung wurde ein Bestseller, immerhin ein Sachbuch, verkaufte es sich in sechs Auflagen von 1973 bis 1981. ...
Eine große Zahl natürlicher sekundärer Metabolite sind kleine und strukturell oft sehr verschiedene Polypeptide und Polyketide. Diese bioaktiven Substanzen haben im allgemeinen ein breit aufgestelltes therapeutisches Potential und werden von verschiedenen bakteriellen Stämmen und Pilzen biosynthetisiert. Sie sind sowohl biologisch, als auch therapeutisch wichtig als Cytostatika, Immunsuppressiva und Antibiotika mit einem sehr großen antibakteriellen und antiviralen Potential. Diese oft äußerst komplexen Polypeptide und Polyketide werden von modular aufgebauten Megaenzymen in mehrstufigen Mechanismen synthetisiert. Für die Synthese dieser Peptide sind sehr große Proteincluster verantwortlich, die meistens aus einer begrenzten Anzahl sehr großer, Multidomänen umfassenden, Superenzyme aufgebaut werden. Diese Proteincluster mit einem Molekulargewicht bis in den Bereich von MegaDalton werden als nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) und Polyketidsynthetasen (PKS) bezeichnet. Die NRPS Systeme zeichnen sich dadurch aus, daß für die biosynthetisierten Polypeptide keine Information in Form von Nukleinsäuren wie DNA oder RNA kodiert (Walsh, C.T., 2004; Sieber & Marahiel, 2005). Für die Synthese der Polypeptide ist eine Aktivierung der einzelnen Bausteine, der Aminosäuren, durch Amino-acyl-adenylierung notwendig. Im Anschluß an die Aktivierung, wird die aktivierte Aminosäure über einen Thioester gebunden weitertransportiert. Die Thioesterbildung erfolgt an Cysteaminthiolgruppen intrinsischer 4’-Phosphopantethein-kofaktoren. Eine Modul einer NRPS stellt eine geschlossene Einheit zum Einbau einer Aminosäure mit einer hohen Spezifität für das Substrat und die biosynthetische Reaktion dar. Diese Module sind aus Domänen aufgebaut, die definierte Funktionen haben und mittels flexibler Linker miteinander verbunden sind. Die Domänen werden nach ihrer Funktion unterschieden. Die Acyl-adenylierung oder Aktivierung eines Substrates, beispielsweise einer Aminosäure, erfolgt durch die A-Domänen. Die Peptidyl- oder Acyltransportfunktion der aktivierten Substrate wird durch Thioester-domänen (T-Domäne), auch PCP (peptidyl carrier domain) genannt, bewältigt. Die Biosynthese der Kopplungsreaktion, beispielsweise die Ausbildung der Peptidbindung in NRPS Systemen, erfolgt an den Kondensations-Domänen (C-Domäne). Für die Substratspezifität eines Synthesemoduls sind die A-Domänen verantwortlich, welche die Aktivierung eines Substrat durch ATP-Hydrolyse ermöglichen. In NRPS Systemen sind auch Zyklisierungsreaktionen, durchgeführt von Cyclase-Domänen (Cy-Domänen), L/D-Epimerase-funktionen (E-Domänen) und N-Methylierungen (M-Domänen) beschrieben. So wird in Tyrocidin A an zwei Positionen spezifisch Phenylalanin in die D-Form epimerisiert und anschließend in der Peptidbiosynthese verwendet. Die Interaktion und Erkennung zwischen den multi-modularen Superenzymen, zum korrekten Aufbau der kompletten Synthetase, wurden in letzter Zeit Kommunikations-Domänen (COM-Domänen) beschrieben. Wie die aufgebaute Synthetase die korrekte Sequenz der biosynthetischen Reaktionsschritte sicherstellt ist nicht bekannt. Die enorme Diversität biosynthetischer Reaktionen in NRPS Systemen und die hohe Substratvielfalt in den verschiedensten Synthetasen unterschiedlicher Stämme eröffnet ein weites Feld für mögliche Neukombinationen von Modulen und Modifikationen von Produkten, um neue bioaktive Polypeptide mit antibiotischen Eigenschaften durch die Gestaltung neuer biosynthetischer Reaktionswege zu erhalten. Die Biosyntheseprodukte der NRPS und PKS Systeme lassen sich Gruppen kategorisieren wie Peptidantibiotika, beispielsweise beta-Lactame und makrozyklischer Polypeptide. Weitere Gruppen sind die makrozyklischen Lactone, beispielsweise Polyene und Makrolide, aromatische Verbindungen, wie Chloramphenicol, und Chinone (Tetracyclin). Die näher diskutierten Beispiele sind die antibakteriellen Polypeptide Surfactin und Tyrocidin A. Surfactin ist ein antibakteriell wirkendes makrozyklisches Lipoheptapeptid, welches von Bacillus subtilis synthetisiert wird und ein enormes antivirales Potential besitzt. Tyrocidin A ist ein antibakteriell wirkendes makrozyklisches Decapeptid und wird von Bacillus brevis und Brevisbacillus parabrevis synthetisiert. Zusätzlich werden viele bakterielle Toxine ebenfalls durch solche Systeme multi-modularer Synthetasen erzeugt. Ein Beispiel ist das Polyketid Vibriobactin, das Toxin des humanpathogenen Bakterium Vibrio cholerae. Ein zunehmendes Problem der wachsenden Weltbevölkerung moderner Gesellschaften und in den Entwicklungsländern ist die wachsende Zahl multiresistenter Bakterienstämme. Die starke Progression in der Entwicklung von Resistenzen gegen Antibiotika ist auch Gegenstand des aktuellen WHO-Reports (2006). Alarmierend ist die beschleunigte Resistenzentwicklung gegen die sogenannten Reserveantibiotika Vancomycin und Ceftazidim. Ein umfangreicheres Verständnis der Interaktion zwischen Domänen in einem Modul und zwischen Modulen eines NRPS Systems ist Grundlage für die Neukombination unterschiedlicher Module zur erfolgreichen Gestaltung neuer Biosynthesen. Da die meisten dieser Biosynthesen oder die Synthese alternativer Substanzen nicht in der Organischen Chemie zu realisieren sind oder die Produkte zu teuer wären, um diese in großen Mengen zu erzeugen, muß das Ziel sein die NRPS und PKS Systeme in ihrem modularen Aufbau und ihre Interaktion zu verstehen, um alternative Antibiotika biosynthetisch herzustellen. Peptidyl Carrier Proteine (PCPs) sind kleine zentrale Transport-Domänen, integriert in den Modulen nicht-ribosomaler Peptidsynthetasen (NRPSs). PCPs tragen kovalent über eine Phosphoesterbindung einen aus dem Protein herausragenden 4’-phosphopantetheinyl (4’-PP) Kofaktor. Der 4’-PP Kofaktor ist an der Seitenkette eines hochkonservierten Serins gebunden, welche ein zentraler Bestandteil der Phosphopantethein-Erkennungs-Sequenz ist. Die Erkennungssequenz ist homolog in vielen Proteinen mit ähnlicher Funktion, inklusive Acyl Carrier Proteinen (ACPs) der Fettsäuresynthetasen (FAS) und der Polyketidsynthetasen (PKS). Die Thiolgruppe des 4’-PP Kofaktors dient zum aktiven Transport der Substrate und der Intermediate der NRPS Systeme. Die generelle Organisation und die Kontrolle der exakt aufeinander folgenden Reaktionsschritte in der Peptidsynthetase, ist die entscheidende Frage für die Funktion des Proteinclusters (assembly line mechanism). In Modulen der NRPS Systeme folgen die PCP-Domänen C-terminal auf die Adenylierungsdomänen (A-Domäne). Die Aufgabe der A-Domänen ist die Selektion and die Aktivierung einer spezifischen Aminosäure für die „assembly line“. Die eigentliche Bildung der Peptidbindung erfolgt an der Kondensations-Domäne (C-Domäne). Der Transfer der Peptidintermediate und der aktivierten Aminosäuren zwischen A-Domänen und C-Domänen ist Aufgabe der PCPs. Um diese Funktion erfüllen zu können, ist eine große Bewegung in PCPs, bzw. des 4’-PP Kofaktors notwendig, welche als „swinging arm model“ (Weber et al., 2001) beschrieben wurde. Die PCPs koordinieren damit die Peptidbiosynthese während sie mit diversen Domänen der Synthetasen spezifisch wechselwirken müssen. Die molekularen Mechanismen des Transportes wurden bisher allerdings nicht untersucht. Eine Dynamik der Transport-Domänen wurde bereits postuliert (Kim & Prestegard, 1989; Andrec et al., 1995), konnte bisher aber nicht gezeigt werden (Weber et al., 2001). Interessanterweise zeigt sowohl apo-PCP (ohne den kovalent gebundenen 4’-PP Kofaktor) also auch holo-PCP langsamen chemischen Austausch, der als jeweils zwei stabile Konformationen beschrieben werden konnte. Diese jeweils zwei stabilen Zustände, welche sich im Austausch befinden, wurden als A und A*, für apo-PCP, und entsprechend H und H* für holo-PCP bezeichnet. Während der A- und der H-Zustand sich sowohl voneinander als auch von den entsprechenden A* und H*-Zuständen unterscheiden und spezifisch für die apo- und die holo-Form von PCP sind, ist die kalkulierte Struktur vom A*-Zustand größten Teils identisch mit der des H*-Zustandes. Die erhaltenen NMR-Strukturen des A-Zustandes, des H-Zustandes und des gemeinsamen A/H-Zustandes beschreiben in ihrer Gesamtheit ein neues Modell für ein allosterie-kontrolliertes System dualer konformationeller Zwei-Zustands-Dynamik. Zu dem beobachteten konformationellen Austausch der PCP-Domäne, konnte die Bewegung des 4’-PP Kofaktors koordiniert werden. Die Bewegung des 4’-PP Kofaktors in Verbindung mit dem konformationellen Austausch der PCP-Domäne charakterisiert die Interaktion mit katalytischen Domänen eines NRPS Moduls. Des weiteren konnte mit Hilfe des Modells die Wechselwirkung mit externen Interaktionspartnern, wie der Thioesterase II und der 4’-PP Transferase, untersucht werden. Die externe Thioesterase II der Surfactin-Synthetase (SrfTEII) von Bacillus subtilis ist ein separat expremiertes 28 KDa Protein. Sie gehört zur Familie der alpha/beta-Hydrolasen und ist verantwortlich für die Regenerierung falsch beladener 4’- PP Kofaktoren der Peptidyl Carrier Domänen. Die SrfTEII wurde mittels Lösungs-NMR untersucht, die Resonanzen wurden zugeordnet, erste strukturelle Modelle konnte berechnet werden und das Interaktionsverhalten mit verschiedenen modifizierten Kofaktoren und PCPs wurde analysiert. Die Spezifität der Substraterkennung durch die SrfTEII kann beschrieben werden. Interessanterweise zeigt auch die SrfTEII Doppelpeaks für einzelne Aminosäuren, diese können als Indikator für eine spezifische Substraterkennung durch das Enzym verwendet werden und helfen den funktionellen Unterschied zwischen der SrfTEI-Domäne und SrfTEII zu verstehen.
Arten von Aschersonia Mont. (Anamorphe von Hypocrella spp., Clavicipitaceae, Hypocreales, Sordariomycetidae, Askomycota) parasitieren Weiße Fliegen und Schildläuse. Petch (1921) stellte eine Monographie über Hypocrella und Aschersonia vor. Seit dieser Zeit wurden einige Arten neu beschrieben und vereinzelte Artkomplexe revidiert. Die vorgestellte Arbeit ist seit rund 80 Jahren das umfassendste Werk über die Gattung Aschersonia. Hierfür wurden Proben in Kuba, Malaysia, Mexico, Panama, Taiwan und Thailand gesammelt und z.T. kultiviert. Es werden 20 Arten detailliert vorgestellt und illustriert. Die Arten sind: A. acutispora, A. aurantiaca, A. australiensis, A. badia, A. basicystis, A. blumenaviensis, A. caespiticia [A. insperata, syn. nov.], A. columnifera, A. crenulata, A. duplex, A. hypocreoidea [A. goldiana, syn. nov.; A. confluens, syn. nov.], A. marginata, A. oxystoma, A. philippinensis, die Anamorphe von H. rhombispora, A. samoensis, A. taitensis [A. aleyrodis, syn. nov.; A. placenta, syn. nov.; A. tamurai, syn. nov.], die Anamorphe von H. tubulata, A. turbinata [A. coffeae, syn. nov.] und A. viridans. Hierzu wurden auch wichtige Merkmale wie Stromataform und Konidiengröße in situ und in vitro charakterisiert. Mit anderen gültigen Beschreibungen von Arten, die nicht untersucht werden konnten, gibt es 32 Arten. Zum ersten Mal wurden ausführliche Daten über die Wirtsinsekten sowie die Trägerpflanzen berücksichtigt. Erstmals wurde die Verbreitung der Aschersonia-Arten kritisch beleuchtet. Die Funde von A. acutispora, A. basicystis, A. hypocreoidea, A. oxystoma, A. turbinata und A. viridans sind Erstnachweise für Panama. Die Funde von A. australiensis, A. hypocreoidea, A. marginata und A. tubulata sind Erstnachweise für Taiwan. Zum ersten Mal wird für Arten der Gattung Aschersonia ein dichotomer Bestimmungsschlüssel vorgestellt. Es werden drei Hypothesen zur Phylogenie der Aschersonia spp. vorgestellt: 1. Die Stellung der Aschersonia spp. innerhalb der Clavicipitaceae basierend auf Sequenzdaten des LSU-Gens: Aschersonia bildet eine schwach unterstützte Paraphylie, dabei steht A. badia basaler als die übrigen Aschersonia-Arten. 2. Die Beziehung der Aschersonia spp. zueinander: A. badia und eng verwandte Arten parasitieren ausschließlich Weiße Fliegen und stehen basal. Arten einer zweiten Gruppe parasitieren Arten der Aleurodidae und Coccidae und Arten einer dritten Gruppe parasitieren ausschließlich Arten der Coccidae. 3. Eine phylogenetische Hypothese basierend auf Sequenzdaten der ITS: Es gibt noch zu wenig Sequenzen um eine eindeutige Aussage treffen zu können.
Klinische 8-Jahres-Studie der indivuell angepassten, nicht zementierten Hüft-TP : Typ LANDOS EGOFORM
(2006)
Fragestellung: Seit 1988 wird das Konzept des individuellen Hüftprothesenschaftes Landos „Egoform“ an der Universitätsklinik Frankfurt / Main angewendet und weiterentwickelt. Die anatomische Prothesenform mit ihrer lateralen Schulter und dem medialen Kragen, sowie der proximalen Hydroxylapatitbeschichtung wurde auf Basis von Finite Elemente Studien entwickelt. Als Basis für die computerassistierte individuelle Anpassung dienen Röntgenbilder in zwei Ebenen mit vorher am Oberschenkel angelegtem, röntgendichtem Referenzband. Ziel der vorliegenden Studie war die retrospektive Erhebung der mittel- bis langfristigen klinischen Ergebnisse dieses zementfreien Schaftes. Methode: Von 1988 bis 1996 wurden in der Universitätsklinik Frankfurt 370 Patienten mit einer Egoform-Individualprothese in zementfreier Technik operiert. Davon konnten 267 Hüften nachuntersucht werden (72,2%; mittlerer Nachuntersuchungszeitraum: 80 Monate). Die Erhebung der postoperativen Daten erfolgte anhand des Harris-Hip-Scores. Ergebnisse: Der durchschnittliche Harris-Hip-Score beträgt 90 von 100 Punkten. Die Ergebnisse für Schmerzfreiheit betragen 39,9 von 44 Punkten, für das Gangbild 29 von 33 und für die Mobilität 4,9 von 5 Punkten. 11 Patienten mussten revidiert werden, 5 (1,35%) wegen aseptischer Lockerung und 6 (1,62%) wegen septischer Lockerung. Schlussfolgerung: Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass durch die zementfreie Individualprothese mit lateraler Schulter einige der typischen Probleme zementfreier Schaftprothesen, wie z.B. der Oberschenkelschmerz oder die Nachsinterung, gelöst werden können. Die funktionellen Ergebnisse entsprechen zusammenfassend denen der zementierten Schäfte aus der Schweden-Studie.
Ziel dieser Arbeit war es, die Effizienz der Ambulanten Endokrinologie an der Universität Frankfurt mit Hilfe statistischer Methoden zu untersuchen. Die Basis hierfür bildeten die Karteikarten von 449 Kassenpatienten, die im Jahr 2000 die Ambulanz aufsuchten!. Dank dieser großen Zahl von Fällen konnten die meisten Aussagen, die im Rahmen dieser Arbeit gemacht wurden, statistisch signifikant belegt werden. Dies geschah mit Hilfe sogenannter statistischer Tests, mit denen es möglich ist, eine Hypothese gegen eine Alternativaussage auf ihre Gültigkeit zu testen. Zentrale Kernaussagen der Arbeit sind die folgenden: o Der Aufwand, der beispielsweise bei den Laboruntersuchungen investiert wird, ist in der Ambulanten Endokrinologie zwar hoch; er ist aber immer noch geringer als der Aufwand, der von niedergelassenen Ärzten getrieben wird, bis die richtige Diagnose feststeht. Der Grund hierfür liegt vor allem in der Anzahl der Ärzte, die vor der Ambulanz aufgesucht werden. o Der Aufwand bei anderen Untersuchungen, wie zum Beispiel Röntgenaufnahmen, Sonographie- oder Szintigraphieuntersuchungen ist in der endokrinologischen Ambulanz deutlich geringer als außerhalb. o Mitglieder der Ersatzkassen sind als Patienten in der Ambulanten Endokrinologie eindeutig überrepräsentiert, Mitglieder der AOK eindeutig unterrepräsentiert. Trotzdem bilden die AOK-Mitglieder die größte Gruppe unter den Kassenpatienten in der Ambulanz. o Die durchschnittliche Dauer bis zur Diagnose beträgt in der Ambulanten Endokrinologie 5 Tage. Ein Arztbrief wird im Mittel jedoch erst 76 Tage nach der Erstaufnahme verfaßt. Diese relativ lange Zeit ist aber immer noch kürzer als die Zeitspanne vom ersten Aufsuchen eines Arztes bis zur richtigen, als Arztbrief festgehaltenen Diagnose. Diese beträgt nämlich 110 Tage. o Obwohl man vermuten könnte, daß die Diagnosezuverlässigkeit von Hausärzten, Fachärzten und der Uniklinik unterschiedlich ist, konnte ein solcher Unterschied nicht in statistisch signifikanter Weise nachgewiesen werden. Der Anteil der Fälle, bei denen die Diagnose geändert werden mußte, betrug bei Hausärzten etwa 15%, bei Fachärzten 18% und bei anderen Abteilungen der Frankfurter Universitätsklinik 9%. Die letzte Zahl ist zwar deutlich kleiner als die anderen beiden; da aber nur 56 Karteikarten von Patienten vorlagen, die aus der Uniklinik heraus überwiesen wurden, ist hier keine sichere Aussage möglich. o Bei der Weiterversorgung der Patienten nach dem Aufsuchen der Ambulanten Endokrinologie ist in mindestens 85% der Fälle der Hausarzt involviert. In 43% aller Fälle übernimmt der Hausarzt die Weiterversorgung sogar alleine; die Ambulanz wird nicht mehr hinzugezogen. Selbst bei den verbleibenden 15% der Patienten ist davon auszugehen, daß sie sich mittelfristig wieder in die Behandlung des überweisenden Arztes begeben - auch wenn sie sich beispielsweise einer Operation unterziehen müssen. Nur 4 % der Patienten befinden sich seit mehr als 5 Jahren in der Obhut der Ambulanz. Die Befürchtung einiger Hausärzte, sie könnten die Patienten im Falle einer Überweisung an die Ambulante Endokrinologie verlieren, konnte mit all diesen Fakten eindeutig widerlegt werden. Zusammenfassend kann man sagen, daß die Effizienz der Ambulanten Endokrinologie bereits sehr hoch ist: o Eine eindeutige Diagnose ist gegeben. o Die Patienten der Ambulanten Endokrinologie erhalten eine lege artis Behandlung, insbesondere eine individuelle medikamentöse Einstellung. o Für die Krankenkassen bedeutet dies langfristig gesehen eine kostengünstige Versorgung. Neben den statistischen Ergebnissen gestattete es die Arbeit auch, Empfehlungen für eine weitere Effizienzsteigerung der Ambulanz zu machen. In diesem Zusammenhang sind die folgenden Vorschläge zu nennen: oDer Arztbrief sollte früher erstellt werden; unter anderem, um die Kommunikation mit dem Hausarzt, auf dessen Überweisung der Patient angewiesen ist, zu verbessern. o Bei den Karteikarten sollten einige zusätzliche Felder definiert werden, die in standardisierter Weise vom behandelnden Arzt auszufüllen sind. Dies gestattet es, in Zukunft ähnliche Statistiken wie die in dieser Arbeit präsentierten leichter und noch präziser auszuarbeiten. o Generell sollte die Flächendeckung der Endokrinologischen Ambulanzen verbessert werden. Auch die Öffnungszeiten könnten den Bedürfnissen berufstätiger Patienten folgend ausgeweitet werden. All dies ist zwar mit einem hohen finanziellen und personellen Aufwand verbunden; volkswirtschaftlich gesehen dürfte aber durch die präzisere Diagnostik und die bessere medikamentöse Einstellung ein gewisser Kompensationseffekt eintreten. Durch die höhere Patientenanzahl wäre eine bessere Kostendeckung gegeben. Beispielsweise wäre die Auslastung der apparativen Einrichtungen bei einer Ganztagssprechstunde deutlich höher.
Integral membrane proteins (IMPs) account for 20-40% of all open reading frames in fully sequenced genomes and they are target of approximately 60% of all modern drugs. So far, cellular expression systems are often very insufficient for the high-level production of IMPs. Toxic effects, instability or formation of inclusion bodies are frequently observed effects that prevent the synthesis of sufficient amounts of functional protein. I have successfully established an individual cell-free (CF) expression system to overcome these IMP synthesis difficulties. The CF system was established in two different expression modes. If no hydrophobic compartment is provided, the IMPs precipitate in the reaction mixture. Interestingly, these insoluble proteins are found to differ from inclusion bodies as they readily solubilize in mild detergents and the bacterial small multi drug transporter EmrE, expressed in the insoluble mode was shown to reconstitute into liposomes in an active form. Alternatively, IMPs can be synthesized in a soluble way by supplementing the CF system with detergents. A comprehensive overview of 24 commonly used detergents was provided by analyzing their impact on the CF system as well as their ability to keep three structurally very different proteins in solution. The class of long chain polyoxyethylene-alkyl-ethers turned out to be most suitable for soluble expression of a-helical EmrE, the bacterial b-barrel type nucleoside transporter Tsx and the porcine vasopressin receptor type 2, resulting in several mg of protein per mL of reaction mixture. So far IMPs have almost completely been excluded from solution nuclear magnetic resonance (NMR) analyses. I could demonstrate that CF expression enables efficient isotopic labeling of IMPs for NMR analysis and further facilitates selective labeling strategies with combinations of 13C and 15N enriched amino acids that have not been feasible before. Four different G-protein coupled receptors (GPCRs) were successfully CF expressed in preparative scale and for the human endothelin B receptor (ETB), ligand binding ability was observed. A series of truncated ETB derivatives containing nested terminal deletions have been CF produced and functionally characterized. The core area essential for Endothelin-1 binding as well as a central region responsible for ETB oligomer formation was confined to a 39 amino acid fragment including the proposed transmembrane segment 1. The binding constant (KD) of ETB was determined to 6 nM for circular ET-1 by SPR and 29 nM for linear ET-1 by TIRFS. This data indicate a large potential of the established individual CF expression system for functional IMP synthesis.
Summary and Outlook The aim of this work was the investigation of the Mn2+ binding sites in hammerhead and the Diels-Alder ribozymes. This project consists of three main topics. In the first part quantification and structural characterization of Mn2+ binding sites in the m- and the tsHHRz using Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy are described. The second part summarizes the newest results obtained for the cleavage activity of both mand tsHHRzs in the presence of different Mg2+ and Mn2+ and Na+ ion concentrations using the new method with fluorescent-labeled RNAs. Here the influence of neomycin B on the structure of Mn2+ binding pockets and on the catalytic activity of both HHRzs is discussed. In addition, a possible role of Mn2+ ions is suggested from correlation of the EPR data with the kinetic results. The last chapter is devoted to quantification and differentiation of Mn2+ binding sites of the Diels-Alder ribozyme using continuous wave (cw) EPR experiments in solution. In this work EPR spectroscopy was used to study the binding of Mn2+ ions to the cis tsHHRz and to compare it with the binding to the trans mHHRz and to the Diels-Alder ribozyme. Cw EPR measurements showed that the tsHHRz possesses a single highaffinity Mn2+ binding site with a KD of < 10 nM at a NaCl concentration of 0.1 M. This dissociation constant is three orders of magnitude smaller than the KD determined for the single high-affinity Mn2+ site in the mHHRz (KD = 4.4 μM). The measurements of catalytic activity have been performed using fluorescent-labeled RNAs. Compared to the mHHRz, the cis tsHHRz cleaves up to 20-fold faster in the presence of Mg2+/Mn2+ ions with no saturation of the cleavage rates at high metal(II) ion concentrations. This is in good agreement with the last investigations on the trans tsHHRz (Nelson et al. 2005). Thus, the much stronger Mn2+ binding and higher cleavage activity were attributed to the interaction between the two external loops of the tsHHRz which reduces the RNA dynamics and traps the Mn2+ in the tightly folded conformation. Intriguingly, according to the EPR studies the binding constants for Mn2+ ions are several orders higher than the concentration of Mn2+ ions required for the catalytic activity (mHHRz: KD = 4.4 ± 0.5 μM and the Mn2+ concentration required to achieve half of the maximum cleavage rate [Mn2+]1/2 = 4.1 ± 0.6 mM respectively). Therefore, strongly bound Mn2+ ions seem to be needed for the folding of the HHRz, whereas weakly bound metal(II) ions are required to achieve full catalytic activity, and may be directly involved in catalysis. A comparison between the Electron Spin Echo Envelope Modulation (ESEEM) and Hyperfine Sublevel Correlation (HYSCORE) spectra of m- and tsHHRz demonstrates that both binding sites in HHRzs are structurally very similar. This suggests that the Mn2+ is located in both ribozymes between the bases A9 and G10.1 of the sheared G•A tandem basepair, as shown previously and in detail for the mHHRz (Vogt and DeRose 1998, Schiemann et al. 2003). However, the hyperfine spectra of the tsHHRz with 15N labeled G10.1 revealed no difference in comparison with the ones with 14N. This leads to an interpretation that the Mn2+ binding sites in both ribozymes are not identical. In addition, aminoglycoside antibiotic neomycin B inhibits the cleavage activity of both despite of the fact that it displaces the high-affinity Mn2+ ion only from the mHHRz. Hence, binding of neomycin B to the m- and the tsHHRzs probably occurs at different sites and neomycin B displaces only loosely bound Me2+ ions from the tsHHRs, whereas in the mHHRz both the high-affinity ion and the weakly bound ions are replaced. Therefore, it cannot be excluded that weakly bound Mg2+/Mn2+ ions, together with looploop interactions, induce a structural rearrangement which brings the high-affinity ion closer to the cleavage site. In the case of the Diels-Alder ribozyme it possesses five Mn2+ binding sites with KD = 0.6 ± 0.2 μM in solution under conditions where it is catalytically active. The competition experiment with Cd2+ allows to distinguish three different types of Mn2+ binding sites in the Diels-Alder ribozyme including inner-sphere monomeric Mn2+, monomeric Mn2+ bound through water-mediated contacts and electronically coupled dimeric Mn2+. Three Mn2+ ions are more strongly bound to the ribozyme via inner-sphere contacts, whereas two other Mn2+ ions form water-mediated outer-sphere contacts with the nucleotides of the ribozyme. The inner-sphere Mn2+ with the highest affinity and the fourth Mn2+ ions added to the ribozyme form a dimer with a Mn2+-Mn2+ distance of ~6 Å (as arises from simulations). Moreover, an addition of the product analog inhibitor (AMDA) to the [Diels-Alder ribozymes/ Mn2+] complex shows no conformational changes in the Mn2+ binding pockets. This is in good agreement with the recent studies which suggest that the Diels-Alder ribozyme is preorganized (Keiper et al. 2004). Some considerations on the evolution of the project (Outlook) There may be several venues of continuation of this project, which exploit on unique combination of EPR experiments and biochemical studies on RNA. This combination may allow us to significantly contribute to understanding of metal role in HHRz catalysis. Since the tsHHRz possesses the high affinity Mn2+ binding site (Kd < 10 nM) it creates a possibility to find conditions where the structural site is occupied by Mn2+, while catalytic sites are occupied by Mg2+ ions. If these conditions will be established by EPR titration, a set of standard biochemical experiments may be designed to look at the kinetic of cleavage and differentiate the “structural” and catalytic effects. The other experiment would be to look at the Mn2+ binding site in the tsHHRz in comparison with P1 and P1/P2 complexes and compare the results with the ones for the mHHRz. No matter the answer, P1 can be used as a simpler model to study the effect of tertiary structure on Mn2+ binding. A set of the tsHHRz mutants can be created to observe the mutations affect on Mn2+ binding sites, Mn2+ affinity and correlate the data with the kinetic analysis. FRET-based kinetic assay with fluorophore pairs on P1 and P2 can be designed for the kinetic experiments. Having this system one will be able to perform kinetic measurements 100-fold faster comparing to standard gel procedures (everything will be done in 96-wells). By manipulating the lengths and the sequence of P2 we most likely will be able to use FRET assay for the chemical step analysis (provided Kd > k2), and measure it using stop-flow system with time resolution of microseconds. And finally, one will be able to quantitatively measure the effect of neomycin B on the tsHHRz. Another interesting possibility would be to look at the state of metal(II) in the tsHHRz – enzyme alone (dissociated product) and in the enzyme-product complex and compare with the full-length tsHHRz. It will provide the information about the local rearrangements upon catalysis and the role of metal(II) ions. Furthermore, additional pulse-EPR experiments using 15N labeling have to be performed in order to reveal the location of the high-affinity Mn2+ binding site in the tsHHRz. Additionally, paramagnetic Mn2+ ions can be localized within the global fold of HHRzs using PELDOR and site-directed spin labeling. Further characterization of the high-affinity binding site in the tsHHRz can be performed using high-field ENDOR measurements in order to obtain the 14N and 31P tensors.
Die technische Entwicklung kleiner, mobiler Ultraschallgeräte erlaubt den Einsatz der Sonographie auch außerhalb der Klinik. In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, ob die präklinische Sonographie mit einem mobilen Ultraschallgerät eine praktikable Methode darstellt, um am Unfallort abdominelle Blutungen zu diagnostizieren und inwieweit dies Einfluß auf die Therapie und das Management schwerverletzter Patienten hat. Die präklinische Sonographie wurde an 61 Patienten durchgeführt, bei denen eine intraabdominelle Verletzung nicht auszuschließen war. Unmittelbar nach Klinikaufnahme wurde der präklinisch festgestellte Ultraschallbefund mittels erneuter Ultraschalluntersuchung bzw. Computertomographie des Abdomens im Rahmen der Schockraumdiagnostik kontrolliert. Bei einer Untersuchungsdauer von durchschnittlich 2.8 ± 1.2 min wurde bei 16 Patienten (26.2 %) freie Flüssigkeit gefunden, 7 mit massivem, 9 mit diskretem pathologischen Befund. 4 der Patienten mit ausgeprägtem Befund wurden unmittelbar nach Klinikaufnahme laparotomiert und 3 aufgrund einer Milzruptur splenektomiert. Drei Patienten verstarben am Unfallort u.a. aufgrund ihrer abdominellen Verletzungen. Die präklinische Sonographie ergab schließlich ein falsch positives Ergebnis, jedoch kein falsch negatives Ergebnis, welches eine Spezifität von 97,9% und eine Sensitivität von 100% ergibt. In 36% der Einsätze wurde das präklinische Management modifiziert und in 21 % aufgrund der sonographischen Diagnose die Wahl der Zielklinik beeinflußt. Die präklinische Sonographie hat sich als sichere und fehlerarme Methode zur präklinischen Diagnostik abdomineller Blutung bewährt und stellt für den Einsatz im Notarztdienst eine sinnvolle Erweiterung der Diagnostik dar. Die Pilotstudie war Grundlage für eine Multicenterstudie der Deutschen Rettungsflugwacht, die klären soll, ob die präklinische Sonographie generell für den Einsatz im Rettungsdienst empfohlen werden kann.
Die vorliegende Arbeit befaßte sich mit der Untersuchung der Protonenbewegung während des O-E Schrittes im katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase von P. denitrificans. Die Zuordnung der Protonenbewegung zu den einzelnen Schritten des katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase ist immer noch ein Gegenstand zahlreicher Kontroversen. Obwohl von Ruitenberg et al. (2000) durch Spannungsmessungen gezeigt wurde, daß die Reduktion von Häm a während des ersten Elektrontransfers in das oxidierte Enzyme eine schnelle Protonenaufnahme von der gegenüberliegenden Seite der Membran bewirkt, wurden diese Ergebnisse angezweifelt. Daher sollte mit einer unabhängigen und direkten Methode herausgefunden werden, ob Protonen bereits während des ersten Schrittes des katalytischen Zyklus aufgenommen werden. Dazu wurde ns-zeitaufgelöste Blitzlicht-Absorptionsspektroskopie in Kombination mit pH-sensitiven Farbstoffen genutzt, und zwar sowohl mit Fluorescein kovalent an der Proteinoberfläche gebunden als auch mit Phenolrot löslich im Medium vorliegend. Zur kovalenten Kopplung von thiolreaktiven Farbstoffen mußten zuerst die nötigen Voraussetzungen geschaffen werden. Dazu wurde in dieser Arbeit ein Mutagenesesystems für sowohl Untereinheit I als auch Untereinheit II etabliert und eine oberflächencysteinfreie Variante und elf Einzelcystein-Varianten hergestellt, exprimiert und aufgereinigt sowie die Enzymaktivitäten überprüft. Danach wurde ein Protokoll zur Kopplung der Einzelcysteinvarianten mit Iodoacetamidfluoresein ausgearbeitet und die Varianten Fluorescein-markiert. Dabei zeigte es sich, daß nur sieben Varianten erfolgreich mit IAF reagierten. Mittels dieser AF-markierten Varianten konnte die Pufferkapazität an der Oberfläche der Cytochrom-c-Oxidase bestimmt werden. Es zeigte sich, daß die Pufferkapazität des Enzyms in Lösung im Vergleich zu Bakteriorhodopsin dreimal so groß ist, an der Oberfläche sogar 10-15mal so groß. Dies deutet auf eine hohe Anzahl protonierbarer Gruppen um die für die Markierung ausgewählten Aminosäuren im Bereich der Eintrittsstellen der Protonen hin. Die gezielte Übertragung eines Elektrons auf die Cytochrom-c-Oxidase erfolgte durch Licht anregbare Rutheniumkomplexe. In unserem Meßsystem war die Elektronentransfereffizienz von [Ruthenium(2,2‘-bipyridin)2]2quarterpyridin am höchsten. Nach einer sorgfältigen Optimierung der Meßbedingungen wie pH-Wert, Ionenstärke und Energie des Lasers konnte eine 10-15 %ige Reduktion von Häm a mit einer Zeitkonstanten von t = 13,7 ± 2,4 µs nachgewiesen werden. Die Protonenkonzentrationsänderungen im Medium konnten durch Phenolrot verfolgt werden. Durch den Vergleich von Funktionsvarianten, bei denen jeweils einer oder beide Protoneneingangswege blockiert sind, konnte ein Modell für die Protonenaufnahme und -abgabe während der Einelektronen-Reduktion der Cytochrom-c-Oxidase entwickelt werden. Dies konnte durch Messungen an in Liposomen inkorporierter wt Cytochrom-c-Oxidase verifiziert werden. Die Nettoprotonenaufnahme von der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase beträgt somit 0,3 H+ für das im O-E Schritt aufgenommene Elektron. Die Variante CS-I302C-AF wurde dazu genutzt, die Oberflächenladungsdichte an der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase zu bestimmen. Die Oberflächenladungsdichte auf der N-Seite des Enzyms in der Nähe zum Eingang des K-Wegs ist negativ und beträgt 0,5 e-/1000 Å2.
In der vorliegenden Studie wurden zwei Polyether und sechs additionsvernetzende Silikone hinsichtlich ihrer Dimensionsgenauigkeit untersucht. Mit Hilfe einer zu diesem Zweck hergestellten V2A-Stahlform konnte das Dimensionsverhalten isoliert betrachtet werden, ohne Einflussnahme anderer Parameter wie zum Beispiel durch die Desinfektion oder die Gipsexpansion. Von jedem Material wurden zehn Abformungen genommen, die mit Hilfe eines Stereomikroskops hinsichtlich ihres Dimensionsverhaltens vermessen wurden. Die Messungen wurde zu zwei Zeitpunkten durchgeführt: der erste Zeitpunkt entsprach dem vom Hersteller frühest möglichen angegebenen Termin zur Modellherstellung, die zweite Vermessung erfolgte nach insgesamt 90-minütiger Lagerung. Im Ergebnis zeigte sich, dass die Messstrecke 1 – 2 die wenigsten signifikanten Differenzen im Vergleich zu den durch Vorvermessungen erhaltenen Referenzwerten aufwies, während die Messstrecken 1 – 3, 1 – 4, 2 – 3 und 3 – 4 sich überwiegend signifikant von diesen unterschieden. Alle Materialien banden teilweise unter Kontraktion, teilweise unter Expansion ab. Hinsichtlich der Vermessungszeitpunkte lies sich bei Honigum ein verbessertes Dimensionsverhalten zum zweiten Vermessungszeitpunkt konstatieren. Bei den anderen getesteten Materialien war keine Abhängigkeit des Dimensionsverhaltens von den beiden Vermessungszeitpunkten feststellbar. Gegenüber den Referenzwerten reichten die Dimensionsveränderungen von 0,001 % bis zum Maximum von 0,19 %. Cirka zehn Prozent der erhaltenen Werte befanden sich in einem Bereich von > 0,1 % bzw. < -0,1 %. Insgesamt konnte den untersuchten Materialien zu beiden Vermessungszeitpunkten ein sehr gutes Dimensionsverhalten konstatiert werden, wobei weder die beiden Materialgruppen Polyether und additionsvernetzende Silikone qualitative Unterschiede zueinander aufwiesen, noch die jeweiligen Produkte selbst.
Entwicklung und Evaluation einer Methode zur Messung der Thrombinbildung in plättchenreichem Plasma
(2006)
Molekulare Regulation der UDP-Zucker-Biosynthese Untersuchungen anhand der myo-Inositoxygenase
(2006)
Der Nukleotidzucker UDP-Glucuronsäure ist die prinzipielle Zuckervorstufe für UDP-Galacturonsäure, -Xylose, -Arabinose und –Apiose, welche alle in die Zellwandpolymere der pflanzlichen Zellwand einfließen. UDP-Glucuronsäure kann in Arabidopsis über zwei alternative, funktionelle Synthesewege gebildet werden, wobei entweder die UDP-Glucose-Dehydrogenase oder die myo-Inositoxygenase als Schlüsselenzym, welche den Kohlehydratfluss in Richtung Zellwandbiosynthese katalysiert, involviert ist. In dieser Arbeit wurden die Gene für die Enzymisoformen der Inositoxygenase (MIOX) aus Arabidopsis thaliana analysiert. Sie repräsentieren eine kleine Genfamilie bestehend aus vier Isoformen. Studien mittels Promotor::GUS-Konstrukten und RT-PCR zeigten, dass die Transkription der MIOX-Gene eine sehr transiente und organspezifische Genexpression ist. Die Isoformen MIOX1 und MIOX2 ließen sich in nahezu allen Geweben nachweisen wogegen die Isoformen MIOX4/5 nur in den generativen Geweben aufzufinden waren. Es konnte eine deutliche Präsenz aller vier MIOX-Isoformen in den generativen Geweben nachgewiesen werden und die Nukleotidzucker, die während der Samenentwicklung benötigt werden, scheinen überwiegend über die MIOX zur Verfügung gestellt zu werden. So zeigen T-DNA-Insertionslinien von ΔMIOX1 & 2 eine reduzierte Schleimhülle um die Samen und eine erhöhte Ausfallrate bei der Samenentwicklung auf. Ansonsten zeigen die untersuchten T-DNA-Insertionslinien einen ähnlichen Wuchs wie der Wildtyp auf. Auch konnten keine Unterschiede über die durchgeführten Zellwandanalysen, mittels GC-MS, MALDI und Dionex-HPLC verifiziert werden, was durch die Redundanz der MIOX- und UGD-Isoformen erklärt werden könnte. Nichtsdestotrotz konnte bei den Isoformen ΔMIOX1 & 2 eine dramatische Reduktion beim Einbau von 3H-Inosit in Zellwandpolymere von Keimlingen verzeichnet werden, was einen klaren Beweis für eine funktionelle MIOX liefert, da in diesem Gewebe diese beiden Isoformen die einzig aktiven sind. Außerdem konnten über Promotor-Deletions-Analysen potentielle cis-Elemente für die Promotoren von MIOX2 und MIOX4 aufgedeckt werden.
Entrepreneurship eröffnet aus didaktischer und organisatorischer Sicht vielversprechende Chancen zum Bewältigen der Modernitätskrise dualer Berufsausbildung, birgt jedoch auch Risiken in sich. Sowohl didaktische Konzeptionen, die von der – traditionell – funktional-objektivistischen Entrepreneurship-Definition ausgehen (z.B. der „Medienkoffer Selbstständigkeit“), als auch subjektorientierte Ansätze (z.B. die „Arbeitsorientierte Exemplarik“) zeichnen sich dadurch aus, dass sie, anders als duale Berufsausbildung, allgemeine Bildungsinhalte gegenüber fachbezogenen stärker gewichten, was sich u.a. in Fachgrenzen überschreitenden Lehr-/Lernarrangements (Projektunterricht) konkretisiert. Damit wird nicht nur den – Stichworte Lean Production und Globalisierung – veränderten Qualifikationsbedarfen am Arbeitsmarkt entsprochen. Auch bestehen Anknüpfungspunkte zu einem Teil der subjektiven Wissens- und Rationalitätsgrundlagen, die aus Sicht der Theorie der reflexiven Modernisierung in der Zweiten Moderne für unabdingbar erachtet werden (Anerkennung von Unsicherheit/nicht erwarteten Nebenfolgen, Befähigung zur kooperativen Entscheidungsfindung). Die untersuchten Ansatzmöglichkeiten weisen jedoch auch Schwachpunkte auf. Die „Arbeitsorientierte Exemplarik“ stellt zwar eine geschlossene didaktische Konzeption dar. Ihre Umsetzung beschränkt sich jedoch weitgehend auf die Erwachsenenbildung. Zudem fehlen Daten, die es ermöglichen, die Validität der „Arbeitsorientierten Exemplarik“ im Feld zu evaluieren. Umgekehrt liegt eine Vielzahl praxiserprobter und auch evaluierter „Entrepreneurship Education“-Programme, -Projekte und -Lehrgänge vor, die jedoch nicht bildungstheoretisch fundiert sind. Auch drohen „Entrepreneurship Education“ und die „Arbeitsorientierte Exemplarik“ entweder von neoliberalen wirtschaftspolititischen Interessen vereinnahmt oder unmittelbar in den Dienst der Gewinnerzielungsabsichten global operierender Konzerne gestellt zu werden. Während bildungstheoretische und empirische Lücken vergleichsweise einfach – durch Bildungsforschung – geschlossen werden können, verdichten sich im Spannungsfeld zwischen funktional-objektivistischen ökonomischen Interessen und dem anthropologisch begründbaren Ethos nach Entwicklung und Entfaltung individueller Persönlichkeitspotentiale divergierende politische Implikationen, mit denen Entrepreneurship (nicht nur) im Kontext erwerbsarbeitsbezogener Bildung konfrontiert ist. Hier bieten sich zwei Reaktionsmöglichkeiten an: Einerseits eine separierende Sichtweise, die entweder funktional-objektivistischen oder subjektivistisch-individuellen Rationalitäten Vorrang einräumt. Dies hätte zur Folge, dass Entrepreneurship entweder für unternehmerisches Denken und Handeln zu qualifizieren hätte oder, losgelöst von utilitaristischen Erwägungen, die gattungsspezifischen und individuellen Entwicklungsbedürfnisse des Menschen zu entfalten wären. Mit Blick auf die Herausforderungen der Zweiten Moderne erscheint gegenüber einer separierenden eine bündelnde Sichtweise erfolgversprechender, die versucht, Entrepreneurship als Option zur Gestaltung von Gesellschaft zu interpretieren ohne zu vernachlässigen, dass das Subjekt Resultat und Produzent seiner – durch die gegebene primär marktwirtschaftliche Wirtschaftsordnung beeinflussten – Vernetzung, Situierung, Verortung, Gestalt ist. Eine solche Quasi-Subjektbildung hätte neben den in der „Theorie reflexiver Modernisierung“ denominierten subjektiven Wissens- und Rationalitätsgrundlagen auch auf den Ausgleich wirtschafts-, gesellschafts- und sozialpolitischer Interessen zu zielen. Auch in organisatorischer Hinsicht beeinflussen ökonomische Rationalitäten die Modernisierungsmöglichkeiten erwerbsarbeitsbezogener Ausbildung. Zwar können die in das öffentliche Bildungssystem eingebundenen Schulen in nicht-staatlicher Trägerschaft als Repräsentanten des Entrepreneurship-Gedankens die kraft ihrer Rechtsform gegebenen pädagogischen Gestaltungsmöglichkeiten nutzen, um dem Berufsausbildungssystem Modernisierungsimpulse zu induzieren. In diesem Zusammenhang wären etwa Angebote zu nennen, in denen berufsbildende mit allgemeinbildenden Inhalten unter Einbezug neuartiger Theorie-Praxis-Kombinationen verschränkt werden. Auch sind einige Privatschulen an Modellversuchen zur Erprobung neuartiger Bildungsgänge beteiligt, die in Kooperation mit den Kultusministerien durchgeführt werden. Gleichwohl zeichnet sich ab, dass die Entscheidungsträger privater Schulen dazu übergehen, ihrer Auffassung nach moderne Erwerbsarbeitsqualifikation zunehmend außerhalb des Berufsausbildungssystems anzubieten, etwa in Form studienqualifizierender Bildungsgänge, im Rahmen berufsqualifizierender Bildungsangebote, die ausschließlich Abiturienten vorbehalten bleiben, oder gar indem berufsbildende durch Fachhochschulstudiengänge substituiert werden. Wenn nun aber moderne Erwerbsarbeitsqualifizierung zunehmend außerhalb des dualen Systems offeriert wird, so untermauert dies nicht nur die These, dass sich das duale System in einer Modernitätskrise befindet. Auch verstärkt dieses an leistungsstarken Schülern orientierte Angebotsverhalten die Selektionsfunktion, welche die Privatschulen ohnehin schon ausüben, indem sie regelmäßig Schulgeld erheben. Vieles spricht dafür, dass die staatliche Finanzhilfe, die sowieso nur Ersatz-, nicht jedoch Ergänzungsschulen beanspruchen können, allein nicht ausreicht, um den Finanzmittelbedarf der Einrichtungen zu decken. Sollen die (verbleibenden) von den Schulen in freier Trägerschaft ausgehenden Modernisierungsimpulse als nachhaltige Schrittmacher für zeitgemäße Erwerbsarbeitsqualifikation fungieren, so bedarf es nicht nur in finanzieller Hinsicht staatlicher Unterstützung. Auch die je nach Bundesland mehr oder weniger großzügigen schulrechtlichen Privatschulrechtsnormen einschließlich ihrer Anwendung durch die Aufsichtsbehörden bedürfen zumindest der Angleichung. Nicht umsonst konnten die von den Kaufmannsvereinigungen betriebenen Schulen Ende des 19. Jahrhunderts erst dann eine (allerdings auf berufliche Ertüchtigung) fokussierte Modernisierungsfunktion übernehmen, nachdem der Staat die hierfür erforderlichen, gesellschaftspolitisch motivierten, weil gegen die Sozialdemokratie gerichteten Rahmenbedingungen geschaffen hatte. Einen Rahmen, die herausgearbeiteten Spannungsbögen zwischen Theorie und Praxis, partikularistischem und holistischem Paradigma sowie ökonomischen und pädagogischen Interessen neuartig zu betrachten, vermag die Historische Anthropologie bereitzustellen. Historisch-anthropologische Forschung ist multiparadigmatisch und zeichnet sich durch Transdisziplinarität sowie Transnationalität aus. In transdisziplinären Forschungsprojekten können die Vertreter mehrerer Fachdisziplinen auf unterschiedliche Wissenskonstellationen, Fragestellungen, Begriffe sowie methodische Zugänge zurückgreifen und so – Stichwort „Quasi-Subjektivität“ – neuartige Lösungsvorschläge für konkrete Problemstellungen einbringen (vgl. WULF 2004, 262). Beim Überschreiten von durch Fachgrenzen begrenztem Denken „spielt das Staunen, das radikale Fragen, die philosophische Kritik und Selbstkritik eine wichtige Rolle“ (WULF 2004, 264). Staunen dürfte sich aller Voraussicht dann einstellen, wenn nicht nur ernsthaft diskutiert würde, dass private Schulen – unter Voraussetzung veränderter Rahmenbedingungen – den öffentlichen Bildungsauftrag möglicherweise besser umsetzen können als staatliche Einrichtungen, sondern auch seitens der politisch Verantwortlichen die hierfür erforderlichen Maßnahmen ergriffen würden. Transnationale (historisch-anthropologische) Forschung eröffnet zudem die Gelegenheit, Grenzen, genauer: ethnische oder kulturelle Grenzen zu überschreiten. (vgl. WULF 2004, 268). Bezogen auf Entrepreneurship böte sich insofern die Option, die anglo-amerikanische Färbung des Entrepreneurship-Diskurses ebenso zu erweitern wie den zentraleuropäischen Nexus des historischen Subjektbildungsdiskurses.
Präzise Zeitstrukturen der Aktivität der Hirnrinde haben sehr wahrscheinlich einen großen Einfluss auf die Verarbeitung von Sinnesreizen und damit auf kognitive Prozesse. Nach einer häufig zitierten Hypothese werden Einzelreize, die an verschiedenen Orten der Hirnrinde durch die jeweilige Aktivität lokaler Nervenzellpopulationen repräsentiert werden, dann als zusammengehörig wahrgenommen, wenn diese Populationen im sogenannten Gamma-Rhythmus (ca. 25-70 Hz) oszillieren und dabei die Zeitpunkte, zu welchen sie Aktionspotentiale feuern, millisekunden-präzise synchronisieren. Wenn synchrone Gamma-Oszillationen eine Rolle für kognitive Prozesse spielen, so ist zu erwarten, dass diese Zeitstrukturen durch das Vigilanzniveau beeinflusst werden. Ein Zustand aufmerksamer Wachheit führt zu einem verstärkten Auftreten synchroner Gamma-Oszillationen. Unter tiefer Narkose ist Wahrnehmung hingegen ausgeschaltet; ein solcher Zustand sollte sich demnach auch in stark reduzierten oder vollständig sistierten synchronen Gamma-Oszillationen ausdrücken. Die Regulation des Vigilanzniveaus steht unter der Kontrolle des aufsteigenden retikulären Aktivierungssystems. Dieses verteilte System innerviert unter Verwendung verschiedener Transmitter in diverse subkortikale Strukturen, unter anderem das basale Vorderhirn. Letzteres stellt die stärkste cholinerge Projektion in den Neokortex dar. Im ersten Teilprojekt dieser Arbeit wurde die Modulation “induzierter” (= nicht mit der Zeitstruktur des Stimulus assoziierter) synchroner Gamma-Oszillationen durch cholinerg wirksame Pharmaka untersucht. Hierzu wurden bei adulten Katzen Elektroden in den primären visuellen Kortex implantiert und in flacher Allgemeinanästhesie neuronale Antworten auf Sehreize aufgezeichnet. Gleichzeitig bestand die Möglichkeit, cholinerge Agonisten oder Antagonisten lokal zu applizieren. Es konnte gezeigt werden, dass cholinerge Agonisten einen fördernden Einfluss auf synchrone Gamma-Oszillationen haben, während cholinerge Antagonisten synchrone Gamma-Oszillationen hemmen und eine durch elektrische Stimulation von Teilbereichen des Aktivierungssystems ausgelöste Förderung der Oszillationen blockieren. Wahrnehmungsleistungen sind nicht nur abhängig vom Vigilanzniveau, sondern auch vom raum-zeitlichen Kontext. Das bedeutet, dass einzelne Reize nicht isoliert bewertet, sondern mit einer riesigen Menge von anderen Reizen in Beziehung gesetzt werden müssen. Der Kortex scheint im Falle der induzierten Gamma-Oszillationen sein komplexes Netzwerk für solche Interaktionen zu nutzen und in der Zeitstruktur kortikaler Signale Kontext zu kodieren. Die Aktivität kortikaler Neurone kann jedoch auch durch periodische sensorische Stimulation (zum Beispiel Flicker) zum Schwingen gebracht werden (“getriebene Oszillationen”). Es war bekannt, dass in der Aktivität des visuellen Kortex unter synchroner Stimulation Zeitstrukturen lokaler Stimuli sehr präzise abgebildet werden können. Gäbe es, wie oft angenommen, unter getriebenen Oszillationen keine Interaktion zwischen räumlich verteilter Aktivität, dann stünde die Zeitstruktur in neuronalen Antworten nicht mehr als unabhängiger Kodierungsraum für Kontext zur Verfügung, sondern wäre alleine durch den lokalen Stimulus determiniert. Dem gegenüber standen psychophysische Befunde, dass die Zeitstrukturen externer Reize zwar mit hoher Auflösung für die Wahrnehmung genutzt werden können, sie diese aber nicht zwingend determinieren. Im zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurde, ebenfalls im visuellen Kortex anästhesierter Katzen, die Modulation getriebener Oszillationen durch Zeitversatz zu räumlich entfernten Flickerstimuli untersucht. Es konnte demonstriert werden, dass lokale Antworten in getriebenen Oszillationen durch den zeitlichen Kontext zu Stimuli weit außerhalb des eigenen rezeptiven Feldes beeinflusst werden. Die zeitliche Streuung der Aktionspotentiale relativ zum Stimulus war in der synchronen Bedingung am kleinsten und wuchs mit steigendem Zeitversatz im Flicker. Die spektrale Analyse lokaler Feldpotentiale zeigte, dass für Antwortkomponenten im Gamma-Band die zeitliche Beziehung zum Stimulus durch asynchrones Flickern instabiler wurde, während niederfrequentere Komponenten (< 25 Hz) den gegenteiligen Effekt zeigten. Diese Änderungen waren auch abhängig von kortikaler Aktivierung. Die Ergebnisse beider Teile demonstrieren, dass präzise Zeitstrukturen kortikaler Aktivität frequenzspezifisch moduliert werden können. Die Befunde, die für den Gamma-Frequenzbereich erhoben wurden, stützen die Hypothese, dass kortikale Gamma-Oszillationen bei der Integration sensorischer Reize eine besonderen Rolle spielen. Die Beeinflussung synchroner Gamma-Oszillationen durch das cholinerge System könnte darüber hinaus eine Erklärung für den Zusammenhang zwischen cholinergem Defizit (wie beispielsweise beim Morbus Alzheimer oder beim Zentralen Anticholinergen Syndrom) und kognitiver Dysfunktion liefern.
Die Transplantatvaskulopathie als Zeichen der chronischen Transplantatabstoßung befällt sowohl die epikardialen als auch die intramyokardialen Arterien des Transplantats. Die transendotheliale Migration der glatten Gefäßmuskelzellen und die Intimaproliferation mit Formation einer Neointima stellen die wichtigsten Charakteristika der TVP dar. Die NO-Synthetasen und die Plasminogen-Aktivatoren scheinen, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der TVP zu spielen. e-NOS besitzt eine antiproliferative Wirkung und verhindert die Entwicklung der TVP. Die Rolle von i-NOS wird in der Literatur überwiegend als TVP-begünstigend bezeichnet. t-PA ist an der Migration und u-PA an der Proliferation der glatten Gefäßmuskelzellen beteiligt. Die vorliegende Arbeit konnte den Einfluß von CsA, FK-506 und MMF auf die Expression der obengenannten Faktoren in den arteriellen Gefäßen von Herztransplantaten aufzeichnen. Darüber hinaus sollte durch die Bestimmung von α-Aktin das Verhalten der glatten Gefäßmuskelzellen während der chronischen Abstoßung aufgezeichnet und interpretiert werden. Anhand eines etablierten Rattenmodells der heterotopen Herztransplantation wurden drei Medikamentengruppen (CsA, FK-506 und MMF) und eine Kontrollgruppe aufgestellt und die dazu gehörenden Tiere an bestimmten Zeitpunkten nach Transplantation sakrifiziert. Die gefrierhistologischen Schnitte der Transplantaten wurden immunhistochemisch auf i-NOS, e-NOS, t-PA, u-PA und α-Aktin gefärbt. Die Intensität der Färbung und der Anteil der befallenen Arterien (Prävalenz) jeder Gruppe wurden bei der Auswertung der Schnitte bestimmt und mit Hilfe des nicht parametrischen Tests von Kruskal und Wallis wurden die Gruppen statistisch auf Unterschiede verglichen. Die Versuche der vorliegenden Arbeit konnten die Expression der NO-Synthetasen in der Neointima der epi- und intramyokardialen Gefäße nachweisen. Die i-NOS-Expression wurde durch alle untersuchten Medikamente reduziert. Zusätzlich war MMF bezüglich der Reduktion der i-NOS-Expression effizienter als FK-506 und CsA. Unter CsA-Behandlung wurde die e-NOS-Expression erst nach anfänglich hohen Werten reduziert, während unter MMF-Behandlung diese Reduktion sich von Anfang an bemerkbar machte. Aus diesen Befunden läßt sich schließen, daß alle untersuchten Medikamente eine Endothelschädigung, z.B. bedingt durch NO-Toxizität, durch die Reduktion der i-NOS-Expression verhindern. Bezüglich der Plasminogen-Aktivatoren konnten die Versuche der vorliegenden Arbeit ihre Expression in der Neointima der epi- und intramyokardialen Gefäße nachweisen. u-PA wurde durch alle untersuchten Medikamente in seiner Expression beeinträchtigt, wobei MMF im Vergleich zu CsA und FK-506 eine signifikant höhere Reduktion zeigte. t-PA wurde nur durch MMF und CsA reduziert, wobei unter CsA-Behandlung eine fast kontinuierliche Abnahme der t-PA-Expression während der Versuchsdauer beobachtet wurde. Da t-PA an der Migration und u-PA an der Proliferation der glatten Gefäßmuskelzellen beteiligt sind, lassen sich hier folgende Schlüsse ableiten: Die Proliferation der glatten Gefäßmuskelzellen kann durch alle untersuchten Medikamente verringert werden, während die Migration nur unter CsA- und MMF-Behandlung reduziert wird. MMF reduziert die Proliferation der glatten Gefäßmuskellzellen effizienter als CsA und FK-506, so daß angenommen wird, daß die Reduktion der Plasminogen Aktivatoren einen besonderen Wirkungsmechanismus von MMF darstellt. Die Expression der Plasminogen-Aktivatoren in der Neointima weist das Vorhandensein von glatten Gefäßmuskelzellen nach, so daß sie, da letzteres ein histologisches Zeichen der TVP darstellt, als Indikatoren der TVP-Entwicklung angewendet werden können. α-Aktin, das charakteristisch für die G0-Phase des Zellzyklus der glatten Gefäßmuskelzellen ist, wurde in der Neointima der arteriellen Gefäße identifiziert und seine Expression in der Neointima durch alle untersuchten Medikamente reduziert. Demnach befinden sich viele der glatten Gefäßmuskelzellen der Neointima nicht in der proliferativen Phase, obwohl sie die Migration abgeschlossen haben. Alle untersuchten Medikamente reduzieren die Remodellierung der Neointima durch die glatten Gefäßmuskeltzellen.
Das Genom des anaeroben ε-Proteobakteriums Wolinella succinogenes codiert überraschenderweise für Enzymkomplexe, die typisch für die aerobe Atmung sind. Die entsprechenden Gene werd en unter bekannten Wachstumsbedingungen nicht
exprimiert. Darunter findet sich ein Operon ( sdhABE) für eine putative „Succinat-Dehydrogenase“, die hohe Sequenzhomol ogien zu sog. „nicht-klassischen“ archaealen Succinat-Dehydrogenasen zeigt. In der vorliegenden Arbeit sollte die „Succinat-Dehydro genase“ mit Hilfe des etablierten genetischen Systems zur Modifikation und Produktion der Chinol:Fumarat-Reduktase(QFR) homolog in W. succinogenes produziert und charakterisiert werden. Das genetische System besteht aus der QFR- Deletions-mutante ΔfrdCAB und dem Vektor pFrdcat2, der aufgrund seiner zentralen Bedeutung im Rahmen dieser Arbeit sequenziert wurde.
Beim Übergang vom Wachstum zur Entwicklung entsteht in Dictyostelium discoideum aus einzelnen vegetativ wachsenden Zellen ein multizellulärer Organismus, der in der Lage ist ausdauernde Sporen zu bilden. Während der im multizellulären Verband stattfindenden morphologischen Veränderungen und Zelldifferenzierung nimmt die Proteinkinase A (PKA) eine Schlüsselfunktion ein. Der C-Modul bindende Faktor A (CbfA), ursprünglich aufgrund seiner spezifischen Bindung an eine regulatorische DNA-Sequenz des Non-LTR Retrotransposons TRE5-A.1 in D. discoideum entdeckt, ist für den Übergang vom Wachstum zur Differenzierungsphase essentiell. Zellen der CbfA-Mangelmutante JH.D2 weisen im Vergleich zu denen des Wildtyp-Stamms AX2 ein verlangsamtes Wachstum und eine verzögerte Einleitung der Aggregation und der Entwicklung auf. Charakteristisch für diese CbfA-Mutante ist die Unterexpression der mRNA für die katalytische Untereinheit der Proteinkinase A (PkaC). Da die Expression der PkaC sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene reguliert ist, wurde in dieser Arbeit ein monoklonaler Antikörper gegen die katalytische Untereinheit hergestellt, um den Proteingehalt an PkaC in Zellen der CbfA-Mutante zu untersuchen. Dabei konnte eine starke Unterexpression der PkaC in den CbfA-depletierten Zellen nachgewiesen werden. Demnach scheint es einen mittelbaren Zusammenhang zwischen der Menge an CbfA und dem sich selbst verstärkenden cAMP-abhängigen Signaltransduktionssystem der Zellen zu geben, da ein Mangel an cAMP eine fehlende Aktivierung der sich selbst induzierenden PKA nach sich zieht. Für D. discoideum konnte erstmals eine reproduzierbare 2D-gelelektrophoretische Trennmethode etabliert werden, mit der es gelang, differentiell exprimierte Proteine im Stadium der frühen Entwicklung zwischen den untersuchten D. discoideum-Stämmen AX2 und JH.D2 aufzufinden. Die Anwendung der DIGE-Technologie ermöglichte dabei die Detektion von ca. 30-40 differentiell exprimierten Proteinen. Durch die massenspektrometrische Untersuchung dieser Proteine unter Verwendung der MALDI-TOF Methode in Kombination mit dem Peptid-Massen-Fingerabdruck konnten insgesamt ca. 30% der differentiell exprimierten Proteine identifiziert werden. Dabei stellte sich heraus, daß vor allem Proteine mit essentiellen Funktionen im zellulären Stoffwechsel in der CbfA-Mangelmutante JH.D2 auf geringerem Niveau exprimiert wurden als im Wildtyp-Stamm AX2. Dies könnte eine Erklärung für die letalen Auswirkungen eines vollständigen knockouts von CbfA in D. discoideum liefern. Zusätzlich wurde mit Hilfe der DIGE-Technologie die Funktion der C-terminalen Domäne des CbfA-Proteins untersucht. Für diese Experimente wurde eine CbfA-Mutante verwendet, die den C-Terminus konstitutiv überexprimiert. Die daraus resultierenden Proteinmuster haben gezeigt, daß die C-terminale Domäne unabhängig vom Rest des Proteins sowohl induzierenden als auch reprimierenden Einfluß auf die Proteinexpression nimmt. Diese Ergebnisse zeigen eine unerwartet komplexe Funktion des Proteins CbfA in der Regulation von Genen während der untersuchten Lebensphasen von D. discoideum.
Adenosintriphosphat (ATP) als universelles Energieäquivalent der Zelle wird durch die oxidative Phosphorylierung synthetisiert, bei der Elektronen entlang des elektrochemischen Gefälles der Atmungskette über verschiedene Redoxkomplexe transferiert und durch die chemiosmotische Kopplung Protonen über die Membran gepumpt werden. Der Protonengradient wird dann von der ATP-Synthase genutzt, um ADP zu ATP zu phosphorylieren. Zentraler Redoxkomplex der Atmungskette vieler Pro- und Eukaryonten ist der bc1-Komplex, der Elektronen von Ubichinol auf Cytochrom c überträgt, von wo sie nachfolgend auf die Cytochrom c-Oxidase transferiert werden. Das mesophile Bodenbakterium Paracoccus denitrificans wird als Modellsystem für den mitochondrialen Elektronentransfer (ET) verwendet, da es eine aerobe Atmungskette exprimiert, die der mitochondrialen homolog ist, allerdings einen wesentlich einfacheren Aufbau der einzelnen Redoxkomplexe aufweist. Auch Thermus thermophilus als extrem thermophiles Bakterium bildet eine vergleichbare aerobe Atmungskette aus, wobei deren Proteine allerdings eine hohe Thermostabilität aufweisen, wodurch sie in das Interesse der Forschung gerückt sind. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des ET zwischen Komplex III und IV der Atmungsketten von P. denitrificans und T. thermophilus, die aufgrund ihrer mesophilen und thermophilen Eigenschaften unterschiedliche Mechanismen in der Wechselwirkung ihrer Redoxproteine aufweisen. Es wurden lösliche Redoxfragmente verwendet, um anhand von Mutagenesestudien, Stopped-Flow (SF)- und Laserflash-Kinetiken (LF) unter pre-steady state-Bedingungen sowie FRET-Experimenten den ET zu untersuchen. Für die LF-Experimente wurde eine photoaktive Rutheniumverbindung kovalent an Cyt c552 gekoppelt, durch die bei Laseranregung das Häm photooxidiert und dadurch der ET von einem reduzierten Redoxpartner induziert werden kann. Die Strukturdaten des bc1/Cyt c-Cokomplexes aus Hefe zeigen, dass direkte Kontakte zwischen Cyt c1 und Cyt c durch unpolare Wechselwirkungen und eine zentrale Kation-p-Interaktion vermittelt werden. Daher wurden anhand von Sequenz- und Struktur-alignments äquivalente Aminosäurepositionen im Paracoccus Cyt c1 identifiziert, die an der Wechselwirkung zu Cyt c552 beteiligt sein könnten. Diese wurden durch gerichtete Mutagenese in ihrem Raumvolumen, ihrer Polarität oder Ladung variiert und in kinetischen Studien untersucht. Für die LF-Kinetiken sowie für die FRET-Experimente wurden Oberflächen-Cysteinmutanten des Cyt c1 bzw. c552 generiert, über deren SH-Gruppen kovalent der Rutheniumkomplex bzw. Fluorophore gekoppelt werden konnten. Die ET-Reaktion zeigt zwei Phasen in Abhängigkeit von der Ionenstärke. Bei niedrigen Ionenstärken ergeben sich Geschwindigkeitskonstanten von 109 M -1s-1 und eine geringe Ionenstärkeabhängigkeit (etwa eine effektive Ladung), wohingegen bei Ionenstärken ab 35 mM 2-3 effektive Ladungen pro Redoxpartner beteiligt sind und bimolekulare Geschwindigkeitskonstanten von 107 bis 109 M-1s-1 erhalten werden. Diese Ergebnisse deuten auf die Bildung eines Encounter-Komplexes bei niedrigen Ionenstärken hin, der ein Ensemble verschiedener Distanzen und relativer Orientierungen der Redoxpartner zueinander darstellt. Diese Annahme wurde ebenfalls durch FRET-Experimente bestätigt, durch die selbst bei niedrigen Ionenstärken keine definierten Abstände erhalten werden konnten. Die Geschwindigkeitskonstanten der bimolekularen Reaktion weisen auf einen diffusionskontrollierten Prozess hin, an dem 2 bis 3 effektive Ladungen an der elektrostatischen Annäherung der beiden Redoxpartner beteiligt sind. Diese Ergebnisse werden durch vorherige kinetische Untersuchungen und EPR-Studien des ET von Cyt c552 zum CuA-Fragment der aa3-Oxidase bekräftigt, für den die gleiche Anzahl effektiver Ladungen und die Bildung eines Encounter-Komplex gefunden wurden. Lediglich c1-Mutanten, deren variierte Aminosäuren sich direkt oberhalb der Hämspalte und in der Sequenz um bzw. innerhalb des Hämbindemotivs befinden, bewirken eine Verlangsamung der Gesamtreaktion und ein leicht verändertes Ionenstärkeverhalten, das auf eine leicht verschobene Interaktionsfläche hindeutet. Es wurde durch Sequenz- und Strukturalignments kein aromatischer Rest in direkter Nähe der entsprechenden Position im Paracoccus Cyt c1 gefunden, der wie im Hefekomplex eine stabilisierende Kation-p-Interaktion zwischen den Redoxpartnern vermittelt. Zur Untersuchung des ET zwischen Komplex III und Komplex IV aus T. thermophilus wurde die hydrophile Cytochrom c-Domäne der caa3-Oxidase in Analogie zum Paracoccus-System als lösliches Redoxfragment kloniert, heterolog exprimiert und charakterisiert. Dieses Fragment wurde in SF-Studien eingesetzt, um den ET zu seinen potentiellen Redoxpartnern Cyt cbc des bc-Komplexes und Cyt c552 zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass das ccaa3-Fragment Elektronen von beiden Redoxpartnern empfängt, wobei die ET-Reaktion mit Cyt c552 so schnell verläuft, dass sie durch SF-Techniken nur schlecht aufgelöst und lediglich eine Größenordnung der Geschwindigkeitskonstanten abgeschätzt werden kann (kon ~ 1010 M-1s-1). Die Reaktion mit Cyt cbc verläuft auch noch schnell (kon = 108-109 M-1s-1) und ist nahezu unabhängig von der Ionenstärke, was eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen beiden Redoxpartnern bestätigt. Die Ergebnisse deuten erstmals darauf hin, dass ein ET direkt zwischen zwei Redoxproteinkomplexen (bc-Komplex und caa3-Oxidase) stattfindet, ohne dass ein Elektronenüberträger (wie z. B. Cyt c552) zwischengeschaltet ist. Um die Übertragbarkeit der Erkenntnisse, die hier über den ET an löslichen Redoxfragmenten gewonnen wurden, in einem Proteinkomplex zu verifizieren, wurde ein bc1-Komplex verwendet, in dem die für P. denitrificans einzigartige saure Cyt c1-Domäne deletiert ist. Der Komplex wurde für eine erleichterte Aufreinigung mit einem His-tag versehen, homolog exprimiert und erste Aufreinigungs- und Charakterisierungsschritte unternommen. Er soll zukünftig eingesetzt werden, um die Mutationen des löslichen c1-Fragmentes in den Komplex zu überführen und die Mutanten kinetisch mittels pre-steady state- und steady state-Techniken im Vergleich zum bc1WT-Komplex zu untersuchen, ohne dass die Effekte der Punktmutationen durch die hohe negative Ladungsdichte der sauren Domäne überlagert werden.
The mammary gland is a perfect system to study the pathways regulating organogenesis during development of an individual. The proper development of the mammary gland requires a tight coordination of expression of many genes involved in proliferation and differentiation. The aim of this work was to identify novel genes and pathways involved in the development of the mammary gland and to find possible correlations between the signaling pathways and their downstream targets that are activated during proliferation and functional differentiation of mammary epithelial cells. In this study rapamycin has been used to inhibit the mTOR protein to analyze its role during mammary gland development. Further a genomic approach was used to identify genes differently expressed during this process. The analysis of the effects caused by the inhibition of the mTOR signaling pathway by using rapamycin on mammary epithelial cells for the first time demonstrate that mTOR plays central role in the coordination of pathways governing the proliferation and differentiation of epithelial cells during mammary gland development. More detailed analysis led to the identification of Id1 and Id2 as two major downstream effectors of the mTOR signaling pathway regulating proliferation and differentiation respectively. The genomics analysis revealed several interesting genes involved in the regulation of a proliferative or secretory phenotype of normal epithelial cells in vitro. Various genes identified by microarray analysis are of high interest and to determine their role in mammary gland development. Among the identified genes some contribute to process of proliferation like Nol5 and Kpna2, whereas other genes are required for proper functional differentiation such as Nkd2 and Cited4. Importantly, the mentioned candidate genes are also interesting regarding cancer development, since deregulation of their expression might contribute to tumor formation. The findings described in this work clearly contribute to our better understanding of the mTOR signaling pathway regulating expression of the genes involved in the development of mammary gland. In addition, the presented results should allow broadening our view of the events that contribute to breast cancer development and help to design better anticancer therapies in the future.
Induktion verschiedener Aktivitätsmuster über differentielle Rezeptor-Rekrutierung von Typ I IFN
(2006)
Für die grundlagenorientierte Forschung sowie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe spielt der Mechanismus der interzellullären Kommunikation über Botenstoffe, wie Cytokine, eine einflussreiche Rolle. Cytokine sind Proteine, welche von Leukozyten sekretiert werden und von großer Bedeutung für die Stimulierung des angeborenen Immunsystems sind. Hierbei bewirken die Typ I Interferone (Interferone, IFN) durch ihre antivirale, immunmodulatorische, antiproliferative und antiflammatorische Wirkung. Zudem stellen sie eine Verbindung zu der zellulären Immunantwort dar, wirken bei antionkogenen Prozessen mit und aktivieren eine Vielzahl an weiteren Funktionen in der Zelle. Bekannt sind bisher eine Vielzahl verschiedener humaner Interferone (verschiedene IFNa-Subtypen, b, w und e), die über einen gemeinsamen Rezeptor wirken, der sich aus den Untereinheiten ifnar1 und ifnar2 zusammensetzt. Auffallend ist, dass verschiedene Interferone unterschiedliche zelluläre Aktivitätsmuster induzieren. Mit dieser Arbeit sollte daher ein möglicher Zusammenhang zwischen der differentiellen Rezeptor-Rekrutierung verschiedener Interferone und der Induktion verschiedener Aktivitäten geklärt werden. Voraussetzung hierfür war die Aufreinigung verschiedener Interferone (IFNa1, IFNa2, IFNa8, IFNa21, IFNb), Mutanten sowie Cystein-Mutanten zur selektiven Fluoreszenzmarkierung in ausreichender Menge und Reinheit. Um den Einfluss der Bindungsaffinität auf die Aktivität zu untersuchen, wurden Aminosäuren innerhalb der Bindungsstellen zu den Rezeptoruntereinheiten ausgetauscht. Die Änderung der Bindungsaffinität sowie deren Effekt auf die Aktivität wurden überprüft. Mit Hilfe der Cystein-Mutanten an der Position a2S136C / a/wS137C konnte eine ortsspezifische Fluoreszenzmarkierung durchgeführt werden. Für die Untersuchung der Interaktion wurden die extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) über einen Deka-Histidin-tag immobilisiert wurden. Die Interaktion wurde in Echtzeit mit der markierungsfreien reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) und der totalinternen Reflektions-Fluoreszenzspektroskopie (TIRFS) detektiert. Hierzu wurden die Stöchiometrie, die Kinetik der Interaktion sowie die Bindungsstelle durch Kompetition zu den Rezeptoruntereinheiten charakterisiert. Dabei zeigten sich in der Stöchiometrie (binärer/ternärer Komplex), den Bindungsstellen oder der Konformationsänderung durch ifnar1 keine Unterschiede zwischen den IFN. Als einziges Unterscheidungsmerkmal konnten signifikant unterschiedliche Bindungsaffinitäten an die Rezeptoruntereinheiten ifnar1 und ifnar2 nachgewiesen werden. Dabei war die Rezeptoruntereinheit ifnar2 gegenüber ifnar1 stets die höher affine Komponente mit deutlichen Affinitätsunterschieden von bis zu drei Größenordnungen. Ebenfalls wurde die Assemblierung eines ternären Komplexes untersucht, für den eine 1:1:1-Stöchiometrie für alle IFN beobachtet wurde. Für Assemblierung ternärer Komplexe konnte ein Einfluss durch die Bindungsaffinitäten sowie den relativen sowie absoluten Konzentration der Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Für die Untersuchung verschiedener zellulärer Aktivitäten, die durch die IFN induziert werden, wurde die Assemblierung des Transkriptionsfaktors ISGF3 (Interferon stimulierten Genfaktors 3), die antivirale Aktivität gegen vesikuläre Stomatitis Viren (VSV) sowie die antiproliferative Aktivität überprüft. Für die ISGF3-Aktivität konnten große Unterschiede für die effektiven Konzentrationen (EC50) zwischen den IFN beobachtet werden (pM- bis nM-Bereich). Für eine antiproliferative Aktivität wurde Konzentrationen im nM-Bereich benötigt. Insbesondere konnten Unterschiede zwischen den Aktivitätsmustern beobachtet werden. Durch die Korrelation der Bindungsaffinitäten mit den jeweiligen Aktivitäten konnte ein deutlicher Zusammenhang beobachtet werden. So wurde für die Induktion der ISGF3-Assemblierung eine Abhängigkeit zu der ifnar2-Affinität nachgewiesen. Bei niedrigen IFN-Konzentrationen wird über die ifnar2-Affinität die Verweildauer der Interferone auf der Oberfläche beeinflusst, wodurch Einfluss auf die Anzahl an ternären Komplexen genommen wird. Im Gegensatz hierzu zeigte sich für die antiproliferative Aktivität eine Korrelation zu der Affinität an ifnar1. Auffällig war zudem die Korrelation der differentiellen antiproliferativen Aktivität zu der relativen Bindungsaffinität von ifnar1 zu ifnar2. Dies lässt sich durch eine mögliche Adaption der Zellen gegenüber IFN erklären, die eine Regulation der Rezeptorkonzentration auf der Membran bewirkt. Durch die Modulation der Bindungsaffinität zu ifnar2 und ifnar1 konnte der Einfluss auf die Aktivität bestätigt werden. In der Medizin könnte dies für eine verbesserte therapeutische Anwendung von Bedeutung sein, da der Einsatz von Interferonen zurzeit durch eine Vielzahl an Nebenwirkungen eingeschränkt ist.
Aus Fruktose-gezogenen Zellen von A. woodii, die in Gegenwart von Caffeat als Elektronenakzeptor gewachsen waren, wurde durch Behandlung mit Lysozym und anschliessendem French-Press-Aufschluß bei niedrigem Druck ein zellfreier Rohextrakt unter strikt anaeroben Bedingungen hergestellt. Dieser katalysierte eine H2-abhängige Caffeatreduktion mit Raten von 8,7 – 18,7 nmol/min x mg Protein. Die Aktivität war strikt ATP-abhängig. Nach einer Auftrennung des Rohextraktes in Cytoplasma- und Membranfraktion war die H2-abhängige Caffeatreduktion ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert. Die Zugabe von Membranen führte zu keiner Stimulierung der Aktivität. Die Membranfraktion selbst wies keine Caffeatreduktionsaktivität auf. Verschiedene Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, als artifizielle Elektronendonatoren für die Caffeatreduktion zu fungieren. TMPD, 1,5-Diphenylcarbazid und reduziertes Methylviologen konnten Caffeat nicht reduzieren. In Gegenwart von Phenylendiamin wurde in zellfreiem Rohextrakt und in der Cytoplasmafraktion Caffeatreduktionsaktivität beobachtet. In der Membranfraktion wurde dagegen keine Reduktion von Caffeat mit Phenylendiamin als Elektronendonor nachgewiesen. NADH + H+ konnte als physiologischer Elektronendonor für die Reduktion von Caffeat fungieren. Die NADH-abhängige Caffeatreduktion war ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert und strikt abhängig von ATP. Die Beobachtung, dass NADH + H+ als Elektronendonor für die Caffeareduktion fungieren kann, führte zu der Frage, wie im Zuge H2-abhängiger Caffeatreduktion NADH + H+ gebildet wird und welche Enzyme daran beteiligt sein könnten. NAD+-abhängige Hydrogenaseaktivität wurde an Membranen und im Cytoplasma nachgewiesen. Rund 70% der Aktivität waren in der löslichen Fraktion lokalisiert. Die Gegenwart einer Elektronendonor:NAD+-Oxidoreduktase in A. woodii wurde untersucht. Gewaschene Membranen vermittelten die Oxidation von NADH + H+ mit Kaliumhexacyanoferrat oder Benzylviologen als Elektronenakzeptor. Diese Beobachtung wurde als Hinweis auf eine NAD+-Reduktase gewertet, da solche Enzyme in der Regel reversibel sind. Eine Hydrogenase konnte hierfür ausgeschlossen werden, da die NADH-oxidierende Aktivität Sauerstoff-unempfindlich war. Die Aktivität des NADH-oxidierenden Enzyms konnte durch zugesetztes Na+ nicht stimuliert werden. In Analogie zu Na+-translozierenden NADH:Chinon-Reduktasen wurde die NADH-oxidierende Aktivität an gewaschenen Membranen aber durch Ag+ oder Cu2+ in mikromolaren Konzentrationen vollständig inhibiert. Membranen von A. woodii vermittelten die Reduktion von NAD+ mit reduzierten Ferredoxin als Elektronendonor. Ob diese Aktivität durch das gleiche membranständige Enzyme katalysiert wurde, das auch die NADH-Oxidation bewerkstelligte, konnte nicht geklärt werden. Die Ferredoxin-abhängige NAD+-Reduktion wurde durch micromolare Konzentrationen Ag+ vollständig inhibiert. Die Inihibition war aber wahrscheinlich unspezifischer Natur. Mittels vergleichender 2D-Gelelektrophorese wurden zwei Caffeat-induzierte Proteine identifiziert. Ein Vergleich der Peptidsequenzen, die durch ESI-MS/MS-Analyse der Proteine erhalten wurden, mit in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen, ergab eine große Übereinstimmung zu der großen alpha- bzw. kleinen beta-Untereinheit von heterodimeren Elektronentransfer-Flavoproteinen (ETFP). Die Proteine wurden mit EtfA und EtfB bezeichnet. Anhand der Peptidsequenzen von EtfA und EtfB wurden degenerierte Oligonukleotide abgeleitet, die zur Amplifikation von Fragmenten der kodierenden Gene herangezogen wurden. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der erhaltenen PCR-Produkte untermauerte die Zuordnung von EtfA und EtfB als Untereinheiten eines ETFP. Die Fähigkeit zur Caffeatreduktion ist in A. woodii nicht konstitutiv vorhanden, sondern wird in erst durch Gegenwart des Phenylacrylats induziert. Die Spezifität dieser Induktion wurde untersucht. Suspensionen ruhender Zellen, die aus Caffeat-induzierten Zellen hergestellt worden waren, reduzierten neben Caffeat auch die Phenylacrylate Ferulat oder p-Cumarsäure mit H2 als Elektronendonor. Analoge Beoabachtungen wurden mit Ferulat-induzierten und p-Cumarsäure-induzierten Zellsuspensionen gemacht. Die Ergebnisse legen den Schluß nahe, dass in A. woodii die Reduktion von Phenylacrylaten durch ein induzierbares enzymatisches System bewerkstelligt wird. EtfA und EtfB wurden als MalE-Fusionsproteine dargestellt und gereinigt. Dagegen wurden Antiseren hergestellt. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass die Produktion von EtfA und EtfB durch Gegenwart verschiedener Phenylacrylate induziert wird. Die Induktion war unabhängig vom Wachstumssubstrat. In Gegenwart von zu Phenylacrylaten ähnlichen Verbindungen erfolgte keine Induktion. Für EtfA und EtfB wurde eine Funktion als universeller Elektronenüberträger des Phenylacrylat-Reduktionssystems in A. woodii postuliert. Für die H2-abhängige Reduktion von Caffeat und anderer Phenylacrylate wurde die folgende Reaktionssequenz postuliert: die Oxidation des Elektronendonors H2 durch eine Hydrogenase geht einher mit der Bildung von reduziertem Ferredoxin. Dieses wird durch eine membranständige Ferredoxin-NAD+-Oxidoreduktase oxidiert, die den Transfer der Elektronen auf NAD+ mit der Translokation von Na+ koppelt. Ein aus EtfA und EtfB gebildetes ETFP fungiert dann als Elektronenüberträger zwischen NADH + H+ und einer löslichen Phenylacrylatreduktase.
Bei der 1590 datierten Monstranz mit Reliquien der Passion Christi handelt es sich um das zentrale Stück des ab dem frühen 17. Jahrhunderts in der Geheimen Cammerkapelle der Residenz München aufbewahrten Reliquienschatzes, den die bayerischen Herzöge Wilhelm V. und Maximilian I. als ihren kostbarsten Besitz ansahen. Die über 1,15 m hohe Monstranz aus getriebenen und gegossenem Silberteilen und graviertem Glas ist sehr reich mit goldgeschmelzten Figuren und Ornamentapplikationen, mit gefassten Smaragden, Rubinen, Diamanten und Perlen verziert. Sie kann als ein bedeutendes Monument der süddeutschen Goldschmiedekunst aber auch der konfessionellen Politik der Herzöge von Bayern gelten, die mit der Reliquienverehrung eine von der Reformation verdammte Kultpraxis propagierten. Die Arbeit diskutiert zuerst die relevante kunsthistorische Literatur. Dann wird die Bedeutung der Reliquien, das ikonographische Programm und die Funktion der Monstranz als Kultmittel des kirchlich geleiteten Reliquienkults und dessen Ausprägung am Münchner Hof um 1600 – im Speziellen innerhalb der Geheimen Cammerkapelle – betrachtet. Die Reliquienmonstranz war nicht nur Ausdruck der Frömmigkeit, sondern Teil einer Repräsentationsstrategie der Herzöge und soll daher auch im Zusammenhang mit anderen wichtigen Elementen der fürstlichen Selbstdarstellung gesehen werden. Es schließen sich stilkritische Betrachtungen über die in verschiedenen Goldschmiede- und Juweliertechniken gearbeiteten Bestandteile der Monstranz an. Dabei werden die Treibarbeiten und gegossenen Teile, die Emailkunst und die Art und Weise der Edelsteinfassungen ebenso behandelt, wie die architektonischen oder ornamentalen Verzierungen. Neben der Beurteilung der bisherigen Datierung werden in den stilkritischen Betrachtungen auch eine Gruppe von verwandten Goldschmiedewerken herausarbeitet, die aus derselben Werkstatt stammen dürften. Als Schöpfer der Monstranz wird Georg Bernhard angenommen, der zwar kein zünftiger Meister war, jedoch für den Münchner Hof über viele Jahre meisterliches gearbeitet hat.
Eine Vielzahl an biologischen und medizinischen Studien, die sich mit möglichen Ursachen von Homosexualität beschäftigen, wurden in den letzten 120 Jahren publiziert. Arbeiten aus den Bereichen der Endokrinologie, Morphologie und Genetik werden anhand wissenschaftlicher Kriterien analysiert. Dabei wird gezeigt, dass keine der Arbeiten einer eingehenden Überprüfung standhält. Ein separates Kapitel gibt Auskunft über Homosexualitätsforschung und „Therapieversuche“ an Homosexuellen im nationalsozialistischen Deutschen Reich. Methoden der Erfassung von sexueller Orientierung und Konzepte sowie die Entstehungsgeschichte des Begriffs Homosexualität werden vorgestellt. Weiterhin werden Motive und Risiken biomedizinischer Homosexualitätsforschung diskutiert. Eine Erklärung für das Missverhältnis zwischen der Popularität der publizierten Ergebnisse und ihrer wissenschaftlichen Qualität wird gesucht. Der Autor legt dar, dass mit der erstmaligen Erwähnung der gleichgeschlechtlichen Liebe in der medizinischen Literatur die Kategorie „des Homosexuellen“ als Sammelbegriff für ein amorphes kulturelles Phänomen erst konstruiert wurde. In der unreflektierten Adaptation dieser Kategorie durch die Naturwissenschaften unter der Annahme, sie reflektiere eine biologische Gegebenheit, sieht er das bisherige und zukünftige Scheitern der biomedizinischen Homosexualitätsforschung begründet. Abschließend wird die Frage nach der Berechtigung dieser Disziplin gestellt.
Im Rahmen dieser wissenschaftlichen Arbeit wurden retrospektiv die Daten von Patienten mit peripherer arterieller Verschlusskrankheit und subtotalen Stenosen oder Okklusionen im Bereich der Becken- oder Beinstrombahn und erfolgter perkutanen Rekanalisationen evaluiert. Hierbei erfolgte eine Läsionsklassifikation gemäß einer modifizierten Einteilung der Läsionen nach dem Transatlantic-Inter-Society-Consensus (TASC) Dokument. Hierzu wurden neben dem primären technischen Erfolg sowie die primäre Offenheitsrate auch die vaskulären Risikofaktoren, die Begleitmedikation sowie der Langzeitverlauf analysiert. Insbesondere sollte ein Vergleich der Ergebnisse zwischen der femoropoplitealen und der iliakalen Region hinsichtlich der Langzeitergebnisse analysiert werden. Diese differenzierte Betrachtung ist insbesondere wichtig, da eine einheitliche Therapieempfehlung für die infrainguinale Gefäßrekanalistion noch kontrovers diskutiert wird. Nach TASC sind die in der eigenen Arbeit hauptsächlich untersuchten Läsionsarten nur eingeschränkt mittels PTA und zusätzlicher Stentimplantation zu therapieren. Für diese Art von Läsionen wird vielmehr eine gefäßchirurgische Therapie empfohlen. Das Ziel dieser Untersuchung war, zu evaluieren, ob die perkutane Intervention bei iliakalen und femoropoplitealen Okklusionen bzw. hochgradigen Stenosen einen akzeptablen technischen Erfolg und primäre Offenheitsrate (PPR) erbringt. Gleichzeitig wurde analysiert, wie die PPR bei den verschiedenen Gefäßsegmenten unter dem Einfluss von Risikofaktoren und von Stentimplantationen variierte. In der vorliegenden Studie wurden in der Zeit von Januar 1999 bis April 2004 168 Patienten mit pAVK in unterschiedlichen Stadien beobachtet. Alle Patienten hatten einen Stenosegrad von >95% bzw. eine Gefäßokklusion. Somit galt es, 38 subtotale Stenosen und 130 Okklusionen zu therapieren. 54 Läsionen lagen im Bereich der A. iliaca communis (AIC) oder der A. iliaca externa (AIE). Iinfrainguinal waren 114 Läsionen in der A. femoralis superficialis lokalisiert. Zur perkutanen Rekanalisation wurde entweder die perkutane transluminale Angioplastie (PTA) oder die Laser assistierte Angioplastie (PTLA) angewendet. In 160 Fällen wurde eine Stentimplantation durchgeführt. In 76% der Patienten lag eine TASC C- (48%) oder TASC D-Läsion(28%) vor. Für die perkutane Therapie konnte ein technischer Erfolg von 96,5% in der infrainguinalen Region und von 96,3% im iliakalen Segment erzielt werden. In beiden Gefäßgruppen zeigten Stenosen gegenüber Okklusionen bessere Werte. Postinterventionell erfolgten Nachuntersuchungen einen Tag sowie 1, 3, 6, 12, 24 und 36 Monate nach dem Eingriff. Im Zuge dieser Kontrollen wurde auch die aktuelle Medikamentenanamnese erhoben. Die Evaluierung der Offenheit des therapierten Gefäßes erfolgte mittels farbkodierter Duplex-Untersuchung der Extremitäten sowie durch die Bestimmung des Tibio-brachialen Quotienten (TBQ). Die Nachuntersuchungen wurden von den Partnern des Gefäßzentrums (Abteilung für Angiologie) der Universitätsklinik Frankfurt am Main durchgeführt. Bis zum Ende des Nachbeobachtungszeitraumes traten 48 primäre Rezidive in den zuvor behandelten Gefäßsegmenten auf. Für die gesamte Population lag die primäre Offenheitsrate somit bei 71,4%. Unterteilt auf die beiden Gefäßsegmente konnte eine femoropopliteale Offenheit von 61,4% und eine iliakale von 92,5% ermittelt werden. Für beide Gefäßgruppen zeigten sich geringere primäre Offenheitsraten bei Okklusionen. Die Evaluierung hinsichtlich der TASC C und D Gruppen erbrachten ein akzeptables Ergebnis. In der Beckenregion betrug die primären Offenheitsraten hierfür 89,2% bzw. 91,6% und im infrainguinalen Segment 56,6% bzw. 61,6%. Die erzielten Werte liegen im Bereich der bislang publizierten Arbeiten und sprechen für den Einsatz der perkutanen Angioplastie bei iliakalen und femoropoplitealen Gefäßläsionen, da diese Therapie nur wenig Komplikationen aufweist. Dies gilt sowohl für die hochgradigen Stenosen als auch für die Okklusionen. Insbesondere kann aufgrund unserer Ergebnisse die Therapie mittels PTA mit Stentimplantation für Läsionen vom Typ TASC D empfohlen werden. Die perkutane Rekanalisation stellt in diesem Fall eine echte Alternative zur chirurgischen Therapie dar und sollte primär angestrebt werden.
In der vorliegenden Arbeit wird die Kopplung von Bloch- und Zyklotron-Oszillationen in Halbleiterübergittern unter dem Einfluss eines elektrischen und magnetischen Feldes zeitaufgelöst-elektro-optisch untersucht. Hierbei hängen sowohl die Stärke der Bloch-Zyklotron-Kopplung als auch die Charakteristika der kohärenten Ladungsträgerbewegung sensitiv von der relativen Anordnung der äußeren Felder ab. Bei gekreuzter Feldanordnung wird der Kohärente Hall-Effekt beobachtet. Semiklassisch lässt sich die Ladungsträgerdynamik in diesem Fall mit der Bewegungsgleichung eines nicht getriebenen, ungedämpften Pendels beschreiben. Abhängig vom Verhältnis E/B der äußeren Feldstärken lassen sich zwei Bewegungsregime mit gegensätzlicher Feldabhängigkeit der Frequenz der Ladungsträgeroszillationen unterscheiden. Bei schiefer Feldanordnung kommt es durch die nichtlineare Kopplung der Bloch-Oszillation mit der Zyklotron-Oszillation in der Übergitterebene zu einer phasenempfindlichen Gleichrichtung der transienten Oszillationen entlang der Wachstumsrichtung, wobei man in Resonanz eine Überhöhung dieses selbstinduzierten Gleichstroms beobachtet. In Anlehnung an ein analoges Phänomen, das an Josephson-Kontakten beobachtet wird, sprechen wir hierbei vom Fiske-Effekt. Für die räumliche Auslenkung X("unendlich") entlang der Wachstumsrichtung nach Abklingen der Kohärenz kann im Rahmen einer analytischen semiklassischen Näherung ein geschlossener Ausdruck angegeben werden. Die zeitaufgelösten Experimente zur Bloch-Zyklotron-Kopplung werden an zwei GaAs/Al0,3Ga0,7As-Übergitterstrukturen mit unterschiedlicher Quantentopfbreite durchgeführt. Im Spezialfall der gekreuzten Feldanordnung wird der Kohärente Hall-Effekt anhand der Existenz zweier Bewegungsregime mit ihrem charakteristischen Frequenz- und Dephasierungsverhalten in Abhängigkeit der äußeren Felder nachgewiesen und die lineare Abhängigkeit des Magnetfeldes am Übergang zwischen den Bewegungsregimen vom elektrischen Feld gezeigt. Die gleichermaßen prognostizierte Zunahme der Intensität höherer harmonischer Moden der Ladungsträgeroszillationen in der Nähe des Übergangs wird jedoch in der elektro-optischen Respons nicht beobachtet, wenngleich die verwendeten elektro-optischen Messtechniken im Vergleich zur Terahertz-Emissionsspektroskopie zur Untersuchung des Übergangsbereichs und höher frequenter Oszillationen prinzipiell besser geeignet sein sollten. Hierbei bestehende Einschränkungen werden diskutiert. Der für den Fall der schiefen Feldanordnung vorhergesagte selbstinduzierte Gleichstrom manifestiert sich experimentell in einem resonanzartigen Verlauf des elektro-optischen Signals nach Abklingen der Oszillationen in Abhängigkeit des Magnetfeldes. Durch Vergleich mit dem analytisch hergeleiteten Ausdruck für die räumliche Auslenkung lassen sich hieraus die relevanten Dämpfungskonstanten abschätzen und durch iterative Anpassung bestimmen. Die bei schiefer Feldanordnung mittels elektro-optischer Spektroskopie gemessenen Signale weisen nach Abklingen der kohärenten Ladungsträgeroszillationen nur einen sehr schwachen Driftanteil auf. Eine schlüssige Erklärung für diese Beobachtung ergibt sich, wenn bei der Behandlung der Ladungsträgerdynamik die Impuls- und Energierelaxation des Bloch-Oszillators unterschieden werden und eine sehr kleine Energiedämpfung angenommen wird.
Im Beobachtungsintervall vom 01.01.1985 bis zum 31.12.1995 wurden 49 Patienten ab dem vollendeten 16. Lebensjahr in der Klinik für Allgemein- und Gefäßchirurgie der Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt/Main aufgrund eines Weichteilsarkoms therapiert. Von diesen wurden 22 Patienten zur Primärtherapie, 5 zur sekundären Herstellung der Radikalität nach extern erfolgter Primäroperation, 21 zur Rezidivtherapie – Lokalrezidiv oder Fernmetastase – und 1 Patienten zur Service- Operation – Einlage eines Expanders vor geplanter adjuvanter Radiatio nach extern erfolgter Primäroperation – eingewiesen. Untersucht wurden in der vorliegenden Studie Sarkomeigenschaften, Patientendaten, Diagnostik, Therapie und Follow up auf ihre Prognosesignifikanz hinsichtlich Lokalrezidivierungs-, Fernmetastasierungsrisiko und Gesamtüberleben. Trotz der relativ niedrigen Patientenzahl in der vorliegenden Studie fanden sich mit der Literatur vergleichbare Ergebnisse der hier untersuchten Sarkomeigenschaften: Die drei häufigsten Sarkomtypen waren Leiomyosarkome (13/49, 26,5%), maligne fibröse Histiozytome (13/49, 26,5%) und Liposarkome (9/49, 18,5%). Konform mit der Literatur zeigten die Liposarkome die signifikant günstigste Gesamtüberlebensprognose (10-Jahres Überlebensrate von 88,89%), was trotz einer hohen Lokalrezidivrate von 66,7% (6/9) mit der geringen Fernmetastasierungsrate von 33% (3/9) in Zusammenhang zu bringen ist. Eine T1-Sarkomgröße nach UICC stellte sich hinsichtlich Lokalrezidivierung und Gesamtüberleben übereinstimmend mit der Literatur als signifikant günstiger Prognosefaktor dar (p=0,031951 und p=0,004346). Es fand sich des weiteren konform mit der Literatur eine Lokalisationsbevorzugung am muskuloskelettalen System mit 57,1% (28/49). Eine muskuloskelettale Sarkomlokalisation stellte sich als statistisch signifikanter Überlebensvorteil heraus (p=0,001704). Die Begründung hierfür ist in der höheren Anzahl an hier befindlichen T1-Sarkomen (13/28, 46,4%) verglichen mit den intraabdominellen Sarkomen (1/21, 4,8%), der höheren adäquaten Operabilität (18/28, 64,3% vs. 8/21, 38,1%) sowie der insgesamt niedrigeren metachronen Fernmetastasierungsrate (12/28, 42,9% vs. 17/19, 89,5%) zu suchen. Eine intrakompartimentale Sarkomlokalisation nach Enneking wurde auch in der vorliegenden Studie als signifikant günstiger Prognosefaktor hinsichtlich Gesamtüberleben bestätigt (p=0,021523) mit einer 10-Jahres Überlebensrate von 78,57% vs. 40,76% für extrakompartimentale Sarkome. Dies lässt sich auf eine deutlich bessere adäquate Operabilität intrakompartimentaler gegenüber extrakompartimentaler Sarkome zurückführen (11/15, 73,3% vs. 15/34, 44,1%), deren allgemeine Eigenschaft es ist, zunächst in Richtung des geringsten Widerstandes innerhalb eines anatomisch definierten Kompartimentes zu wachsen. Analog hierzu konnte auch eine epifasziale Sarkomlokalisation nach den UICC Kriterien von 2002 als statistisch signifikanter Überlebensvorteil (p=0,031622) konform mit der Literatur bestätigt werden...
Die Nutzung von Computern hat in unserer Gesellschaft während der letzten Jahre stark zugenommen und eine Umkehrung dieses Trends ist derzeit nicht denkbar. Auch in zunehmend mehr Feldern der Medizin wird Computertechnik genutzt, wobei nicht nur die im medizinischen Sektor Beschäftigten, sondern auch die Patienten immer häufiger mit dem Computer als diagnostischem Hilfsmittel konfrontiert werden. Es erscheint naheliegend, daß psychiatrisch kranke Menschen besonders sensibel hierauf reagieren könnten. Menschen richten ihr Handeln an individuellen Leitschienen aus, sie handeln auf der Grundlage von Einstellungen (englisch: attitude). Akzeptanz beschreibt hingegen einen kurzfristigen Prozeß, die Bereitschaft, etwas Neues anzunehmen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, welche Rolle die Einstellung zu Computern (‚computer attitude‘) und die Akzeptanz von Computeruntersuchungen bei deren Anwendung an psychiatrischer Patienten spielen. Sie untersucht, ob und wie sich Einstellung und Akzeptanz messen lassen und wodurch sie beeinflusst werden. 160 stationär behandelte psychiatrische Patienten der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie I der J.W. Goethe-Universität beantworteten einen Fragebogen zur Messung der Einstellung gegenüber Computern (GCAS). Ein Teil (N=78) dieser 160 Patienten absolvierte zusätzlich eine umfangreiche Test- und Fragebogenbatterie am Computer und mit herkömmlichen ‚Papierund-Bleistift‘-Verfahren, in deren Verlauf die Akzeptanz der Untersuchung erfaßt wurde. Die Untersuchungszeitpunkte lagen jeweils in enger zeitlicher Nähe zur Aufnahme und zur Entlassung aus der stationären Behandlung. Wiederum ein Teil (N=22) dieser 78 Patienten hatte zwischen Erst- und Zweituntersuchung Gelegenheit, den Computer in einer spielerisch gestalteten Weise als Freizeitinstrument zu nutzen. Die Auswertungen berücksichtigten die Zugehörigkeit zu drei diagnostischen Subgruppen (‚psychotische Störung‘, ‚affektive Störung‘ und ‚andere Störungen‘). Zunächst wurden die Testgütekriterien der selbst entwickelten Instrumente geprüft. Es zeigte sich eine generell positive Einstellung der untersuchten Patienten gegenüber dem Computer (GCAS-Score > 48 bei 76,9% der Patienten). Bezüglich der diagnostischen Subgruppen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Männliche (Z=2,4; p=0,02), jüngere (R=-0,22; p=0,002) und besser gebildete Patienten (R=0,34; p=0,00001) hatten jedoch eine bessere Einstellung gegenüber Computern. Es fanden sich Unterschiede in der Akzeptanz der Computeruntersuchung in Abhängigkeit von diagnostischer Subgruppe und Einstellung zu Computern. Die spielerische Kurzintervention erwies sich als nicht geeignet die Einstellung gegenüber Computern signifikant zu verändern. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, welchen Einfluß Einstellungen und Akzeptanz auf die Interaktion von Patient und Computer haben. Die Kenntnis dieses Einflusses ist für die Bewertung der am Computer erzielten Testergebnisse eine wesentliche Information.
Diese längsschnittliche Fragebogenstudie soll einen Beitrag zur Erforschung des Konzeptes Kundenorientierung im Kontext der arbeitsbezogenen Stressforschung leisten. Kundenorientierung wurde in der Vergangenheit vorwiegend von der betriebswirtschaftlichen Seite betrachtet und empirisch häufig im Zusammenhang mit Kundenzufriedenheit untersucht. In organisationspsychologischen Stressstudien wurde das Thema Kundenorientierung nur unzureichend berücksichtigt. Darüber hinaus bestehen Unklarheiten in der Definition des Konzeptes. Die hier vorliegende Untersuchung betrachtet Kundenorientierung als Rollenübernahme im Sinne einer positiven Einstellung zu bzw. Identifikation mit dem Berufsbild des Dienstleisters. Zur Konstruktvalidierung von Kundenorientierung wurden verschiedene organisations-, arbeitsplatz- und personenbezogene Antezedenzen formuliert. Die vorgebrachten Hypothesen konnten anhand des querschnittlichen Datensatzes (N=1571t1 / N=1180t2) überwiegend empirisch bestätigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Kundenorientierung ein heterogenes Konstrukt ist und verschiedene Antezedenzen vorliegen, die in einem bedeutsamen Zusammenhang zur Kundenorientierung stehen. Um die Bedeutung von Kundenorientierung als persönliche interne Ressource herauszuarbeiten, wurde sowohl der direkte als auch der indirekte bzw. moderierende Wirkungsmechanismus von Kundenorientierung auf das Wohlbefinden untersucht. Als Kriterium diente Burnout, mit den drei Dimensionen der Emotionalen Erschöpfung, Depersonalisation und Persönlichen Leistungsfähigkeit. Zur Überprüfung der moderierenden und indirekten Effekte wurde der Stressor Emotionale Dissonanz eingesetzt. Zur Überprüfung dieser Effekte wurde der längsschnittliche Datensatz (597 Dienstleister aus vier von ursprünglich sechs verschiedenen Organisationen wurden nach 12-18 Monaten erneut befragt) herangezogen. In den durchgeführten moderierten Regressionsberechnungen erwies sich Kundenorientierung als bedeutsamer Moderator, der in der Lage ist, die positive Beziehung zwischen dem Stressor Emotionale Dissonanz und den Burnout-Dimensionen abzupuffern. Die Effekte konnten sowohl im Querschnitt als auch im Längsschnitt gezeigt werden. Eine Moderatorwirkung von Kundenorientierung im Zusammenhang mit dem Konzept der Persönlichen Leistungsfähigkeit konnte dagegen nicht nachgewiesen werden. Mit Hilfe von Strukturgleichungsmodellen wurde die Wirkungsrichtung zwischen Kundenorientierung, Emotionaler Dissonanz und der Stressreaktion Burnout untersucht. Bei der multivariaten Kausalanalyse gelangte das LISREL-Verfahren zur Anwendung, wobei verschiedene Modelle bezüglich ihrer Angemessenheit überprüft wurden. Die Befunde zu den direkten Effekten bestätigen die hier postulierte Hypothese, dass Kundenorientierung den Charakter einer internen Ressource hat und zur Verbesserung des Wohlbefindens beiträgt. Gleichzeitig zeigten aber nur die Modelle einen guten bzw. besseren Fit, bei denen auch der umgekehrte Kausaleffekt von der abhängigen auf die unabhängige Variable freigesetzt wurde. Der stärkste direkte Zusammenhang besteht dabei zwischen Kundenorientierung und der Variable der Persönlichen Leistungsfähigkeit. Bei der Untersuchung der indirekten Effekte konnte gezeigt werden, dass zwischen Emotionaler Dissonanz und Kundenorientierung keine direkte signifikante Beziehung vorliegt. Dagegen erwies sich Emotionale Dissonanz als bedeutsamer Stressor für Emotionale Erschöpfung und Depersonalisation, wobei in gleicher Weise wie bei der Kundenorientierung nur Modelle, die auch gleichzeitig den umgekehrten Kausaleffekt modellierten, einen guten Fit erkennen ließen. Daraus kann gefolgert werden, dass gegenseitige Effekte zwischen den Konstrukten bestehen und Rückkopplungsschleifen die beste Erklärung für das Wirkungsgefüge der untersuchten Variablen darstellen. Abschließend werden die Ergebnisse hinsichtlich ihrer Einordnung in theoretische Zusammenhänge und ihrer praktischen Konsequenzen diskutiert.
Von Juni 1990 bis Februar 1991 wurde bei 9 Patienten eine immunszintigraphische Untersuchung mit dem Technetium-99m markierten, intakten, murinen, monoklonalen Anti-CEA-Antikörper BW 431/26 (Behring-Werke, Marburg) im Rahmen einer Phase-I-III-Studie durchgeführt. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß die Immunszintigraphie potentiell ein diagnostisch leistungsfähiges Verfahren ist, dem als Prinzip eine bildgebende Darstellung der spezifischen Interaktion radioaktiv markierter, monoklonaler Antikörper mit tumorzellständigen Antigenen zugrunde liegt (Baum 1989). Nach Dokumentation der Anamnese, der Ergebnisse anderer bildgebender Verfahren - und soweit erfolgt - von Operationsbefunden und Histologie, erfolgte eine Auswertung der Kinetik des Tc-99m markierten Antikörpers im Blut sowie eine Ganzkörperuntersuchung, getrennt nach anatomischen Regionen und Organen sowie einzelnen Tumorlokalisationen, wozu die Immunszintigraphie auch mit anderen bildgebenden Verfahren (Sonographie, CT, Endoskopie, Röntgen, Szintigraphie) verglichen wurde. Mögliche Indikationen zur Immunszintigraphie mit dem monoklonalen Antikörper BW 431/26 sind demnach: • Staging des Blasenkarzinoms zum Ausschluß extravesikaler Tumormanifestationen • Primärtumorsuche von unbekannten, CEA-exprimierenden Primärtumoren, die konventionell nicht auffindbar/darstellbar sind • Diagnostik von Lebermetastasen • Diagnostik von Lokalrezidiven bei vesikalen und rektosigmoidalen Karzinomen • Diagnostik von Lymphknotenmetastasen abdominell und thorakal • Diagnostik von extrahepatischen Läsionen bei Patienten mit bekannter Lebermetastasierung. Die kinetischen Eigenschaften des Tc-99m markierten monoklonalen Anti-CEAAntikörpers BW431/26, seine Verteilung und Anreicherung in den verschiedenen Organen und in CEA-exprimierenden Tumoren, die gute Verträglichkeit bei insgesamt geringer Strahlenbelastung, lassen die Immunszintigraphie als geeignet zum patientengerechten Staging von CEA-exprimierenden Tumoren erscheinen. Dieses Verfahren ermöglicht als Ganzkörperuntersuchung auch eine gute Übersicht über das Tumorgeschehen. Um allerdings wiederholte Untersuchungen im Rahmen der Nachsorge durchführen zu können, wird künftig die klinische Erforschung humaner Antimaus-Antikörper-Reaktionen und deren immunologischen Verhaltens nach erneuter Applikation des murinen Antikörpers erforderlich sein.
The multidrug resistance like protein 1 (Mdl1p) belongs to the class of ATP binding cassette (ABC) transporters which comprise a large family of membrane proteins utilising ATP hydrolysis to drive up-hill transport of a wide variety of solutes across membranes. Mdl1p is a mitochondrial ABC transporter involved in the export of protein fragments derived from the proteolysis of non-assembled inner membrane proteins out of the mitochondrial matrix. Mdl1p forms a homodimeric complex consisting of two polytrophic transmembrane domains (TMDs) and two nucleotide binding domains (NBDs). The transport function and structural organisation of Mdl1p have not been elucidated yet. To characterise the ATP hydrolysis cycle of Mdl1p, the His-tagged NBD (amino acids D423-R695) was over-expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. The isolated NBD was active in ATP binding and hydrolysis. The ATPase activity was non-linear regarding to the protein concentration, indicating that the functional state is a dimer. Dimeric catalytic transition states could be trapped and three different intermediate states were isolated, containing two ATPs, one ATP and one ADP, or two DPs, which are trapped by orthovanadate or beryllium fluoride. These experiments showed that (i) ATP binding to the NBDs induces dimerisation, (ii) in all isolated dimeric states, two nucleotides are present, (iii) phosphate can dissociate from the dimer, (iv) both nucleotides are hydrolysed, and (v) hydrolysis occurs in a sequential mode. Studies in the workgroup systematically screened for over-expression of the full-length Mdl1p and expression conditions were optimised. These studies showed that highest expression was obtained in S. cerevisiae, where the protein was over-expressed 100-fold. In this work over-expressed His-tagged protein was purified via immobilised metal-ion affinity chromatography that was active in ATP binding and hydrolysis with a turn-over of 2.5 ATP per second. N-terminal amino acid sequencing of purified Mdl1p by Edman degradation confirmed experimentally a N-terminal targeting sequence of a mitochondrial ABC transporter of S. cerevisiae for the first time. This sequence was determined to be 59 amino acids in length. Mdl1p was reconstituted into liposomes, which was confirmed by freeze fracture electron microscopy. The reconstituted protein showed ATP hydrolysis similar to the solubilised Mdl1p. However peptide translocation with radiolabelled X(8) or X(23) libraries as done for the transporter associated with antigen processing TAP could not be shown with this setup. Furthermore, structural insights of the mitochondrial transport complex and its oligomeric state were obtained via single particle electron microscopy. It was shown that Mdl1p forms a homodimer in detergent. These in vitro studies provide the basis for further detailed investigation of the mitochondrial ABC transporter Mdl1p.
In einer Vielzahl maligner Zellen übt Par-4 eine proapoptotische Wirkung aus, indem es diese Zellen gegenüber Apoptose-induzierenden Substanzen wie Chemotherapeutika und Todesrezeptoragonisten durch die Herunterregulation der Expression von antiapoptotischem Bcl-2 sensibilisiert. Unter Berücksichtigung der Bedeutung von Bcl-2 in der Entwicklung einer Medikamentenresistenz bei der akuten myeloischen Leukämie wurde das Potential von Par-4, in den Zelllinien K562 und HEL Bcl-2 herunterzuregulieren und Apoptose zu induzieren, untersucht. Um die Hypothese zu unterstützen, dass Par-4 auch maligne myeloische Zelllinien gegenüber Apoptose-induzierenden Substanzen sensibilisiert, wurden K562- und HEL-Zellen stabil mit einem Par-4-Expressionsvektor und dem entsprechenden Par-4-negativen Kontrollvektor transfiziert. Die transfizierten Klone wurden mit konventionellen Chemotherapeutika (Bendamustin, Doxorubicin, Mitoxantron, Cladribin und AraC) und neuen Substanzen (STI571, LAQ824 und TSA) sowie mit Todesrezeptoragonisten (Fas-L und TRAIL) behandelt. In K562-Zellen führt die Überexpression von Par-4 zu einer Hochregulation der Konzentrationen von Bcl-2 und Daxx. Unter der Behandlung mit konventionellen Zytostatika und Todesrezeptoragonisten zeigten die Par-4-positiven Klone im Vergleich zu den Par-4-negativen Klonen keinen Anstieg der Apoptoserate. Der molekulare Mechanismus dieser Resistenz ist möglicherweise in dem Versagen von Par-4, Bcl-2 und Daxx herunterzuregulieren, begründet. Unter Inkubation mit STI571 und LAQ824 wurde der Apoptose-induzierende Effekt von Par-4 wiederhergestellt, ohne die Expression von Bcl-2 zu beeinflussen. Das Par-4-induzierte Ansprechen auf HDAC-Inhibitoren und STI571 ist assoziiert mit einer verstärkten Caspasenaktivierung, vermehrten Spaltung von cIAP-1 und -2 sowie einer verstärkten Herunterregulation von Daxx. Dies impliziert eine mögliche funktionelle Interaktion zwischen Par-4 und Daxx auf einem neuartigen Apoptoseweg, der durch STI571 und LAQ824 verstärkt wird, zumal dieser Effekt unter Behandlung mit Bendamustin nicht auftrat. In der erythroleukämischen Zelllinie HEL ist Par-4 nicht in der Lage, diese gegenüber konventionellen Chemotherapeutika und Todesrezeptoragonisten als auch STI571 und TSA zu sensibilisieren. Die Expression von Par-4 führte in HEL-Zellen zu einer Hochregulation von Bcl-2. Das Unvermögen von Par-4, Bcl-2 herunterzuregulieren, ist zumindest teilweise verantwortlich für die fehlende Sensibilisierung der Par-4-positiven HELKlone. Diese Hypothese wird durch die erhöhte Apoptoserate in den Par-4-negativen Klonen unter TSA unterstützt, was mit einer weiteren Herunterregulation von Bcl-2 assoziiert war. Darüber hinaus zeigten die Par-4-positiven im Vergleich zu den Par-4-negativen HEL-Zellen verminderte Konzentrationen des proapoptotischen Bax. Zusätzlich verstärkte Par-4 die Expression von Daxx und der Procaspasen-8, -9 und 10, wohingegen die Expression der Procaspasen-3 und -7 unverändert blieb. Par-4-positive Zellen waren nicht in der Lage, Daxx herunterzuregulieren, was mit einer verstärkten Sensibilisierung gegenüber Chemotherapeutika assoziiert war. Dies unterstützt die Schlussfolgerung, dass die Hochregulation von Daxx in Par-4-positiven HEL-Zellen dazu beiträgt, dass Par-4 keine Apoptose-sensibilisierende Funktion aufweist. Aufgrund der fehlenden Sensibilisierung gegenüber einer Vielzahl Apoptose-induzierender Substanzen kann angenommen werden, dass HEL-Zellen generell gegenüber dem Apoptose-induzierenden Effekt von Par-4 resistent sind. Die Rolle von Daxx - insbesondere seine Fähigkeit, Apoptose zu fördern oder zu hemmen - wird immer noch kontrovers diskutiert. Ein Interaktionspartner von Par-4 ist Daxx. Über Interaktionen von Par-4 und Daxx innerhalb des Zellkerns in PODs über die ZIP-Kinase wird ein neuer Apoptoseweg beschritten. Des Weiteren zeigen Par-4 und Daxx eine gleichgerichtete Herunterregulation unter Behandlung mit synergistischen Kombinationen von zytostatischen Substanzen. Um die funktionelle Bedeutung von Daxx in malignen Myelound Lymphozyten zu beleuchten, wurden HEL- und Jurkat-Zelllinien stabil mit einem Daxxexprimierenden Vektor und dem entsprechenden Kontrollvektor transfiziert. Durch Untersuchung einer ektopen Daxx-Expression auf molekularer Ebene in HEL-Zellen konnte gezeigt werden, dass Daxx zu einer Herunterregulation von p53 führt. Daxxüberexprimierende Myelozyten regulieren darüber hinaus Bax, ein proapoptotisches Bcl-2-Familienmitglied herunter, während die Expression von antiapoptotischem Bcl-2 unverändert bleibt. Des Weiteren vermindert Daxx die Expression der Initiatorcaspasen-8 und -10 und der Exekutionscaspase-7, wohingegen die Expression der Procaspasen-6, -7 und -9 unverändert bleibt. Die veränderten Proteinkonzentrationen der Caspasen in Daxx-überexprimierenden HEL-Klonen werden begleitet von einer verminderten Expression von cIAP-1, -2 und survivin. Trotz der gezeigten Auswirkungen einer Daxx-Expression auf wichtige Moleküle der Apoptosekaskade, hatte die Daxx-Expression in HEL-Zellen keine Auswirkungen auf die Proliferationsrate - eine Wirkung, die sehr wahrscheinlich mit der Unfähigkeit, die molekularen Veränderungen unter Serumentzug aufrechtzuerhalten, zusammenhängt. Unter einem proapoptotischen Stimulus ist Daxx nicht mehr in der Lage, die Expression von p53, Bax und der Procaspasen-8, -10 und -7 herunterzuregulieren. In der Daxx-transfizierten Zelllinie Jurkat erhöhte Daxx unter Inkubation mit Todesrezeptoragonisten wie Fas-L und TRAIL sowie unter Inkubation mit Doxorubicin die Apoptoserate. Die Veränderungen auf molekularer Ebene während des extrinsischen und intrinsischen Apoptosewegs zeigen, dass der Anstieg der Apoptoserate durch die Daxx-Überexpression über verschiedene Mechanismen hervorgerufen wird. Hauptunterschiede zwischen Fas-L-/TRAIL- induzierter und Doxorubicin-induzierter Apoptose bestehen im Expressionsmuster von XIAP, p53, Bid, ZIP-Kinase und Par-4. Die erhöhte Sensibilität war in beiden Apoptosewegen von der Aktivierung von Caspasen abhängig. Daxx verstärkt in Abhängigkeit vom apoptotischen Stimulus die Aktivierung von Caspasen auf unterschiedliche Art. In Daxx-positiven Klonen, die mit Fas-L oder TRAIL behandelt wurden, wurde die ZIP-Kinase hochreguliert, die Expression von Par-4 und Daxx verminderte sich proportional zur Apoptoserate, das heißt, je höher die Apoptoserate desto höher ist die Herunterregulation/Degradation von Par-4 und Daxx. Die Kombination von Doxorubicin mit einem Fas-blockierenden Antikörper führte in Daxx-positiven Jurkat-Klonen zu einer zweifachen Amplifizierung der Apoptoserate und der Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials.
Die Überzeugung, dass der Computer nicht als Werkzeug, sondern als Medium zu denken sei, hat in den zurückliegenden Jahren die Debatte zu einer Medientheorie des Computers wesentlich geprägt. Damit war insbesondere eine bestimmte Auffassung des Technischen verbunden. Die Effekte der technischen Medien lassen sich, so der Gedanke, nicht über die Aktivierung anthropologischer Schemata begreifen, vielmehr müssen die Medien in ihrer Technizität ernst genommen werden. Dies heißt aber nichts anderes, als dass der Technik ein Eigenwert zuzugestehen sei, der sich gerade nicht vom Menschen her konturieren lässt. Hierüber diskreditiere sich dann letztlich eine Rede von den Medien als werkzeughaften Extensionen des Menschen. Demgegenüber soll in dieser Arbeit der Vorschlag unterbreitet werden, den Computer eben doch wieder vom Werkzeug her zu denken. Damit soll jedoch keinesfalls über den erreichten Stand medientheoretischer Positionen hinweggesehen werden. Mit dem Medienbegriff umzugehen bedeutet nicht zuletzt, den epistemischen Status mitzureflektieren, den die Medien inne haben. Sie geben den Rahmen vor, in dem sich die Subjekte äußern können. Die Medien strukturieren diese Äußerungen bereits vorab bzw. ermöglichen überhaupt erst bestimmte Äußerungsformen. Sich hierüber Rechenschaft abzulegen bedeutet aber nicht notwendig, die Metapher einer werkzeughaften Nutzung des hoch technischen neuen Mediums als trügerisch verwerfen zu müssen. Gerade diese Nutzungsweise unterscheidet den Computer vom vorherrschenden Medienparadigma des 20. Jahrhunderts, von Film und Fernsehen und dem daraus abzuleitenden Status des Rezipienten als Rezipienten. Die vorliegende Arbeit betreibt also Werbung für einen produktiven Gebrauch des neuen Mediums, wobei es jedoch nicht darum geht, den Computer als eine Art Befreiung von den "Zwängen" der anderen technischen Medien zu positionieren. Sofern Medien überhaupt -- im strengen Sinne – Zwänge ausüben, so wäre doch nicht einzusehen, warum dies beim Computer anders sein sollte. Dennoch: Dass es so etwas wie eine "Creative Commons" gibt, dass es immer selbstverständlicher wird, wenn Nutzer ihre kreativen Produkte nicht nur mit anderen Nutzern teilen, sondern sie es darüber hinaus ermöglichen, dass auf Basis ihrer Produkte weitergearbeitet werden kann, nährt die Vermutung eines sich ändernden Verhältnisses zwischen den Nutzern und den Medien. Zentrales Ziel dieser Arbeit ist daher zunächst, die sich in der Medienwissenschaft bereits etablierte Perspektive auf den Computer als eines Textmediums zu kritisieren, da hierüber allzu leichtfertig eine bestimmte Nutzungsweise des Computers verabsolutiert werden kann: Einzig der programmierende Zugriff gilt als emanzipativ. Daran anschließend möchte ich nach einer kurzen Diskussion des Medienbegriffes das in der Softwareentwicklung lange Zeit bestimmende Gestaltungskonzept der Werkzeugnutzung für eine neuerliche Verwendung in der Medienwissenschaft vorschlagen. Vorteil ist, dass hiermit auch Nutzerpraxen adäquat einbezogen werden können, die sich auf den "Oberflächen" der Software abspielen. Betrachtet man Medien nicht als bloße Übertragungskanäle und versucht man, die produktive Seite von Medientechnologien in den Blick zu nehmen, dann weist die "Botschaft" des neuen Mediums in die Richtung eines Wechsels vom Rezipienten zum Produzenten. In dieser Perspektive erscheinen die Nutzer nicht mehr nur als Anhängsel der Technik. Sie sind nicht von ihr aus zu bestimmen, ebenso wenig wie die Medientechnik rein vom Menschen her zu bestimmen wäre. Um die These einer werkzeughaften Verwendbarkeit des Computers auszuführen, konzentriert sich die vorliegende Arbeit auf bestimmte Texte, die genauer diskutiert und in die Argumentation integriert werden. Dies erscheint mir fruchtbarer als der Versuch, das gesamte Spektrum der neueren Diskussion um den Computer als Medium aufgreifen und synthetisieren zu wollen. Die Gliederung verläuft dementsprechend weitgehend entlang dieser (theoretischen) Referenzen.
Die vakuumassistierte stereotaktische Brustbiopsie (Mammotome) bei mammographisch verdächtigen aber nicht palpablen und sonographisch nicht nachweisbaren Veränderungen der Brust ist mittlerweile ein probates Verfahren. In der vorliegenden Studie werden 152 Mammotombiopsien genauer untersucht. Es werden die konventionellen, vor der Biopsie angefertigten, und wenn vorhanden Film-Folien- Vergrößerungsaufnahmen mit den während der Biopsie angefertigten digitalen Ausschnittsmammographien verglichen, um eventuell vorhandene Unterschiede deutlich zu machen. Die Veränderungen werden in die BI-RADS-Klassifikation eingeteilt und mit der gewonnenen Histologie korreliert. Die durchschnittliche Dauer einer Biopsie beträgt 49,2 min, zum Auffinden und korrektem Einspannen der Brust in den Biopsietisch sind 1,47 Fehlversuche nötig und es werden 2,75 Rotationen pro Biopsie durchgeführt. Die Entfernung der Läsion erfolgt in 32,9% der Läsionen komplett, 51,5% werden überwiegend entfernt und 12,5% können nur unvollständig entfernt werden. Im Durchschnitt werden 15,53 Mikrokalzifikationen im Film-Folien- und 14,45 Mikrokalzifikationen im digitalen Bild gezählt, in den Film-Folien- Vergrößerungsaufnahmen sind 17,98 Mikrokalzifikationen sichtbar. Signifikant sind diese Unterschiede nur in der Gruppe der Läsionen mit 1 – 5 Mikroverkalkungen, hier sind in der digitalen Ausschnittsmammographie signifikant mehr Verkalkungen zu sehen. In der Gruppe der Läsionen mit 16 – 30 Mikroverkalkungen sind ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen den beiden Aufnahmen zu sehen, wobei hier die Film-Folien-Mammographie mehr Verkalkungen sichtbar macht. Die Läsionen werden nach Betrachten der Film-Folien- Mammographien in signifikant höhere BI-RADS-Kategorien eingeteilt, als nach Beurteilung der digitalen Ausschnittsmammographien. Die histologische Untersuchung ergibt 7 invasive Karzinome, 30 in situ Karzinome, 14 ADHs und 101 benigne Veränderungen, wobei hier die duktale Hyperplasie und die Mastopathie den größten Anteil haben. Der Vergleich mit dem in der Literatur angegebenen Anteil an malignen Befunden in den einzelnen BI-RADS-Kategorien zeigt, dass die Film-Folien-Bilder recht gute Ergebnisse erzielen (27,5% maligne Befunde in Kategorie 4 und 6,5% in Kategorie 3-4), während die digitalen Bilder zu hohe Malignitätsanteile (45,0% in Kategorie 4) liefern. Es zeigt sich, dass bei der Unterscheidung von malignen Befunden und Präkanzerosen von benignen Befunden, die Film-Folien-Aufnahme signifikant bessere Ergebnisse erzielt als die digitale, gleiches gilt für die Unterscheidung von DCIS und ADH. Die Präparateradiographie zeigt, dass in 76,3% der Biopsien in der ersten Rotation Mikrokalk sichtbar ist, die histologische Diagnose kann aber in 92,1% der Biopsien bereits nach der ersten Rotation gestellt werden, auch wenn kein sichtbarer Kalk entnommen wurde. In 52 Fällen folgte auf die Biopsie eine operative Gewebeentnahme bzw. Tumorentfernung aus der Brust. In 13 Fällen ist die Veränderung im OP-Präparat nicht mehr nachweisbar, hier ist davon auszugehen, dass sie mit der Biopsie vollständig entfernt wurde. Bei 5 Läsionen wurde die Diagnose nach der OP als maligner eingestuft, die underestimation-rate beträgt 9,6%. Die Film-Folien-Mammographieaufnahmen eignen sich zur Einteilung in die BI-RADS-Klassifikation und Feststellung des Malignitätsrisikos besser, als die digitalen Ausschnittsmammographien.
In the first part of the present work (Chapter 3), EPR spectroscopy at different microwave frequencies, namely at 9 GHz (X-band), 34 GHz (Q-band) and 180 GHz (G-band), was employed to resolve the g-values and the HFCs of a putative radical intermediate involved in the reduction of benzoyl-CoA catalyzed by benzoyl-CoA reductase. In particular, the effect of 33S-labeling on the EPR line shape was studied at X- and Q-band frequencies in order to gain further evidence for a sulfur centered radical proposed to be the electron donor in the reduction or the aromatic ring of BCoA [I]. The spectral components observed at X-, Q- and G-band were overall consistent and showed at least three overlapping EPR signals. The signal postulated to be due to a disulfide radical anion showed no resolved g-values and a relaxation behaviour faster than expected for such a radical species. These observations together with the simulations suggest that the signal could arise from a radical exchange coupled to an [4Fe-4S] cluster located nearby. In the future, pulsed EPR and ENDOR spectroscopy on the 57Fe-labeled enzyme could help to solve this question. The potential of high-field ENDOR in combination with 13C- and 31P-labeling for investigating the structure at the active site in proteins could be verified in the studies of the ligation sphere of the cofactor Mn2+ in Ras as reported in Chapter 4 [2]. Therein, high-field ENDOR performed at 94 GHz (W-band) was used to detect the hyperfine interactions between the electron spin mainly located on the metal ion and the phosphorous nuclei of the bound GDP and GppNHp as well as the carbon nuclei of bound amino acids in the wild-type Ras protein and its oncogenic mutant G12V. These studies aimed at searching for an additional free phosphate ion or amino acid ligand bound to the metal center in the wild type GDP-bound protein with respect to its oncogenic mutant. Rom the 13C- and 31P-ENDOR spectra, the hyperfine couplings of directly bound amino acids and the bound nucleotides were compatible with the hyperfine couplings obtained from DFT calculations based on the crystal structure data. No differences in the 13C- and 31P-ENDOR spectra could be found for the wild-type GDP-bound protein in comparison to its oncogenic mutant in frozen solution. Therefore, no evidence for binding of an additional free phosphate ion or amino acid ligand in the wild-type GDP-bound protein was found. The distances between the detected nuclei and the meta1 ion were in agreement with the ones extracted from crystal structures reported in the literature. Future 35C1-ENDOR studies could clarify whether a chloride ion from the buffer solution could be the ligand replacing one water molecule in the wild type GDP-bound Ras. In Chapter 5, the implementation of a high-field ENDOR setup into a homebuilt pulsed EPR spectrometer operating at 180 GHz is reported and its performance for 1H-ENDOR demonstrated on the model system BDPA. Mims and Davies ENDOR spectra were also obtained for Ras(wt).Mn2+.DP. The increased nuclear Zeeman resolution at 180 GHz may be further exploited in the future by extending the setup for studying hyperfine couplings of low-y nuclei such as 33S, 15N , 17O or 2H. In the present work, the advantages of performing EPR and ENDOR experiments at high fields and frequencies could be nicely demonstrated with the 94 GHz ENDOR studies of Ras. Furthermore, the complementing information obtained at X- and Q-band frequencies in the multifrequency EPR studies on BCR demonstrated that the analysis of EPR spectra can be greatly facilitated by simulating the spectra measured at different MW frequencies with the same set of parameters consistent with a proposed radical. Overall, it could be shown that the use of different experimental techniques at multiple fields and frequencies renders EPR spectroscopy a powerfull tool for structural studies in biological systems.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der BFV-Reduktion von Hamiltonschen Systemen mit erstklassigen Zwangsbedingungen im Rahmen der klassischen Hamiltonschen Mechanik und im Rahmen der Deformationsquantisierung. Besondere Aufmerksamkeit wird dabei Zwangsbedingungen zuteil, die als Nullfaser singulärer äquivarianter Impulsabbildungen entstehen. Es ist schon länger bekannt, daß für Nullfasern regulärer äquivarianter Impulsabbildungen die in der theoretischen Physik gebräuchliche Methode der BFV-Reduktion zur Phasenraumreduktion nach Marsden/Weinstein äquivalent ist. In [24] konnte gezeigt werden, daß in dieser Situation die BFV-Reduktion sich auch im Rahmen der Deformationsquantisierung natürlich formulieren läßt und erfolgreich zur Konstruktion von Sternprodukten auf Marsden/Weinstein-Quotienten verwendet werden kann. Ein Hauptergebnis der vorliegenden Arbeit besteht in der Verallgemeinerung der Ergebnisse aus [24] auf den Fall singulärer Impulsabbildungen, deren Komponenten 1.) das Verschwindungsideal der Zwangsfläche erzeugen und 2.) einen vollständigen Durchschnitt bilden. Die Argumentation von [24] wird durch Gebrauch der Störungslemmata aus dem Anhang A.1 systematisiert und vereinfacht. Zum Existenzbeweis von stetigen Homotopien und stetiger Fortsetzungsabbildung für die Koszulauflösung werden der Zerfällungssatz und der Fortsetzungssatz von Bierstone und Schwarz [20] benutzt. Außerdem wird ein ’Jacobisches Kriterium’ für die Überprüfung von Bedingung 2.) angegeben. Basierend auf diesem Kriterium und Techniken aus [3] werden die Bedingungen 1.) und 2.) an einer Reihe von Beispielen getestet. Als Korollar erhält man den Beweis dafür, daß es symplektisch stratifizierte Räume gibt, die keine Orbifaltigkeiten sind und dennoch eine stetige Deformationsquantisierung zulassen. Ferner wird (ähnlich zu [92]) eine konzeptionielle Erklärung dafür gegeben, warum im Fall vollständiger Durchschnitte das Problem der Quantisierung der BRST-Ladung eine so einfache Lösung hat. Bildet die Impulsabbildung eine erstklassige Zwangsbedingung, ist aber kein vollständiger Durchschnitt, dann ist es im allgemeinen nicht bekannt, wie entsprechende Quantenreduktionsresultate zu erzielen sind. Ein Hauptaugenmerk der Untersuchung wird es deshalb sein, in dieser Situation die klassische BFV-Reduktion besser zu verstehen – natürlich in der Hoffnung, Grundlagen für eine etwaige (Deformations-)Quantisierung zu liefern. Wir werden feststellen, daß es zwei Gründe gibt, die Tate-Erzeuger (alias: Antigeister höheren Niveaus) notwendig machen: die Topologie der Zwangsfläche und die Singularitätentheorie der Impulsabbildung. Die Zahl der Tate-Erzeuger kann durch Übergang zu projektiven Tate-Erzeugern, also Vektorbündeln, verringert werden. Allerdings sorgt Halperins Starrheitssatz [57] dafür, daß im wesentlichen alle Fälle, für die die Zwangsfläche kein lokal vollständiger Durchschnitt ist, zu unendlich vielen Tate-Erzeugern führen. Erzeugen die Komponenten einer Impulsabbildung einer linearen symplektischen Gruppenwirkung das Verschwindungsideal der Zwangsfläche, so kann man eine lokal endliche Tate-Auflösung finden. Diese besitzt nach dem Fortsetzungssatz und dem Zerfällungssatz von Bierstone und Schwarz stetige, kontrahierende Homotopien. Ausgehend von einer solchen Tate-Auflösung konstruieren wir, die klassische BFV-Konstruktion für vollständige Durchschnitte verallgemeinernd, eine graduierte superkommutative Algebra. Wir können zeigen, daß diese graduierte Algebra auch im Vektorbündelfall eine graduierte Poissonklammer besitzt, die sogenannte Rothstein-Poissonklammer. Die Existenz einer solchen Poissonklammer war bereits von Rothstein [87] für die einfachere Situation einer symplektischen Supermannigfaltigkeit bewiesen worden. Darüberhinaus werden wir sehen, daß es auch im Vektorbündelfall eine BRST-Ladung gibt. Diese sieht im Fall von Impulsabbildungen etwas einfacher aus als für allgemeine erstklassige Zwangsbedingungen. Insgesamt wird also die klassische BFV-Konstruktion [95] auf den Fall projektiver Tate-Erzeuger verallgemeinert, und als eine Homotopieäquivalenz in der additiven Kategorie der Fréchet-Räume interpretiert.
Der Brustkrebs ist eine der häufigsten Todesursachen bei der Frau. In Deutschland und den industriell fortgeschrittenen Ländern erkrankt jede zehnte Frau im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs. Nach Schätzungen der International Agency for Research on Cancer (IARC) erkrankten im Jahr 2004 ca. 1,2 Millionen Frauen weltweit an Brustkrebs. In den USA wurden ca. 215.990 Frauen mit einem invasiven Brustkrebs 2004 diagnostiziert (Breast Cancer: Statistics on Incidence, Survival, and Screening: http://imaginis.com/breasthealth/statistics.asp). Laut Berechnungen der IARC für das Jahr 2000 liegt die altersstandardisierte Neuerkrankungsrate für die industrialisierten Länder bei 63 Fällen (Weltstandard – WSR) je 100.000, bei den weniger entwickelten Regionen bei 23 Fällen je 100.000. Die Erkrankungsrate in Deutschland liegt mit 70,1 (WSR) deutlich unter den USA mit 99,6 (weiße Frauen - WSR) je 100.000 und geringfügig über dem Durchschnitt der EU mit 68,57 (WSR) je 100.000 (Stabenov und Eisinger 2001). Es gibt große Fortschritte in der Früherkennung, Diagnostik und Therapie des Brustkrebses, die eine bessere und längere Überlebenschance für die erkrankten Frauen bedeuten: Die Magnetresonanz(MR)-Mammographie hat einen neuen Stellenwert in der Diagnostik des Brustkrebses gefunden. Die Kernspintomographie ist die zurzeit sensitivste Methode zur Detektion von Karzinomen bei Hochrisikofrauen (Loibl et al. 2003). Seit Mitte der neunziger Jahre können bei unklaren Befunden MR-gesteuerte Biopsien oder präoperative Markierungen durchgeführt werden (Diebold et al. 2004). Die intraoperative Strahlentherapie verkürzt die mehrwöchige postoperative Strahlentherapie. Die Rate der brusterhaltenden Operationen nimmt stetig zu. Die endokrine Therapie beim hormonsensitiven Brustkrebs mittels dreijähriger ovarieller Downregulation und fünfjähriger Tamoxifenbehandlung hat sich fest etabliert. Es gibt klare Vorteile der stadiengerechten primären systemischen Therapie. In Zukunft könnten monoklonale Antikörper auch außerhalb von Studien zum Einsatz kommen. Man findet heute in den meisten westlichen Industrieländern eine rückläufige Mortalität an Brustkrebs. Die Inzidenz des Brustkrebses wächst jedoch in den westlichen Industrieländern seit 25 Jahren stetig weiter. Änderungen der Lebensweise, des Fortpflanzungsverhaltens und verbesserte Diagnostik erklären diese Entwicklung jedoch nur zum Teil. Die Vorsorge- und Früherkennungsprogramme haben leider nicht den erhofften Erfolg gebracht: Nur etwa ein Drittel der Frauen geht regelmäßig zu den angebotenen Vorsorgeuntersuchungen. Der Nutzen eines Mammographie-Screening-Programms wird kontrovers diskutiert (Miller et al.1992, Baines 1994, von Minckwitz und Kaufmann 1997, Gotzsche und Olsen 2000), manche Autoren machen Mammographien sogar für einen Teil der Inzidenzsteigerung bei jungen Frauen verantwortlich. Zielgruppen des Screenings sind aktuell Frauen zwischen dem 50. und dem 69. Lebensjahr. Derzeitig wird ein Screening-Intervall von 24 Monaten für diese Frauen empfohlen. Bisher ist eine evidenzbasierte Mortalitätsreduktion der Mammographie-Screenings für jüngere Frauen nicht nachgewiesen worden (Jackisch et al. 2004). Es muss daher nach weiteren Ursachen geforscht werden, die diese stetige Steigerung der Inzidenz erklären. Seit Mitte des 20. Jahrhunderts nimmt der Prozentsatz der Frauen in der Arbeitswelt stetig zu, so dass man hier neben den zivilisatorisch bedingten Veränderungen der Umwelt und des Konsumverhaltens arbeits- und berufsspezifische Ursachen für die Entstehung des Brustkrebses vermutet. Weltweit ist in den letzten zehn bis 20 Jahren eine Vielzahl von Studien mit kontroversen Ergebnissen in der Fachliteratur publiziert worden, die die Rolle dieser neuen Faktoren zu klären versuchen. Wir führten daher eine Fall-Kontroll-Studie zur Untersuchung arbeitsund umweltbedingter chemischer und physikalischer Faktoren für die Entstehung eines Brustkrebses durch. Im ersten Teil dieser Arbeit, die sich ausschließlich mit der Hypothese einer chemischen Verursachung befasst, erfolgt die Darstellung des heutigen Standes der Forschungsergebnisse zum Brustkrebs. Es werden Hypothesen zur Entstehung des Brustkrebses und die publizierte Literatur vorgestellt. Im zweiten Teil der Arbeit werden dann die Methodik und die Ergebnisse dieser Fall-Kontroll-Studie dargestellt. Im dritten Teil dieser Arbeit werden schließlich die Ergebnisse dieser Studie diskutiert und zu den bekannten internationalen Forschungsergebnissen in der Literatur ins Verhältnis gesetzt. Die Arbeit wird anhand der Kriterien für Qualität und Kausalität von Sir Austin Bradford Hill analysiert. Die Methodik der Arbeit wird auf systematische Fehler und Verzerrungen untersucht. Zum Schluss wird eine Zusammenfassung der Arbeit gezogen, und es wird ein Ausblick auf die künftig zu erwartenden Ergebnisse der Forschung unternommen.
Die vorliegende Fall-Kontroll-Studie untersucht den Zusammenhang zwischen der Belastung durch berufsbezogene psychosoziale Einflussfaktoren und bandscheibenbedingten Erkrankungen im Bereich der Lendenwirbelsäule bei Männern. Die Probanden der Fallgruppe wurden über vier Kliniken und zwei orthopädische Arztpraxen im Frankfurter Raum gewonnen (94 Patienten mit gesichertem symptomatischen lumbalen Bandscheibenvorfall und 94 Patienten mit radiologisch gesicherten, mit Beschwerden einhergehenden Osteochondrosen oder Spondylosen im Bereich der Lendenwirbelsäule). Sie wurden verglichen mit 197 anamnestisch rückengesunden Probanden (107 Bevölkerungskontrollen, 90 wegen Urolithiasis behandelte Kontrollpersonen mit röntgenologisch ausgeschlossener Osteochondrose/Spondylose). In einem strukturierten Interview wurden sämtliche Berufstätigkeiten von mindestens einem Jahr Dauer gesondert erfasst mit Schwerpunkt auf die physikalische Belastung durch Heben, Tragen und Tätigkeiten mit Belastung durch Ganzkörperschwingungen sowie auf die psychosoziale Belastung am Arbeitsplatz durch Monotonie, Langeweile, fehlende Möglichkeit des Einsatzes eigenen Wissens oder eigener Fähigkeiten, mangelnde Information über Pläne der Abteilung oder des Betriebes, mangelnde Zufriedenheit mit Vorgesetzten und Kollegen, psychische Belastung durch den Umgang mit Klienten, Arbeiten unter Zeitdruck und durch das Gefühl, zu viel Verantwortung tragen zu müssen. Zusätzlich wurden Daten erhoben zu Alter, Gewicht und Größe, Rauchgewohnheiten, Schulbildung, zu sportlichen Aktivitäten und außerberuflichen physikalischen Belastungen, zur Belastung durch sog. life-events sowie zum Gesundheitszustand des Achsenskeletts mit Schwerpunkt auf jemals aufgetretene Beschwerden im Bereich der Lendenwirbelsäule. Als Effektschätzer für die relativen Erkrankungsrisiken wurden mittels logistischer Regression Odds Ratios berechnet, adjustiert für Alter, Region, Staatsangehörigkeit, andere Erkrankungen mit Beteiligung der Lendenwirbelsäule und Belastung durch Heben, Tragen und Arbeiten in extremen Rumpfbeugehaltungen. Es fand sich ein grenzwertig signifikanter Zuammenhang zwischen psychischer Belastung durch den Umgang mit Klienten und dem Auftreten mit Beschwerden einhergehender osteochondrotischer und/oder spondylotischer Veränderungen im Bereich der Lendenwirbelsäule (OR=10,4; CI95%=1,0-113) sowie ein signifikanter Zusammenhang zwischen mehr als zehn Berufsjahren, in denen unter starkem Zeitdruck gearbeitet werden musste, und dem Auftreten eines behandlungsbedürftigen lumbalen Bandscheibenvorfalls (OR=2,9; CI95%=1,3-6,3). Diese Ergebnisse können verstanden werden als ein erster Hinweis auf einen möglichen Zusammenhang zwischen psychosozialer Belastung am Arbeitsplatz und dem Auftreten nicht nur von Schmerzen im Bereich der Lendenwirbelsäule (low back pain), sondern auch von mittels bildgebender Verfahren und/oder intraoperativ gesicherten morphologischen Korrelaten der Beschwerdesymptomatik. Ein alternativer Erklärungsansatz liegt in dem möglichen Einfluss psychosozialer beruflicher Faktoren auf Schmerzempfinden bzw. Schmerzverarbeitung und auf die Inanspruchnahme medizinischer Versorgung. Weitere und größere epidemiologische, aber auch psychobiologische und psychoimmunologische Studien werden notwendig sein, um eine mögliche Verursachung bandscheibenbedingter Erkrankungen durch berufsbezogene psychosoziale Belastungsfaktoren und die sie vermittelnden Mechanismen nachzuweisen.
Anhand einer osmotischen Auffschlussmethode für B. subtilis konnte ohne Zugabe von Detergenzien erreicht werden, dass die beiden Modifikationsproteine SpaB und SpaC in löslicher Form vorliegen. Demzufolge handelt es sich bei dem Subtilin-Synthetase-Komplex nicht um einen starren membranständigen Komplex, sondern um eine transiente Assoziation der SpaB/C-Proteine mit dem Transportprotein SpaT während der Modifikationsreaktion. Durch Interaktionsstudien mit heterolog produzierten Subtilinpräpropeptid (SubHAHis) konnte eine spezifische Interaktion mit dem löslichen SpaC-Protein gezeigt werden. Komplementationsversuche zeigten, dass der DspaC amyE::spaS-Stamm durch das SpaCsowie das EriC-, jedoch nicht durch das NisC-Protein komplementiert wird. Ebenfalls ist ein C-terminal verkürztes bzw. verlängertes SpaC-Protein nicht in der Lage ist, Subtilin richtig zu modifizieren. Mit Hilfe einer in vitro Mutagenese der ligandierenden Aminosäuren Cystein 303, Cystein 349 und Histidin 350 konnte gezeigt werden, dass das Zink-Ion des SpaC-Proteins an der katalytischen Reaktion beteiligt ist. Beim Ausschalten der Aminosäuren Histidin 212 und Tyrosin 304 konnte ebenfalls ein Ausfall der Subtilinproduktion beobachtet werden. Es wäre denkbar, dass beide Aminosäuren in einer Säure/Base-Reaktion bei der Subtilinmodifikation involviert sein könnten. Die Aminosäure Tryptophan 302 hingegen bildet mit dem C-terminalen ALL-Motiv des Proteins ein hydrophobes Cluster, was eine Rolle beider Elemente in Stabilisation des Reaktionszentrums und Substratbindung nahe legt. Für das SubHAHis konnte gezeigt werden, dass es von der Modifikationsmaschinerie akzeptiert und auch produziert wird, jedoch entsteht ebenfalls ein Heterodimer zwischen dem SubHAHis und den Modifikationsproteinen SpaB und SpaC, an dessen Formation der Hexa-Histidin-Tag maßgeblich beteiligt ist. Eine mögliche Heterodimerformation im Subtilinproduzenten ATCC 6633 konnte unter bestimmten Bedingungen ebenfalls nachgewiesen werden, was auf eine mögliche kovalente Zwischenstufe bei der Lanthioninbrückenbildung hinweist. Des Weiteren konnte durch in vitro Mutagenese-Studien gezeigt werden, dass die katalytische Reaktion des SpaC-Proteins an der Heterodimerformation beteiligt ist. Das SpaC-SubHAHis Heterodimer konnte erfolgreich angereichert und mittels Peptidmassenkartierung eindeutig als kovalentes Heterodimer zwischen den beiden Proteinen identifiziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass bei der Modifikation des Subtilinpräpropeptids durch das SpaC-Protein eine transiente kovalente Bindung zwischen dem Präpropeptid und dem SpaCProtein ausgebildet wird. Die Bildung eines möglichen Heterodimers zwischen SpaC und dem Subtilinpräpropeptid konnte ebenfalls unter bestimmten Bedingungen beim Wildtyp nachgewiesen werden. Dieser Befund legt nahe, dass es sich bei der Heterodimerbildung um eine katalytische Zwischenstufe bei der Modifikation des Präpropeptids durch das SpaC handeln könnte, welches durch die Anwesenheit des Hexa-Hisitidin-Tags arretiert wird. Neben dem bekannten Subtilinproduzenten B. subtilis ATCC 6633 konnten weitere Stämme der W23-Untergruppe der Spezies B. subtilis als Subtilinproduzenten identifiziert werden, was impliziert, dass ein Merkmal der W23-Gruppe die Produktion von Subtilin ist und diese als Biomarker dienen könnte. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass ein um die Aminosäuren Glycin und Serin C-terminal verlängertes Subtilin (Subtilin-GS) eine gesteigerte Subtilin-Autoinduktion hervorruft. Durch die Zugabe von Mangan zu einer Subtilin-Produzierenden Kultur konnte ebenfalls gezeigt werden, dass das Mangan alleine einen steigernden Einfluss auf die Induktion des PspaB-Promotors besitzt, während eine gesteigerte Aktivität des PspaS-Promotors nur bei der gleichzeitigen Anwesenheit von Subtilin beobachtet werden konnte. Durch die gezielte Zugabe von Mangan und Subtilin-GS ist es dementsprechend möglich, eine erhöhte Autoinduktion und somit eine erhöhte Produktion an Subtilin zu erreichen.
Ferrocenbasierte Polymere haben in den vergangenen Jahrzehnten reges Interesse hervorgerufen, welches in ihren einzigartigen optischen und elektronischen Eigenschaften begründet ist. Diese sind auf die Anwesenheit der redoxaktiven Eisenionen sowie auf kooperative Effekte entlang des Polymerstrangs zurück zu führen. Die substanzspezifischen Merkmale hängen dabei nicht nur von der Position der Ferroceneinheiten im Makromolekül ab, sondern auch von der chemischen Natur der verbrückenden Einheiten. Hier bewähren sich solche Atome und Gruppen, die in der Lage sind, Elektronendichte zu übertragen. Ein in dieser Hinsicht besonders viel versprechendes Element ist Bor, da es im sp2-hybridisierten Zustand ein leeres p-Orbital besitzt und dieses für die Übertragung von Ladungsdichte zur Verfügung stellen kann. Vor diesem Hintergrund galt es nun auf der Basis neuartiger Kondensationsreaktionen zunächst Diferrocenylborane zu synthetisieren und anhand ausgewählter Derivate Kenntnisse über charakteristische Eigenschaften dieser Substanzklasse zu gewinnen. Die kurzkettigen Moleküle dienten als Modellverbindungen für Poly(ferrocenylen)e, welche im Mittelpunkt des zweiten Teils dieser Arbeit standen. .... In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich das neuartige Polymer [-fc-B(Br)-]n (33) hervorragend als Edukt eignet, um vielfältige borverbrückte Poly(ferrocenylen)-Derivate sowohl mit trigonalen als auch mit tetragonalen Borzentren darzustellen. Die beschriebenen Systeme weisen eindeutige Merkmale von Eisen-Eisen-Wechselwirkungen entlang der Polymerhauptkette auf, wobei sich das Ausmaß dieser Interaktionen über die Wahl der Substituenten an den Boratomen gezielt beeinflussen lässt. Die dargestellten Materialien besitzen somit großes Potential für die Entwicklung „Molekularer Drähte“ auf der Nanoskala.
Ubiquitylation is a three-step process, which results in the attachment of the small protein ubiquitin (Ub) to lysine residues on a substrate protein. SUMO proteins are ubiquitin (Ub)-related modifiers implicated in the regulation of gene transcription, cell cycle, DNA repair and protein localization. The molecular mechanisms by which the sumoylation of target proteins regulates diverse cellular functions remain poorly understood. During my PhD I isolated and characterized SUMO1 and SUMO2 binding motifs. Using Yeast Two Hybrid system, bioinformatics and NMR spectroscopy we defined a common SUMO-interacting motif (SIM) and map its binding surfaces on SUMO1 and SUMO2. This motif forms a β-strand that could bind in parallel or anti-parallel orientation to the β2-strand of SUMO due to the environment of the hydrophobic core. A negative charge imposed by a stretch of neighboring acidic amino acids and/or phosphorylated serine residues determines its specificity in binding to distinct SUMO paralogues and can modulate the spatial orientation of SUMO-SIM interactions. Mutation of the SUMO interacting motif of TTRAP (TRAFS and TNF receptor associated protein) influences both its localization and dynamic behaviour in living cells. Ubiquitin (Ub)-binding domains (UBDs) are key elements in conveying Ub-based cellular signals. UBD-containing proteins interact with ubiquitylated targets and control numerous biological processes including receptor trafficking, DNA repair, virus budding and gene transcription. They themselves undergo UBD-dependent monoubiquitylation, which promotes intramolecular binding of the UBD to the attached Ub and consequently leads to their functional inhibition. During the second part of my PhD I could show that, in contrast to the established ubiquitylation pathway, the presence of UBDs allows the monoubiquitylation of host protein independently of classical E3 ligases. UBDs of different types including UBA, UIM, UBM, NFZ and UBZ, can directly cooperate with E2 Ub-conjugating enzymes to promote monoubiquitylation of their host proteins. Using FRET technology I verified that the E2 enzyme and the substrate directly interact in cells. Moreover, UBD-containing proteins Stam2 and Sts2 promote self-ubiquitylation and not ubiquitylation of other targets or form polyUb chains from free Ub. Our study revealed a yet unappreciated role of E2 enzymes in ubiquitylation reactions of UBD containing proteins.