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‘The whole is more than the sum of its parts.’ This idea has been brought forward by psychologists such as Max Wertheimer who formulated Gestalt laws that describe our perception. One law is that of collinearity: elements that correspond in their local orientation to their global axis of alignment form a collinear line, compared to a noncollinear line where local and global orientations are orthogonal. Psychophysical studies revealed a perceptual advantage for collinear over non-collinear stimulus context. It was suggested that this behavioral finding could be related to underlying neuronal mechanisms already in the primary visual cortex (V1). Studies have shown that neurons in V1 are linked according to a common fate: cells responding to collinearly aligned contours are predominantly interconnected by anisotropic long-range lateral connections. In the cat, the same holds true for visual interhemispheric connections. In the present study we aimed to test how the perceptual advantage of a collinear line is reflected in the anatomical properties within or between the two primary visual cortices. We applied two neurophysiological methods, electrode and optical recording, and reversibly deactivated the topographically corresponding contralateral region by cooling in eight anesthetized cats. In electrophysiology experiments our results revealed that influences by stimulus context significantly depend on a unit’s orientation preference. Vertical preferring units had on average a higher spike rate for collinear over non-collinear context. Horizontal preferring units showed the opposite result. Optical imaging experiments confirmed these findings for cortical areas assigned to vertical orientation preference. Further, when deactivating the contralateral region the spike rate for horizontal preferring units in the intact hemisphere significantly decreased in response to a collinear stimulus context. Most of the optical imaging experiments revealed a decrease in cortical activity in response to either stimulus context crossing the vertical midline. In conclusion, our results support the notion that modulating influences from stimulus context can be quite variable. We suggest that the kind of influence may depend on a cell’s orientation preference. The perceptual advantage of a collinear line as one of the Gestalt laws proposes is not uniformly represented in the activity of individual cells in V1. However, it is likely that the combined activity of many V1 neurons serves to activate neurons further up the processing stream which eventually leads to the perceptual phenomenon.
Mit ihren so genannten Linsenkästen gelang Mary Bauermeister Anfang der 1960er-Jahre der Durchbruch auf dem New Yorker Kunstmarkt. Bis heute sind die fragilen, leuchtenden Objekte aus Holz, Glas, Leinwand und Papier das Alleinstellungsmerkmal der Künstlerin. Die hier vorliegende Dissertationsschrift erläutert die konsequente Entwicklung der Linsenkästen aus dem Frühwerk und unternimmt erstmals eine stilistische Einordnung in den Kunstkontext der 1960er-Jahre. Dabei wird deutlich, dass Bauermeister mehr den Künstlern der Klassischen Moderne (Duchamp, Schwitters, Klee, Kandinsky) verpflichtet ist denn ihren Zeitgenossen im Rheinland oder in der Kunstmetropole New York.
Die supratentorielle dekompressive Kraniektomie mit Eröffnung und Erweiterungsplastik der Dura mater ist heutzutage eine wichtige Therapiemaßnahme in der Behandlung des konservativ nicht kontrollierbaren Hirndrucks. Unter Kranioplastik versteht man den chirurgischen Verschluss des entstandenen Knochendefekts zum Schutz des direkt unter der Kopfhaut liegenden Gehirns, zur ästhetischen Wiederherstellung der Konturen sowie zur Verbesserung einer neurologischen Symptomatik („syndrome of the trephined“).
In der vorliegenden Arbeit werden die Daten von insgesamt 242 Patienten, die einer Kranioplastik unterzogen worden waren, retrospektiv analysiert. Die Patienten wurden im Zeitraum 2001-2008 in der neurochirurgischen Abteilung der Städtischen Kliniken Frankfurt am Main-Höchst operiert. Um Aufschluss über das postoperative, funktionelle und kosmetische Ergebnis zu erhalten, wurde im Anschluss an die Aktenauswertung bei diesen Patienten eine telefonische Befragung durchgeführt.
Ziel der Arbeit war es, die bisherigen Erfahrungen der Kalottenplastik und insbesondere der autogenen orthotopen Knochendeckelreimplantation im Hinblick auf die verschiedenen Kranioplastik Zeitpunkte zu untersuchen und unter klinischen Aspekten zu bewerten.
Die Frage des Kranioplastik Zeitpunktes ist essentiell für die Therapieplanung.
Das autologe Schädelknochentransplantat hat bessere Eigenschaften und Qualitäten als alle anderen alloplastischen Materialien. In Anbetracht der perfekten Histokompatibilität, der optimalen biomechanischen Eigenschaften, der guten anatomischen Fusion mit dem umgebenden Knochen und der Möglichkeit der partiellen oder totalen Revitalisation des Transplantats, besteht kein Zweifel, dass der autologe Knochen immer zu verwenden ist, wenn die Möglichkeit dazu besteht.
Die Analyse der Patientengruppen ergab, dass die ultra frühe Kranioplastik der Patienten mit großen Defekten nach dekompressiver Kraniektomie ein besseres Outcome im langfristigen Follow-up hat. Diese Patienten hatten keine gesteigerte Infektions- oder andere Komplikationsraten. Das Timing der Kranioplastik spielt eine Rolle in der Komplikationsrate nur bei den Patienten, die sekundär eine Komplikation erlitten haben. Patienten, die nach der Kraniektomie eine Nachblutung, einen Infarkt oder eine Infektion erlitten haben, hatten eine signifikant höhere Infektionsrate bei ultra früher Kranioplastik. Insbesondere soll betont werden, dass der Trend einer Häufung von Wundheilungsstörungen und Infektionen mit der Folge einer erneuten Explantation des Knochendeckels bei Patienten nach autogener Knochendeckelreimplantation mit mehr als 2 Risikofaktoren und bei Patienten mit kompliziertem Verlauf nach Kraniektomie festgestellt wurde.
Gemäß den Ergebnissen dieser Patientenserie kann die ultra frühe Kranioplastik bei ausgewählten Patienten mittels Reimplantation des Eigenknochens als ein sicheres und hilfreiches Verfahren für die schnellere Rehabilitation und Besserung der neurologischen Funktion und der Prognose bewertet werden. Ähnlich gute Ergebnisse zeigten die Pantienten in der Gruppe 1 der ultra frühen Kranioplastik die aufgrund einer Liquorzirkulationsstörung ein VP Shunt System als kombinierte Therapie in der gleichen Sitzung erhalten haben.
Somit kann zusammenfassend festgehalten werden:
Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass die Kranioplastik nach einer supratentoriellen dekompressiven Kraniektomie mit Reimplantation des eigenen Schädelknochens zum frühesten möglichen Zeitpunkt ein sicheres und effektives Verfahren darstellt und bei ausgewählten Patienten sogar bessere Ergebnisse als die späte Kranioplastik haben kann. Eine mögliche Erklärung dafür könnte das Auftreten und die Persistenz von neurologischen Defiziten im Rahmen des „syndrome of the trephined“ bei Patienten bieten, bei denen eine späte Kranioplastik durchgeführt wurde. In diesem Patientengut hatten die Patienten mit ultra-früher Kranioplastik das beste neurologische Outcome, die Komplikationsrate war in allen Gruppen vergleichbar.
Um Komplikationen zu vermeiden, sollten Patienten mit einer vorausgegangenen lokalen Infektion spät kranioplastiert werden.
Das neurologische Outcome der Patienten, bei denen ein kombiniertes Verfahren Kranioplastik –VP Shunt durchgeführt wurde, war vergleichbar mit anderen Patientengruppen. Somit ist eine Kranioplastik bei Patienten mit konvexen, über Kalottenniveau prolabierten Kraniektomielappen aufgrund eines Hydrocephalus keine Kontraindikation.
Manual development of deep linguistic resources is time-consuming and costly and therefore often described as a bottleneck for traditional rule-based NLP. In my PhD thesis I present a treebank-based method for the automatic acquisition of LFG resources for German. The method automatically creates deep and rich linguistic presentations from labelled data (treebanks) and can be applied to large data sets. My research is based on and substantially extends previous work on automatically acquiring wide-coverage, deep, constraint-based grammatical resources from the English Penn-II treebank (Cahill et al.,2002; Burke et al., 2004; Cahill, 2004). Best results for English show a dependency f-score of 82.73% (Cahill et al., 2008) against the PARC 700 dependency bank, outperforming the best hand-crafted grammar of Kaplan et al. (2004). Preliminary work has been carried out to test the approach on languages other than English, providing proof of concept for the applicability of the method (Cahill et al., 2003; Cahill, 2004; Cahill et al., 2005). While first results have been promising, a number of important research questions have been raised. The original approach presented first in Cahill et al. (2002) is strongly tailored to English and the datastructures provided by the Penn-II treebank (Marcus et al., 1993). English is configurational and rather poor in inflectional forms. German, by contrast, features semi-free word order and a much richer morphology. Furthermore, treebanks for German differ considerably from the Penn-II treebank as regards data structures and encoding schemes underlying the grammar acquisition task. In my thesis I examine the impact of language-specific properties of German as well as linguistically motivated treebank design decisions on PCFG parsing and LFG grammar acquisition. I present experiments investigating the influence of treebank design on PCFG parsing and show which type of representations are useful for the PCFG and LFG grammar acquisition tasks. Furthermore, I present a novel approach to cross-treebank comparison, measuring the effect of controlled error insertion on treebank trees and parser output from different treebanks. I complement the cross-treebank comparison by providing a human evaluation using TePaCoC, a new testsuite for testing parser performance on complex grammatical constructions. Manual evaluation on TePaCoC data provides new insights on the impact of flat vs. hierarchical annotation schemes on data-driven parsing. I present treebank-based LFG acquisition methodologies for two German treebanks. An extensive evaluation along different dimensions complements the investigation and provides valuable insights for the future development of treebanks.
In wissenschaftlichen als auch administrativen Kontexten ist die Überzeugung weit verbreitet, es müssten neue Steuerungsmodelle und Steuerungsinstrumente im Schulwesen implementiert werden. Die Einführung neuer Steuerungsmodelle und Steuerungsinstrumente wird dabei entweder am Vorbild anderer Länder ausgerichtet, so
z. B. bei der Einrichtung von Qualitätsagenturen, oder es wird an Steuerungsinstrumente angeknüpft, die auch in Deutschland eine Tradition haben, wie bspw. das Zentralabitur. Für diese unterschiedlichen Maßnahmen hat sich in den letzten Jahren der Begriff der Qualitätssicherung bzw. Qualitätsentwicklung eingebürgert. Man kann die im Schulwesen ergriffenen Maßnahmen aber auch in einen weiteren Kontext stellen und neue Steuerungsmodelle im Zusammenhang mit allgemeinen Modernisierungsbestrebungen im Staats- und Verwaltungswesen betrachten. Diese Theorieansätze, die unter dem Oberbegriff New Public Management populär geworden sind, eröffnen den begrifflich-analytischen Rahmen, der institutionelle Wandlungsprozesse verständlich macht. Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach, ob und wie sich ein Funktionswandel der (unteren) staatlichen Schulaufsicht von einem bürokratischen Steuerungssystem zu einem schulischen Unterstützungssystem abzeichnet. Dabei geht die vorliegende Arbeit von der Grundannahme aus, dass die staatliche Schulaufsicht als Teil des Staats- und Verwaltungswesens betrachtet werden muss, wenn man eine realistische Einschätzung darüber gewinnen möchte, welche institutionellen Veränderungsprozesse sich aktuell vollziehen und welche Entwicklungsspielräume in Zukunft bestehen. Dieser Frage soll nicht nur theoretisch, sondern auch empirisch nachgegangen werden. Um dem Forschungsgegenstand gerecht zu werden, wird ein akteursorientierter Ansatz gewählt. Da man es bei vielen Reformen im öffentlichen Sektor mit einer Gemengelage von Interessen unterschiedlichster Akteure zu tun hat, bietet eine akteursorientierte Perspektive den Vorteil, institutionelle Wandlungsprozesse in einem gesellschaftlichen
System auf makro- und mikropolitischer Ebene greifbar zu machen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit werden die Modernisierungsansätze vorgestellt, die unter dem Begriff New Public Management firmieren. Ergänzend dazu wird der aktuelle wissenschaftliche Diskussionsstand in Politik- und Sozialwissenschaft skizziert. Es folgt eine Beschreibung erster Wirkungen neuer Steuerungsformen in
Deutschland und im anglo-amerikanischen Raum sowie konkret am Fallbeispiel der Schulaufsichtsbehörden in England. Abschließend wird der Diskurswechsel von New Public Management zu New Public Governance beschrieben. Der Diskurs zu New Public Governance betont die Rolle von Akteuren in Modernisierungsprozessen. Der zweite Teil stellt überblicksartig die Institutionalgeschichte der staatlichen
Schulaufsicht dar, die als wichtigste Determinante für weitergehende Reformbestrebungen gelten kann. Es folgt die Darstellung aktueller Entwicklungstendenzen im schulischen Steuerungssystem. Dabei können die Neu-Gründung von Qualitätsagenturen, die Einführung von Schulinspektionen, die Bestimmung strategischer Ziele im Schulsystem und die Etablierung von Berichtssystemen als ein Lernen aus internationalen Entwicklungen beschrieben werden. Die anschließende vertiefte Diskussion von Managementansätzen macht deutlich, dass die Möglichkeiten, die untere Schulaufsicht zu einem schulischen Unterstützungssystem zu entwickeln, noch nicht ausgeschöpft sind. Es wird dahingehend argumentiert, dass die Managementansätze als ein Professionalisierungsimpuls für das Steuerungssystem gelten können: Anspruchsvolle Aufgaben im system monitoring und im Bereich der Schulentwicklung kann die untere Schulaufsicht nur auf der Basis breiten, sozialwissenschaftlichen Wissens gerecht werden. Im dritten Teil wird konkret am Beispiel der unteren Schulaufsicht in Hessen
herausgearbeitet, welche Funktionen die staatliche Schulaufsicht wahrnimmt und wie sich ein möglicher Funktionswandel auf die Arbeit der unteren Schulaufsichtsebene auswirkt. Dazu wird Interviewmaterial genutzt, dass in Gruppendiskussionen mit fachlichen Schulaufsichtsbeamten in Hessen gewonnen wurde. Um einen umfassenderen Überblick über aktuelle Entwicklungstendenzen zu erhalten, wird ergänzend dazu Material aus Experteninterviews mit Vertretern der oberen Schulaufsicht hinzugezogen. Im Rückgriff auf die Daten eines Evaluationsprojekts am Deutschen Institut für Internationale Pädagogische Forschung(DIPF), werden Leistungen und Funktionalität der unteren Schulaufsicht aus der Perspektive der fachlichen Schulaufsichtsbeamten bewertet: Zum einen aus der Binnensicht interner Organisation und zum anderen in der Außendimension als Steuerungsinstanz im Schulsystem. Der zusätzliche Vergleich mit den Schulleiterdaten soll Auskunft darüber geben, inwieweit die Bewertungen hinsichtlich derzeitiger und zukünftiger Funktionen konvergent bzw. divergent sind. Im vierten Teil werden die Ergebnisse der Untersuchung mit den theoretischen Vorüberlegungen aus den ersten beiden Kapiteln verknüpft. Es werden Entwicklungsmöglichkeiten des schulischen Steuerungssystems aufgezeigt und weitergehende Evaluationsansätze nach Maßgabe der Grundlagentheorien diskutiert.
This study analyses five British translations of Bertolt Brecht's 'Mutter Courage und ihre Kinder'. Two of these translations were written by speakers of German, and three by well-known British playwrights with no knowledge of the source text language. Four have been produced in mainstream British theatres in the past twenty-five years. The study applies translation studies methodology to a textual analysis which focuses on the translation of techniques of linguistic "Verfremdung", as well as linguistic expression of the comedy and of the political dimension in the work. It thus closes the gap in current Brecht research in examining the importance of his idiosyncratic use of language to the translation and reception of his work in the UK. The study assesses the ways in which the translator and director are influenced by Brecht's legacy in the UK and in turn, what image of Brecht they mediate through the production on stage. To this end, the study throws light on the formation of Brecht's problematic reputation in the UK, and it also highlights the social and political circumstances in early twentieth century Germany which prompted Brecht to develop his theory of an epic theatre. The focus on a linguistic examination allows the translator's contribution to the production process to be isolated. Together with an investigation of the reception of each performance text, this in turn facilitates a more accurate assessment of the translator and director's respective influence in the process of transforming a foreign-language text onto a local stage. The analysis also sheds light on the different approaches taken by speakers of German, and playwrights creating an English version from a literal translation. It pinpoints losses in translation and adaptation, and suggests how future versions may avoid these.
Risikoabschätzung für das Auftreten Thrombolyse-assoziierter intrazerebraler Blutungen mittels MRT
(2009)
Symptomatische intrazerebrale Blutungen (sICH) stellen die wichtigste Komplikation der Thrombolyse akuter ischämischer Schlaganfälle dar. Sie sind mit einer erhöhten Mortalität und sehr schlechten Langzeitergebnissen verbunden. Die Identifikation von Patienten mit einem erhöhten Blutungsrisiko stellt daher ein wesentliches Ziel aktueller Forschungsbemühungen dar.
In der vorliegenden Studie wurde die Bedeutung ausgewählter MR-Parameter (Leukoaraiosis, Mikroblutungen, Ausmaß der DWI-Läsion) als mögliche Prädiktoren für Thrombolyse-assoziierte sICH untersucht.
In die retrospektive, multizentrische Studie wurden prospektiv erhobene Daten von 475 Patienten aus sechs deutschen und zwei internationalen anerkannten Schlaganfallzentren eingeschlossen, die im Zeitfenster von <6 Stunden mit einem akuten ischämischen Schlaganfallereignis im Bereich der vorderen Zirkulation mit einer i.v. (n=367; 77%), i.a. (n=74; 16%) oder i.v./i.a. (n=34; 7%) Thrombolyse behandelt worden.
Alle Patienten wurden mit einem Schlaganfall-MR-Protokoll untersucht, welches neben Diffusions- und FLAIR-Sequenzen auch T2*-gewichtete Sequenzen enthielt.
Für die Analyse wurden die Patienten jeweils in eine Gruppe ohne und eine Gruppe mit schwerer LA (Fazekas 0-1 vs. 2-3) und je eine Gruppe mit kleinem (<1/3 des A. cerebri media-Stromgebietes (MCA)) und großem (>1/3 MCA) DWI-Läsionsausmaß dichotomisiert. T2*-Wichtungen wurden auf das Vorliegen und die Anzahl von zerebralen Mikroblutungen (CMB) untersucht und Patienten in eine Gruppe mit ≥1 CMB und ohne CMB dichotomisiert.
Eine sICH wurde als eine in der Verlaufsbildgebung (cCT oder MRT) dokumentierte (≥10 ml) Blutung definiert, die innerhalb von 36 Stunden nach Thrombolysebeginn mit einer klinischen Verschlechterung des Patienten (≥1 Punkt auf der NIHSS-Skale) einherging.
Insgesamt entwickelten 28 (5,9%) Patienten eine sICH. SICH waren signifikant häufiger in der Gruppe mit LA (Fazekas 2-3) (n=12/114; 10,5%) als in der Gruppe ohne LA (Fazekas 0-1) (n=13/335; 3,5%) zu finden. In einer logistischen Regressionsanalyse (Alter, National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) bei Aufnahme, Art der Thrombolyse) blieb LA ein unabhängiger Risikofaktor (Odds ratio 2,7 (95% KI, 1,29-6,59), p=0,015).
Die Anzahl der sICH konnte auch in der Gruppe mit großen (>1/3 MCA) (n=6/32; 18,8%) signifikant häufiger als in der Gruppe mit kleinen DWI-Läsionen (<1/3 MCA) (n=12/319; 3,8%) erhoben werden, was umgerechnet einem 5,9 fachen Risiko (Odds ratio 5,9 (95% KI, 2,048-17,017, p=0,003) einer sICH für Patienten mit großen DWI-Läsionen im Vergleich zu Patienten mit kleinen DWI-Läsionen entspricht. Das Ausmaß der DWI-Läsion bleibt in einer multivariaten Regressionsanalyse (s.o.) ein unabhängiger Risikofaktor für sICH.
Die Ergebnisse einer großen Subgruppenanalyse der i.v.-behandelten Patienten (n=367/376, 77%) waren hinsichtlich der Bedeutung für LA und Ausmaß der DWI-Läsion vergleichbar mit den Ergebnisse der Gesamtmenge.
Die Anzahl der sICH unterschied sich nicht signifikant zwischen der Gruppe mit ≥1 CMB (n=7/79, 9%) und der Gruppe ohne CMB (n=20/367, 5%, p=0,295).
Zusammenfassend konnte die vorliegende Arbeit die MR-Parameter Leukoaraiose und das Ausmaß der initialen DWI-Läsion als unabhängige Risikofaktoren hinsichtlich der Enwicklung Thrombolyse-assoziierter sICH nachweisen. Hiermit kann einerseits die Sicherheit der Thrombolyse im 3h-Zeitfenster erhöht und der Behandlungzeitraum hoffentlich zukünftig erweitert werden. Der potentielle Behandlungsgewinn einer Thrombolyse sollte bei Einschluss in Betracht kommender Schlaganfallpatienten sorgfältig gegen das mit zunehmender LA und DWI-Läsionlast ansteigende Blutungsrisiko abgewogen werden. Eine unabhängige Assoziation zwischen sICH und CMB konnte nicht gezeigt werden, so dass das Blutungsrisiko bei Patienten mit CMB’s den Behandlungsvorteil wahrscheinlich nicht übersteigt.
Um die kontinuierlich auf uns einströmende Menge an Reizen zu verarbeiten, ist es wichtig, die Informationen genau zu selektieren. Ein hilfreicher Mechanismus ist hierbei die Aufmerksamkeit gezielt nur auf eine Informationsquelle zu richten und zu verarbeiten.
So ist es möglich, selbst in komplexen Situationen, wie zum Beispiel einer Feier mit vielen verschiedenen Gesprächen, ganz gezielt ein einzelnes herauszufiltern.
Der Effekt von Aufmerksamkeit auf auditory steady-state Responses (aSSR) wurde in der Vergangenheit schon in verschiedenen Studien mit unterschiedlichen Messverfahren und Stimuli untersucht. Dabei wurden teils widersprüchliche Ergebnisse gefunden, die entweder gar keine oder auf sehr kleine Frequenzbereiche beschränkte Aufmerksamkeitseffekte fanden.
Das Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen von Aufmerksamkeit auf die aSSR innerhalb eines größeren Frequenzspektrums (11 Hz, 23 Hz, 41 Hz, 73 Hz und 97 Hz) zu analysieren. Für diesen Zweck wurden den Probanden nach Instruktion der zu beachtenden Seite jeweils zwei benachbarte Modulationsfrequenzen während vier aufeinander folgenden Blöcken dichotisch präsentiert. Die Probanden wurden angewiesen, Trägerfrequenzänderungen auf der zu beachtenden Seite durch Betätigen einer Maustaste anzugeben. Die Registrierung der aSSR-Antworten geschah mittels Elektroenzephalogramm (EEG). Auch die durch die Stimulation hervorgerufene P300 wurde dargestellt.
Bezüglich des Effekts von Aufmerksamkeit auf die aSSRs zeigte sich nach Analyse der gewonnenen Daten im Frequenzbereich von 23 Hz eine Auswirkung. Diese stellte sich in Form einer Amplitudensteigerung auf der jeweils durch den Probanden beachteten Präsentationsseite dar. Bei einer Modulationsfrequenz von 41 Hz kam es bei Präsentation auf der rechten Seite zu höheren Amplituden als bei Präsentation auf der linken Seite. Bei 73 Hz und 97 Hz konnte keinerlei Auswirkung weder der Aufmerksamkeit noch der Präsentationsseite registriert werden. Auffällig war bei den präsentierten Tönen im 20 Hz und 70 Hz Bereich auch eine im Vergleich zu den anderen Frequenzbereichen (11 Hz, 41 Hz und 97 Hz) verlängerte Reaktionszeit der Probanden. In Kombination mit der Modulation der aSSR-Amplitude durch Aufmerksamkeit bei 23 Hz könnte dies ein Hinweis auf einen förderlichen Einfluss der Aufgabenschwierigkeit auf die Detektierbarkeit von Aufmerksamkeitseffekten sein.
Im Gegensatz hierzu zeigte die dargestellte P300 in allen präsentierten Blöcken einen deutlichen Effekt der Aufmerksamkeit. Dieser äußerte sich ebenfalls in einer Steigerung der Amplitude.
Es scheint also zumindest ein moderater Einfluss von Aufmerksamkeit auf die aSSRs zu existieren. Gleichzeitig wirkt dieser allerdings stark abhängig von gewähltem Stimulus und Messmethode. Der Effekt von Aufmerksamkeit auf die P300 konnte dagegen gut repliziert werden und scheint daher bei dichotischer Stimulation ein deutlicher Marker für Aufmerksamkeit zu sein.
In der vorliegenden Studie wurden Adoptierte auf Merkmale wie Selbstbewusstsein, Widerstandsfähigkeit und Bindungseinstellungen in Abhängigkeit verschiedener möglicher Einflussfaktoren wie beispielsweise Heimaufenthalten untersucht. Mittelpunkt der Forschung war die Exploration der Entwicklung von Persönlichkeitsmerkmalen in Abhängigkeit der verschiedenen Adoptionsformen, die den Kontakt zu den leiblichen Eltern möglich machen oder verhindern. Untersuchungen an erwachsenen Adoptierten sind noch selten, ebenso gibt es keine wissenschaftlichen Studien in Deutschland, die sich mit dem Thema der Adoption befassen. Auch die Forschung auf dem Gebiet der verschiedenen Adoptionsformen und ihrer Auswirkung auf die Entwicklung von Persönlichkeitsmerkmalen bei Adoptierten ist noch sehr jung. Dies wurde mit der vorliegenden Studie deutschlandweit erstmalig in Angriff genommen. Die Ergebnisse zeigten, dass Heimaufenthalte, je häufiger sie sind, zu einer verminderten Widerstandsfähigkeit der Adoptierten führten. Heimaufenthalte konnten als starker Prädiktor für verminderte Resilienz identifiziert werden. Ebenso sanken die Werte auf manchen Skalen der Multidimensionalen Selbstwertskala wie beispielsweise die Wertschätzung der eigenen Leistungsfähigkeit. Adoptierte wurden mit steigender Anzahl an Heimaufenthalten neurotischer. Leider konnte aufgrund mangelhafter Angaben die Dauer der Heimaufenthalte und Aufenthalte in Pflegefamilien nicht in die Auswertung mit einbezogen werden, darüber hinaus auch nicht die Qualität der Erinnerungen an diese Heimaufenthalte. Dennoch lässt sich feststellen, dass Heimaufenthalte das Selbstwertgefühl und die Selbstsicherheit Adoptierter nachhaltig beeinträchtigen können. Sie sollten so gering wie möglich gehalten werden. Auf die Bindungseinstellungen zeigten sie keine Auswirkungen. Hier könnte zukünftig eine genauere Untersuchung des Einflusses von Heimaufenthalten erfolgen, die unter anderem die Dauer und zusätzliche Wechsel von Pflegefamilien mit einbezieht. Bezüglich der Adoptionsformen offene Adoption vs. Inkognitoadoption konnte gezeigt werden, dass es für die Entwicklung der untersuchten Persönlichkeitsmerkmale keine Rolle zu spielen scheint, ob die Adoptierten die Möglichkeit des Kontaktes zu ihren leiblichen Eltern haben oder nicht. Dennoch führte die positive Bewertung dieses Kontaktes zu besseren Ergebnissen bezüglich des Selbstwertes als die negative Bewertung des Kontaktes zu den leiblichen Eltern. Interessant ist, dass Adoptierte, die keine Kontaktmöglichkeit zu ihren leiblichen Eltern hatten, bessere Werte bezogen auf Facetten des Selbstwertgefühles zeigten als Adoptierte, die diesen Kontakt negativ bewerteten. Es scheint, als wäre es für das eigene Selbstbewusstsein gesünder, keinen Kontakt zu haben als ihn letztendlich negativ zu bewerten. Positiv empfundener Kontakt konnte das Selbstwertgefühl und die Bindungseinstellungen nicht zusätzlich verbessern. Allerdings kann keine sinnvolle Konsequenz aus diesen Ergebnissen gezogen werden. Im Voraus ist selten zu beurteilen, wie der / die Adoptierte das Treffen und den Kontakt zu den leiblichen Eltern bewerten wird. Dies hängt mit Sicherheit nicht nur vom Adoptierten selbst, sonder mitunter von einer Anzahl an Faktoren ab, nicht zuletzt von dem Vorhandensein früher Vorurteile und der Unterstützung seitens des Adoptivelternhauses. Es ist nicht verantwortlich und angemessen, aus reiner Spekulation über den möglichen Ausgang eines Kontaktes diesen im Voraus zu verhindern und dem Kind diese Möglichkeit zu versagen. Laut den Ergebnissen ist ein anderes Ereignis im Leben eines Adoptierten für sein Selbstwertgefühl und sein Bindungsverhalten entscheidender. Dies bezieht sich auf die Kommunikation der Adoptiveltern mit ihrem Kind. Wichtigster Prädiktor für ein gesundes Selbstbewusstsein und günstige Bindungseinstellungen war laut den Ergebnissen das Geständnis der Eltern über die Adoption. Eltern, die diesbezüglich offen und ehrlich ihren Kindern gegenüber waren, wurden in ihrem Erziehungsverhalten von diesen als emotional wärmer und weniger kontrollierend bewertet als Eltern, die ihre Kinder nicht über die Adoption aufgeklärt hatten. Adoptierte, die über ihre eigene Adoption nicht aufgeklärt wurden, zeigten vermindertes Selbstwertgefühl, verminderte Widerstandsfähigkeit und schlechtere Bindungseinstellungen, wobei die Skala „Nähe“, das heißt die Messung zur Fähigkeit, andere Menschen an sich heran zu lassen, Werte außerhalb des Normbereiches aufzeigte und man hier sogar von einem pathologisch veränderten Persönlichkeitsmerkmal sprechen kann. Auch das Alter bei Aufklärung spielt eine wichtige Rolle. Frühe Aufklärung über die Adoption, in der vorliegenden Studie wurde ein Zeitpunkt bis zum neunten Lebensjahr als früh definiert, führte zu höherem allgemeinen Selbstwertgefühl und einer erhöhten Widerstandsfähigkeit. Auf die Bindungseinstellungen schien der Zeitpunkt der Aufklärung keine Auswirkung zu haben. Eltern, die ihre Kinder früh über ihre Adoption informierten, wurden als weniger überbehütend und kontrollierend bewertet. Wichtig zu erwähnen ist, dass die Werte bei den Rechnungen der Gruppenvergleiche, mit Ausnahme des oben erwähnten Wertes für die Skala „Nähe“ der Adult Attachment Scale, alle im Normbereich lagen. Es liegen also, auch im Vergleich mit den Normstichproben, keine Befunde vor, die bei der adoptierten Stichprobe auf Pathologien hinweisen. Zu finden sind jedoch leichte Abweichungen von der Norm, die statistisch gesehen von Signifikanz sind und auch inhaltlich wichtige Hinweise auf die Folgen von Adoption liefern. Obwohl der Großteil der Adoptierten (90.3%) über ihre Adoption aufgeklärt worden war und dies laut oben beschriebener Ergebnisse eine günstiger Faktor bezüglich der Entwicklung von Selbstwert und Bindung ist, lässt sich feststellen, dass Adoptierte im Vergleich zu den nicht adoptierten Normstichproben ein vermindertes Selbstwertgefühl und ungünstigere Bindungseinstellungen aufwiesen. Weitere Einflussfaktoren dieser Persönlichkeitsmerkmale im Leben eines Adoptierten müssten zukünftig identifiziert werden. Seelische Vorerkrankungen, wie beispielsweise eine Depression, könnten einen solchen Einflussfaktor darstellen. 20.6% der Adoptierten der vorliegenden Studie gaben an, seelisch erkrankt zu sein, darunter waren 12.1% depressiv, was zu zusätzlichen Rechnungen veranlasste. Bei diesen Berechnungen mit dem Vergleich von depressiven Adoptierten versus seelisch gesunden Adoptierten fiel auf, dass die depressive Gruppe niedrigere Werte auf Skalen des Selbstwertes und der Resilienz aufwies, sowie schlechtere Bindungseinstellungen hatte als die seelisch gesunde Gruppe. Depressive Adoptierte waren zusätzlich neurotischer und bewerteten ihre Elternhäuser als emotional kühler. Ebenso hatten sie mehr Ablehnung und Strafe durch die Mütter erfahren. Besonders hervorzuheben sind jedoch die Ergebnisse auf den Skalen der emotionalen Selbstwertschätzung und der Bindungseinstellung Angst. Hierbei lagen die Werte der depressiven adoptierten Gruppe deutlich außerhalb des Normbereichs und wiesen auf pathologisch veränderte Persönlichkeitsmerkmale hin. Depressive hatten somit deutlich schlechtere Einstellungen gegenüber sich selbst als Adoptierte, die nicht depressiv waren. Ebenso hatten sie eine sehr schlechte Selbstachtung und litten vermehrt unter Ängsten. Es bleibt also die Frage offen, inwiefern seelische Vorerkrankungen, die in der vorliegenden Studie zu einem hohen Prozentsatz vertreten waren, zu den schlechteren Ergebnissen bezüglich Selbstwert und Bindung Adoptierter im Vergleich zu Normstichproben beitragen. Es bleibt offen, ob Adoption alleine ein Risikofaktor für vermindertes Selbstbewusstsein und schlechte Bindungseinstellungen ist oder ob diese Ergebnisse nicht vielmehr durch andere Faktoren, wie seelische Erkrankungen, beeinflusst werden. Abschließend lässt sich feststellen, dass die Ehrlichkeit der Adoptiveltern und der offene Umgang mit dem Thema der Adoption entscheidend zur Bildung eines gesunden Selbstwertes und günstiger Bindungseinstellungen ihres Kindes beitragen. Ebenso sollten Adoptierte nicht lange in Unwissenheit über ihre Herkunft gelassen werden. Ein früher Zeitpunkt der Aufklärung über die eigene Adoption hat positiven Einfluss auf die Entwicklung des Selbstwertes, der Widerstandsfähigkeit und der Bindungseinstellung. Weiterhin ist zu sehen, dass die reine Kontaktmöglichkeit zu den leiblichen Eltern für die Entwicklung von Selbstwertgefühl, Resilienz und Bindung keine entscheidende Rolle zu spielen scheint. Eine offene Adoptionsform alleine, in der der Kontakt zwischen Adoptivfamilie und leiblichen Eltern von Anfang an aufrechterhalten bzw. zu einem späteren Zeitpunkt wieder aufgenommen wird, scheint für die Entwicklung des Adoptivkindesnicht die entscheidende Rolle zu spielen. Interessant bleibt die Frage nach dem Einfluss von Adoption als Risikofaktor für die Entwicklung von seelischen Erkrankungen und hierunter insbesondere Depression. Ein hoher Prozentsatz der Adoptierten dieser Studie gab an, seelisch erkrankt zu sein (20.6%), die häufigste genannte Diagnose darunter war die Depression (12.1%). Die Diagnosehäufigkeiten und Prädiktoren für die Entwicklung von Depressionen müssen zukünftig genauer untersucht werden. Da es sich bei der vorliegenden Studie um eine anonymisierte Fragebogenstudie ohne zusätzliche Führung von Interviews handelte, war es nicht möglich, Fragen zu Angaben der Probanden zu beantworten und Missverständnisse zu klären. Manches Ergebnis, wie die Angabe der Probanden, depressiv zu sein, oder die Untersuchung der Anzahl von Heimaufenthalten schien sehr fraglich. Zukünftige Studien sollten zusätzlich Interviews mit den Teilnehmern beinhalten, da sich so Missverständnisse am leichtesten klären lassen und Rückfragen möglich sind. Zur Erfassung von seelischen und körperlichen Erkrankungen können Testverfahren wie das Brief Symptom Inventory (Franke 2000) und die Hospital Anxiety and Depression Scale (Lingen, Buss, Snaith 2005) verwendet werden. Die Teilnehmerzahl der Studie belief sich auf 165 Probanden. Bei 75.8% der Probanden handelte es sich um weibliche Teilnehmerinnen. Da Studien bereits belegt haben, dass das Geschlecht einen entscheidenden Einfluss auf die Ergebnisse bei Untersuchungen zu Persönlichkeitsmerkmalen hat (Freeark, Rosenberg et al.2005), müsste man die Unterteilung in männliche und weibliche Probandengruppen vornehmen. Aufgrund der zu kleinen Teilnehmerzahl an Männern konnte diesin der vorliegenden Studie nicht geschehen. Ebenso betrifft dies die Einteilung der Probanden in die Altersgruppen bei Aufklärung über die Adoption. Hier konnte aufgrund der kleinen Teilnehmerzahl nur eine Unterteilung in ein Alter bis zum neunten Lebensjahr und ab dem zehnten Lebensjahr erfolgen. Bis zum neunten Lebensjahr durchläuft das Kind jedoch wichtige Entwicklungsschritte auf den Gebieten der Bindung zu Bezugspersonen, Entwicklung eines Selbstbildes und Integration in eine Gemeinschaft, in denen das Kind die Information über die eigene Adoption unterschiedlich verarbeitet. Anhand größerer Teilnehmerzahlen kann eine genauere Einteilung in verschiedene Altersklassen auch vor dem neunten Lebensjahr erfolgen und so der optimale Zeitpunkt der Aufklärung über die Adoption genauer festgelegt werden. Ebenso wichtig wäre eine weitere Einteilung in Inlands- vs. Auslandsadoptionen. Kinder, die aus dem Ausland adoptiert wurden, haben vermehrt Integrationsschwierigkeiten aufgrund ihres andersartigen Erscheinungsbildes, die sich auch auf die Entwicklung von Selbstbewusstsein auswirken können (von Borczyskowski, Hjern et al. 2006). Dies müsste man anhand der Unterteilung in Inlands –und Auslandsadoptionen genauer untersuchen. Die Probanden der vorliegenden Studie gaben an, ein emotional wärmeres und empathischeres Elternhaus gehabt zu haben als die Normstichprobe. Bei der Bewertung des Elternhauses handelt es sich jedoch lediglich um die Einschätzung der Teilnehmer, es ist eine subjektive Bewertung. Über die Qualität der Elternhäuser an sich kann man aus objektiver Sicht keine Aussage machen. Weitere Testverfahren zur Messung der Beziehungsqualitäten zwischen den Adoptierten und ihren Eltern und/oder der Persönlichkeitsmerkmale der Adoptiveltern müssten hierfür herangezogen werden. Ebenso wenig kann mit der Adult Attachment Scale das tatsächliche Bindungsverhalten gemessen werden. Vielmehr gibt dieses Testverfahren einen Hinweis auf die Bindungseinstellungen der Probanden. Zur Untersuchung von Bindungsverhalten liegen keine Testverfahren in Fragebogenform vor, dies müsste auf andere Weise erfolgen, beispielsweise mit Hilfe des Adult Attachment Interviews. Es lässt sich also feststellen, dass zur genaueren Untersuchung von Adoptierten eine größere Teilnehmerzahl erforderlich wird. Eine erweiterte Testbatterie und die Führung von Interviews können Missverständnisse und offene Fragen aus dem Weg räumen und ermöglichen so eine differenziertere Auswertung der Ergebnisse.
Ziel dieser Arbeit ist es, Art, Häufigkeit und Dauer der Komplikationen nach sekundärer Kieferspaltosteoplastik mit Beckenkammtransplantation bei Patienten mit Lippen-, Kiefer-, Gaumenspalten aufzuzeigen. Dazu wurden in dieser retrospektiven Studie die Daten von 236 Patienten, die im Zeitraum zwischen Juli 1986 und August 1997 im Klinikum „Rechts der Isar“ der Technischen Universität München eine Spanentnahme am vorderen Beckenkamm zur autologen Transplantation im Mund-Kiefer-Gesichtsbereich erhielten, ausgewertet. Die Datenerhebung erfolgte durch Analyse der OP-Berichte, Krankenblätter, persönliche Befragung und körperliche Untersuchung aller 236 Patienten. Der Focus dieser Arbeit liegt bei der Darstellung der Ergebnisse der 182 LKG-Patienten, welche mit den anderen Indikationsgruppen verglichen wurden. Das durchschnittliche OP-Alter der LKGPatienten betrug 13,8 Jahre, die Daten wurden im Mittel 5,3 Jahre nach der Entnahme-OP erfasst. Chirurgische Frühkomplikationen konnten bei 15 LKG-Patienten (8,2 %) beobachtet werden, die bei zwei Patienten (1,1 %) einer chirurgischen Nachbehandlung (Hämatomausräumung) bedurften. Die Komplikationsrate war bei den Patienten mit der Diagnose LKG (8,2 %) geringer als bei den übrigen Indikationsgruppen zur Knochenentnahme. Diese reichte von 11 % bei Tumorpatienten bis 26 % bei Patienten mit Dysgnathie. Eine Gehbehinderung war mit 91,7 % die häufigste nichtchirurgische Komplikation. Die Gehbehinderung war bei 13,7 % der LKG-Patienten so stark, dass sie auf Gehhilfen angewiesen waren. 78 % waren ebenfalls gehbehindert, benötigten jedoch keine Gehhilfe. Starke postoperative Schmerzen in der Entnahmeregion nannten 48,4 %. Über postoperative Sensibilitätsstörungen klagten 28,6 % der LKG-Patienten. Zum Untersuchungszeitpunkt, im Durchschnitt 5,3 Jahre nach dem operativen Eingriff, wurden immerhin noch bei 6,0 % der LKG-Patienten persistierende Schmerzen als Spätfolge gefunden. Sensibilitätsstörungen persistierten bei 9,9 % aller Spalt-Patienten. Bei der subjektiven Bewertung fanden sich desweiteren bei 7,8 % nichtschmerzhafte bleibende Beschwerden wie Wetterfühligkeit. Mit der Ästhetik der Narbe im Entnahmebereich waren 86,3 % zufrieden, unzufrieden nur 7,1 %. Bei entsprechender Indikation würden sich 91,8% der LKG-Patienten wieder für die gleiche Therapieform (Beckenkammtransplantation) entscheiden, immerhin 14 Patienten (7,9 %) würden diesen Eingriff unter keinen Umständen wiederholen bzw. nur Fremdmaterial als Augmentat verwenden, als sich erneut einer Entnahme-OP zu unterziehen. Beim isolierten Vergleich der Schmerzhaftigkeit werteten 60,4% die Becken-Operation und 18,1 % die Operation im Mund-Kiefer-Gesichtsbereich als schmerzhafter. Beim Vergleich der Gesamtbefindlichkeit des postoperativen Zustandes hingegen wurden der Mund-Kiefer-Gesichtsbereich von 56,0 % und der Beckenbereich nur von 19,8 % als der insgesamt unangenehmere Befund bezeichnet. Für 29,7 % war die Entnahme-Operation schlimmer als erwartet, für 25,3 % deckte sich die Erfahrung durch die Operation mit ihrer Erwartungshaltung und 13,7 % erwarteten stärkere Beschwerden, als sie letztendlich auftraten. 31,3 % hatten keine Erwartungshaltung oder machten keine Angabe. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mit der autologen Beckenkammtransplantation für Patienten mit Lippen-Kiefer-Gaumenspalten eine Therapieform zur Verfügung steht, die ästhetisch und funktionell sehr gute Ergebnisse ermöglicht. Dennoch sind mit der Entnahmeoperation Komplikationen und Langzeitschäden verbunden, über die der Patient aufgeklärt werden muss und die insgesamt das Operationsergebnis schmälern. Um zukünftig die Entnahme von Beckenkammspongiosa zu umgehen, sollten zukünftig vermehrt Knochenersatzstoffe zur Defektauffüllung zum Einsatz kommen. Dies ist Inhalt momentan laufender, intensiver Forschung.
Während des Alterungsprozesses kommt es u.a. im Gehirn zu einem signifikanten Verlust
postmitotischer Zellen, was zu Hirnleistungsstörungen im Alter führen kann.
Der Grund für diesen Zellverlust durch Apoptose könnte sein, dass es im Alter zu erhöhtem
oxidativen Streß und zu einer Veränderung in der Konzentration der an der Apoptose beteiligten
Proteine und Faktoren kommt. Diese Studie befaßt sich mit der neuronalen Apoptose und den daran
beteiligten Proteinen und Regulatoren. Ziel war es, herauszufinden, ob es im Alter zu einer
gesteigerten Apoptoserate im Hippokampus und zu einer Veränderung der Konzentration von
Proteinen kommt, die das Auftreten bzw. die Hemmung der Apoptose begünstigen könnte.
Untersucht wurden die Hippokampi von Pavianen als mögliches Primaten-Modell für altersbedingte
Pathologien, die das menschliche Gehirn betreffen können.
Um apoptotische Zellen im Hippokampus der Paviane nachzuweisen, wurde mit der TUNEL-Methode
gearbeitet und mittels Immunhistochemie untersucht, welchen Effekt das Alter auf die Verteilung der
Immunreaktivität von Cytochrom C, AIF, Bax, Bcl-2, Caspase-3 sowie von XIAP, einem Inhibitor der
Apoptose, hat. Auch die Immunreaktivität der Enzyme PARP und ICAD wurde dargestellt. Die
Ergebnisse zeigen, dass in den Hippokampi der gealterten Paviane das anti-apoptotische Protein Bcl-2
in unveränderter Reaktivität vorlag und das pro-apoptotische Protein Bax hochreguliert war. Es gab
eine Umverteilung und möglicherweise Freisetzung von Cytochrom C, jedoch aber keine Aktivierung
von Caspase-3. Diese Ergebnisse zeigen eine gewebepezifische Änderung des Bcl-2/Bax-
Verhältnisses in den Hippokampi der alten Primaten, die zur Beeinflussung der Cytochrom CFreisetzung
beitragen, ohne jedoch zur Apoptose der Zelle zu führen. Apoptotische Zellen konnten
mittels TUNEL-Färbung nicht nachgewiesen werden. Das könnte damit zusammenhängen, dass
XIAP, ein inhibitorisches Regulatorprotein der Apoptose, bei den gealterten Pavianen hochreguliert
war, ebenso wie das DNA-Reparaturenzym PARP. Auch das Enzym ICAD, welches in aktivierter
Form während der Apoptose wesentlich zum Chromatinabbau beiträgt zeigte im Alter eine erhöhte
Aktivität. Da in einer Studie über Tau-Pathologie im Hippokampus von Pavianen für das Auftreten
dieser Pathologie ein Zusammenhang mit dem Alter nachgewiesen werden konnte, und man weiß,
dass Zellen in der Nähe der β-Amyloidablagerung bei M.Alzheimer durch Apoptose absterben, wurde
mit Hilfe der Immunfloureszenz die Reaktivität des Enzyms Neprelysin untersucht, welches für den
β-Amyloidablagerung zuständig ist. Dieses war in seiner Reaktivität in den Hippokampi
der älteren Paviane im Gegensatz zu der in den Hippokampi der jüngeren Primaten erniedrigt, was auf
eine altersbedingte Disposition zu diesen Plaques hinweist.
Die primär – und sekundärprophylaktische Versorgung durch einen plötzlichen Herztod bedrohter Patienten mittels Implantierbarer Cardioverter Defibrillatoren hat sich in mehreren groß angelegten Studien einer rein konservativ-medikamentösen Behandlung gegenüber als überlegen erwiesen. Ein Hauptproblem dieser Therapieform ist jedoch die mit 25 – 40% berichtete hohe Inzidenz inadäquater Therapieabgaben. Bisher weitgehend ungeklärt blieben die prognostische Bedeutung, eventuelle Risikofaktoren sowie die daraus abzuleitenden therapeutischen Implikationen des Auftretens inadäquater Therapieabgaben. Die vorliegende Arbeit analysiert die Daten 783 (630 Männer, 153 Frauen. Medianes Alter 65 Jahre) konsekutiv im Zeitraum von 1993 bis 2005 in der Medizinischen Klinik III – Kardiologie und Angiologie – Abteilung für Elektrophysiologie der Universitätsklinik der Johann Wolfgang Goethe-Universität implantierter Patienten über einen medianen Nachbeobachtungszeitraum von 37 Monaten. Implantiert wurden nach allgemein anerkannter Indikationsstellung Cardioverter Defibrillatoren der Firmen CPI/Guidant, Ela-Medical, Medtronic Inc. und St. Jude Medical. Zum Einsatz kamen hierbei Ein – Zwei – und Dreikammergeräte (Einkammer = 511, Zweikammer = 239, Dreikammer = 33). Die Sachkontrolluntersuchungen fanden im ersten Jahr nach Implantation dreimonatig, danach halbjährlich sowie bei Notwendigkeit außerplanmäßig statt. Hierbei wurden jeweils alle stattgehabten, von den Implantierbaren Cardioverter Defibrillatoren registrierten Ereignisse ausgedruckt und auf Speichermedien gesichert. Die archivierten Elektrogramme der in diesem Zeitraum aufgetretenen 11.942 tachykarden Ereignisse bilden die Grundlage der Analyse der vorliegenden Arbeit. Hierbei wurden alle aufgetreten inadäquaten Therapiegaben an Hand der Elektrogramme einer von neun ätiologischen Kategorien zugeordnet. Der aktuelle Status aller 783 Patienten wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit, soweit unbekannt und somit notwendig, telefonisch oder per Briefkontakt mit den weiterbehandelnden Ärzten und Zentren eruiert. Im Rahmen der Untersuchung wurden Parameter betreffend der Erkrankungen der Patienten (Herzinsuffizienz, Koronare Herzerkrankung, Dilatative Cardiomyopathie, Klappenvitien und vorbekannte atriale Tachykardien) sowie zu ihrer zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt aktuellen Medikation (Klasse-I-Antiarrhythmika, Sotalol, Amiodaron, Beta-Blocker, Klasse-IV-Antiarrhythmika, Digitalisglykoside, ACE-Inhibitoren/AT1-Antagonisten, Aldosteronantagonisten, Diuretika und CSE-Inhibitoren ) erfasst. Die statistische Auswertung bezüglich des Auftretens inadäquater Therapien sowie ihrer Ätiologie, der Versterbenshäufigkeit, der Überlebensdauer, des gefährdeten Auftretenszeitraums inadäquater Therapien, eines eventuellen prädilektiven Risikoalters, des Einflusses der verschieden Ätiologien und der Anzahl inadäquater Therapiegaben auf Überlebensdauer und Versterbenshäufigkeit, des Einflusses der Begleitmedikation, des Einflusses der Begleiterkrankungen, der Differenzen zwischen Ein – Zwei – und Dreikammergeräten, der Differenzen der Geräte der verschiedenen Hersteller sowie der erfolgten Programmierung der Implantierbaren Cardioverter Defibrillatoren erfolgte mittels des Leevene-Tests, des Kolmogoroff-Smirnoff-Tests, des Zweistichproben-t-Tests sowie Fisher’s exaktem Test. Im nachbeobachteten Zeitraum wurden 11.942 tachykarde Ereignisse registriert, deren Auswertung 2806 (23,5%) inadäquate Therapien ergab. Davon waren 27,9% Defibrillationen, 72,1% antitachykarde Überstimulationen. 200 der 783 Patienten (25,5%) erlitten inadäquate Therapieabgaben während der Nachbeobachtungsperiode. 29,1% der implantierten CPI/Guidant-Geräte waren von inadäquaten Therapien betroffen, 40,8% der Ela90 Geräte, 21,2% der Medtronic-Geräte und 25% der St. Jude-Geräte. Tachykard übergeleitetes Vorhofflimmern machte 45,6% der inadäquaten Therapien aus, Sinustachykardien 11,3%, Vorhofflattern 9,1%, supraventrikuläre Tachykardien 16,1%, Sondendefekte 14,1%, Muskelpotentialfehlwahrnehmungen 0,8%, T-Wellen-Fehlwahrnehmungen 1,6%, R-Wellen-Doppelwahrnehmungen 0,4% und nicht anhaltende Ventrikuläre Tachykardien 0,9%. Die Analyse der Differenzen der Patienten, welche inadäquate Therapien erlitten und der Patienten, welche keine inadäquaten Therapien erlitten, ergab signifikante Unterschiede. Die Nachbeobachtungsperiode der Patienten mit inadäquaten Therapien war mit 54,2 Monaten im Median länger als die der Patienten ohne inadäquate Therapien (Median hier 30 Monate, p<0,000001). Gleiches gilt für die Überlebensdauer der Patienten mit inadäquaten Therapien (mediane Überlebenszeit 56,9 Monate versus 33,4 Monate, p<0,0001). Weder das generelle Auftreten inadäquater Therapien noch die Zahl der erlittenen inadäquaten Therapien reduzierten die Überlebensdauer. Auch konnte keine Form von inadäquater Therapie identifiziert werden, die mit einer Übersterblichkeit einherging. Das Auftreten inadäquater Therapien an sich jedoch ging in einer Subgruppenanalyse der Patienten mit inadäquaten Therapien, der Patienten mit nur adäquaten Therapien und der Patienten ohne jegliche Therapien mit einer erhöhten Versterbenswahrscheinlichkeit einher (p<0,000003 bzw. p<0,01). Insofern kann an dieser Stelle ein negativer Einfluss inadäquater Therapien in der Zusammenschau der Befunde nur gemutmaßt, nicht aber eindeutig nachgewiesen werden. Bezüglich der Risikofaktoren für das Auftreten inadäquater Therapien ergab sich ein gefährdeter Zeitraum innerhalb der ersten sechs Monate nach Implantation, was auf die zu diesem Zeitpunkt noch nicht individuell optimierte Programmierung zurückzuführen ist. Patienten jeden Alters wiesen ein vergleichbares Risiko auf, inadäquate Therapien zu erleiden. Insofern konnte kein Risikoalter identifiziert werden. Mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung inadäquater Therapien gingen eine insuffiziente Versorgung mit Betablockern oder Amiodaron (p<0,000001 bzw. p<0,04) sowie vor der Implantation bekannte atriale Tachykardien (p<0,001) einher. Beide Umstände erklären sich mit der Dominanz atrialer Rhythmusstörungen als auslösende Ursache inadäquater Therapien (82,1% aller inadäquaten Therapien wurden durch atriale Rhythmusstörungen ausgelöst) sowie durch den reduzierenden Effekt der beiden Antiarrhythmika auf die Inzidenz dieser atrialen Rhythmusstörungen. Die restlichen Begleiterkrankungen blieben ohne nachweisbaren Einfluss auf das Auftreten inadäquater Therapieabgaben. Zwei- und Dreikammergeräte konnten, entgegen der Erwartungen, die Inzidenz inadäquater Therapieabgaben gegenüber den Einkammergeräten nicht signifikant reduzieren (p<0,1). Am ehesten zu erklären ist dies mit den bei Zwei- und Dreikammergeräten vermehrt auftretenden Wahrnehmungsproblemen sowie den zusätzlich benötigten, defektanfälligen Sonden. Die vorliegende Arbeit konnte die berichtete hohe Inzidenz inadäquater Therapiegaben sowie deren dominierende Ätiologien in einem breiten, den klinischen Routinebedingungen entsprechenden Patientenkollektiv innerhalb eines langen Zeitverlaufes bestätigen und eventuelle Risikofaktoren identifizieren. Weiterhin konnten Erkenntnisse bezüglich der prognostischen Bedeutung inadäquater Therapieabgaben gewonnen werden. Die Kenntnis der Risikofaktoren könnte dazu beitragen helfen, gefährdete Patienten frühzeitig zu identifizieren sowie durch prophylaktische Maßnahmen die Inzidenz inadäquater Therapiegaben zu mindern. Weiterhin können die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse als Grundlage der Hypothesengenerierung und Planung weiterer klinischer Studien dienen.
Das Ziel der vorliegenden Dissertationsarbeit ist die durchflusszytometrische Bestimmung Cytomegalievirus-spezifisch aktivierbarer CD4+T-Lymphozyten bei Patienten nach Lungentransplantation. Virusinfekte, insbesondere mit dem Cytomegalievirus (CMV), sind häufige Komplikationen nach Lungentransplantation. Bei Untersuchungen zu knochenmark-, leber-und nierentransplantierten Patienten konnte gezeigt werden, dass eine enge Korrelation zwischen der virusspezifischen, zellvermittelten T-Zellreaktion und der viralen Replikation besteht [Sesters, M. et. al., 2001 Transplantation 71, 1287-1294]. Zur Klärung der Frage, inwieweit ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten einer CMVInfektion und dem Anteil CD4+ T-Zellen mit de-novo-Synthese von Interferon-γ (INF-γ) und CD69 bei Patienten nach einer Lungentransplantation existiert, wurde bei n=22 Patienten nach Lungentransplantation während 12 Monate der Anteil [%] virusspezifisch aktivierbarer CD4+ Lymphozyten mit de-novo-Synthese von INF-γ und CD69 gemessen. Dazu wurde peripheres venöses Blut mit CMV-KBR-Antigen inkubiert und der Anteil virusspezifisch stimulierbarer CD4+ Lymphozyten durchflusszytrometrisch quantifiziert. Bei n=7 CMV-positiven Patienten ohne akuten CMV-Infekt während des Beobachtungszeitraums (kein Nachweis von CMV-DNA und CMV-pp65) reagierten 6,13 % (median; Spannweite: 0,86-45,15%) der CD4+ T-Lymphozyten auf die Simulation mit dem Virusantigen mit einer de-novo-Synthese von INF-γ und CD69. Im Vergleich dazu zeigte sich bei n=5 CMV-positiven Patienten mit akuter CMV-Infektion im Beobachtungszeitraum ein deutlich verringerter Anteil CD4+ T-Zellen mit de-novo-Synthese von INF-γ und CD69 (0,99%; 0,01-3,20%). CMV-negative Patienten (n=10) wiesen im Vergleich zu den CMV-positiven Patienten mit und ohne CMV-Infekt im Untersuchungszeitraum einen geringeren Anteil CD4+ T-Zellen mit de-novo-Synthese von INF-γ und CD 69 (0,04%; 0,02-0,41%) auf. Bei der durchflusszytometrischen Bestimmung spezifisch aktivierbarer CD4+ T-Lymphozyten im peripheren Blut lungentransplantierter Patienten konnte ein Zusammenhang zwischen dem Anteil der virusspezifisch aktivierbaren T-Zellen und der viralen Replikation gezeigt werden. Die Methode ermöglicht eine Eingrenzung von Risikopatienten im Hinblick auf eine CMVReaktivation und kann das bestehende CMV-Monitoring sinnvoll ergänzen. Die gewonnenen Ergebnisse können Ausgangspunkt für weitere Studien zu virusspezifisch aktivierbaren T-Lymphozyten bei lungentransplantierten Patienten sein.
In mitochondrial respiration, the soluble protein cytochrome c accepts an electron from the membrane bound cytochrome bc1. The interaction between cytochrome bc1 and cytochrome c is highly transient in nature, enabling turnover numbers greater than 160 s-1. Yeast cytochrome bc1 has been successfully crystallised with bound cytochrome c with the help of an antibody fragment (Lange and Hunte 2002; Solmaz and Hunte 2008). In all crystal structures of the complex, the homodimeric cytochrome bc1 binds only one cytochrome c, with the binding site located on subunit cytochrome c1. Univalent cytochrome c binding is correlated with conformational changes of the Rieske protein head domain and subunit QCR6p. The interface of the complex is small. The haem moieties are centrally located in a mainly non-polar contact site that includes a cation–! interaction and is surrounded by complementary charged residues. The crystal structure is in agreement with the general architecture of the interfaces of transient redox complexes and also reveals several interesting features unique to the cytochrome bc1. On the basis of the crystal structures, an extensive thermodynamic and kinetic characterisation of the interaction was carried out in this work to challenge the static snapshot of the bound proteins in the crystal structure as the relevant physiological electron transfer. The thermodynamic parameters of the interaction between the redox partners were determined using isothermal titration calorimetry (ITC). The association constant for cytochrome bc1 and cytochrome c in oxidised state under physiological ionic strength of 120 mM at 25 °C, was determined to be 5 " 103 M-1 by direct ITC titration. So, the partners interact with an affinity of 200 #M. In spite of the low affinity the complex has a life time ($ = 1/koff) of 5 #second, sufficiently long to enable the theoretically calculated electron transfer rates of 1.0 " 106 to 2.6 " 107 s%1 with a lifetime ($ = 1/rate) of 1-0.04 μseconds and experimentally determined rate of 7.7 " 104 s%1 with a lifetime of 13 μseconds. The low affinity makes it difficult to ascertain the stoichiometry of binding. The enthalpy of the interaction is endothermic, which is consistent with the nature of an interface where hydrophobic interactions are dominant. The enthalpy and entropy is 3.6 kJmol-1 and 83 kJmol-1K-1, respectively. The importance of key interface residues was also investigated. The role of the interface residue G89 of cytochrome c which might have a role in the dissociation of the complex has been probed by site-directed mutagenesis. The interface contains a cation-! interaction between F230 of cytochrome bc1 and R19 of cytochrome c, which is thought to provide the specificity to the interaction between the otherwise promiscuous partners. To analyse the role of this interaction pair in electron transfer, F230L and F230W mutants were used to measure direct electron transfer rates by flash photolysis and steady state kinetics. The findings indicate that another ! system can work as functional substitution of F230, while deleting the ! system has a deleterious effect on the complex formation. The inability of F230L to achieve the transient and steady state turnover rates as wild type protein indicates a scenario where the variant achieves an altered bound state with inefficient electron transfer pathways and higher edge-to-edge distance. The role of supernumerary subunit QCR6p in complex formation was investigated by steady state kinetics measurements. Subunit QCR6p does not interact directly with cytochrome c but is positioned in such a way that it could electrostatically steer cytochrome c in a reactive ensemble. The highly acidic and disordered N-terminus of QCR6p could interact with a patch of conserved lysine residues on cytochrome c. The role of subunit QCR6p has been assessed using QCR6p deleted cytochrome bc1 and a lysine variant of cytochrome c. The results show that QCR6p not only affects the kinetics of the interaction but is also important for the stability of cytochrome bc1. The kinetic and thermodynamic data obtained during this study provide evidence for the functional importance of non-catalytic cytochrome bc1 subunit QCR6p, show that the entropy driven interaction is indeed of low affinity and highly transient in nature and indicate that the interface is well suited to ensure the high turnover of the electron transfer chain where cytochrome c interacts with multiple partners using overlapping interfaces. The suggested role of the cation-! interaction as a highly specific interaction has been validated.
Der hereditäre Fibrinogen-Mangel ist ein seltener Hämostasedefekt, der in einer quantitativen (Hypofibrinogenämie und Afibrinogenämie) oder qualitativen Form (Dysfibrinogenämie) bzw. einer Kombination aus beiden Formen (Hypodysfibrinogenämie) vorliegt. Seltene Ausprägungen wie die Fibrinogen- Amyloidose und die hepatische Speicherkrankheit Endoplasmic Reticulum Storage Disease (ERSD) tragen zum heterogenen klinischen Bild der Erkrankungen bei, das neben einem asymptomatischen Verlauf Blutungen und Thrombosen umfassen kann. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Spektrum genetischer Veränderungen, deren Auswirkungen auf die klinische Manifestation und gerinnungsphysiologische Ausprägung bei 101 Probanden mit angeborenem Fibrinogen-Mangel sowie bei 41 erstgradig verwandten Familienangehörigen zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit stellt das bisher größte zusammenhängend untersuchte und genetisch charakterisierte Patientenkollektiv mit Fibrinogen-Mangel dar. Von den insgesamt 96 nachgewiesenen Sequenz-Varianten wurden 30 erstmals beschrieben. Hierdurch ergibt sich ein Zuwachs von 15 % an der Gesamtzahl der verschiedenen bisher in der Literatur beschriebenen genetischen Defekten. Bei acht nachgewiesenen Mutationen war bisher erst eine Familie mit dieser Sequenz-Variante beschrieben. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass diese Mutationen kausal für den Phänotyp des Fibrinogen-Mangels sind. Die klinische Präsentation der Patienten umfasste, häufiger als in der Literatur bisher beschrieben, zu 50 % leichte bis moderate Blutungen in Form von Menorrhagien oder verlängerten Nachblutungen nach Verletzungen. Schwere Blutungen traten bei Patienten mit Afibrinogenämie oder selten bei heterozygoten Mutationsträgern in Assoziation mit Operationen, Schwangerschaften und Traumata auf. Probanden mit ERSD erlitten gegensätzlich zu den bisherigen Beschreibungen aus der Literatur sowohl Blutungen als auch Thrombosen. Die Vorhersage des klinischen Phänotyps nach traditioneller Einteilung des Fibrinogen-Mangels anhand laborchemischer Beschreibungen war nicht zuverlässig. Zudem lagen die hierfür erforderlichen Laborparameter häufig nicht vor. Die Mutationsdiagnostik konnte zu einer verbesserten Einschätzung des klinischen Phänotyps beitragen. Spezifische Mutationen wiesen eine Korrelation zu bestimmten klinischen Manifestationen auf. Hierbei zeigte sich eine ausgeprägte Assoziation der Varianten BbArg14Cys und gAsn319-Asp320del mit thromboembolischen Ereignissen. Für weitere Mutationen (AaArg19Gly, BbArg44Cys, gTyr262Cys, gAla327Thr und gLys380Asn) ist ebenfalls eine Assoziation mit Thromboseneigung anzunehmen, konnte jedoch aufgrund kleiner Fallzahlen nicht zweifelsfrei beurteilt werden. Die am häufigsten auftretenden Mutationen an Position AaArg16 waren mit einer moderaten Blutungs- (17 % bis 53 %) und einer nur geringen Thromboserate (3 % bis 13 %) assoziiert, die jedoch für die AaArg16Cys-Variante höher lag im Vergleich zur AaArg16His-Variante. Die Mutationen gGly333Ser und gArg375Trp zeigten eine Korrelation zur hepatischen Speicherkrankheit ERSD und gingen mit einer beeinträchtigten Leberfunktion einher. Die Verdachtsdiagnose des Fibrinogen-Mangels wurde bei einem Großteil der Indexpatienten (42 %) aufgrund pathologischer Gerinnungswerte gestellt. Vor allem „Null“-Mutationen gingen jedoch oftmals mit im Referenzbereich liegenden Fibrinogen-Werten einher, so dass sich neben der mehrmaligen Fibrinogen-Bestimmung die zusätzliche Testung weiterer Laborparameter, wie die Thromboplastinzeit (TPZ), die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und die Thrombinzeit (TZ) als hilfreich erwiesen haben. Die Bestimmung des abgeleiteten Fibrinogens (Fib. QD) zeigte sich als nicht geeignet zur Detektion des kongenitalen Fibrinogen-Mangels, da die am häufigsten vorliegenden Mutationen an AaArg16 zu keiner Erniedrigung führten. Die Messung des funktionellen Fibrinogen nach Clauss (Fib. n. Cl.), der Fibrinogen- Konzentration (Fib. Ag) und die daraus resultierende Fibrinogen-Ratio (RaAg) bzw. die Bestimmung von RZ und TZ waren die Grundlage eines in der vorliegenden Arbeit entwickelten Stufenmodells für einer schnelle und kostengünstige Mutations-Detektion. Bei Anwendung der vorgeschlagenen Stufendiagnostik im Vergleich zur herkömmlichen Komplettsequenzierung ist eine Reduktion von Arbeitsaufwand und Kosten um bis zu 64 % zu erwarten.
Demokratiefördernde Geberstaaten sind hinsichtlich ihrer politischen Interventionen in Transformationsländern mit komplexen Wirkungszusammenhängen konfrontiert. In einem konfliktbehafteten Umfeld sind sie einem „Demokratisierungs-Stabilitätsdilemma“ (JÜNEMANN 2005) ausgesetzt. Wenn destabilisierende Folgewirkungen eines Systemwechsels die eigenen Interessen gefährden, dann setzen demokratische Geber unter bestimmten Situationen vordergründig ihre „harten“ Stabilisierungsinteressen um und stellen ihre Demokratieförderpolitik in den Nehmerländern zurück. Im Unterschied zum „Theorem des Demokratischen Friedens“ belegt die demokratisierungspolitische Geberpraxis über verschiedene Zeiträume und Nehmerländer Abweichungen vom erwarteten normativen, demokratiefördernden Verhalten. Vorliegende Dissertation erarbeitet eine Begründung für diese Verhaltensabweichung. Anhand der Zielkonflikte demokratischer Geber wird vergleichend analysiert, welche Risiken für die Geber bestehen und wie sich diese spezifische Konfliktsituation auf deren Ziel und Praxis der Demokratieförderung auswirkt und somit einer kohärenten Umsetzung von „Demokratieexport“ (HANISCH 1996 a) entgegensteht. Diese Forschungsarbeit ist an das HSFK-Program „Antinomien des Demokratischen Friedens“ (MÜLLER 2002), das die „Schattenseiten“ des Außenverhaltens liberaler Demokratien eingehender beleuchtet, angebunden. Sie trägt zur systematisch vergleichenden Forschung unterschiedlicher Demokratien und deren Demokratieförder-strategien bei, die bisher nur unzureichend untersucht wurden. Vorliegende Studie ist zudem die erste ihrer Art, die das Außenverhalten Frankreichs und Deutschlands gegenüber Algerien in den 1990er Jahren auf Zielkonflikte und Anpassungsreaktionen analysiert. Bisher liegen nur wenige Arbeiten vor, die dem „Demokratisierungs- Stabilitätsdilemma“ demokratischer Geber und der Risikoanalyse politischer Interventionen wie Demokratieförderung Aufmerksamkeit schenken. Gezieltere Konflikt- und Prognosefähigkeit, wie außen- und entwicklungspolitische Interventionen auf die Geberländer wirken, haben jedoch einen hohen praktischen Wert für Politikberatung und –gestaltung. Die derzeitige Forschungspraxis trennt immer noch zwischen der normativ motivierten, entwicklungspolitisch geprägten Demokratieförderung einerseits und der realpolitisch ausgerichteten, sicherheitspolitischen Wirkungsanalyse andererseits. Vorliegende Arbeit sucht eine Brücke zwischen beiden Paradigmen zu schlagen, indem sie Demokratieförderung, unter Bezugnahme auf die Transformationsforschung, empirisch geleitet untersucht und mit sicherheitsbezogener Risikoanalyse verbindet. Sie bietet somit einen konfliktsensitiven Beitrag zu politischen Interventionen von Gebern. Die Ergebnisse des Gebervergleichs werden vereinfachend in einem Vier-Phasen-Modell zusammengefasst. Ausgehend von der Policy-Formulierung (Phase 1) untersucht die Arbeit die konkrete Umsetzung der Demokratieförderung (Phase 2) und gibt die Anpassungsreaktionen der Geber (Phase 4) auf beobachtete Dilemmasituationen und Zielkonflikte (Phase 3) wieder. Das Modell zeigt ebenso auf, wie sich die Risiken auf die Umsetzung der Politik und der Policy auswirken. ...
Die Therapie von Skelettmetastasen sollte sich, in Anbetracht einer limitierten Überlebenszeit der betroffenen Patienten, an einem palliativen Konzept orientieren. Diesem Ansatz entspricht die intramedulläre Stabilisierung von Osteolysen und pathologischen Frakturen ohne Metastasenresektion an langen Röhrenknochen. Im Zeitraum von 01.10.1991 bis 31.03.04 wurden in der Klinik für Unfall- und Wiederherstellungschirurgie des Klinikums Darmstadt bei 68 Patienten in 79 stationären Verläufen und bei insgesamt 88 Operationen 27 stabilitätsgefährdete Osteolysen und 60 pathologische Frakturen aufgrund von Knochenmetastasen eines malignen Tumors oder aufgrund eines Multiplen Myeloms operativ versorgt. Die 41 Frauen und 27 Männer hatten ein Durchschnittsalter von 63,7 Jahren. Der häufigste Primärtumor war das Mammakarzinom, gefolgt vom Multiplen Myelom, Prostata- und Bronchialkarzinom. Die 48 Läsionen des Femurs wurden 19-mal mit einem proximalen Femurnagel, 11-mal mit einem Classic-Nail, 13-mal mit einem Femurmarknagel und 3-mal mit einem distalen Femurnagel versorgt. Zusätzlich wurde eine Versorgung mit Duocup-Prothese und mit 95°-Winkelplatte dokumentiert. Am Humerus wurden die 35 Läsionen 30-mal mit einem Russel-Taylor-Nagel, 4-mal mit Bündelnagelung, 1-mal mit einer LCDCPlatte und in einem Fall mit einem pneumatischen Humerusnagel versorgt. An der Tibia kam bei 3 Läsionen 3-mal ein Tibiamarknagel zur Anwendung. Am Radius wurde eine Verbundosteosynthese durchgeführt. Die durchschnittliche Operationszeit der intramedullären Stabilisierungen lag bei 74 Minuten. Intraoperativ kam es in vier Fällen zum Auftreten von Fissuren oder Frakturen, die alle ohne weitere Konsequenz für die postoperative Nachbehandlung blieben. Intraoperative pulmonale Komplikationen durch die intramedullären Implantate traten nicht auf. Postoperativ kam es zu einer passageren Radialisparese nach intramedullärer Osteosynthese und einer passageren Radialisparese nach Osteosynthese mit LCDC-Platte am Humerus, zwei größeren Nachblutungen, zwei Wundinfekten, sowie zu einer revisionsbedürftigen Lockerung der Verriegelungsbolzen eines Russel-Taylor-Nagels. 77,8 % der Patienten mit einer operativen Versorgung im Bereich der unteren Extremität waren bis zur Entlassung unter Vollbelastung gehfähig mobil. Nach durchschnittlich 15,9 Tagen konnten 42 % der Patienten direkt in die häusliche Umgebung entlassen werden. 77,9 % der Patienten erhielten eine prä- oder postoperative Bestrahlung der betroffenen Region. Die mittlere Überlebenszeit nach palliativer Operation lag bei 6,1 Monaten. Bereits 2 Monate postoperativ waren 50 % der Patienten verstorben. Die von uns durchgeführte intramedulläre Stabilisierung ohne Metastasenresektion bei stabilitätsgefährdeten Osteolysen und pathologischen Frakturen ist ein Therapiekonzept, das dem geforderten palliativen Ansatz der Patienten mit Skelettmetastasen sehr gut gerecht wird. Dadurch wird den Patienten in ihrer oft kurzen verbleibenden Restlebenszeit durch relativ einfache, wenig invasive Eingriffe mit kurzen Operationszeiten und geringen Komplikationsraten, eine rasche primär belastungsstabile und schmerzfreie postoperative frühfunktionelle Nachbehandlung ermöglicht, die ihnen ein Höchstmaß an Mobilität und Lebensqualität erhält. Ziel muss es sein, frakturgefährdete Metastasen rechtzeitig zu identifizieren und vor einer pathologischen Fraktur zu stabilisieren, dadurch können perioperative Mortalität und Morbidität weiter gesenkt werden. Eingeschlossen in das palliative Therapiekonzept ist eine supportive konservative Therapie mit lokaler Strahlentherapie und der Gabe von Bisphosphonaten. Dadurch wird das Fortschreiten der osteolytischen Destruktionen limitiert und eine zusätzliche Analgesie kann durchgeführt werden.
Diagnostisches Vorgehen beim Kniegelenkstrauma im Kindes- und Jugendalter : gestern und heute
(2009)
Fragestellung: Knieverletzungen im Kindesalter sind der klinischen Untersuchung schwer zugänglich und werden heutzutage oft durch die Magnetresonanztomographie ergänzt, um relevante Kniebinnenschäden frühzeitig zu erkennen. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Wertigkeit der MRT nach Kniegelenkstrauma in Abhängigkeit von der klinischen Verdachtsdiagnose zu evaluieren und die magnetresonanztomographischen sowie arthroskopischen Befunde zu vergleichen. Methodik: 195 Patienten im Alter von 3 bis 17 Jahren mit Kniegelenksverletzungen wurden in die Studie eingeschlossen. Davon wurden 87 Patienten in den Jahren 1990-1999 ohne Magnetresonanztomographie, aufgrund des klinischen Befundes, arthroskopiert (Gruppe 1). In den Jahren 2000-2006 (Gruppe 2) wurden 83 Patienten zunächst durch die MRT diagnostisch abgeklärt und dann nachfolgend arthroskopiert; 25 Patienten (Gruppe 2a) wurden in diesem Zeitraum direkt arthroskopiert. Ergebnisse: Die klinische Verdachtsdiagnose wurde in Gruppe 1 bei 79% (Patellaluxation 89%, ligamentäre Verletzungen 79% Meniskusverletzungen 46%) der Patienten durch die Arthroskopie bestätigt. Bei 32% konnte anhand der klinischen Untersuchung keine Zuordnung zu einer der Diagnosegruppen erfolgen. In Gruppe 2 stimmten die klinische und die arthroskopische Diagnose bei 60% der Patienten überein (Patellaluxation 79%, ligamentäre Verletzungen 71%, Meniskusverletzungen 40%). Bei 48% konnte nach der klinischen Untersuchung keine konkrete Verdachtsdiagnose formuliert werden. Der Magnetresonanztomographiebefund wurde, in Gruppe 2, bei 100% der Patellaluxationen, bei 83% der ligamentäre Verletzungen und bei 56% der Meniskusverletzungen richtig erkannt. Letztlich konnte durch den Einsatz der Magnetresonanztomographie der Anteil der rein diagnostischen Arthroskopien von 22% (Gruppe 1) auf 13% (Gruppe 2) reduziert werden. Schlussfolgerung: Bei klinisch unklarem Befund kann die Anzahl rein diagnostischer Arthroskopien im Kindesalter durch Einsatz der Magnetresonanztomographie deutlich gesenkt werden. Auch bei Meniskus- oder Bandverletzung ist die MRT ein wertvolles Hilfsmittel zur Überprüfung der Diagnose, da häufig klinisch keine sichere Beurteilung möglich ist. Bei der klinischen Verdachtsdiagnose einer Patellaluxation ist die MRT zur Diagnosesicherung selten erforderlich, kann jedoch zur Beurteilung von Begleitverletzungen wertvolle Zusatzinformationen liefern.
Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Herstellung und Charakterisierung einer neuen Stat5 Reportermaus zur Analyse der transkriptionellen Aktivität von STAT5 in verschiedenen Entwicklungsstadien, Zelltypen und Organen auf Einzelzellebene in vivo. Die Zusammenfassung dieser Promotionsarbeit gibt im Folgenden einen Überblick über den JAK/STAT Signalweg und seine einzelnen Komponenten. Das Hauptaugenmerk liegt hierbei auf STAT5, da es eine wichtige Rolle in der zellulären Entwicklung, Differenzierung und Proliferation spielt. Anschließend werden die Klonierung des Stat5 Reportergenkonstruktes und die Herstellung der Reportermaus durch DNA-Mikroinjektion besprochen und die Ergebnisse sowie Schlussfolgerungen der funktionellen in vivo Analyse dieses neuen Reportermausmodells dargestellt. Signal transducer and activator of transcription (STAT) Proteine gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, die latent im Zytoplasma vorkommen. Diese Proteinfamilie besteht aus sieben Mitgliedern: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b und STAT6. Alle STAT Proteine weisen eine konservierte Struktur auf, bestehend aus einer N-terminalen Domäne (NTD), einer Coiled-Coil-Domäne (CCD), einer DNA-Bindedomäne (DBD), einer Linkerdomäne (LD), einer src-homology 2- Domäne (SH2) und einer Transaktivierungsdomäne (TAD). Eine Vielzahl löslicher, extrazellulärer Signalmoleküle wie zum Beispiel Hormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren binden an ihre spezifischen Oberflächenrezeptoren und Aktivieren so die JAK/STAT Signalkaskade. Dabei führt die Ligandenbindung an den entsprechenden Rezeptor zunächst zur Dimerisierung des Rezeptors und anschließend zur Transphosphorylierung von Janus Kinasen (JAKs). Aktivierte JAKs phosphorylieren dann den Rezeptor an spezifischen Tyrosinresten. An diese können STAT Proteine über ihre SH2 Domäne binden. Die gebundenen STAT Proteine werden anschließend durch JAKs an einem Tyrosinrest (und Serinrest) in der TAD phosphoryliert und dimerisieren im Zytoplasma. Dimerisierte STAT Proteine translozieren anschließend in den Nukleus und binden an spezifische DNA-Sequenzen, die sogenannten GAS (gamma-IFN-aktivierende Seite) Elemente in der Promotorregion ihrer Zielgene. GAS Elemente sind kurze palindromische DNA Regionen mit einer TTTCCNGGAAA Konsensussequenz. Nach Bindung der aktivierten, phosphorylierten STAT Proteine an die GAS Elemente werden weitere Kofaktoren, wie zum Beispiel das CREB Bindeprotein p300/CBP rekrutiert, die gemeinsam als Transkriptionsfaktoren wirken und die Transkription ihrer Zielgene anschalten. Die Identifizierung von STAT5 erfolgte im Rahmen von Promotorstudien am β-Casein Milchgen in der murinen Brustepithelzelllinie HC11 (Schmitt-Ney et al., 1991). Kurz darauf wurde STAT5 auch im Brustgewebe von laktierenden Mäusen, Ratten und Kühen gefunden. Bevor eine Sequenzhomologie zu Proteinen der STAT Genfamilie festgestellt wurde, wurde STAT5 zunächst MGF – „mammary gland factor“ genannt (Schmitt-Ney et al., 1992b; Wakao et al., 1992). Es sind zwei Stat5 Gene bekannt, Stat5a und Stat5b, die eine Sequenzhomologie von 96 % aufweisen und ihren größten Unterschied in der TAD Domäne zeigen. Da keine STAT-ähnlichen Proteine in Hefezellen identifiziert wurden, ist der JAK/STAT Signalweg nur für multizelluläre Organismen von Bedeutung, vermutlich weil diese auf komplexe Zell-Zell Kommunikationen angewiesen sind, um im Zellverband auf Signale in der Umgebung reagieren zu können. STAT5 im Speziellen reguliert neben der Entwicklung des Brustgewebes während der Schwangerschaft, die Produktion von Blutzellen in der fötalen Leber sowie die Zellproliferation während der adulten Hämatopoese. Im Embryo ist die fötale Leber der Ort der Hämatopoese, bevor hämatopoetische Stammzellen im Knochenmark kolonialisieren und sich die Leber zu einem metabolischen Organ entwickelt. In der Maus gelangen ab dem Embryonaltag E12 hämatopoetische Stammzellen aus der Aorta, den Gonaden und dem Mesonephros (Urniere), der sogenannten AGM Region, sowie aus der Plazenta durch den Blutstrom in die fötale Leber. Die Zellen proliferieren hier und migrieren etwa zwei Tage vor der Geburt (E18) ins Knochenmark, wo die Hämatopoese nach der Geburt erfolgt. Durch die Übermittlung einer Vielzahl von Zytokinsignalen reguliert STAT5 die Differenzierung der pluripotenten Zellen in reife Blutzellen und sorgt zusätzlich für die Generierung von Zellen, die anschließend in der Lage sind, das Knochenmark zu repopulieren. Ein STAT5 Verlust führt aufgrund einer auftretenden Anämie zu einer pränatalen Letalität. Während der adulten Hämatopoese fördert STAT5 hingegen die Zellproliferation und den Zellzyklus sowie die Apoptose in hämatopoetischen Stammzellen. Im Brustgewebe ist STAT5 sowohl in der Mammogenese als auch in der Laktogenese involviert. Die Aktivierung von STAT5 erfolgt hierbei durch eine Vielzahl von Faktoren, wie zum Beispiel Prolaktin und Erythropoietin. Der Phosphorylierungsstatus von STAT5 im virgin Stadium ist hierbei gering, steigt aber während der Schwangerschaft und Laktation stetig an und führt zur Aktivierung von einer Reihe von Zielgenen wie Milchproteinen, aber auch Zellzyklusregulatoren wie CyclinD1 und negativen Regulatoren des JAK/STAT Signalweges, wie zum Beispiel SOCS3. Nach der Laktation nimmt die Phosphorylierung von STAT5 hingegen ab und aufgrund von Apoptose kommt es zu einer Rückbildung des alveolaren Gewebes. Die Regulation der Apoptose erfolgt durch eine erhöhte STAT3 Phosphorylierung. Eine Deregulierung des JAK/STAT Signalweges wird in einer Vielzahl von Tumoren beobachtet. Hier liegt STAT5 typischerweise konstitutiv aktiv vor, führt dadurch zu einer verstärkten Zellproliferation und Angiogenese und verhindert gleichzeitig die Apoptose der mutierten Zellen und eine Immunantwort, was zusammen die Tumorentstehung begünstigt. Konstitutiv aktives STAT5 spielt vor allem bei der Entstehung von soliden Tumoren wie Brustkrebs sowie verschiedenen Leukämieformen wie zum Beispiel akute und chronische myelogene Leukämien eine wichtige Rolle. Neben diesen bereits bekannten STAT5 Funktionen ist die Funktion von aktivem, phosphoryliertem STAT5 im Kontext der Mausentwicklung und in adultem Gewebe noch unklar. Um die Rolle von STAT5 während der Entwicklung näher zu charakterisieren, wurden bereits verschiedene Mausmodelle generiert. Seit dem ersten Gentransfer in Mäuse im Jahre 1980 bieten transgene Tiere eine Möglichkeit, detaillierte Einblicke in zelluläre Prozesse im Rahmen der Entwicklung, des Stoffwechsels und der Entstehung von (Krebs-) Erkrankungen zu erlangen. Transgene Mäuse wurden somit zu einem wichtigen Modellsystem, das in der Lage ist, die Mechanismen, die hinter diesen Prozessen stehen, näher zu beleuchten. STAT5a und STAT5b knock out Mäuse sind überlebensfähig, zeigen jedoch phänotypische Unterschiede. Da eine Signalweiterleitung nach Prolaktininduktion in Brustgewebszellen von STAT5a knock out Mäusen nicht erfolgt, sind diese nicht in der Lage während der Schwangerschaft zu Proliferieren und zu Differenzieren. Die Deletion von STAT5a und STAT5b hingegen ist pränatal letal und die Embryos zeigen schwere Anämien aufgrund einer erhöhten Apoptoserate der erythroiden Zellen in der fötalen Leber. Zusätzlich zu den knock-out und gain-of-function Mäusen wurde die Generierung von Reportermäusen immer wichtiger, um spezifische Signalwege im Kontext des gesamten Organismus zu untersuchen. Das Ziel dieser Promotionsarbeit war somit die Herstellung und funktionelle Analyse einer neuen Stat5 Reportermaus. Hierfür wurde zunächst ein neues Stat5 Reporterkonstrukt kloniert. Dieses Reporterkonstrukt sollte eine Vielzahl spezifischer Eigenschaften aufweisen, um speziell durch phosphoryliertes STAT5 aktiviert zu werden: (i) ein LacZ Reportergen, (ii) Stat5 Responsive-Elemente und (iii) einen minimalen Promoter. Das LacZ Reportergen wurde hierbei gewählt, um die transktiptionelle Aktivität von STAT5 in Gewebeschnitten direkt durch Blaufärbung der Zellen zeigen zu können. Bei dem gewählten Promoter handelt es sich um einen Minimalpromoter, für die Bindung genereller Transkriptionsfaktoren. Eine Aktivierung des LacZ Reportergens erfolgt jedoch nur nach vorheriger Bindung eines Transaktivators. Damit STAT5 diese Funktion übernimmt wurden zusätzliche Responsive-Elemente aus dem β-Casein Gen in das Konstrukt eingefügt. Nach erfolgreicher Klonierung von insgesamt sieben verschiedenen Stat5 Reporterkonstrukten, wurde ihre spezifische Induzierbarkeit nach STAT5 Phosphorylierung mittels transienter Transfektionsstudien in vitro analysiert und bestätigt. Das p(Stat5RE)4-CMVmin-LacZ Konstrukt wurde anschließend zwischen humane matrix attachment regions (MAR) kloniert, die als sogenannte Insulatoren fungieren. Diese sollen in der transgenen Maus verhindern, dass entfernt bindende Faktoren die Expression der Reportergenkassette positiv (enhancer) oder negativ (silencer) beeinflussen. Zusätzlich zu den sieben hier generierten Stat5 Reporterkonstrukten, wurde das p(Stat5RE)4-CMVmin-LacZ Reportergenkonstrukt im Rahmen einer Diplomarbeit in einen lentiviralen Gentransfervektor kloniert. Dieser erlaubt die stabile Transduktion von Krebszellen und Primärzellen, so dass eine ineffiziente Transfektion dieser Zellen umgangen werden kann (Gäbel, 2009). Zur Herstellung der transgenen Stat5 Reportermaus wurde das linearisierte und aufgereinigte Stat5 Reporterkonstrukt mittels DNA-Mikroinjektion in den Pronukleus von 470 Eizellen von FVB und C57BL/6 Mäusen injiziert. Die Eizellen wurden anschließend in Ammenmäuse transplantiert. Von den 470 Eizellen kamen 57 Mäuse auf die Welt. Die Integration des Transgens wurde anschließend mittels PCR und Southern Blot analysiert und die Integration des kompletten Transgens konnte in zwei der 57 Mäuse festgestellt werden. Bei beiden transgen-positiven Mäusen handelte es sich um C57BL/6 Mäuse, die anschließend mit Wildtyp C57BL/6 Mäusen verpaart wurden. Nachkommen der F2 Generation wurden dann auf die spezifische Induzierbarkeit des Stat5 Reportergenkonstruktes durch phosphoryliertes STAT5 in vivo untersucht. Da der Phosphorylierungsstatus von STAT5 im Brustgewebe bereits eingehend untersucht wurde und bekannt ist, erfolgte zunächst die Analyse der Reportergenaktivität im murinen Brustgewebe. Hierfür wurde das Brustgewebe isoliert, fixiert und über Nacht gefärbt. Anschließend wurden Paraffinschnitte hergestellt und im Detail analysiert. Im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollmäusen konnte die Aktivierung des Reportergens im Brustgewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien, vor allem während der späten Schwangerschaft und der Laktation, durch Blaufärbung einzelner Zellen, gezeigt werden. Eine Korrelation der Blaufärbung mit der Phosphorylierung von STAT5 in diesen Zellen wurde anhand von immunhistologischen Färbungen von Paraffinschnitten mit Antikörpern gegen Stat5 und P-Stat5 gezeigt. Zusätzlich zu der hormonell induzierten STAT5 Phosphorylierung bedingt durch eine Schwangerschaft, wurde die Aktivierung des Reportergens durch das Verabreichen von LPS gezeigt. Eine Behandlung der Stat5 Reportermäuse mit LPS führt zu einer Phosphorylierung von STAT5 in Zellen des hämatopoetischen Systems, speziell Granulozyten und Makrophagen, und sollte anschließend das LacZ Reportergen in diesen Zellen aktivieren. Dies konnte durch die Färbung von Blut- und Knochenmarkzellen mit spezifischen Oberflächenmarkern, sowie einer Färbung mit FDG (Fluoresceindi-β-D-galactopyranoside) mittels FACS Analysen bestätigt werden. Das nicht-fluoreszierende FDG wird hierbei von der exprimierten β-Galaktosidase zunächst zu Fluoreszein-monogalactosid (FMG) und anschließend zum hoch fluoreszierenden Fluoreszein hydrolysiert, was eine messbare Erhöhung der Fluoreszenz nach sich zieht. Zusammenfassend konnte das Stat5-Reportergen sowohl durch endogene Signale als auch durch extern zugeführte Signale induziert werden. Anschließend erfolgte die Analyse der Reportergenaktivierung in anderen Organen der Stat5 Reportermaus. Hierbei konnte die Aktivierung des LacZ Reportergens sowohl in der Leber (Hepatozyten), Milz (Pulpa) und Niere (Mark und Rinde) als auch im Thymus (Lymphozyten und antigen präsentierende Zellen) und im Uterus (endometrisches Epithel) bestätigt werden. Diese Ergebnisse korrelieren mit zuvor durchgeführten Western Blot Analysen, die eine Phosphorylierung von STAT5 in eben diesen Organen gezeigt haben. Zusätzlich wurde phosphoryliertes STAT5 auf Proteinebene im Herz und im Gehirn gefunden, jedoch nicht in Gewebsschnitten der β-Galactosidase gefärbten Organe. Dies deutet darauf hin, dass das Reportergen trotz der Anwesenheit von phosphoryliertem STAT5, nicht immer eingeschaltet wird und somit weitere Faktoren für die transkriptionelle Aktivität von STAT5 notwendig sind. Western Blot Analysen sind somit alleine nicht ausreichend, um eine Aussage über die transkriptionelle Aktivität von phosphoryliertem STAT5 zu treffen, so dass die im Rahmen dieser Arbeit generierte Stat5 Reportermaus einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von aktivem STAT5 bietet. Das generierte Stat5 Reportermausmodel wurde dann im Rahmen dieser Arbeit genutzt, um die Beteiligung von aktivem STAT5 in der Entwicklung von ΔTrkA induzierter akuter myeloischer Leukämie näher zu untersuchen. Hierfür wurden lineage negative Knochenmarkszellen aus den Stat5 Reportermäusen isoliert. Dabei werden sogenannte „Lin“ Antigene (z.B. CD3, CD4, CD8, Gr-1, Ter-119) genutzt, um reife murine Blutzellen zu identifizieren. Zellen, die diese Oberflächenmarker nicht oder nur in sehr geringen Mengen exprimieren, werden als lineage negativ bezeichnet. Ein Mix monoklonaler Antikörper gegen lineage Antigene kann somit zur Isolation lineage negativer Knochenmarkszellen genutzt werden. Diese negative Selektion führt letztendlich zur Anreicherung hämatopoetischer Stammzellen oder früher Progenitorzellen, die diese Marker (noch) nicht exprimieren. Diese Progenitorzellen wurden dann retroviral mit einem ΔTrkA Konstrukt transduziert und anschließend in bestrahlte Rag-1-/- Mäuse transplantiert und repopulierten in diesen das Knochenmark. Durch die ΔTrkA Transduktion wurde in den Rag-1-/- Mäusen myeloische Leukämie induziert. Jedoch konnte im Rahmen dieser Arbeit keine Aktivierung des Stat5 Reportergenkonstruktes beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass STAT5 in ΔTrkA induzierten Leukämien keine Rolle spielt und bestätigt die Annahmen von Meyer et al. Durch die hier vorgestellten Ergebnisse bestätigt sich sowohl die Generierung eines neuen Stat5 Reportermausmodels als auch ihre spezifische Induzierbarkeit sowohl durch endogene hormonelle Prozesse (Schwangerschaft) als auch durch externe Manipulation (LPS Behandlung). Diese neue Stat5 Reportermaus wird in Zukunft als wichtiges und effizientes Modell fungieren, um die Rolle von transkriptionel aktivem STAT5 näher zu beleuchten. Hierbei wird sich der Fokus nicht nur auf die Rolle einzelner Zellen bei der normalen Entwicklung von Organen während verschiedener Entwicklungsstadien beschränken, sondern sich mehr und mehr in Richtung Tumorinitiierung und Tumorentwicklung bewegen. Anhand des hier generierten Stat5 Reportermausmodels können in Zukunft weitere Brustkrebs- und Leukämie-Tumormodelle herangezogen werden, um die Rolle und Funktion von STAT5 in der Tumorentwicklung in vivo detailliert analysieren zu können. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wird dann die Möglichkeit bestehen, dieses neue Stat5 Reportermausmodell als Plattform zu nutzen, um zahlreiche neue Krebsmedikamente zu entwickeln und zu evaluieren.
Um die Bedeutung bestimmter Neurone oder Klassen von Neuronen innerhalb von Nervensystemen zu untersuchen, sind Methoden, die eine Manipulation der Aktivität der Neurone in vivo erlauben, besonders nützlich. Die bisher zur Verfügung stehenden Methoden haben jedoch Einschränkungen in beispielsweise der Zelltypspezifität, der zeitlichen Präzision, der Reversibilität oder der Anwendbarkeit in frei beweglichen Tieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden optogenetische, d.h. auf der Expression lichtempfindlicher Proteine basierende Methoden entwickelt, um eine präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone durch Licht zu ermöglichen. Die Techniken wurden daraufhin zur Untersuchung z.B. der Neurotransmission sowie der Funktion kleiner Netzwerke im Nervensystem des Nematoden Caenorhabditis elegans verwendet. Die zelltypspezifische heterologe Expression des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ermöglichte es, Muskel- oder Nervenzellen der Nematoden durch blaue Beleuchtung innerhalb weniger Millisekunden zu depolarisieren. Dadurch ließen sich spezifische Verhaltensweisen in frei beweglichen Tieren auslösen. Dieser Ansatz wird in Zukunft die Untersuchung der Bedeutung einzelner Neurone innerhalb ihrer Schaltkreise deutlich erleichtern. So konnte hier gezeigt werden, dass die Photostimulation des propriorezeptiven Neurons DVA eine signifikante Erhöhung der mittleren Körperbiegungswinkel während der sinusförmigen Fortbewegung der Tiere zur Folge hatte. Außerdem wurde versucht, die Anwendbarkeit von ChR2 durch die gezielte Manipulation der subzellulären Lokalisation mittels Fusion mit speziellen Peptiden oder Proteinen zu erhöhen. Des Weiteren wurde eine zur Verwendung von ChR2 analoge Methode zur Hemmung von Neuronen durch Licht entwickelt. Hierfür wurde die lichtgetriebene Cl--Pumpe Halorhodopsin aus Natronomonas pharaonis (NpHR) zelltypspezifisch in C. elegans exprimiert. Durch Photoaktivierung von NpHR mit gelbem Licht war es möglich, Muskelzellen und cholinerge Neurone zu hyperpolarisieren und somit in ihrer Aktivität zu hemmen. Dies führte in frei beweglichen Tieren zu einer augenblicklichen Paralyse verbunden mit einer drastischen Reduktion der Schwimmfrequenz und einer Erhöhung der Körperlänge. Die Aktionsspektren von ChR2 und NpHR sind unterschiedlich genug, um eine unabhängige Photoaktivierung der beiden Proteine mit blauem und gelbem Licht zu ermöglichen. Dadurch konnte die Aktivität von Muskelzellen und cholinergen Neuronen nach Koexpression der beiden Proteine bidirektional kontrolliert werden. Es wurden somit Methoden entwickelt, die in vivo eine zeitlich äußerst präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone mit Licht verschiedener Wellenlängen ermöglichen. Die Beobachtung der dadurch induzierten Verhaltensänderungen erlaubt es, zuverlässige Aussagen über die Bedeutung einer Nervenzelle für die Ausprägung eines Verhaltens zu treffen und wird die Erforschung der Nervensysteme von C. elegans und anderen Modellorganismen deutlich vereinfachen. Schließlich wurden in dieser Arbeit optogenetische Methoden zur Untersuchung der synaptischen Übertragung an neuromuskulären Synapsen (neuromuscular junctions, NMJs) von C. elegans entwickelt. Hierfür wurde ChR2 in GABAergen oder cholinergen Neuronen exprimiert, um eine lichtgesteuerte Freisetzung des inhibitorischen Neurotransmitters GABA bzw. des exzitatorischen Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) an NMJs zu erreichen. Die Methode wurde OptIoN getauft, ein Akronym für „Optogenetic Investigation of Neurotransmission“, also „optogenetische Untersuchung der Neurotransmission“. Die GABA-Freisetzung hatte ähnlich wie die NpHR-vermittelte Photoinhibition von Muskelzellen eine Reduktion der Schwimmfrequenz und Erhöhung der Körperlänge zur Folge. Die Ausschüttung von ACh verursachte hingegen starke Muskelkontraktionen verbunden mit einer Reduktion der Körperlänge. Die Änderungen der Körperlänge waren bei Mutanten mit verschiedenen Neurotransmissionsdefekten signifikant unterschiedlich im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem kam es während längerer Beleuchtungsphasen in Mutanten mit defektem Recycling der synaptischen Vesikel (SV) zu einer verstärkten Abnahme der lichtinduzierten Effekte. OptIoN ermöglicht es dadurch erstmals, die Mechanismen des SV-Recyclings in C. elegans Verhaltensexperimenten zu untersuchen. In elektrophysiologischen Messungen ließen sich durch kurze Lichtpulse wiederholt und mit hoher Frequenz Neurotransmitter-spezifische postsynaptische Ströme evozieren. Diese Ströme waren in Mutanten mit gestörter SVExozytose reduziert und gingen bei wiederholter Stimulation in Mutanten mit defektem SVRecycling schneller zurück. Die Verwendung von OptIoN erleichtert die elektrophysiologische Untersuchung neuronaler Defekte und stellt erstmals eine Möglichkeit dar, Vorgänge der neuronalen Plastizität in dem genetischen Modellsystem C. elegans zu untersuchen. Das Potential von OptIoN zeigte sich unter anderem auch in der Identifizierung eines neuen, über metabotrope GABA-Rezeptoruntereinheiten vermittelten Mechanismus zur heterosynaptischen Hemmung cholinerger Neurone.
Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit betrifft die Rolle der spezifisch gegen Adenovirus Typ 5 und 7 sowie gegen das humane Herpesvirus 6 reagiblen CD4+ T-Lymphozyten als Surrogatmarker der virusspezifischen zellulären Immunität bei lungentransplantierten Patienten. Adenoviren und auch das humane Herpesvirus 6 sind wichtige Pathogene nach der Transplantation von soliden Organen und Knochenmark. Bei lungentransplantierten Patienten sind Adenovirusinfektionen mit einer hohen Mortalität verbunden. Die Reaktivierung des humanen Herpesvirus 6 ist ein Risikofaktor für die Entwicklung von CMV-vermittelten Erkrankungen bei Patienten unter immunsuppressiver Therapie. Bei nierentransplantierten Patienten kann die durchflusszytometrische Quantifizierung von spezifisch gegen Adenoviren und gegen CMV reagiblen CD4+ T-Zellen dazu beitragen, Patienten mit einem hohem Risiko für eine unkontrollierte Virusreplikation zu identifizieren. Die zelluläre Immunantwort bezüglich des humanen Herpesvirus 6 bei lungentransplantierten Patienten ist bisher kaum untersucht worden. Zur Klärung der Frage, inwieweit die durchflusszytometrische Analyse der de-novo-Zytokinsynthese von CD4+ T-Zellen Aussagen über die virusspezifische zelluläre Immunantwort zulässt, wurde bei 22 Patienten nach Lungentransplantation während 12 Monaten regelmäßig venöses Blut mit Adenovirus Typ 5 (Ad5)- und 7 (Ad7)- sowie humanem Herpesvirus 6 (HHV-6 )-Antigen inkubiert und der Anteil [%] von CD4+ TLymphozyten welche eine de-novo-Synthese von Interferon (INF)-γ und CD69 durchführten durchflusszytometrisch bestimmt. Bei n=6 Ad5 positiven Patienten ohne Infekt im Beobachtungszeitraum reagierten im Median 0,31% (Spannweite: 0,09-1,47%), bei n=5 Ad7 positiven Patienten ohne Infektion (kein Nachweis von Adenovirus 5-DNA [copies/ml]) im Beobachtungszeitraum im Median 0,34% (Spannweite: 0,08-1,58%) der CD4+ Lymphozyten, bei n=16 Ad5 negativen Patienten reagierten im Median 0,06% (Spannweite: 0,01-0,25%), bei n=16 Ad7 negativen Patienten 0,05% (Spannweite: 0,01-0,28%) der CD4+ T-Lymphozyten auf die Stimulation mit dem entsprechenden Virus-Antigen mit einer de-novo-Synthese von INF-γ und CD69. Im Gegensatz dazu konnte nach Stimulation mit HHV-6-Antigen bei n=4 HHV-6 positiven Patienten ohne Infektion im Beobachtungszeitraum keine INF-γ- und CD69-Neusynthese nachgewiesen werden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass die durchflusszytometrische Untersuchung Adenovirus-spezifischer CD4+ T-Zellen bei lungentransplantierten Patienten möglich ist. Es hat sich im Verlauf dieser Studie gezeigt, dass die Ergebnisse Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen der virusspezifischen zellulären Immunantwort bei Transplantationspatienten sein können. In diesem Sinn ist die Untersuchung einer größeren Patientengruppe bei einer zentralen Durchführung der Methode sinnvoll. Im Bezug auf das humane Herpesvirus 6 bleibt es zu klären, ob auf der Basis von Modifikationen des von uns verwendeten durchflusszytometrischen Verfahrens Aussagen zur virusspezifischen Immunität von lungentransplantierten Patieten möglich sind.
Hintergrund: Adipositas und die mit ihr assoziierten Komorbiditäten verursachen eine Verkürzung der Lebenserwartung und mindern die Lebensqualität in einer wachsenden Patienten Bevölkerung. Die bariatrische laparoskopische Chirurgie kann effizient zu einer Gewichtsreduktion beitragen und die damit verbundenen Komorbiditäten senken. In dieser Longitudinal-Studie untersuchten wir den Einfluss von präoperativem BMI, Geschlecht und operative Techniken auf den Verlauf von drei Komorbiditäten. Methodik: Alle Patienten (N=448) die sich einem bariatrischen Eingriff im Zeitraum von 2001 bis 2005 in unserem Krankenhaus unterzogen, erhielten einen Fragebogen, welcher unter anderem zur Evaluation der drei Komorbiditäten Hypertonie, Diabetes mellitus Typ II und Gelenkbeschwerden präoperativ, sowie 6 und 12 Monate nach der Operation diente. Von insgesamt 191 Patienten erhielten wir alle Fragebögen zurück. Der Rückgang der Komorbiditäten im Verlauf wurde unter Zuhilfenahme des Chochrans Q-Test evaluiert. Für die Vorhersage für eine Verbesserung der Komorbiditäten nach 12 Monaten verwendeten wir eine Diskriminanzanalyse. Ergebnisse: Es fand sich ein signifikanter Rückgang bei der Hypertonie (Q=47,26, p<0,001) sowohl nach 6 Monaten (29,3%), als auch nach 12 Monaten (20,4%), verglichen mit den Baseline Erhebungen (40,3%). In einer detaillierten Untersuchung fand sich dieser Rückgang unabhängig vom präoperativen BMI, Geschlecht und der verwendeten operativen Technik. Alter, Anzahl der eingenommen Medikamente und der Excess-weight-loss konnten als Prädiktoren für einen signifikanten Rückgang der Hypertonie nach 12 Monaten identifiziert werden. Mittels der Diskriminanzanalyse konnte unter Verwendung dieser drei Variablen zu 69,5% eine Vorhersage für das Vorhandensein einer Hypertonie nach 12 Monaten vorgenommen werden. Auch für den Diabetes mellitus Typ II (Q=26.69, p<0,001) und die Gelenkbeschwerden (Q=22,68, p<0,001) wurde ein signifikanter Rückgang herausgearbeitet. Schlussfolgerung: Zusätzlich zu dem primären Ziel der Gewichtsreduktion, war nach durchgeführtem laparoskopisch bariatrischem Eingriff ein signifikanter Rückgang der untersuchten Komorbiditäten Hypertonie, Diabetes mellitus Typ II und Gelenkbeschwerden zu belegen. Diese könnte sowohl eine Steigerung der Lebenserwartung, als auch eine Kostenreduzierung im Gesundheitssystem bedeuten. Schlüsselwörter: Adipositas Chirurgie, Komorbiditäten, Hypertonie, Longitudinalstudie, Explorative Datenanalyse
Hintergrund: Bisher gibt es nur wenige Daten bezüglich des Neuauftretens von Vorhofflimmern nach dem Verschluss des persistierenden Foramen ovale (PFO). Methodik: In der Zeit von 1994 bis Januar 2007 wurde bei 1349 Patienten, im Alter von 17 bis 85 Jahren (mittleres Alter 50 Jahre), ein PFO kathetertechnisch verschlossen. Vor der Intervention erlitten 696 einen ischämischen Schlaganfall, 610 eine transitorisch Ischämische Attacke (TIA), 22 eine periphere Embolie, 8 Migräneattacken und 13 Patienten eine Dekompressionskrankheit. Es wurden 535 Amplatzer-, 379 Helex-, 270 STARFlex-, 131 Premere-, 9 SIDERIS-, 9 ASDOS-, 7 CardioSEAL-, 5 AngelWings- und 4 PFO-Star-Okkluder implantiert. Die Nachuntersuchungen beinhalteten ein EKG nach einem, drei und sechs Monaten. Jedes Jahr wurde ein EKG wiederholt und Fragebögen an die Patienten verschickt. Ergebnisse: Die Nachbeobachtungszeit betrug im Mittel 38,1 ± 28 Monate. 1324 von 1334 (99.3%) nahmen an der 6-Monats-Nachuntersuchung, 1198 von 1220 (98.2%) an der 1-Jahres-Nachuntersuchung -, 747 von 778 (96%) an der 3-, 374 von 393 (95.2%) an der 5- und 21 von 21 (100%) an der 10-Jahres-Nachuntersuchung teil. Vorhofflimmern trat bei 50 Patienten, kombiniert mit Vorhofflattern bei zwei weiteren, nur Vorhofflattern bei einem Patient auf (insgesamt 53 von 1349, 3,9%). Bei 33 Patienten wurde das Vorhofflimmern innerhalb der ersten vier Wochen diagnostiziert, bei 8 Patienten innerhalb sechs Monaten, bei 12 Patienten noch später. 23 Patienten entwickelten paroxysmales, 4 von ihnen rezidivierend, 28 persistierendes und 2 permanentes Vorhofflimmern. Die Inzidenz beim Amplatzer-Okkluder betrug 3% (16/535), 1,8% (7/379) beim Helex-, 10% (27/270) beim STARFlex-, 1,5% (2/131) beim Premere-, 11% (1/9) beim SIDERIS-, 0/9 beim ASDOS-, 0/7 beim CardioSEAL-, 0/5 beim AngelWings- und 0/4 beim PFO-Star-Okkluder. Der Unterschied zwischen dem STARFlex- versus Premere- (+), Amplatzer- (+) und Helex- (+) Okkluder war statistisch signifikant (jedes p<0,05). Bei 13 Patienten wurde Vorhofflimmern während einer Routinenachuntersuchung entdeckt, die anderen 40 Patienten waren symptomatisch. Bei 22 Patienten wurde der Sinusrhythmus mittels medikamentöser Konversion erreicht, bei 7 Patienten mittels elektrischer Kardioversion. 20 Patienten erhielten eine medikamentöse Prophylaxe, 22 zusätzlich Marcumar. 1 Patient erlitt eine TIA, 2 Patienten einen Schlaganfall (1 während einer Episode von Vorhofflimmern). Das Alter war ein positiver Prädiktor für Vorhofflimmern (p=0,0009). Bei 3 Patienten wurde ein Thrombus auf dem Okkluder diagnostiziert. Bei 1 von 3 Patienten wurde Vorhofflimmern eine Woche vor Diagnosestellung des Thrombus entdeckt, bei 2 von 3 Patienten wurde Vorhofflimmern und Thrombus zeitgleich diagnostiziert. Patienten mit Vorhofflimmern (3/53) haben eine signifikant höhere Inzidenz (p=0,02) Thromben zu entwickeln, verglichen mit Patienten ohne Vorhofflimmern (13/1296). Schlussfolgerung: Permanentes oder symptomatisches Vorhofflimmern ist eine seltene Komplikation nach PFO-Verschluss. Es trat häufiger beim STARFlex-Okkluder auf. Für gewöhnlich war es vorübergehend, es kann jedoch zur Thrombusbildung auf dem Okkluder führen. Eine frühzeitige Diagnostik und Behandlung sind wichtig.
Die positive Wirkung einer psychoonkologischen Versorgung onkologischer Patienten, die über ein kritisches Maß hinaus belastet sind, ist heute unbestritten. Krebspatienten sind sowohl mit der Krebsdiagnose selbst, als auch mit der medizinischen Behandlung hohen Belastungen ausgesetzt. Unbehandelte psychosoziale Belastungen wirken sich negativ auf die Lebensqualität der Patienten aus, erschweren die Krankheitsverarbeitung, beeinflussen medizinische Behandlungsergebnisse und können chronifizieren. Die psychoonkologische Behandlung in der akutstationären Versorgung weist jedoch große Lücken auf. Ausgangspunkt dieser Untersuchung war deshalb der Blick auf zwei Desiderate der Psychoonkologie: Zum einen besteht der Wunsch nach empirischen Untersuchungen zum psychoonkologischen Behandlungsbedarf an Akutkrankenhäusern. Zum anderen mangelt es am Einsatz valider, praktikabler und krebsspezifischer Messinstrumente. Diese Studie untersuchte deshalb den psychoonkologischen Behandlungsbedarf von Krebspatienten in der akutstationären Versorgung mit krebsspezifischen diagnostischen Instrumenten. Insgesamt 478 stationäre Krebspatienten wurden über einen Zeitraum von sechs Monaten an den Frankfurter Diakoniekliniken (Markus-Krankenhaus) in Frankfurt am Main mit Hilfe der neuen Kurzform der „Psychoonkologischen Basisdokumentation“ (Po-Bado-KF) sowie der spezifischen Version für Brustkrebspatienten (PO-Bado-BK) im Rahmen eines psychoonkologischen Anamnesegespräches (Fremdeinschätzung) untersucht. Da Fremd- und Selbsteinschätzung der Patienten häufig nicht übereinstimmen, wurde darüber hinaus die revidierte Fassung des Fragebogens zur Belastung von Krebspatienten (FBK-R23) als Selbsteinschätzungsinstrument eingesetzt. Des Weiteren wurde der mögliche Einfluss soziodemografischer und krankheitsbezogener Variablen auf den psychoonkologischen Behandlungsbedarf überprüft. Die Ergebnisse der Studie belegen, dass ein Routine-Screening der psychosozialen Belastung von Krebspatienten – vorausgesetzt, es wird ein entsprechendes Behandlungsangebot bereit gehalten – sehr sinnvoll ist: Über die Hälfte (56%) der 478 Patienten in der vorliegenden Studie waren psychoonkologisch behandlungsbedürftig. In der Selbsteinschätzung durch den FBK-R23 lagen 31% der Patienten über einem kritischen Wert. Fremd- und Selbsteinschätzung stimmten in dieser Untersuchung signifikant überein. Für die psychoonkologische Behandlungsindikation waren ein fortgeschrittener Krankheitsstatus, der körperliche Funktionsstatus, psychische Probleme vor Ausbruch der Erkrankung, die Einnahme von psychotropen Substanzen (Antidepressiva, Anxiolytica, Schlafmittel) sowie krankheitsunabhängige Belastungen wie Probleme im familiären, sozialen oder finanziellen Bereich entscheidend. Die PO-Bado-KF hat sich in dieser Untersuchung als ein praktikables und ökonomisches Fremdeinschätzungsinstrument bewährt und kann, nach entsprechender Schulung, unproblematisch in die medizinische Anamnese integriert werden. Ist dies aus verschiedenen Gründen nicht möglich, können die in dieser Studie extrahierten Parameter, die signifikant mit dem Behandlungsbedarf in Zusammenhang standen, als Indikatoren für Interventionen herangezogen werden. Auch die Selbsteinschätzung der Patienten lieferte in dieser Studie valide Daten des psychoonkologischen Betreuungsbedarfs. Das Erfassen der Daten, die Auswertung des Fragebogens und die Weiterleitung an die Psychoonkologie scheint jedoch weniger praktikabel und ökonomisch als die Erfassung mit der PO-Bado-KF. Wie in jeder Untersuchung bleiben auch nach Abschluss dieser Studie Fragen offen. Insbesondere wird genauer zu erforschen sein, inwieweit die psychosoziale Belastung der Patienten mit dem Zeitpunkt des psychoonkologischen Interviews zusammenhängt. Die Hypothese liegt nahe, dass Patienten, die auf eine Operation oder auf die Mitteilung der histologischen Befunde warten, höher belastet sind als Patienten, die diese spezifische Belastung zum Zeitpunkt des Interviews nicht haben. In der vorliegenden Untersuchung wurde dieser Frage nicht nachgegangen. Ferner bleibt zu untersuchen, ob sich Patienten, die sich selbst als nicht belastet wahrnehmen, vom Interviewer hingegen als belastet eingestuft werden, voneinander unterscheiden und ob Patienten mit einer psychoonkologischen Behandlungsindikation eine entsprechende Behandlung möchten bzw. diese in Anspruch nehmen. Auch die Überprüfung von Interventionseffekten durch die psychoonkologische Anamnese mittels PO-Bado-KF könnte wertvolle Hinweise liefern, ob dieses neu vorgelegte Screeninginstrument über ein größeres Potenzial verfügt, als bisher angenommen.
Bei dieser Studie wurde die antivirale Effektivität, sowie die Verträglichkeit von einem selektiven NS3/4A Protease-Inhibitor als Monotherapie und in Kombination mit Peginterferon alfa-2a über einen Behandlungszeitraum von 14 Tagen evaluiert. Bezüglich der Hepatitis unvorbehandelte Patienten mit einer Genotyp 1 Infektion wurden in unterschiedliche Therapiearme randomisiert: (i) Placebo und Peginterferon alfa-2a (n=4), (ii) Telaprevir Monotherapie (n=8) oder (iii) Telaprevir in Kombination mit Peginterferon alfa-2a (n=8). Telaprevir wurde in oraler Tablettenform mit jeweils 750 mg alle 8 Stunden verabreicht und Peginterferon alfa-2a wurde einmal wöchentlich 180 μg subkutan injiziert. Bei der Studie zeigte sich ein medianer Abfall der HCV RNA von Beginn der Therapie bis zu letztem Behandlungstag 15 von -1.09 log10 (Bereich: -2.08 log10 und -0.46 log10) in der Placebo und Peginterferon alfa-2a-Gruppe; -3.99-log10 (Bereich: -5.28 und -1.26) in der Telaprevir-Gruppe, und -5.49-log10 (Bereich: -6.54 und -4.30) in der Kombinations- Gruppe mit Telaprevir plus Peginterferon alfa-2a. Bei 4 Patienten, die mit Telaprevir und Peginterferon alfa-2a behandelt wurden, war die HCV RNA an Tag 15 nicht mehr nachweisbar und bei einem Patienten, der initial mit Telaprevir behandelt wurde. Insgesamt kam es unter der Therapie zu keinem viralen Durchbruch unter der Kombination mit Telaprevir und Peginterferon alfa-2a während der 14-tägigen Behandlung innerhalb der Studie. Die meisten Nebenwirkungen waren von milder Intensität und es kam zu keinen schwerwiegenden Nebenwirkungen oder vorzeitigen Therapieabbrüchen. Die Studie zeigte eine potente antivirale Wirksamkeit von Telaprevir als Monotherapie und bei der Kombination mit Peginterferon alfa-2a kam es zu einer gesteigerten antiviralen Aktivität. Bereits aufgrund dieser Ergebnisse initiierte, größere Studien werden nun evaluieren, ob Telaprevir in Kombination mit Peginterferon alfa und Ribavirin die dauerhaften antiviralen Ansprechraten verbessern kann.
Kollagen des marinen Schwammes Chondrosia reniformis Nardo: Optimierte großtechnische Herstellung, Analytik und neue pharmazeutisch-technologische Anwendungsmöglichkeiten Großtechnische Isolierung und Untersuchung von Chondrosia-Kollagen Schwämme spielen eine wichtige Rolle im Ökosystem des Meeres und ihr Vorkommen ist begrenzt. Zur schonenden und nachhaltigen Nutzung als Rohstoffquelle müssen im Hinblick auf eine industrielle Nutzung alternative Wege zur Gewinnung von marinem Schwammkollagen entwickelt werden. Ein Beispiel hierfür sind die sogenannten „Marikulturen“ direkt im Meer, aus denen die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Schwämme stammten. Im Gegensatz zu den früher eingesetzten Methoden zur Isolierung des Chondrosia-Kollagens, die Laborcharakter trugen, konnte in der vorliegenden Dissertationsarbeit ein stark vereinfachtes, für die großtechnische Produktion geeignetes Verfahren mit einer hohen Ausbeute (ca. 35%) beschrieben werden. Das Schwammausgangsmaterial wurde über ca. 4 Tage mit Hilfe von Natriumsulfit reduktiv behandelt und die Kollagenfasern (nach einem Filtrationsschritt) in saurem Medium gewonnen. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen des isolierten Materials zeigten die kollagentypische Fibrillenquerstreifung, die Unlöslichkeit der Faserbündel in saurem Milieu sowie deren Abbau in die einzelnen Fibrillen in neutraler Pufferlösung. Die von tierischen Kollagenen abgeleitete Bestimmung des Proteingehaltes ergab einen im Vergleich zum kalkulierten Kollagenanteil höheren Gesamtproteingehalt. Dies ist ein Hinweis auf mögliche nichtkollagene Proteinanteile, die an Kollagen assoziiert vorliegen können. Untersuchungen zur Aminosäurenzusammensetzung des isolierten Materials ergaben im Vergleich zu den von Swatschek et al. (2002a) publizierten Ergebnissen einen deutlich höheren Glycin- und einen mehr als doppelt so hohen Hydroxyprolingehalt. Dies kann dahingehend gedeutet werden, dass die neue Isolierungsmethode die bekannten Verunreinigungen des Kollagens mit Glykoproteinen reduziert und zu einem deutlich reineren Kollagenmaterial führt. Mit Hilfe einer neu entwickelten Methode konnten erstmalig Partikel aus Chondrosia-Kollagen hergestellt werden, deren Größe im Nanometerbereich lag. Hierbei handelte es sich um eine kontrollierte alkalische Hydrolyse des isolierten, gefriergetrockneten Kollagens in 1,5 M NaOH. Es konnte eine Partikelausbeute in Höhe von ca. 10% erzielt werden. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen zeigten gleichförmige, sphärische Partikel. Die Partikelgrößenuntersuchungen mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (nach Resuspension der gefriergetrockneten Schwammkollagennanopartikel (SKNP)) ergaben eine Größe von 168 ± 9,1 nm. Somit sind diese Partikel im Gegensatz zu den bisher aus Chondrosia-Kollagen gewonnenen Mikropartikeln auch für intravenöse Anwendungen geeignet und haben eine größere Trägerkapazität. Die hergestellten Nanopartikel wurden adsorptiv mit dem Wirkstoff 17?-Estradiol-Hemihydrat beladen. In Abhängigkeit von der eingesetzten Stoffkonzentration (1,25 bis 5,0 mg/ml) konnten Beladungsraten von bis zu 13,1% erzielt werden. Die Stabilitätsprüfung von wässrigen Partikelsuspensionen ergab nach 180 Tagen Einlagerung eine auf 7 bis 8% reduzierte Beladungsrate. Nach Inkorporation der beladenen Partikel in eine Hydrogelgrundlage wurde die transdermale Bioverfügbarkeit des Arzneistoffs im Rahmen der Hormonersatztherapie bei postmenopausalen Frauen untersucht. SKNP-Gele mit einer Estradiolkonzentration in Höhe von 0,06% wurden mit gleichkonzentrierten partikelfreien Gelen verglichen. In den Speichelproben der Patientinnen konnten nach täglicher einmaliger Applikation des Nanopartikelgels nach 28 Tagen signifikant höhere Estradiolkonzentrationen gemessen werden. Die ermittelten Flächen unter den Konzentrations-Zeit-Kurven (AUC) über 24 h nach der einmaligen topischen Applikation von 0,75 mg Estradiol waren um das 2,3 bis 3,4-fache höher als die entsprechenden AUC-Werte des Vergleichsgels. 24 h nach Auftragen des Gels lagen die Estradiolspiegel des Vergleichsgels in etwa wieder auf Höhe der Basalwerte, wohingegen die Estradiolwerte nach Applikation des SKNP-Gels zum gleichen Messzeitpunkt mindestens doppelt so hoch waren. Somit konnten bei Anwendung der SKNP-Zubereitung eine deutlich erhöhte transdermale Estradiolabsorption und eine verlängerte Arzneistoffwirkung beobachtet werden. Das nanopartikuläre Trägersystem aus Chondrosia-Kollagen stellt damit eine vielversprechende Möglichkeit zur Erhöhung der transdermalen Bioverfügbarkeit von lipophilen, schlecht resorbierbaren Wirkstoffen dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Formulierung für einen magensaftresistenten Überzug mit Chondrosia-Kollagen als Filmbildner entwickelt. Die Sprühsuspension bestand aus 15% gefriergetrocknetem Kollagen, dem Weichmacher Triethylcitrat (1,5%), dem Trennmittel Talkum (7,5%) und Wasser. Der Coating-Prozess wurde in einem Dragierkessel mit Placebotabletten durchgeführt. In regelmäßigen Abständen wurden Tabletten-Stichproben entnommen, um die erforderliche Kollagenschichtdicke für eine Magensaftresistenz zu bestimmen. Tabletten mit einer Kollagenauftragsmenge von 12,9 mg/cm2 entsprachen der Prüfung auf Magensaftresistenz gemäß Europäischem Arzneibuch. Die Widerstandsdauer in 0,1 M Salzsäure betrug mehr als 2 h und der Zerfall in Phosphatpufferlösung pH 6,8 höchstens 10 min. Rasterelektronenmikrosko-pische Aufnahmen bei unterschiedlichen Vergrößerungen zeigten eine gleichmäßige und glatte beschichtete Oberfläche. Das Auftragsverfahren im Dragierkessel erwies sich als reproduzierbar. Die mechanischen Eigenschaften der überzogenen Tabletten waren zufriedenstellend und die Magensaftresistenz wurde durch eine 6-monatige Lagerung nicht beeinträchtigt. Als Naturprodukt eignet sich Schwammkollagen als Überzugsmaterial für Nichtarzneimittel. Der schnelle Zerfall des Kollagenüberzugs in neutraler Pufferlösung stellt einen Vorteil gegenüber den häufig verwendeten Schellacküberzügen dar, die sich im Darmtrakt zu langsam auflösen und daher nicht selten mit synthetischen Polymeren kombiniert werden.
Understanding the dynamics of recurrent neural networks is crucial for explaining how the brain processes information. In the neocortex, a range of different plasticity mechanisms are shaping recurrent networks into effective information processing circuits that learn appropriate representations for time-varying sensory stimuli. However, it has been difficult to mimic these abilities in artificial neural models. In the present thesis, we introduce several recurrent network models of threshold units that combine spike timing dependent plasticity with homeostatic plasticity mechanisms like intrinsic plasticity or synaptic normalization. We investigate how these different forms of plasticity shape the dynamics and computational properties of recurrent networks. The networks receive input sequences composed of different symbols and learn the structure embedded in these sequences in an unsupervised manner. Information is encoded in the form of trajectories through a high-dimensional state space reminiscent of recent biological findings on cortical coding. We find that these self-organizing plastic networks are able to represent and "understand" the spatio-temporal patterns in their inputs while maintaining their dynamics in a healthy regime suitable for learning. The emergent properties are not easily predictable on the basis of the individual plasticity mechanisms at work. Our results underscore the importance of studying the interaction of different forms of plasticity on network behavior.
In this study, I investigate the crustal and upper mantle velocity structure beneath the Rwenzori Mountains in western Uganda. This mountain range is situated within the western branch of the East African Rift and reaches altitudes of more than 5000 m. I use four different approaches that belong to the travel-time tomography method. The first approach is based on the isotropic tomographic inversion of local data, which contain information about 2053 earthquakes recorded by a network of up to 35 stations covering an area of 140×90 km2. The LOTOS-09 algorithm described here is used to realize this approach. The second approach is based on the anisotropic tomographic inversion of the same local dataset. This method employs the tomographic code ANITA, developed with my participation, which provides 3D anisotropic P and isotropic S velocity distributions based on P and S travel-times from local seismicity. For the P anisotropic model, four parameters for each parameterization cell are determined. This represents an orthorhombic anisotropy with one vertically-oriented predefined direction. Three of the parameters describe slowness variations along three horizontal orientations with azimuths of 0°, 60° and 120°, and one is a perturbation along the vertical axis. The third approach is based on tomographic inversion of the teleseismic data, which contain information about the traveltimes of P-waves coming from 284 teleseismic events recorded by the seismic network stations. The TELELOTOS code, which is my own modification of the LOTOS-09 algorithm, is used in this approach. The TELELOTOS code is designed to iteratively invert the local and/or teleseismic datasets. Finally, I present the results of the new tomographic approach, which is based on the simultaneous inversion of the joint local and teleseismic data. The simultaneous use of these datasets for the tomographic inversion has several advantages. In this case, the velocity structure in the study area can be resolved as deep as in the teleseismic approach. At the same time, in the upper part of the study volume, the resolution of the obtained models is as good as in the local tomography. The TELELOTOS algorithm is used to perform the joint tomographic inversion. Special attention is paid in this work to synthetic testing. A number of different synthetic and real data tests are performed to estimate the resolution ability and robustness of the obtained models. In particular, synthetic tests have shown that the results of the anisotropic tomographic inversion of the local data have to be considered as unsatisfactory. For all approaches used in this study, I present synthetic models that reproduce the same pattern of anomalies as that obtained by inverting the real data. These models are used to interpret the results and estimate the real amplitudes of the obtained anomalies. The obtained models exhibit a relatively strong negative P anomaly (up to -10%) beneath the Rwenzori Mountains. Low velocities are found in the northeastern part of the array at shallower depths and are most likely related to sedimentary deposits, while higher velocities are found beneath the eastern rift shoulder and are thought to be related to old cratonic crust. The presence of low velocities in the northwestern part of the array may be caused by a magmatic intrusion beneath the Buranga hot springs. Relatively low velocities were observed within the lower crust and upper mantle in the western and southern parts of the study area (beneath the rift valley and the entire length of the Rwenzori range). The higher amplitude of the low-velocity anomaly in the south can be related to the thinner lithosphere in the southern part of the Albertine rift. In the center of the study area, a small negative anomaly is observed, with the intensity increasing with depth. This anomaly is presumably related to a fluids rising up from a plume branch in the deeper part of the mantle. According to the interpretation of the local earthquake distribution, the Rwenzori Mountains are located between two rift valleys with flanks marked by normal faults. The Rwenzori block is bounded by thrust faults that are probably due to compression.
Das photoneuroendokrine System der Vertebraten steuert die rhythmische Melatoninsynthese. Melatonin ist ein wichtiges Signal für circadiane und saisonale Rhythmen und für die Synchronisation der Föten mit dem mütterlichen Organismus. Bei Säugetieren besteht das photoneuroendokrine System aus den folgenden Komponenten: der Retina für die circadiane Lichtperzeption, dem endogenen Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) und dem Pinealorgan als neuroendokrinem Effektor. Dieses System vermittelt, durch die nächtliche Abgabe des Hormons Melatonin vom Pinealorgan, Änderungen in den Belichtungsverhältnissen der Umgebung an den Körper. Bei der Synthese von Melatonin im Pinealorgan ist die Arylalkylamin Nacetyltransferase (AANAT) das geschwindigkeitsbestimmende Enzym. Die nächtlich erhöhte Expression von Aanat in Pinealozyten wird vor allem durch die Freisetzung des Neurotransmitter NA aus sympathischen Nervenendigungen angetrieben. NA bindet an adrenerge Rezeptoren in der Pinealozytenmembran und aktiviert den cAMP-Signaltransduktionsweg, der zur CRE-vermittelten gesteigerten Aanat Expression führt. In der Promoterregion von Aanat ist auch ein E-box Promoterelement vorhanden, das durch Uhrenproteine angesteuert werden kann. Bislang jedoch war die Rolle des molekularen Uhrwerkes für die Expression von Aanat noch unklar. Um zu untersuchen, wie sich eine Schwächung des negativen Regulatorkomplexes auf die Expression von Aanat im Pinealorgan und in anderen Geweben auswirkt, wurden Mäuse mit gezielter Deletion des Per1 Gen (Per1 KO) untersucht. Die Expression von Aanat im Pinealorgan von Per1 KO Mäusen, die in der Standardphotoperiode gehalten wurden, zeigte einen circadianen Rhythmus mit ähnlicher Dynamik, aber erhöhter Amplitude im Vergleich zum WT. AANAT Enzymaktivität und Melatoninkonzentration folgen dem gleichen Profil. Eine Verkürzung der Photoperiode hat bei Per1 KO Mäusen starke Auswirkungen auf dieendogene Periodenlänge der Aanat Expression, die sich gegenüber dem WT drastisch verlängert. Bei einer Verlängerung der Photoperiode kommt es zu einer Verzögerung im Rhythmus der Aanat Expression von ca. 8 h gegenüber dem WT. Dies zeigt, dass das molekulare Uhrwerk je nach Photoperiode Amplitude, Periodenlänge und Phasenlage modulieren kann. Um zu untersuchen, ob es sich dabei um Pinealorgan-intrinsische Effekte handelt, wurden in vitro Experimente durchgeführt. Im WT-Pinealorgan gibt es zum Zeitpunkt CT18 ein Sensitivitätsfenster für die NA-induzierte Aanat Expression. Überraschenderweise steigt die Aanat Expression im unstimulierten Per1 KO Pinealorgan in der Nacht signifikant gegenüber dem subjektiven Tag an. Eine weitere Induktion durch NA ist nicht möglich. Dies deutet darauf hin, dass ein abgeschwächter negativer Regulator Komplex (NRC), welcher über das E-box Element wirkt, dieselben Auswirkungen in der Per1 KO Maus hat, wie eine NA-Stimulation im WT. Im WT wird der inhibitorische Effekt des NRC offenbar durch die NA-abhängige Aktivierung von CRE überwunden. Untersuchung zur ektopischen Expression von Aanat zeigten, dass dieses Gen in der Hypophyse einen cicadianen Rhythmus aufweist, der unabhängig von einem intakten molekularen Uhrwerk abläuft. Im Gegensatz dazu findet sich in der Milz von Per1 KO Mäusen eine verstärkte Aanat Expression am subjektiven Tag im Vergleich zum WT. Offenbar hat das molekulare Uhrwerk auch einen Einfluss auf die Gewebespezifität der Aanat Expression. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des molekularen Uhrwerkes im SCN von Melatoninrezeptor1 und 2 defizienten (MT1,2 -/-) Mäusen untersucht. Im Gegensatz zu Mäusen mit intakten Melatoninrezeptoren, zeigen diese Mäuse im Fötalstadium noch keinen Rhythmus in der Anzahl mPER1- und mPER2-Ir Zellen. In diesem Stadium sind die einzelnen SCN-Neurone noch kaum durch Synapsen miteinander gekoppelt. Dies deutet darauf hin, dass das mütterliche Melatonin die rhythmischen Uhrengenexpression in den einzelnen fötalen SCN-Zellen synchronisiert. Erst im juvenilen SCN ist ein Rhythmus der Uhrenproteine identisch mit dem adulten Tier. Zu diesem Stadium sind die intrasuprachiasmatischen Kontakte vermutlich schon soweit ausgebildet, dass kein rhythmisches Eingangssignal für die Synchronisation der SCN-Zellen notwendig ist.
Einleitung: Die der Entwicklung des Normaldruckhydrozephalus (NPH) zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen sind trotz intensiver Forschung weitgehend ungeklärt. Ein bildgebend prominenter Befund beim NPH ist die z.T. massive Erweiterung der inneren liquorführenden Räume (sog. Ventrikel). Diagnostisch hinweisend auf das Vorliegen eines NPHs ist neben einer charakteristischen, jedoch nicht pathognomonischen klinischen Befundkonstellation das rasche klinische Ansprechen auf einen lumbalen Liquorablassversuch, bei dem insbesondere eine Besserung der Gehfähigkeit verzeichnet werden kann. Die dieser raschen Besserung zugrunde liegenden physiologischen Mechanismen sind jedoch unbekannt, allgemein wird davon ausgegangen, dass durch eine Abnahme des Liquorvolumens eine Druckentlastung auf bedeutsame zerebrale, insbesondere periventrikuläre Strukturen erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des diagnostischen Liquorablassversuches auf Volumenänderungen der inneren liquorführenden Räume und Änderungen klinischer Parameter untersucht. Material + Methoden: Bei 15 NPH-Patienten wurden nach einem definierten Studienprotokoll standardisierte klinische Tests und magnetresonanztomografische Untersuchungen vor und nach einem Liquorablassversuch durchgeführt. Die klinische Testbatterie sollte insbesondere die Kardinalsymptome des NPH (kognitive Störungen, Gangstörungen, Harninkontinenz) erfassen. Computergestützt wurden die Volumina der Seitenventrikel vor und nach Liquorablassversuch bestimmt. Zur Validierung der volumetrischen Methode wurden zusätzlich 11 gesunde, ältere (> 50 Jahre) Probanden nach dem gleichen bildgebenden Protokoll magnetresonanztomografisch untersucht. Ergebnisse: Nach dem Liquorablassversuch konnte eine insgesamt geringe, aber signifikante Abnahme der Volumina der Seitenventrikel nachgewiesen werden. Diese beträgt höchstens wenige Prozent des initialen Ventrikelvolumens bei NPH-Patienten und damit weniger als 10% des abgelassenen Volumens. Klinisch konnte eine gewisse Besserung kognitiver Funktionen und eine Verbesserung der z.T. ausgeprägten Gangstörungen festgestellt werden. Ein Zusammenhang zwischen den volumetrischen Veränderungen der Seitenventrikel und den klinischen Tests konnte nicht gefunden werden. Schlussfolgerung: Durch den Liquorablassversuch kommt es zu einer geringen Volumenreduktion der inneren liquorführenden Räume, allerdings ergibt sich kein Zusammenhang zu klinischen Parametern. Insofern kann die gängige Hypothese, dass die nach Liquorablassversuch zu verzeichnende klinische Besserung auf einer Volumenreduktion der inneren liquorführenden Räume beruht, nicht bestätigt werden. Im Rahmen der Arbeit werden alternative Erklärungsmodelle erläutert und kritisch hinterfragt.
Dank neuer Diagnoseverfahren zeigt die Inzidenz der Krebserkrankungen einen zunehmenden Verlauf. Durch verbesserte Methoden in der chirurgischen und medikamentösen Therapie wird aus einer ehemals tödlichen, häufig eine chronische Krankheit. Immer mehr Patienten leben jahrelang mit ihrer Erkrankung. Die Erhaltung der Lebensqualität bei diesem steigenden Patientenkollektiv rückt immer mehr in den Fokus der Wissenschaft. Ziele der Forschung auf diesem Gebiet bestehen darin, die Nebenwirkungen der Therapiemaßnahmen zu minimieren oder sie durch zusätzliche Therapieoptionen zu mildern. Sport bzw. Bewegung ist dabei eine der möglichen unterstützenden Maßnahmen sowohl noch während der Therapie als auch in der Zeit danach. Obwohl noch bis in die 90er-Jahre die Meinung verbreitet war, dass körperliche Aktivität das Tumorwachstum fördern und die Effekte der Chemotherapie negativ beeinflussen könnte, werden heute in immer mehr Studien die positiven Auswirkungen eines moderaten Ausdauertrainings auf körperliche und psychische Parameter bei Krebskranken nachgewiesen. Das Verlieren der körperlichen Integrität, die funktionellen Einschränkungen und Nebenwirkungen der Therapie lassen die Psyche des Patienten nicht unberührt – psychopathologische Komorbiditäten können die Folge sein. Folglich nimmt die Lebensqualität aufgrund der physischen und psychischen Einschränkungen ab. Die vorliegenden Studie untersucht, ob und inwieweit sich durch Sport bzw. Bewegung ein positiver Einfluss auf die Verbesserung der psychischen Belastung und der Lebensqualität bei Krebspatienten erzielen lässt. Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurde eine heterogene Stichprobe, bestehend aus 70 Patienten, davon 38 (54,3%) Frauen, herangezogen. Die Patienten hatten verschiedene Krebsarten, befanden sich in unterschiedlichen Stadien und erhielten entweder eine kurative oder eine palliative Therapie. Nach einer sportmedizinischen Untersuchung der körperlichen Leistungsfähigkeit wurde den Patienten eine individualisierte Sportempfehlung und -anleitung für ein moderates selbstständiges Ausdauertraining ausgesprochen. Zuvor wurde ein Interview durchgeführt und die Patienten wurden gebeten, psychometrische Fragebögen zu bearbeiten. Vier bis sechs Wochen nach dem Beginn der Sportintervention wurde erneut die körperliche Leistung im sportmedizinischen Institut untersucht, ein zweites Interview durchgeführt und psychometrische Fragebögen vom Patienten bearbeitet. Die Interviews wurden durchgeführt, um in einer weiteren Studie ausgewertet zu werden. Mit den Fragebögen SCL-K-9, POMS und EORTC QLQ-C30 wurden die psychische Belastung, die emotionale Befindlichkeit und die Lebensqualität vor und vier bis sechs Wochen nach dem Sportprogramm erfasst. Dabei stellte sich eine signifikante Reduktion des mittels SCL-K-9 erfassten psychischen Befindens und eine Verbesserung der Skala Müdigkeit des POMS heraus. Die mittels EORTC QLQ-C30 erfasste Lebensqualität ergab eine signifikante Verbesserung der Skalen Globaler Gesundheitsstatus/ Lebensqualität, Kognitive Funktion, Soziale Funktion, Fatigue und Schlaflosigkeit. Die Untersuchung oben genannter psychischer Parameter bei der Gruppe der Brustkrebspatientinnen, die die größte homogene Gruppe innerhalb der Krebsdiagnosen der Stichprobe darstellte, ergab eine signifikante Senkung der psychischen Belastung. Die Untersuchung der Effekte soziodemographischer und medizinischer Merkmale wie Geschlecht, Alter, Stadium und palliative vs. kurative Therapie auf signifikante Änderungen der psychischen Parameter durch Sport wiesen keine Signifikanz auf. Dies könnte sowohl an der zu kleinen Stichprobe als auch an der inhomogenen Verteilung der Patienten innerhalb der Merkmalsgruppen liegen, sodass unklar bleibt, ob diese Merkmale einen Prädiktor für die signifikanten Verbesserungen durch Sport darstellen und ob sie sich aufgrund der statistischen Gegebenheiten signifikant erfassen ließen. Dieser Aspekt sollte zukünftig genauer untersucht werden. Insgesamt hat die Sportintervention durchschnittlich bei keiner der untersuchten Skalen der psychischen Parameter zu einer Verschlechterung bei der Gesamtstichprobe der in diese Arbeit eingeschlossener Krebspatienten geführt. Vielmehr ist es entweder zu einer signifikanten Verbesserung gekommen oder, wenn auch nicht signifikant, doch mit eindeutigen Tendenzen in Richtung Besserung der Stimmung und der Lebensqualität durch Sport und das unabhängig von Art, Stadium oder Therapie der Krebserkrankung. Somit fügt sich diese Arbeit in die Reihe der Studien ein, die die positive Wirkung des Sports bei Krebskranken bestätigt. Sport bzw. Bewegung sollten zukünftig als unterstützende Maßnahme in der Therapie und Betreuung krebskranker Menschen eingesetzt werden, um sowohl körperliche als auch psychische Beschwerden und insbesondere die Fatigue zu lindern.
In Philadelphia Chromosome (Ph) positive ALL and CML the fusion between BCR and ABL leads to the BCR/ABL fusion proteins, which induces the leukemic phenotype because of the constitutive activation of multiple signaling pathways down-stream to the aberrant BCR/ABL fusion tyrosine kinase. Targeted inhibition of BCR/ABL by ABL-kinase inhibitors induces apoptosis in BCR/ABL transformed cells and leads to complete remission in Ph positive leukemia patients. However, a large portion of patients with advanced Ph+ leukemia relapse and acquire resistance. Kinase domain (KD) mutations interfering with inhibitor binding represent the major mechanism of acquired resistance in patients with Ph+ leukemia. Tetramerization of BCR/ABL through the N-terminal coiled-coil region (CC) of BCR is essential for the ABL-kinase activation. Targeting the CC-domain forces BCR/ABL into a monomeric conformation, reduces its kinase activity and increases the sensitivity for Imatinib. Here we show that i.) targeting the tetramerization by a peptide representing the Helix-2 of the CC efficiently reduced the autophosphorylation of both WT BCR/ABL and its mutants; ii.) Helix-2 inhibited the transformation potential of BCR/ABL independently of the presence of mutations; iii.) Helix-2 efficiently cooperated with Imatinib as revealed by their effects on the transformation potential and the factor-independence related to BCR/ABL with the exception of mutant T315I. These findings suggest that BCR/ABL harboring the T315I mutation have a transformation potential which is at least partially independent from its kinase activity. Targeted inhibition of BCR/ABL by small molecule inhibitors reverses the transformation potential of BCR/ABL. We definitively proved that targeting the tetramerization of BCR/ABL mediated by the N-terminal coiled-coil domain (CC) using competitive peptides, representing the Helix-2 of the CC, represents a valid therapeutic approach for treating Ph+ leukemia. To further develop competitive peptides for targeting BCR/ABL, we created a membrane permeable Helix-2 peptide (MPH-2) by fusing the Helix-2 peptide with a peptide transduction tag. In this study, we report that the MPH-2: (i) interacted with BCR/ABL in vivo; (ii) efficiently inhibited the autophosphorylation of BCR/ABL; (iii) suppressed the growth and viability of Ph+ leukemic cells; and (iv) was efficiently transduced into mononuclear cells (MNC) in an in vivo mouse model. The T315I mutation confers resistance against all actually approved ABL-kinase inhibitors and competitive peptides. It seems not only to decrease affinity for kinase inhibitors but to confer additional features to the leukemogenic potential of BCR/ABL. To determine the role of T315I in resistance to the inhibition of oligomerization and in the leukemogenic potential of BCR/ABL, we investigated its influence on loss-of-function mutants with regard to the capacity to mediate factor-independence. Thus we studied the effects of T315I on BCR/ABL mutants lacking functional domains in the BCR portion indispensable for the oncogenic activity of BCR/ABL such as the N-terminal coiled coil (CC), the tyrosine phosphorylation site Y177 and the serine/threonine kinase domain (ST), as well as on the ABL portion of BCR/ABL (#ABL-T315I) with or without the inhibitory SH3 (delta SH3-ABL) domain. Here we report that i.) T315I restored the capacity to mediate factor independence of oligomerization_deficient p185BCR/ABL; ii.) resistance of p185-T315I against inhibition of the oligomerization depends on the phosphorylation at Y177; iii.) autophosphorylation at Y177 is not affected by the oligomerization inhibition, but phosphorylation at Y177 of endogenous BCR parallels the effects of T315I; iv.) the effects of T315I are associated with an intact ABL_kinase activity; v.) the presence of T315I is associated with an increased ABL_kinase activity also in mutants unable to induce Y177 phosphorylation of endogenous BCR; vi.) there is no direct relationship between the ABL-kinase activity and the capacity to mediate factor_independence induced by T315I as revealed by the #ABL-T315I mutant, which was unable to induce Y177 phosphorylation of BCR only in the presence of the SH3 domain. In contrast to its physiological counterpart c-ABL, the BCR/ABL kinase is constitutively activated, inducing the leukemic phenotype. The N-terminus of c-ABL (Cap region) contributes to the regulation of its kinase function. It is myristoylated, and the myristate residue binds to a hydrophobic pocket in the kinase domain known as the myristoyl binding pocket in a process called “capping”, which results in an auto-inhibited conformation. Because the cap region is replaced by the N-terminus of BCR, BCR/ABL “escapes” this auto-inhibition. Allosteric inhibition by myristate “mimics”, such as GNF-2, is able to inhibit unmutated BCR/ABL, but not the BCR/ABL that harbors the “gatekeeper” mutation T315I. Here we investigated the possibility of increasing the efficacy of allosteric inhibition by blocking BCR/ABL oligomerization. We demonstrate that inhibition of oligomerization was able not only to increase the efficacy of GNF-2 on unmutated BCR/ABL, but also to overcome the resistance of BCR/ABL-T315I to allosteric inhibition. These results strongly suggest that the response to allosteric inhibition by GNF-2 is inversely related to the degree of oligomerization of BCR/ABL. Taken together these data suggest that the inhibition of tetramerization inhibits BCR/ABL-mediated transformation and can contribute to overcome Imatinib-resistance. The study provides the first evidence that an efficient peptide transduction system facilitates the employ-ment of competitive peptides to target the oligomerization interface of BCR/ABL in vivo. Further the data show that T315I confers additional leukemogenic activity to BCR/ABL, which might explain the clinical behavior of patients with BCR/ABL -T315I-positive blasts. In summary, our observations establish a new approach for the molecular targeting of BCR/ABL and its resistant mutants represented by the combination of oligomerization and allosteric inhibitors.
Das Ziel dieser Arbeit ist die Synthese von nicht-kovalenten supramolekularen Komplexen, um nachfolgend aus den Kristallstrukturen dieser Verbindungen bessere Einsichten über die H-Brückenwechselwirkungen zwischen den organischen Molekülen zu erlangen. Um an dieses Ziel zu kommen, wurde ein Konzept zur gezielten Synthese von supramolekularen Komplexen entwickelt. Die Steuerung des Co-Kristallisationsprozesses ist keine einfache Aufgabe, deshalb darf der Verlauf einer solchen Synthese von nicht-kovalenten Verbindungen nicht einfach dem Zufall überlassen werden. Der Start erfolgt mit einer gründlichen Auswahl der Verbindungen durch Intuition mit Hilfsmitteln (Chemikalienkataloge und chemische Datenbanken). In einem Selektionsabschnitt werden chemische Datenbanken, analytische Methoden und rechnergestützte Programme zu Hilfe genommen. Aussichtsreiche Kandidaten werden mit dem Programm SUPRA getestet; so zeigt sich, ob das gewünschte H-Brückenmuster prinzipiell realisierbar ist. Auch die verschiedenen Vorproben zum Test auf H-Brücken gebundene Komplexe (siehe Kapitel 8 und 9) liefern wertvolle Informationen. Mit den so ausgewählten Kandidaten wurden schließlich Kristallisationsversuche angesetzt. Falls möglich können Strukturvorhersagen der jeweiligen Komplexe mit Hilfe von Strukturvorhersageprogrammen getroffen werden (siehe Kapitel 7). Die erhaltenen Co-Kristalle werden anschließend am Einkristalldiffraktometer gemessen und darauf folgend die Kristallstrukturen gelöst. Um die Reaktionsbedingungen zur Bildung von bestimmten supramolekularen Komplexen kontrollieren zu können, wurden die Gitterenergie des Komplexes berechnet und die Schmelzpunkte bestimmt. Mit Kenntnis der Gitterenergie des Komplexes, der Edukte bzw. der Pseudokomplexe kann die Reaktionsbedingung so eingestellt werden, dass nur eine bestimmte Verbindung bei einer vorgegebenen Reaktionsbedingung auskristallisiert. Der Einfluss bzw. die Auswahl von Lösungsmitteln darf bei Co-Kristallisationsprozessen nicht vernachlässigt werden. Der erste Abschnitt dieser Arbeit befasst sich mit der Synthese von supramolekularen Komplexen aus Komponenten, die ausschließlich zwei Protonen-Akzeptoren bzw. zwei Protonen-Donoren (AA-DD-Muster) beinhalten. Die fehlgeschlagenen Experimenten passen zur Trefferquote dieser Verbindungsklasse in der CSD. Der Grund für diesen Misserfolg ist grundsätzlich auf die geometrische Anordnung der freien Elektronenpaare der Akzeptoren zurückzuführen. Sind Sauerstoffatome an solchen H-Brückenmustern als H-Akzeptoren beteiligt, ist es oft nicht möglich, eine lineare Anordnung der H-Donorengruppe mit diesen Sauerstoffatomen als Akzeptoren zu bewerkstelligen. Nach erfolglosen Bemühungen wandten wir uns Verbindungen zu, die mindestens drei Akzeptoren bzw. Donoren im jeweiligen Molekül aufweisen. Für dieses Experiment wurden zunächst starre, kleine organische Moleküle ausgesucht. Das AAA-DDD-Muster konnte im gesamten Verlauf dieser Arbeit nicht hergestellt werden. Es ist nicht leicht, eine Verbindung zu synthetisieren, bei der alle H-Akzeptorgruppen auf einer Seite benachbart angeordnet sind. Eine Literaturaussage, dass Verbindungen mit dem AAA-DDD-Muster die stabilsten aller dreifach gebildeten Wasserstoffbrückenbindungen sind, konnte daher nicht experimentell verifiziert werden. Unsere Gruppe hat daraufhin versucht, die bekannten H-Brückenmuster aus den Watson-Crick-Basenpaarungen (AAD-DDA) sowie das ADA-DAD-Muster nachzuahmen. Nur mit dem Muster ADA-DAD konnten Erfolge erzielt werden. Die entsprechenden Komplexe konnten nicht nur erfolgreich synthetisiert, sondern auch durch die Einführung sterisch anspruchsvoller Substituenten die Bildung von unerwünschten Wasserstoffbrückenmustern gezielt verhindert werden. Nachdem die Synthese von zahlreichen Komplexen gelang, sind wir zu pharmazeutischen Wirkstoffen übergegangen. Mit diesem Schritt soll eine Brücke zur Pharmazie geschlagen werden. Vier pharmazeutische Wirkstoffe mit definiertem Wasserstoffbrückenmuster wurden ausgesucht und anschließend mit den passenden Gegenstücken zur Kristallisation angesetzt. Nur für Trimethoprim konnten Co-Kristalle erhalten werden. Mit diesem Wirkstoff konnte anschließend gezeigt werden, wie sich Moleküle in bestimmten chemischen Umgebungen im Festkörper anpassen und ihre geometrische Anordnung ändern, um die bestmöglichen Wechselwirkungen zu erreichen. Sämtliche Kristallstrukturen von Trimethoprim, die in der CSD in neutraler Form aufzufinden sind, demonstrieren, wie flexibel diese Verbindung in Abhängigkeit von der Umgebung ihre Konformation ändert. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, wie Kristallisationsbedingungen verändert werden sollten, um den gewünschten Komplex herstellen zu können. Die Schmelzpunktbestimmung sowie die Kombination mit der Gitterenergie dienten dazu, für die gegebenen Verbindungen die passenden Bedingungen für den Kristallisationsprozess zu ermitteln. Die Schmelztemperaturen von drei in der Struktur ähnlichen Komplexen liegen jeweils zwischen den Schmelztemperaturen ihrer Ausgangsverbindungen, was zu der Annahme verleitet, dass bei höheren Temperaturen die Verbindungen mit höheren Schmelztemperaturen und somit stabileren Kristallgittern bevorzugt gebildet werden. Wird die Temperatur gesenkt, so könnten alle Formen von Kristallen (die der Edukte, Pseudokomplexe und der supramolekularen Komplexe) in einer einzigen Probe anfallen. Um die Gültigkeit dieser Annahme zu überprüfen, bedarf es der Durchführung von Pulveraufnahmen der gesamten Proben. Diese konnten aufgrund der geringen Mengen an Kristallsubstanz nicht realisiert werden. In Zukunft wird das Augenmerk besonders auf die Erforschung von supramolekularen Komplexen mit anspruchsvolleren Freiheitsgraden gelegt. Diese Komplexe sollen mehrere Rotationsfreiheitsgrade besitzen bzw. aus mehr als vier H-Brücken komplementär zusammengesetzt sein. Darüber hinaus ist unsere Gruppe immer noch bemüht, Komplexe zu co-kristallisieren, die am Ende die Muster bzw. die Konstellationen aufweisen, die von vornherein konzeptionell ausgearbeitet wurden.
Signal-dependent regulation of actin dynamics is essential for many cellular processes, including directional cell migration. In particular, cell migration is initiated by lamellipodia, actin-based protrusions of the plasma membrane. The formation of these protruding structures require incessant assembly and disassembly of actin filaments. The Arp2/3 complex and WAVE proteins are essential for both lamellipodium formation and its dynamics. WAVEs mediate the activation of the Arp2/3 complex downstream of the small GTPase Rac, thus being critical for Rac- and RTK-induced actin polymerization and cell migration. The WAVE-family proteins are always found associated with multiprotein complexes. The most abundant WAVE-based complex is referred to as the WANP (WAVE2-Abi-1-Nap1-PIR121) complex. IQGAP1 is a huge scaffolding protein with multiple protein-interacting domains. IQGAP1 participates in many fundamental activities, including regulation of the actin cytoskeleton, mitogenic, adhesive and migratory responses, as well as in cell polarity and cellular trafficking. IQGAP1 binds to N-WASP, thus raising the possibility that it might control actin nucleation by the Arp2/3 complex. In this study, IQGAP1 was found co-immunoprecipitated not only with WAVE, but also with the endogenous WANP-complex subunits. Correspondingly, IQGAP1 associated to both anti-WAVE and anti-Abi-1 immuno-complexes. Pull-down experiments proved that IQGAP1 binds directly to the WANP-complex subunits. Physical interaction between IQGAP1 and the reconstituted WANP complex could also be demonstrated. Together, these data indicate that IQGAP1 is an accessory component of the WANP complex. Interestingly, the IQGAP-WANP complex disassembled after either EGF stimulation or transfection with constitutively active Cdc42 and Rac1. HeLa cells devoid of IQGAP1 showed diminished and less persistent ruffling upon EGF, but not HGF, stimulation in comparison with the control. This phenotype was accompanied by a strong reduction in chemotaxis towards both growth factors, which was as dramatic as in WANP-complex knockdown (KD) cells. Moreover, GM130 and Giantin showed a polarized and flat ribbon-like pattern in control cells, as it is expected for cis- and cis/medial-Golgi markers. Conversely, small and dispersed vesicular structures were found in both IQGAP1 KD and WANP-complex KD cells. Importantly, Arp2/3-complex silencing resulted in the same phenotypes. Consistently, Brefeldin A-induced disassembly of the Golgi strongly inhibited the IQGAP1-WANP-complex interaction and chemotaxis towards EGF in wild-type cells. The re-expression of an RNAi-resistant wild-type IQGAP1 in IQGAP1 KD cells fully rescued both the ruffling abilities and Golgi structure. A constitutively active mutant, unable to bind to neither Rac1 /Cdc42 nor the WANP complex, could reconstitute only the former defect. Hence, this study shows that actin dynamics regulated by the IQGAP1-WANP complex controls Golgi-apparatus architecture and its contribution to cell chemotaxis. The working model here proposes that at the Golgi apparatus, recruitment of the WANP complex by IQGAP1 leads to the assembly of actin filaments required to maintain the appropriated Golgi morphology. The dissociation of the complex may be required to allow the remodeling of the Golgi membranes in order to respond following a chemoattractant gradient.
Die Detektion und die Charakterisierung von Leberläsionen gehört zu den wichtigsten Aufgaben der radiologischen Leberdiagnostik. Dafür stehen verschiedene bildgebende Verfahren wie Sonographie, Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) zur Verfügung. Aufgrund der technischen Verbesserungen und der Entwicklung von neuen Sequenzen zur Leberbildgebung in der MRT hat sich die Diagnostik von fokalen Leberläsionen entscheidend verbessert. Verbunden mit dem Einsatz von modernen MRT-Kontrastmitteln ist die MRT in den letzten Jahren zum Goldstandard für die bildgebende Diagnostik von Lebertumoren, vor allem in deren Differentialdiagnose, avanciert. Magnevist® (Gd-DPTA), wurde 1988 als erstes extrazelluläres MRT-Kontrastmittel auf dem Markt eingeführt, und ist seither verfügbar. Resovist® (SHU 555 A) ist ein leberspezifisches, superparamagnetisches Kontrastmittel bestehend aus Eisenoxid (SPIO)- Partikeln, das seit 2001 für die Magnetresonanztomographie der Leber zugelassen ist. Als ein extrazelluläres Kontrastmittel ist Gadovist® (Gadobutrol), das einzige 1.0 molare Kontrastmittel, seit dem Jahr 2000 von der deutschen Gesundheitsbehörde (BfArM) für die Magnetresonanztomographie des zentralen Nervensystems zugelassen. Das Sicherheitsprofil, Kontrastverhalten und die Wertigkeit von Gadovist® in der Diagnostik der Leber wurde unter Verwendung unterschiedlicher Sequenzprotokolle in Phase-III-Studien weiter untersucht. Als ein Teil einer klinisch offenen, randomisierten, doppelblinden, interindividuell kontrollierten Phase III-Studie wurden 60 Patienten mit dem hochgradigen Verdacht auf eine Leberläsion oder mit einer bekannten Leberläsion an unserem Institut in diese Studie eingeschlossen. Der Hälfte der Patienten wurde Gadobutrol (Gadovist®, Molarität 1,0 mol/l), der anderen Hälfte Gd-DTPA (Magnevist®, Molarität 0,5 mol/l) intravenös im Bolus für die MRTBildgebung der Leber appliziert. Hierbei wurden keine schwerwiegenden Nebenwirkungen registriert. Die Sicherheit und Verträglichkeit von Gadobutrol war mit der von herkömmlichen, Gadolinium-haltigen MRT-Kontrastmitteln vergleichbar. Routinemäßig wurden weitere Vergleichsuntersuchungen bei den Patienten aufgrund der vorliegenden Erkrankung durchgeführt. Als Goldstandard zur Erfassung der Leberläsionen wurden MRT-Untersuchungen mit Resovist® (50 Patienten), CT-Untersuchungen (10 Patienten), Sonographie, Biopsie, chirurgische Maßnahmen, Szintigraphie und Laboruntersuchungen eingesetzt. In der dynamischen und statischen Gd-verstärkten MRT wiesen die einzelnen Läsionen in Abhängigkeit vom Vaskularisationsgrad ein spezifisches Kontrastverhalten auf, was eine Unterscheidung in maligne und benigne zu einem hohen Grad ermöglichte. In der eisenverstärkten MRT zeigte sich die T2- gewichtete Sequenz als die geeignetste Methode zur Detektion und Differenzierung der Leberläsionen. Besonders bei den gutartigen Lebertumoren mit Kupffer’schen Sternzellen, wie FNH oder hoch differenzierten HCC’s, war ein signifikanter Signalintensitätsverlust zu evaluieren. Anders hingegen zeigten die undifferenzierten bis mäßig differenzierten HCC’s und maligne Lebermetastasen keinen wesentlichen Signalintensitätsabfall. In einem Vergleich mit dem Goldstandard wurden die Sensivität, die Spezifität und die Genauigkeit der nativen-MRT, Gd-MRT, SPIO-MRT/CT und SPIO-MRT ermittelt. Der Einsatz von MRT-Kontrastmitteln führte zur Erhöhung von Sensivität, Spezifität und Genauigkeit bei der Untersuchung der Leberläsionen im Vergleich zur MRT ohne Kontrastmittel. Die Sensivität von Gadolinium-MRT (94%) war vergleichbar mit der von SPIO-MRT/CT (96%) und SPIO-MRT (95%). Im indirekten Vergleich wurde für die Gadobutrol-MRT eine höhere Sensivität (100%) als für die Gd-DTPA-MRT (86%) dokumentiert. Die Spezifität war bei Gadolinium-MRT mit 88% schlechter als bei SPIO-MRT/CT (95%) und SPIO-MRT (95 %). In der indirekten Evaluierung zeigte sich für die Gadobutrol-MRT eine höhere Sensivität (100%) und Spezifität (91%) als für die Gd-DTPA-MRT (Sensivität 86%, Spezifität 84%). Die diagnostische Genauigkeit der Gd-DTPA-verstärkten MRT war mit 85% schlechter als die der Gadobutrol-verstärkten MRT (96%). Jedoch war zwischen der Genauigkeit von Gadobutrol-MRT (96%), SPIO-MRT/CT (96%) und SPIO-MRT (95%) kein statistisch signifikanter Unterschied feststellbar. Insgesamt zeigte sich für die Gadobutrol-verstärkte MRT im Vergleich zur Gd-DTPAverstärkten MRT eine verbesserte Sensivität, Spezifität und diagnostische Genauigkeit. Aufgrund des interindividuellen Ansatzes der Studie konnte kein direkter Vergleich der Wertigkeit zwischen den beiden extrazelluären Kontrastmitteln dargestellt werden. Die Ergebnisse dieser Studie weisen Gadovist® als ein ausgezeichnetes extrazelluläres Kontrastmittel mit gutem Sicherheitsprofil, hoher Detektionsrate, ausgezeichneter Charakterisierung von Lebertumoren und guter diagnostischer Genauigkeit aus.
Protein S-100B als Serummarker der zerebralen Schädigung bei pädiatrischen Schädel-Hirn-Verletzungen
(2009)
Protein S-100 ist ein Calcium-bindendes Protein, das die Aktivität seiner Zielproteine moduliert. Der Aufgabenbereich umfasst die Regulation von Zellwachstum und Zellstrukturbildung. Entdeckt wurde es im Jahre 1965 von B.W. Moore, der es erstmals aus Rinderhirn isolierte. Seinen Namen erhielt es aufgrund seiner Löslichkeit in 100% gesättigtem Ammoniumsulfat bei neutralem ph-Wert. Protein S-100 besteht aus mehreren Untereinheiten, von denen S-100B nur im Hirngewebe vorkommt, hauptsächlich im Zytosol von Gliazellen. Bei astroglialer Zerstörung und konsekutiver Störung der Blut-Hirn-Schranke können erhöhte Konzentrationen von Protein S-100B im Serum gemessen werden. Durch seine spezifische Herkunft besitzt Protein S-100B einen potentiellen Wert als biochemischer Marker einer strukturellen Hirnschädigung. Ziel dieser Studie ist die Überprüfung des posttraumatischen Protein S-100B Serumspiegels bezüglich seiner Korrelation mit dem Schweregrad kindlicher Schädel-Hirn-Verletzungen und deren Prognose. In Form einer prospektiven Studie wurden insgesamt 45 Kinder (23 Jungen und 22 Mädchen) zwischen 4 Monaten und 17 Jahren (Mittelwert 7,64 Jahre) mit Hirnverletzungen unterschiedlicher Schweregrade untersucht, bei denen innerhalb der ersten 20 posttraumatischen Stunden mittels eines immunoluminometrischen Assays die Protein S-100B Serumkonzentration bestimmt wurde. Der Normalbereich für Protein S-100B liegt bei < 0,15 µg/l. Werte zwischen 0,15 und 0,5 µg/l gelten als leichtgradig erhöht, Werte über 0,5 µg/l als deutlich erhöht. Die S-100B-Werte wurden mit den klinischen Daten und dem posttraumatischen Outcome (Nachbeobachtungszeit mindestens 6 Monate) korreliert. Die statistischen Signifikanzberechnungen erfolgten mittels des Fisher-Exact-Tests.Die gemessenen S-100B Werte lagen zwischen 0,05 und 3,05 µg/l (Mittelwert 0,46 µg/l). Die mittlere Latenzzeit der posttraumatischen Protein S-100B Bestimmung betrug 5 Stunden. 38 % der Kinder zeigten leichtgradige Erhöhungen (>= 0,2-0,5 µg/l), 29 % deutliche Erhöhungen (> 0,5 µg/l). Niedrige Punktwerte in der initialen Glasgow-Coma-Scale (GCS) bedeuteten im Mittel höhere Werte für Protein S-100B. Ein initialer GCS-Wert von unter 8 ging in allen Fällen mit S-100B Werten über 0,5 µg/l einher (p=0,005). In Fällen ohne Verlust des Bewusstseins, bzw. maximal einer leichten Eintrübung des Bewusstseins (Lange-Cosack I-II) lagen die S-100B Werte im Mittel niedriger als bei Vorliegen eines Bewusstseinsverlustes (III-IV). Ein Bewusstseinsverlust ging immer mit einem S-100B Wert von mindestens 0,2 µg/l einher (p=0,04), meist lag der Wert über 0,5 µg/l (p=0,015). 25 Kinder erhielten eine Computer- und /oder Magnetresonanztomographie. Hier zeigten sich erhöhte S-100B Werte vor allem bei schweren Kontusionen und Subduralblutungen. Den höchsten Wert (3,05 µg/l) wies ein Kind mit ausgedehnten diffusen axonalen Verletzungen auf. Bei 38 der 45 Patienten konnte nach einer durchschnittlichen Nachbeobachtungszeit von 27,5 Monaten das neurologische Outcome (Glasgow Outcome Scale, GOS) erhoben werden. 8 Kinder (21 %) wiesen neurologische Residuen auf, vor allem Koordinationsstörungen und Verlangsamungen im Sinne eines Psychosyndroms, 1 Kind verstarb im Akutverlauf an einem malignen Hirnödem. Die Kinder mit posttraumatischen Residuen / Behinderungen wiesen im Mittel tendenziell höhere Werte für Protein S-100B auf. Die unterschiedlichen Beschwerdebilder und Residualzustände nach leichten und schweren Schädel-Hirn-Verletzungen lassen sich anhand der etablierten klinischen, neurophysiologischen und neuroradiologischen Prognosemarker bislang nur bedingt vorhersagen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen gute Korrelation des Serum S-100B Wertes mit der Schwere und Dauer der initialen Bewusstseinsstörung sowie dem Ausmaß der hirnparenchymatösen Läsionen. Die Aussagekraft bezüglich des posttraumatischen Outcomes ist aufgrund der Fallzahl und der zu einem großen Teil einbezogenen leichten Schädel-Hirn-Verletzungen begrenzt. Die Untersuchungsergebnisse unterstützen die bei Erwachsenen erhobenen Daten und zeigen, dass Protein S-100B auch im Kindesalter einen viel versprechenden Parameter zur Objektivierung einer akuten Hirnschädigung darstellt und bereits zu einem frühen posttraumatischen Zeitpunkt einen Beitrag zur Beurteilung des Schweregrades und der Prognose von Schädel-Hirn-Verletzungen leisten kann. Der posttraumatische Protein S-100B Serumwert bringt hier als biochemischer Marker eine zusätzliche Information und kann so bei der Einschätzung und Initiierung von diagnostischen, therapeutischen, rehabilitativen und Follow-up-Maßnahmen hilfreich sein.
In dieser Arbeit sollte die Bindung von Tetrahydromethanopterinderivaten an zwei Enzyme des methanogenen, CO2-reduzierenden Energiestoffwechselweges strukturell charakterisiert werden. In jenem Stoffwechselweg verläuft die schrittweise Reduktion von CO2 über die Bindung an den C1-Carrier Tetrahydromethanopterin (H4MPT), ein Tetrahydrofolat-Analogon, welches unter anderem in methanogenen Archaeen zu finden ist. Die thermophilen bzw. hyperthermophilen Ursprungsorganismen der untersuchten Enzyme, Methanothermobacter marburgensis, Methanocaldococcus jannaschii und Methanopyrus kandleri, sind aufgrund ihrer Anpassung an extreme Habitate durch spezielle genomische, strukturelle und enzymatische Eigenschaften von strukturbiologischem Interesse. Beim ersten in dieser Arbeit untersuchten Enzym handelte es sich um den aus acht Untereinheiten bestehenden membrangebundenen N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M-Methyltransferasekomplex (MtrA-H). Dieser katalysiert in einem zweistufigen Mechanismus den Methyltransfer von H4MPT zum Co(I) der prosthetischen Gruppe 5’-Hydroxybenzimidazolylcobamid (Vitamin B12a), um die Methylgruppe dann auf Coenzym M zu übertragen. Gleichzeitig findet ein der Energiekonservierung dienender vektorieller Natriumtransport über die Membran statt. Für den Mtr-Komplex aus M. marburgensis (670 kDa) lag bereits ein Protokoll zur Reinigung unter anaeroben Bedingungen vor. Dieses wurde im Rahmen dieser Arbeit verbessert, für die Isolierung und Reinigung unter aeroben Bedingungen vereinfacht und für die Erfordernisse der zur Strukturbestimmung verwendeten elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung optimiert. Neben der Präparation des kompletten Komplexes MtrA-H wurde als Alternative die Präparation des Enzymkomplexes MtrA-G unter möglichst vollständiger Abtrennung der hydrophilsten Untereinheit MtrH gewählt. Mit der zu diesem Zweck entwickelten Methode konnte das Abdissoziieren von MtrH besser als im etablierten Protokoll kontrolliert und somit die Homogenität der Probe deutlich verbessert werden. Dies schafft zum einen die Vorraussetzungen für eine Kristallisation zur Röntgenstrukturanalyse, zum anderen war auch in bei der elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung erkennbar, dass mit dem Mtr-Komplex ohne MtrH bessere Ergebnisse zu erzielen sind. Parallel zu den Untersuchungen am Gesamtkomplex sollten die den Cobamid-Cofaktor bindende Untereinheit MtrA sowie die H4MPT-bindende Untereinheit MtrH in für die Kristallisation und röntgenkristallographische Untersuchung ausreichender Menge und Qualität gereinigt werden. Hierfür wurden MtrA und MtrH aus oben genannten Organismen für die heterologe Expression in E. coli kloniert, die Expressionsbedingungen optimiert und Reinigungsprotokolle etabliert. Anschließend wurden die Untereinheiten umfangreichen Kristallisationsversuchen unterzogen. Die Untereinheit MtrA aus M. jannaschii konnte ohne die C-terminale Transmembranhelix als lösliches Protein in E. coli produziert und als Holoprotein bis zur Homogenität gereinigt werden. Bei M. kandleri MtrA gelang die Herstellung von geringen Mengen teilweise löslichen StrepII-Fusionsproteins ohne C-terminale Transmembranhelix in E. coli. Eine Produktion der Untereinheit MtrH in E. coli als lösliches Protein war bei keiner der in dieser Arbeit getesteten Varianten möglich. Mit dem in Einschlusskörperchen exprimierten Protein aus M. marburgensis wurde eine Reinigung und Rückfaltung versucht. Auch eine Co-Expression der Untereinheiten MtrA und MtrH, durch welche eine bessere Faltung und Löslichkeit erreicht werden sollte, war nur in Einschlusskörperchen möglich. Das zweite in dieser Arbeit untersuchte Enzym, die F420 abhängige N5,N10 Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (Mtd), katalysiert den reversiblen, stereospezifischen Hydrid-Transfer zwischen reduziertem F420 (F420H2) und Methenyl-H4MPT+, welches hierbei zu Methylen-H4MPT reduziert wird. Die Reaktion verläuft über einen ternären Komplex bestehend aus Protein, Substrat (Methylen-H4MPT) und Cosubstrat (F420), welcher strukturell charakterisiert werden sollte. Das gereinigte, rekombinante Enzym aus M. kandleri wurde mit verschiedenen H4MPT- und F420-Derivaten co-kristallisiert, die Struktur des ternären Komplexes röntgenkristallographisch bestimmt und die Bindung von H4MPT und F420 analysiert. Methenyl-H4MPT+ und F420H2 sind in der in dieser Arbeit gelösten Kristallstruktur in katalytisch aktiver Konformation gebunden, jedoch kann bei einer Auflösung von 1,8 Å nicht beurteilt werden, ob Methylen-H4MPT und F420 oder Methenyl-H4MPT+ und F420H2 vorlagen. Ein Vergleich mit der Struktur von M. kandleri-Mtd (KMtd) ohne Substrat und Cosubstrat ergab nur äußerst geringe Abweichungen in der Proteinkonformation, sodass sich KMtd überraschenderweise als Beispiel für ein Enzym mit ungewöhnlich starrer, vorgegebener Bindetasche erwies.
In dieser Arbeit wurden die physiologische Funktion innerhalb der Ribosomenbiogenese und die physikalischen Interaktionen des nukleolären, essentiellen Proteins Nep1p in der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Durch Hefe-Zwei-Hybrid-Experimente und biochemische Analysen konnte eine Homodimerisierung des Proteins festgestellt sowie eine strukturabgeleitete Dimerisierungsmutante identifiziert werden. Ebenfalls aus der Struktur des Nep1p-Homologs aus Methanocaldococcus jannaschii konnte eine Nop14p-Bindungsregion auf der der Dimerkontaktfläche abgewandten Seite des Hefeproteins vorhergesagt und nach in vitro-Mutagenese bestätigt werden. Innerhalb des Nop14-Proteins wurden zwei Domänen charakterisiert, die im Zwei-Hybrid-System mit Nep1p interagieren. Aus Strukturdaten in Kombination mit Hefe-Drei-Hybrid-Experimenten konnte die RNA-Bindungsregion an der Dimerkontaktfläche des Nep1-Proteins lokalisiert werden. In Drei-Hybrid-Selektionen wurden RNA-Sequenzen mit hoher Affinität zu dem M. jannaschii Nep1p identifiziert, die auf eine Bindung des Proteins bei Helix 35 der 16S rRNA schließen lassen. Aufgrund der hohen Konservierung dieser rRNA-Region ist eine Bindung des Hefeproteins an die 18S rRNA-Schleife von Nukleotid 1189-1196 sehr wahrscheinlich. Da Nep1p eine große Ähnlichkeit zu Proteinen der SPOUTFamilie von Methyltransferasen aufweist, war von einer rRNA-Methylierung im Verlauf der Ribosomenbiogenese als katalytische Funktion des Proteins auszugehen. Aus verschiedenen Drei-Hybrid-Experimenten zur RNA-Bindungungsspezifität ergab sich als mögliche Reaktion die N1-Methylierung des Nukleotids 1-Methyl-3-(3-Amino-3-Carboxypropyl)-Pseudouridin (m1acp3Y) 1191 der 18S rRNA. Durch eine spezifische radioaktive Markierung der acp-Gruppe konnte gezeigt werden, dass Nep1p keinen Einfluss auf die spätere Aminocarboxypropylmodifizierung hat. Diese findet auch bei einer Deletion der snoRNA35 statt, also auch an einem Uridin, und ist unabhängig von dem cytoplasmatischen Protein Tma20p. In RP-HPLC-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass die 18S rRNA einer Dnep1Dnop6-Doppelmutante ein Aminocarboxypropyl-modifiziertes Nukleosid enthält, dass sich in seinem Retensionsverhalten von dem m1acp3Y eines Wildtyps unterscheidet. Bei dem in diesem Stamm detektierten acp-modifizierten Nukleosid handelt es sich vermutlich um ein nicht-methyliertes acpY, was eine Funktion von Nep1p als N1-Methyltransferase des Nukleotids Y1191 der 18S rRNA höchst wahrscheinlich macht. Diese katalytische Funktion konnte in Zusammenarbeit mit Prof. Wöhnert auch für das M. jannaschii Nep1p gezeigt werden. Dass sowohl eine snr35- Deletion als auch eine 18S rRNA-Mutation des Nukleotids 1191 nicht letal sind, machte deutlich, dass die N1-Methylierung nicht die essentielle Funktion von Nep1p darstellen kann. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die Suppression der nep1-1ts-Mutante durch S-Adenosylmethionin nicht auf der Unterstützung der Methyltransferase-Aktivität des Proteins, sondern vermutlich eher auf einer generellen Stabilisierung des temperatursensitiven Proteins beruht. Sowohl im Hefe-Nep1p als auch im humanen Homolog wurden durch biochemische und genetische Experimente mehrere Phänotypen der Bowen-Conradi-Mutation (Aspartat 90 zu Glycin in ScNep1p) nachgewiesen. Diese lassen auf eine Aggregation des mutierten Proteins sowie eine dadurch bedingte Fehllokalisation innerhalb der Zelle schließen. Zusätzlich ist aber auch ein RNA-Bindungsdefekt durch den Aminosäureaustausch wahrscheinlich. Nichtsdestotrotz liegt offensichtlich ausreichend Nep1p-Protein vor, dass seine essentielle Funktion erfüllen kann, da die Mutation selbst zu keinem Wachstumsphänotyp führt. Erst bei einer partiellen Translationsrepression des mutierten Proteins unter Verwendung des artifiziellen Tetrazyklin-Aptamer-Systems ist ein verlangsamtes Wachstum von Hefezellen zu beobachten, was dieses System geeignet zur Analyse von möglichen Therapeutika macht.
Zielsetzung: Schizophrenie ist eine psychische Erkrankung, die mit den strukturellen und funktionellen Veränderungen in Gehirn zusammen hängt. Die Mehrheit der kernspintomographischen Studien konnte hippocampale Veränderungen bei den schizophrenen Patienten finden, obgleich diese Veränderungen nicht immer bei der Early-Onset Schizophrenie repliziert werden konnten. Frühere Studien weisen jedoch darauf hin, dass Volumenreduktion der Hippocampi entweder während der Adoleszenz oder während des Übergangs zu einer akuten Phase auftritt. Außerdem bleibt das funktionelle Korrelat hippocampaler Struktur unklar. Das Ziel unserer Arbeit besteht darin, zu überprüfen, ob strukturelle Veränderungen bereits bei den Patienten mit einer Early-Onset Schizophrenie nachzuweisen sind und ob ein Zusammenhang zwischen dem Volumen der Hippocampi und den neurokognitiven Funktionen und der Psychopathologie besteht. Methode: Mittels Magnetresonanztomographie wurden die Volumina des rechten und des linken Hippocampus, der grauen und weißen Substanz sowie der zerebrospinalen Flüssigkeit bei 26 Patienten mit einer Early-Onset Schizophrenie und 26 gematchten gesunden Probanden untersucht. Es wurden 1mm dicke MRT Schnitte angefertigt. Die neurokognitive Funktionstüchtigkeit wurde in beiden Gruppen mit Wisconsin Card Sorting Test (WSCT), Trail Making Test-A (TMT-A), Trail Making Test-B (TMT-B) und Mehrfach Wortschatz Intelligenztest–B (MWT-B) verglichen. Die Beurteilung der psychopathologischen Symptomatik erfolgte mit dem Structured Clinical Interview: Positive and Negative Syndrom Scale (PANSS). Zudem wurde mittels Korrelationsanalysen berechnet, inwieweit eine Übereinstimmung zwischen neurokognitivem Funktionsniveau, der Psychopathologie und Volumengröße von Hippocampi gegeben ist. Ergebnisse: Jugendliche mit einer Early-Onset Schizophrenie wiesen im Vergleich zu gesunden Kontrollprobanden signifikant kleinere Hippocampi rechts auf und zeigten eine tendenzielle Verkleinerung der Hippocampi links. Das Volumen der grauen Substanz war bei Patienten ebenfalls signifikant reduziert und das CSF Volumen signifikant erhöht. Das Volumen der weißen Substanz zeigte in beiden Gruppen keine signifikanten Unterschiede. Bei Patienten zeigte sich eine signifikant bedeutsame höhere Perseverationsrate (WSCT) im Vergleich zu gesunden Probanden. Es fand sich eine signifikant negative Korrelation zwischen den negativen Symptomen und dem Volumen des rechten Hippocampus. Die Volumengröße der Hippocampi korrelierte jedoch nicht mit dem neuropsychologischen Funktionsniveau, dem Alter bei der Untersuchung, dem Alter bei Erkrankungsbeginn und Erkrankungsdauer. Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass hirnstrukturelle Veränderungen bereits bei den Patienten mit einer Early-Onset Schizophrenie nachweisbar sind. Sie unterstützen somit die Hypothese der gestörten Hirnentwicklung.
Die Hämophilie A stellt die häufigste angeborene Koagulopathie dar. Ursache der Hämophilie A ist die fehlende oder verminderte Aktivität des Faktor VIII (FVIII)-Proteins, das eine zentrale Rolle im plasmatischen Gerinnungssystem spielt. Antikörper (Inhibitoren) vermittelte Reaktionen, die die Funktion des Gerinnungsfaktors VIII inhibieren können, stellen eine ernstzunehmende Komplikation bei der Substitutionstherapie von Hämophilie A Patienten dar. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, die komplexen immunologischen Mechanismen einer Inhibitorbildung auf Ebene der T-Helferzellen im hämophilen Mausmodell genauer zu untersuchen. Insbesondere sollte untersucht werden, ob sich immunogene T-Zellepitope des humanen FVIII-Proteins identifizieren lassen, die für die Ausbildung einer T-Helferzellantwort und damit letztlich für eine Antikörperbildung gegen FVIII verantwortlich sein könnten. Hierzu wurden FVIII-KO-Mäuse intraperitoneal und intravenös mit FVIII-Protein immunisiert und die T-Zellantwort isolierter Milz-T-Helferzellen gegen FVIII-Gesamtprotein sowie ein Panel aus 240 synthetisch hergestellten 15mer Peptiden immunogener Regionen (a1: AS 320-405, A2: AS 460-595, a3: AS 1630-1715, A3: AS 1790-1845, C1-C2: AS 1977-2332) des FVIII-Proteins untersucht. Es zeigte sich, dass FVIII-KO-Mäuse unter den genannten Bedingungen vorrangig eine TH1-Antwort (IFN-gamma) ausprägen. Die Frequenz FVIII-spezifischer T-Helferzellen liegt hierbei im Mittel bei 44 FVIII spezifischen CD4+-Zellen/105 T-Helferzellen. Eine weitere Steigerung der zur Restimulation eingesetzten FVIII-Dosis auf 10 mikro g/ml führte interessanterweise zu einer Abschwächung der T-Zellantwort (11 CD4+-Zellen/105 T-Helferzellen). Die Untersuchung der Spezifität der T-Zellantwort durch Restimulation mit FVIII-Peptidpools der einzelnen Regionen des FVIII Proteins ergab zunächst eine vergleichbar starke T-Zellantwort gegen alle eingesetzten FVIII-Peptidpools (24 FVIII-spezifische CD4+-Zellen/105 T-Helferzellen). Eine weiterführende Auflösung der Peptidpools mit anschließender Untersuchung der T-Zellspezifität gegen die einzelnen 240 FVIII-Peptide ergab, dass die T-Helferzellen immunisierter FVIII-KO-Mäuse gegen alle Peptide gleichermaßen reagierten (Frequenz von im Mittel 47 FVIII-spezifische CD4+-Zellen/105 CD4+-T-Zellen), nicht aber gegen ein mitgeführtes irrelevantes Kontrollantigen Ova323-339. Hämophile Mäuse, die mit humanem FVIII-Protein immunisiert wurden, scheinen demnach eine T-Zellantwort auszubilden, wie sie der von gesunden Probanden entspricht, bei denen ebenfalls T-Zellen gegen eine Vielzahl verschiedener FVIII Peptide nachgewiesen werden konnten (Reding et al., 2004). Diese klinisch irrelevanten T-Zellklone werden im Rahmen der Ausbildung einer spezifisch gegen FVIII gerichteten T-Zellantwort bei Hämophilie A-Patienten möglicherweise herunterreguliert, so dass T-Zellklone gegen individuelle klinisch relevante Epitope prädominieren (Reding et al., 2004).
Als Nadelstichverletzungen (NSV) bezeichnet man jede Stich-, Schnitt- und Kratzverletzung der Haut durch Kanülen, Skalpelle oder andere medizinische Instrumente, die mit Patientenmaterial verunreinigt sind. Davon unabhängig ist, ob die Wunde geblutet hat oder nicht. Die beinhaltet auch den direkten Kontakt mit der Schleimhaut von Mund, Nase oder Augen. Die größte Gefahr geht hierbei von einer Infektion mit Hepatitis B, C sowie dem humanem-Immundefizients- Virus (HIV) aus. In der vorliegenden Arbeit wurden Häufigkeit und Ursachen von NSV bei Beschäftigten von fünf verschiedenen medizinischen Fachkliniken der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main, mithilfe eines anonymisierten Fragebogens ermittelt. Dabei handelte es sich um die Zentren für Anästhesie, Dermatologie, Chirurgie, Gynäkologie und Pädiatrie. Alle Befragten hatten in den 12 Monaten vor dieser Erhebung Kontakt mit Patienten- oder Untersuchungsmaterial. Die Ergebnisse wurden zwischen den jeweiligen Fachkliniken und den einzelnen Berufsgruppen, wie Ärzten, Pflege- und Reinigungspersonal, verglichen. Es sollte geklärt werden, womit und wobei sich NSV am häufigsten ereigneten. Weiterhin wurde untersucht, wie Health Care Worker (HCW) eine erlittene NSV einschätzen, welche Schutzmaßnahmen sie gegen Verletzungen ergriffen haben und ob eine erlittene NSV Einfluss auf ihr künftiges Verhalten hatte. Anhand dieser Daten wurde klassifiziert, ob und gegebenenfalls wie viel NSV vermeidbar gewesen wären. Anschließend wurde diskutiert, wie das Risiko von NSV verringert werden kann. An der Erhebung nahmen 720 von 919 in den Zentren beschäftigten Personen teil (Rücklaufrate 78,3%). 71,6% der Ärzte, 76,4% des Pflegepersonals, 75% der Laborangestellten sowie 100% von denen, die als “Sonstige“ klassifiziert wurden als auch vom Reinigungspersonal, sandten den Fragebogen zurück. Von den 226 HCW (31,4%), die in den letzten 12 Monaten mindestens eine NSV erlitten hatten, waren Ärzte mit 55,1% signifikant häufiger betroffen als das Pflegepersonal mit 22%. Von allen 561 stattgefundenen NSV im letzten Jahr ist es in der Chirurgie am 10 häufigsten zu einer NSV gekommen (59,9%), am seltensten in der Dermatologie (6,4%). Dabei waren die Ärzte der Chirurgie, Pädiatrie, Dermatologie und Gynäkologie signifikant häufiger betroffen als das Pflegepersonal, in der Anästhesie waren jedoch nicht mehr signifikant mehr Betroffene. In der Anästhesie gaben 75% aller Mitarbeiter an, mehr als 20 Eingriffe mit Verletzungsrisiko pro Woche vorzunehmen, in der Chirurgie nur 53,8%. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Häufigkeit verletzungsträchtiger Eingriffe nicht mit der Zahl der Verletzungen korreliert. Abgesehen von der Angabe „Sonstiges“, die mehrere Ereignisse repräsentiert, ereigneten sich NSV am häufigsten beim Nähen (23%) und bei Blutabnahmen (13%), also an den Instrumenten, die in den meisten Fachkliniken auch am häufigsten verwendet wird. Nur 5% aller NSV wurden von den HCW als schwer bezeichnet. Ein ungenügendes Sicherheitsbewusstsein bei den Mitarbeitern zeigte sich zum einen dadurch, dass insgesamt bei fast einem Drittel (27,9%) der NSV auf das Tragen von Handschuhen verzichtet wurde. Dabei unterschieden sich die Kliniken untereinander signifikant, wobei in der Chirurgie und Anästhesie mit 85,7% bzw. 81,3% im Gegensatz zu der Pädiatrie mit 35,8%, am häufigsten Handschuhe getragen wurden. Auch waren sich zwar insgesamt 78,2% der HCW sicher über einen suffizienten Hepatitis-B-Impfschutz, wobei die Ärzte signifikant besser in Kenntnis darüber waren als das Pflegepersonal, jedoch wussten über ein Viertel (25,8) der Angestellten in der Pädiatrie nicht darüber Bescheid. Beim Arbeiten mit scharfen Gegenständen am Krankenbett nahmen nur 29,4% der Befragten einen Abwurfbehälter mit und über die Hälfte (50,4%) gaben an, keine NSV dem D-Arzt gemeldet zu haben. Das Pflegepersonal hatte signifikant häufiger gemeldet als die Ärzte. Ihr Verhalten nach einer NSV nicht geändert zu haben, gaben 53,1% der Betroffenen an. Insgesamt hätten 36,7% aller NSV durch Instrumente mit Sicherheitsvorkehrungen sicher vermieden werden können, in der Pädiatrie und der Gynäkologie sogar mehr als 80%.
A framework for the analysis and visualization of multielectrode spike trains / von Ovidiu F. Jurjut
(2009)
The brain is a highly distributed system of constantly interacting neurons. Understanding how it gives rise to our subjective experiences and perceptions depends largely on understanding the neuronal mechanisms of information processing. These mechanisms are still poorly understood and a matter of ongoing debate remains the timescale on which the coding process evolves. Recently, multielectrode recordings of neuronal activity have begun to contribute substantially to elucidating how information coding is implemented in brain circuits. Unfortunately, analysis and interpretation of multielectrode data is often difficult because of their complexity and large volume. Here we propose a framework that enables the efficient analysis and visualization of multielectrode spiking data. First, using self-organizing maps, we identified reoccurring multi-neuronal spike patterns that evolve on various timescales. Second, we developed a color-based visualization technique for these patterns. They were mapped onto a three-dimensional color space based on their reciprocal similarities, i.e., similar patterns were assigned similar colors. This innovative representation enables a quick and comprehensive inspection of spiking data and provides a qualitative description of pattern distribution across entire datasets. Third, we quantified the observed pattern expression motifs and we investigated their contribution to the encoding of stimulus-related information. An emphasis was on the timescale on which patterns evolve, covering the temporal scales from synchrony up to mean firing rate. Using our multi-neuronal analysis framework, we investigated data recorded from the primary visual cortex of anesthetized cats. We found that cortical responses to dynamic stimuli are best described as successions of multi-neuronal activation patterns, i.e., trajectories in a multidimensional pattern space. Patterns that encode stimulus-specific information are not confined to a single timescale but can span a broad range of timescales, which are tightly related to the temporal dynamics of the stimuli. Therefore, the strict separation between synchrony and mean firing rate is somewhat artificial as these two represent only extreme cases of a continuum of timescales that are expressed in cortical dynamics. Results also indicate that timescales consistent with the time constants of neuronal membranes and fast synaptic transmission (~10-20 ms) appear to play a particularly salient role in coding, as patterns evolving on these timescales seem to be involved in the representation of stimuli with both slow and fast temporal dynamics.
Biophysikalische Charakterisierung von endogenen Ionenkanälen (P2X7, TRPV) in humanen Mastzellen
(2009)
Die Akupunktur ist zentraler Bestandteil der traditionellen ostasiatischen Medizin, die auch Moxibustion und Kräuterheilkunde (Herbalmedizin) umfasst [Focks et al. 2006]. Akupunkturpunkte sind auch durch eine höhere Konzentration von sensorischen Rezeptoren und Mastzellen charakterisiert [Dung 1984; Heine 1988; Hwang 1992]. So ergaben Untersuchungen, dass die Stimulation (physikalische und chemische Reize) von Akupunkturpunkten auf Rezeptoren und auch Mastzellen einwirkt [Belmonte 1996; Schmidt 2002; Yang et al. 2007; Zhang et al. 2008a; Zhang et al. 2008b; Zhao 2008]. Dabei zeigten auch Pflanzenkomponenten aus der TCM Einflüsse [Lee 2000; Smith et al. 2006]. ...
The mTOR kinase inhibitor rapamycin (sirolimus) is a drug with potent immunosuppressive and antiproliferative properties. We found that rapamycin induces the TGF/Smad signaling cascade in rat mesangial cells (MC) as depicted by the nuclear translocation of phospho-Smads 2, -3 and Smad-4, respectively. Concomitantly rapamycin increases the nuclear DNA binding of receptor (R)- and co-Smad proteins to a cognate Smad-binding element (SBE) which in turn causes an increase in profibrotic gene expression as exemplified by the connective tissue growth factor (CTGF) and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1). Using small interfering (si)RNA we demonstrate that Smad 2/3 activation by rapamycin depends on its endogenous receptor FK-binding protein 12 (FKBP12). Mechanistically, Smad induction by rapamycin is initiated by an increase in active TGF1 as shown by ELISA and by the inhibitory effects of a neutralizing TGF antibody. Using an activin receptor-like kinase (ALK)-5 inhibitor and by siRNA against the TGF type II receptor TGF-RII) we furthermore demonstrate a functional involvement of both types of TGF receptors. However, rapamycin did not compete with TGFfor TGF-receptor binding as found in radioligand-binding assay. Besides SB203580, a specific inhibitor of the p38 MAPK, the reactive oxygen species (ROS) scavenger N-acetyl-cysteine (NAC) and a cell-permeable superoxide dismutase (SOD) mimetic strongly abrogated the stimulatory effects of rapamycin on Smad 2 and 3 phosphorylation. Furthermore, the rapid increase in Dichlorofluorescein (DCF) formation implies that rapamycin mainly acts through ROS. In conclusion, activation of the profibrotic TGFSmad signaling cascade accompanies the immunosuppressive and antiproliferative actions of rapamycin. Keywords: FK506 binding protein; p38 MAP kinase; rapamycin; renal fibrosis; Smads; TGFβ
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stehen das qualitative soziologische Interview und seine Auswertung. Hierzu werde ich die im Zusammenhang mit einem konkreten abgeschlossenen Forschungsprojekt geführten Interviews und deren Interpretation empirisch untersuchen. Die zentrale erkenntnistheoretische Basis besteht in der Vorstellung einer narrativen Konstruktion von Wahrheit sowie der Vorstellung von wissenschaftlicher Geltung im Allgemeinen und der Geltung dieser konkreten Auswertungen im Besonderen. ...
Das humane Immundefizienz-Virus (HIV) benötigt für die Virus-Zellbindung spezifische Oberflächenrezeptoren auf den Wirtszellen (z. B. CD4, CXCR4, CCR5). Zurzeit basiert die Behandlung der chronisch persistierenden HIV-Erkrankung auf einer lebenslangen Chemotherapie (Highly Active Antiretroviral Therapy, ART) bestehend beispielsweise aus einer Kombination von 2 Nukleosidanaloga und einem Protease-Inhibitor, die das Virus nicht eradiziert, sondern nur in seiner Vermehrung hemmt. Dies birgt jedoch die Gefahr der Entwicklung von Resistenzen gegenüber der medikamentösen Therapie. Zusätzlich wird eine Veränderung der HIV-Rezeptorspezifität unter der Behandlung mit Antagonisten des HIV-Rezeptors CCR5 befürchtet. Cytarabin (Ara-C) ist ein Zytostatikum, das in der Therapie von Leukämien eingesetzt wird. Als Nukleosidanalogon gehört es strukturell zur selben Wirkstoffklasse wie die in der HIV-Therapie eingesetzten Nukleosidanaloga, jedoch sind bisher keine antiretroviralen Eigenschaften für Ara-C beschrieben worden. Die T-lymphoide Zelllinie C8166 ist permissiv für HIV. Die Adaptation von C8166-Zellen an das Wachstum in Gegenwart von Ara-C (Zellinie C8166rAra-C5μM) resultierte in einer signifikanten Verringerung der Oberflächenexpression der HIV-Rezeptoren CD4 und CXCR4 und zu einer verringerten Permissivität gegenüber HIV. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob die Adaptation an Ara-C bei anderen T-lymphoiden Zelllinien ebenfalls zur Verringerung der Expression von CD4, und CXCR4 führt. Zusätzlich sollte untersucht werden, wie sich die Expression von CCR5 verhält. Es wurden die folgenden parentalen und an Ara-C adaptieten T-lymphoiden Zelllinien verwendet: H9, H9rAra-C600μM, MOLT4/8, MOLT4/8rAra-C100μM und MOLT4/8rAra-C200μM. Bei allen Ara-C resistenten Zelllinien kam es zu einer signifikant verringerten Expression von CD4 und CXCR4 auf mRNA und Proteinebene sowie zu einer signifikanten Erhöhung der CCR5-Expression. Im Gegensatz hierzu zeigten an AZT adaptierte H9-Zellen (H9rAZT3000μM) keine signifikante Veränderung in der Expression von CD4, CXCR4 oder CCR5 im Vergleich zu parentalen H9-Zellen. Die akute Behandlung der parentalen H9-Zellen mit niedrigen, untoxischen Ara-C Konzentrationen führte ebenfalls zu einem Anstieg der CCR5-Expression und zu einer Verminderung der CD4- und CXCR4-Expression. Zellzyklusmessungen ergaben, dass der Zellzyklus in mit untoxischen Ara-C-Konzentrationen behandelten H9-Zellen (Anstieg der Zellteilungsrate auf das 2-fache) und in allen an Ara-C adaptierten Zelllinien im Vergleich zu den unbehandelten bzw. parentalen Zellen stärker stimuliert war. Epigenetische Einflüsse könnten bei der veränderten Expression von CD4, CXCR4 und/oder CCR5 in Ara-C resistenten Zellen eine Rolle spielen. Dies erscheint jedoch unwahrscheinlich, da weder der DNA-Methylierungsinhibitor Aza-C noch der Histondeacetylase-Inhibitor SAHA die Expression von CD4, CXCR4 oder CCR5 beeinflussten. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob eine Kombination von Ara-C, das zu einer Verringerung der CXCR4- und CD4-Expression und zu einer Erhöhung der CCR5-Expression führt, mit CCR5-Inhibitoren eine therapeutische Option darstellt. Möglicherweise wirkt die Verwendung von Ara-C auch einem CCR5/CXCR4-Shift entgegen.
The documentation of life on Earth, that is, the inventorization of nature and the naming and classification of organisms found therein, is a major task for biologists today and a fundamental precondition for nature conservation efforts. This study aimed at contributing to the inventory of amphibians and reptiles in selected, previously understudied ecoregions of Bolivia. I strove to document diversity patterns and seek possible ecological and historical reasons for these patterns. Special attention was paid to the Chiquitano Region situated in the eastern lowlands of Bolivia in a climatic transition zone between the humid evergreen Amazon Forests and the deciduous thorn-scrub vegetation of the Gran Chaco. In congruence with its location in the transition zone, the Chiquitano Region displays a mosaic of habitats: The vegetation is dominated by the endemic Chiquitano Dry Forest, which is probably the largest extant patch of Seasonal Dry Tropical Forest, with enclaves of savanna, the western outliers of the Cerrado biome of central Brazil. Taxonomic revisions: The taxonomic data in this study are used as a tool to measure biodiversity, to assess biogeographic relationships, and to evaluate conservation needs. Since all is predicated on the taxonomic decisions made, an adequate taxonomy is essential, and taxonomy can be regarded as the foundation of this study. The methodology encompassed a variety of herpetological field techniques, such as different survey methods, preparation and documentation of voucher specimens, recording of frog calls, and herpetological laboratory techniques, such as morphology, molecular procedures with mtDNA, phylogenetic analyses, and bioacoustic analysis and descriptions of frog calls. A total of 1251 specimens belonging to 200 species were obtained during this study, including 87 amphibian and 123 reptile species. This constitutes about 36% of the herpetofauna currently known for Bolivia, about 34% of the amphibians currently known for Bolivia and about 40% of the reptiles, respectively. In the course of this study, a new species of frog was described from the study site Caparu in the eastern lowlands of Bolivia; this species, Hydrolaetare caparu Jansen, Gonzales & G. Köhler 2007, differs from the other two congeners in external morphology (e.g., lateral fringes and relative length of fingers, size of palmar tubercle, webbing of toes, and colouration) and advertisement call. Two new colubrid snake species were also described from the study site San Sebastián. Thus far, both are known only from the Chiquitano Region, Provincia Ñuflo de Chávez. Phalotris sansebastiani Jansen & G. Köhler 2008 differs from all the other species in the genus in having a triangular projection of the red snout colouration reaching onto the parietals. Xenopholis werdingorum Jansen, Gonzales & G. Köhler 2009 can be identified as a member of the genus Xenopholis by its vertebral morphology. It differs from the other two species of Xenopholis in having a unique uniform dorsal colour pattern, and from X. scalaris in having two prefrontals and a narrow septum within the neural spine and perpendicular to its long axis as evident in the x-ray images. A review of a small collection of pitvipers from different lowland localities and from the Inter-Andean dry valleys of the region of Pampagrande revealed one new species of Bothrops and one of Bothrocophias (both to be formally described elsewhere). The two pitviper species differ morphologically and genetically from their congeners. The results of a brief review of a small collection of frogs of the genus Scinax (Anura: Hylidae) from different localities in the lowlands, together with analyses of their bioacoustics, suggest an unknown cryptic diversity in Bolivian species of Scinax cf. fuscomarginatus and allies. However, further studies are necessary to clarify the taxonomic status of these populations. In addition, this study provides new data on the morphology (e.g., pholidosis) of snakes, many of them previously known only from few museum specimens. Keys to the Bolivian lizard species of Cercosaura and the Bolivian snake species of Chironius, Clelia, Liophis, Lystrophis, Phalotris, and Xenodon are presented here for the first time. New information on distribution includes many range extensions of amphibian and reptile species, such as five new country records (one frog species, four snake species) and six new departmental records (two frog species, four snake species). Observations on ecology and natural history: Several observations on ecology and natural history were made during field work. Visual signaling, an aspect of territorial behavior that was already known for several species of the genus Phyllomedusa, could be described for the first time for Phyllomedusa boliviana (Jansen & J. Köhler 2007). Furthermore, during audio surveys of an anuran community at the study site San Sebastián from 2005 to 2007, a decline of certain amphibian populations was observed in the rainy season 2006/2007 (Jansen et al., in press). This is possibly related to an extreme drought in the dry season of 2006 where 158 consecutive days without rainfall were recorded. In addition, a new method for measuring intensity of anuran choruses by means of a continuous sound pressure metre was developed (Jansen 2009). The method was suitable to detect calling phenology (during one night), as well as differences in calling activity (between two nights). Biodiversity and biogeographical relationships: Species lists were compiled at the six study sites Pampagrande, Los Volcanes, San Sebastián, Caparú, El Espinal und El Corbalan. The total amphibian and reptile species numbers observed ranged from 37 to 101 with the highest species numbers in San Sebastián (101) and Caparú (89) and the lowest in Los Volcanes (37) and El Espinal (41). A preliminary species list of the herpetofauna of the Chiquitano Region was presented, including 60 amphibian and 84 reptile species. The majority of the amphibians of the Chiquitano Region are classified predominantly as inhabitants of open formations (41 species, 68.3%). Interestingly, even the majority of species recorded from the Chiquitano Dry Forest (32 species) are usually associated with open formations (22 species, 66.7%), followed by the number of species associated with open and forest formations (8 species, 24.4%). Only two of the observed species (6.0%) are predominant forest dwellers. The amphibian assemblage of the Chiquitano Region is most similar in composition to that of the Cerrado biome: 46 species (76.7%) occur in the Cerrado as well, and three species are regarded as Cerrado endemics (5.0%). The Chiquitano Region shares considerably fewer amphibian species with the other biomes (Amazon: 22 species, 36.7%; Gran Chaco: 13 species, 21.7%; Caatinga: 16 species, 26.7%). The reptile assemblage also has significant affinities to the Cerrado, which can be seen in the high proportion of reptile species distributed in that biome (68 species; 81.0%). Affinities to the other biomes are as follows: Amazon (48 species, 57.1%), Chaco (37 species, 40.1%), and Caatinga (30 species, 35.7%). When arranged in mutually exclusive biome categories, reptiles and amphibians showed similar patterns so that the majority of both amphibians and reptiles of the Chiquitano Region can be regarded as widespread. The high proportion of reptile species probably endemic to this region (5 species, 6.0%) is remarkable (i.e. Tropidurus xanthochilus, Apostolepis phillipsi, Phalotris sansebastiani, Xenopholis werdingorum, and Micrurus diana). In an analysis of the biodiversity patterns and biogeographical relationships of the herpetofauna of the study sites, these sites were compared with literature data from 37 localities and included in a presence/absence matrix with a total of 657 amphibian and reptile species in the surrounding South American biomes Amazon, Cerrado and Gran Chaco. The biogeographic relationships between these sites were evaluated using the Coefficient of Biogeographic Resemblance (CBR), cluster analysis, and multidimensional scaling (MDS) of sites. The analyses were first conducted on amphibians and reptiles combined, and than group-specific each for amphibians, reptiles, lizards, and snakes, separately. A “bias-reduced analysis” was developed for a better understanding of the affinities of the amphibians. In this analysis, e.g., the distinct habitat types of the Chiquitano Region, the Chiquitano Dry Forest and the Cerrado were taken into account. Analyses of the biodiversity patterns revealed that the sites in the Amazon comprise highest species numbers, as expected, followed successively by the sites in the Cerrado biome and sites in-between the two biomes. Within the eastern lowlands of Bolivia, the Chiquitano Region is the most rich in species. Comparing it with the other South American sites, the Chiquitano Region has a surprisingly high alpha diversity, especially in amphibians. The microgeographic variation in species composition (beta diversity) in the Chiquitano Region is also remarkably high and obviously related to the mosaic character of the vegetation and habitats. However, the bias-reduced analysis revealed that the amphibian fauna of the open areas and savannas at Hacienda San Sebastián (with 36 species in the Cerrado and pastureland) was one of the most species-rich savanna sites known for amphibians in South America. Considering that the Hacienda San Sebastián site is only ca. 3300 ha (= 1.29 amphibian species per km2), this outcome is particularly suprising. The results of the analyses of the biogeographical relationships suggest that the herpetofauna of Bolivia’s lowlands, including the Beni, the Pantanal and the Chiquitano Region, is as distinct from the herpetofauna of the Gran Chaco, Amazon, and Cerrado as these biomes are from each other. The Chiquitano herpetofauna in particular represents a unique and well-defined herpetofaunal assemblage when compared to all surrounding localities and biomes. This is supported by high CBR-values, findings from the cluster analysis, as well as a clear separation of the Chiquitano sites in the MDS. Biogeographic relations exist in all the surrounding biomes, but are strongest to Cerrado, followed by the Amazon. This study strongly suggests that the Chiquitano herpetofauna is composite and has multiple affinities. This is congruent with a well-defined Chiquitano flora, avifauna and mammalian fauna, suggesting a similar history. The bias-reduced analysis revealed a more detailed picture of the biogeographic relations of the Chiquitano Region, especially the Chiquitano Dry Forest. I argue here that the Chiquitano Dry Forest herpetofauna is a “young”, and “former savanna herpetofauna”. Whereas the Chiquitano Dry Forest is rather poor in amphibian and reptile species, and endemics are lacking from this forest type, the isolated Cerrado enclaves are especially diverse in species and probably contain locally endemic species, such as Phalotris sansebastiani and Xenopholis werdingorum. The colonization of the young Chiquitano Dry Forest may have taken place from savannas by mainly open area species, and only briefly through the Amazon. The results emphasise the importance of bias-reduction in studies of biogeography, e.g., by using group-specific analyses or by taking into account criterias as area size and heterogeneity of compared sites. The different biogeographic patterns of reptiles and amphibians of the Andean valleys indicate a different history of these two groups. In regard to reptiles, dispersals and withdrawals into the valleys in warm humid and dry cool periods in the Pleistocene seem likely, supported by a relation between the valleys and the dry lowland (e.g., Chaco). However, it is more plausible that, during these climatic fluctuations, amphibians migrated to adjacent, more humid regions, such as Yungas. The study verified the known patterns of sister-species pairs in the Inter-Andean Dry Forest and the lowlands. Additionally, pairs of populations with slight differences in morphology were found in the valleys and in the lowlands (Cercosaura parkeri and Xenodon rhapdocephalus). Further studies must test the taxonomic status of these populations. The discovery of new species of Bothrops and Bothrocophias from the Andean valleys has several implications, and possible reasons for the high endemism in the dry valleys are discussed. Conservation and outlook: The high local alpha and beta diversity of the Chiquitano herpetofauna shows that this is a region of complex faunal interaction, which reflects the present heterogeneity of the region, but which is possibly also related to a complex geological and environmental history. The Chiquitano Region can be assessed as a region of distinct regional herpetofaunal diversity charaterised by small scale diversity patterns. It therefore merits recognition as a unique ecoregion, and conservation effort should be increased. Further research is necessary to solve the taxonomic problems addressed in this study. Moreover, future work should be directed towards the development and institution of longterm monitoring programs to evaluate the effects of climate change and changes in land-use on biodiversity, especially that of the Chiquitano Region.
The various OPE mixtures were also tested on sSOI material which consists of a thin strained silicon layer on top of an insulator like silicon dioxide. The OPE A, B and F are able to reveal threading dislocations (TD) in the strained silicon film (chapter 5.11). The TD densities determined for the OPE A correspond very well with those obtained with the Secco diluted reference. The tested OPE mixtures are not able to delineate other crystal defects like stacking faults, pile ups or twins, which also appear in the strained silicon. Some Organic Peracid Etches were also tested on wafers with an epitaxial silicon layer and on silicon substrates. Epitaxially produced silicon layers are nearly defect-free. Etching times were chosen such that only a part of the epitaxial layer was removed. Nevertheless, after very long etching times (> 16 h) isolated pits were found, with defect densities ranging from 104/cm3 to 106/cm3 depending on the etching solution used. No etch pits were found in the remaining epitaxial layer when OPE F was used. Longer etching times appear to favour the formation of artefects. These artefacts could be caused by the formation of gas bubbles, particles or micro scratches at the crystal surface. The OPE C and D are able to reveal vacancy agglomerates (D-defects) in silicon substrates (see under 5.5, 5.6 and 5.11in chapter 5). Due to their low removal rates and the long etching times which favour the formation of artifacts, these solutions are less suited to the delineation of defects in silicon substrates. In the second part of this study the different etch formulations have been compared with each other in respect of their physical properties like removal rates, activation energies, standard potentials and selectivities (chapter 6). The selectivity was determined at etch pits caused by dislocations. The depth of the etch pits, determined by atomic force microscopy (AFM), should be dependent on the selectivity of the corresponding etching solution used. The higher the selectivity of the solution the deeper the etch pit should be. It was assumed that a low removal rate and a high activation energy for the etching process should correspond to a high selectivity. However, the experimental results have shown that it is not possible to predict the selectivity of an etching solution from experimental parameters like removal rate or activation energy. One must bear in mind that selectivity was only determined on one particular type of crystal defect, namely on dislocations. Values for selectivity in the etching solutions can differ for other defect types. Besides the etching solutions used in this study differ considerably from each other in respect of their chemical and physical roperties. They can be divided into three completely different etching systems. The original Secco solution and the diluted variations thereof are hydrofluoric acid-dichromate mixtures with the Cr6+ species as the oxidizing agent. The Jeita and MEMC solutions contain nitric acid, hydrofluoric acid and, as diluents, acetic acid and water. Here the oxidizing agents are various N(III) species which are formed autocatalytically during the etching process. The concentration of acetic acid also plays an important role as it lowers the degree of dissociation of HF and of HNO3. This has an influence on the pH and the standard potential of the etching solution. The Organic Peracid Etches are mixtures of hydrogen peroxide and a short-chain alkanoic acid like acetic acid. Such systems are strictly speaking not aqueous solutions, the reactive species is the peracid formed.Within each system, however, a certain relationship is perceived between the selectivity of the etching solution on the one hand, and the and the activation energy or the removal rate on the other. The decreased activation energy for the etching process of silicon at a dislocation can be calculated from experimental data by using the Arrhenius equation (chapter 6.3). It was found that the strain inside the crystal lattice caused by a dislocation loop leads to an increase of the potential energy of ~ 5 % and, hence, a decrease of the activation energy of ~ 5 % and an increase in the removal rate of ~ 100 %.
Orthopoxviruses are large DNA viruses that replicate within the cytoplasm of infected cells encoding over a hundred different proteins. The orthopoxviral 68k ankyrin‐like protein (68k‐ank) is highly conserved among orthopoxviruses, and this study aimed at elucidating the function of 68k‐ank. The 68k‐ank protein is composed of four ankyrin repeats (ANK) and an F‐box‐like domain; both motifs are known proteinprotein interaction domains. The F‐box is found in cellular F‐box proteins (FBP), crucial components of cellular E3 ubiquitin (Ub) ligases. With yeast‐two‐hybrid screens and subsequent co‐immunoprecipitation analyses, it was possible to identify S‐phase kinase‐associated protein 1a (Skp1a) as a cellular counterpart of 68k‐ank via binding to the F‐box‐like domain. Additionally, Cullin‐1 was co‐precipitated, suggesting the formation of a viral‐cellular SCF E3 Ub ligase complex. Modified Vaccinia virus Ankara (MVA) ‐ being attenuated and unable to replicate in most mammalian cell lines due to a block in morphogenesis – nevertheless, expresses its complete genetic information attributing to its properties as promising vector vaccine. Conservation of 68k‐ank as the only ANK protein encoded by MVA implied a substantial role of this viral factor. Hence, its function in the viral life cycle was assessed by studying a 68k‐ank knock‐out MVA. A mutant phenotype manifested in nonpermissive mammalian cells characterized by a block succeeding viral early gene expression and by a reduced ability of the virus to shutoff host protein synthesis. Studies with MVA encoding a 68k‐ank F‐box‐like domain truncated protein revealed that viral‐cellular SCF complex formation and maintenance of viral gene expression are two distinct, unrelated functions fulfilled by 68k‐ank. Moreover, K1, a well‐described VACV host range factor of the ANK protein family, is able to complement 68k‐ank function. This suggests that gene expression of MVA putatively depends on the ANKs encoded in 68k‐ank. In addition to the important findings in vitro, first virulence studies with the mouse pox agent, ectromelia virus (ECTV) deleted of the 68k‐ank ortholog (C11) suggested that this factor contributes to ECTV virulence in vivo.
1. Fab co-complexes of proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) Fab fragments suitable for co-crystallization with complex I were generated using an immobilized papainbased protocol. The binding of the antibody fragments to complex I was verified using Surface Plasmon Resonance and size exclusion chromatography. The binding constants of the antibodies and their respective Fab fragments were found to be in the nanomolar range. This work presents the first report on successful crystallization of complex I (proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase) from Yarrowia lipolytica with proteolytic Fab fragments. The quality of the crystals was significantly improved when compared to the initial experiments and the best crystals diffracted X-rays to a resolution of ~7 Å. The activity of complex I remained uninfluenced by antibody fragment binding. The initial diffraction data suggest that the complex I/Fab co-complex crystals represent a space group different to the one observed for the native protein. Ongoing experiments are aimed at further enhancements of the diffraction quality of the crystals. Providing a different space group the CI/Fab co-complexes may become a very useful approach for structure determination of the enzyme. Moreover, the bound Fab offers an additional possibility to generate phase information. The antibody-mediated crystallization represents a valuable tool in structural characterization of the NADH:oxidoreductase subcomplexes or even single subunits. 2. UDP-glucose pyrophosphorylase UDP-glucose pyrophosphorylase from Yarrowia lipolytica displays affinity towards Ni2+ NTA and was first detected in a contaminated sample of complex I. Following, separation from complex I, Ugp1p was purified using anion exchange chromatography. Sequence similarity studies revealed high identity to other known pyrophosphorylases. As indicated by laser-based mass spectrometry method (LILBID) Ugp1p from Y. lipolytica builds octamers similarly to the enzyme from Saccharomyces cerevisiae. The initial crystals grew as thin needles favorably in sitting drop setups. The size of the crystals was increased by employment of a micro batch technique. The improved crystals diffracted X-rays to a resolution of 3.2 Å at the synchrotron beamline. Structural characterization is under way using a molecular replacement approach based on the published structure of baker’s yeast UGPase.
Ezrin gehört zur Gruppe der Actin-Zytoskelett-bindenden ERM-Proteine und ist in seiner Funktion für Leukozyten gut beschrieben, wo es in Zusammenhang mit der interund intrazellulären Induktion von Apoptose gebracht wurde. Im Kontext der Astrozytenbiologie ist seine Expression mit astrozytärer Aktivierung, der Malignität von Astrozytomen und der Apoptose von Neuronen bei HIV-Encephalitis assoziiert. Die vorliegende Studie untersucht die Expression von Ezrin in Astrozyten bei verschiedenen Demenzerkrankungen mit der Frage nach krankheitsspezifischen astrozytären Aktivierungsphänomenen und einem möglichen Zusammenhang mit neuronaler Apoptose. Hierzu wurden 51 Gehirne von Demenzpatienten und 17 Gehirne von Normalkontrollen des Neurologischen Instituts (Edinger Institut) der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main histopathologisch untersucht. An Schnitten von jeweils 4-6 in Paraffin eingebetteten Gehirnarealen pro Fall wurden eine modifizierte Silberimprägnationsfärbung nach Bielschowsky und immunhistochemische Färbeverfahren für Ezrin, GFAP, HLA-DR, hyperphosphoryliertes Tau-Protein und Ubiquitin angefertigt und semiquantitativ evaluiert. Zur Darstellung von apoptotischen DNA-Strangbrüchen wurde die TUNEL-Methode verwendet. Die hier untersuchte Stichprobe entspricht in Hinsicht auf die Verteilung verschiedener Demenztypen weitgehend der neueren Literatur: Die häufigste Demenzerkrankung war die Alzheimersche Erkrankung mit 84% (N=43), gefolgt von der Demenz mit Lewy-Körperchen mit 35% (N=18), der vaskulären Demenz mit 18% (N=9) und der Frontal–Lobe-Dementia mit 6% (N=3). 47% der Fälle litten an einer Kombination von zwei Demenzerkrankungen. Die astrozytäre Ezrin-Expression zeigt keine signifikante Differenz zwischen verschiedenen Demenzformen. Dies trifft sowohl für singuläre Demenzerkrankungen als auch für Kombinationsdemenzerkrankungen zu. Die astrozytäre Ezrin-Expression korreliert hochsignifikant mit dem Schweregrad der Alzheimerschen Erkrankung, gemessen an der Dichte neuritischer Plaques in Anlehnung an die Klassifikation nach CERAD. Die astrozytäre Ezrin-Expression korreliert hochsignifikant positiv mit der Apoptose von Neuronen unabhängig vom Erkrankungstyp. Im Unterschied zur Ezrin-Immunoreaktivität, die nahezu ausschließlich bei Demenzfällen mit neuronaler Apoptose eine deutliche Erhöhung aufwies, zeigte sich die GFAP- und HLA-DR-Immunoreaktivität bei Demenzfällen generell im Vergleich zu Kontrollfällen deutlich erhöht. Zusammenfassend trägt die Untersuchung der astrozytären Ezrinexpression nicht zur Differentialdiagnose von Demenztypen bei, ist jedoch mit dem Schweregrad von Demenzerkrankungen korreliert. Ezrin fungiert offenbar als Indikator eines spezifischen astrozytären Aktivierungszustandes, der eine Assoziation mit schwerem Gewebeschaden in Form neuronaler Apoptose aufweist. Dieser Aktivierungszustand erwies sich in der vorliegenden Untersuchung als unabhängig vom Krankheitstyp, was für die These spricht, dass eurodegenerative Erkrankungen pathophysiologische Gemeinsamkeiten teilen könnten. Darüber hinaus weisen die Ergebnisse der Studie darauf hin, dass die Aktivierung von Astrozyten kein homogenes Phänomen darstellt, sondern in distinkten Formen assoziiert mit progressiver Gewebsschädigung des ZNS auftreten kann.
Knochenmarkszellen sowie zirkulierende endotheliale Progenitorzellen (EPC) beteiligen sich an der Neovaskularisation ischämischen Gewebes im Tiermodell und wurden nach Myokardinfarkt in ersten klinischen Studien erfolgreich eingesetzt. Stromal cell derived factor-1 (SDF) ist der physiologische Ligand des CXCR4-Rezeptors, der auf hämatopoietischen Stammzellen sowie auf EPC exprimiert ist. Der CXCR4-Rezeptor ist entscheidend für das Homing von hämatopoietischen Stammzellen und für die unktionelle Aktivität von EPC. Eine Aktivierung des CXCR4-Rezeptors führt zur Phosphorylierung und Aktivierung der Janus Kinase 2 (JAK2), Phosphatidylinositol 3 (PI3)-Kinase sowie der Aktivierung fokaler Adhäsionsproteine, entscheidende Schritte für die SDF induzierte Migration von CXCR4+ Zellen. EPC von Patienten mit koronarer Herzerkrankung sind funktionell eingeschränkt, jedoch sind die genauen Mechanismen dieser Einschränkung bislang nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es die funktionelle Aktivität von mononukleären Zellen aus dem Knochenmark (BM-MNC) von heterozygoten CXCR4+/- Mäusen mit denen von homozygoten CXCR4+/+ Mäusen zu vergleichen. Im Weiteren sollte die Phosphorylierung von JAK2 in BM-MNC dieser Mäuse sowie in EPC von Patienten mit koronarer Herzerkrankung und gesunden Probanden untersucht werden. Die CXCR4-Expression auf der Oberfläche von BM-MNC von heterozygoten CXCR4+/- Mäusen ist signifikant niedriger als die CXCR4-Expression auf BM-MNC von homozygoten CXCR4+/+ Mäusen. BM-MNC von CXCR4+/- Mäusen zeigten eine eingeschränkte funktionelle Kapazität die Perfusion im Hinterlaufischämiemodell der athymischen Nacktmaus nach Transplantation zu verbessern verglichen zu BM-MNC von CXCR4+/+ Mäusen. CXCR4+/- Mäuse zeigten eine signifikant erniedrigte Erholung nach Anlage einer Hinterlaufischämie verglichen zu CXCR4+/+ Mäusen. Die reduzierte Erholung der CXCR4+/- Mäuse konnte durch Transplantation von BM-MNC aus CXCR4+/+ Mäusen verbessert werden. Die JAK2-Phosphorylierung in BM-MNC von CXCR4+/- Mäusen war signifikant niedriger als bei CXCR4+/+ Mäusen. EPC von Patienten mit koronarer Herzerkrankung (KHK) hatten eine niedrigere basale JAK2-Phosphorylierung verglichen zu EPC von gesunden Probanden und die JAK2- Phosphorylierung in EPC von Patienten mit KHK ließ sich weniger stark durch SDF stimulieren als in EPC von gesunden Probanden. Die vorliegende Arbeit unterstützt die Rolle des CXCR4-Rezeptors für die funktionelle Aktivität von Progenitorzellen in vivo. Sowohl die funktionell eingeschränkten BM-MNC von CXCR4+/- Mäusen als auch EPC von Patienten mit KHK zeigen eine verringerte JAK2 Phosphorylierung verglichen zu CXCR4+/+ Zellen bzw. EPC von gesunden Probanden. Eine Aktivierung des SDF-CXCR4-Signaltransduktionsweges könnte therapeutisch eingesetzt werden um die funktionelle Aktivität der Zellen vor der klinischen Stammzelltransplantation zu verbessern.
Katheterinterventioneller Verschluss des persistierenden Foramen ovale mit neuem Okklusionssystem
(2009)
Der perkutane Katheterverschluss des persistierenden Foramen ovale ist mittlerweile zum Standardeingriff bei Patienten mit erlittener paradoxer Embolie geworden. Die derzeit zur Verfügung stehenden Verfahren zum PFO- Verschluss beruhen auf der Implantation eines Schirmchens in der Vorhofscheidewand und hinterlassen Fremdmaterial im rechten und linken Vorhof, woraus Komplikationen im Verlauf resultieren können. Das PFXVerschlusssystem dagegen ist ein neues nicht- implantierbares System. Das Okklusionssystem schweißt mithilfe monopolarer Hochfrequenzenergie das Septum primum und Septum secundum des PFOs zusammen und bewirkt somit den Verschluss des persistierenden Foramen ovale. Ziel dieser Arbeit war die Beurteilung der Wirksamkeit und Sicherheit dieses neuen Systems, angewandt bei Patienten mit kryptogenem Schlaganfall oder transienter ischämischer Attacke. Von April bis Oktober 2005 wurde bei 30 Patienten (w: 15, m: 15) mit einem diagnostizierten PFO und kryptogenem Schlaganfall oder peripherer arterieller Embolie ein kathetertechnischer Verschluss des Defektes mittels des neuen PFX- 15 Okklusionssystems vorgenommen. Das PFX- System besteht aus einem Katheter mit einer Metallelektrode an seinem distalen Ende und einem elastischen Gummisauger, der die Elektrode umfasst. Der Sauger führt die beiden Septa des PFO zusammen und hält sie während des Schweißvorgangs in Position. Zum Verschweißen des PFO wird monopolare Hochfrequenzenergie verwendet. Die Nullelektrode wird in Form eines Klebepflasters auf dem Rücken des Patienten angebracht. Bei 27 der 30 Patienten gelang eine korrekte Positionierung des PFX-15 Katheters (90%). Bei den restlichen 3 Patienten konnte in gleicher Sitzung erfolgreich ein implantierbares Okklusionssystem eingesetzt werden. Die durchschnittliche Eingriffszeit von Punktion der Leistenvene bis zum Entfernen des Systems betrug 52± 26,4 min (27 bis 90 min). Die PFX- Katheter Zeit, definiert als die Zeit vom Einführen des Katheters in die Vena femoralis bis zur Entfernung des Systems aus der Vene, betrug im Mittel 26± 12,9 min (11 bis 55 min). Die mittlere Durchleuchtungszeit betrug 12± 7,2 min. Die primäre Verschlussrate direkt nach dem Eingriff, ermittelt durch ein Kontrastmittel-TEE, lag bei 60% (18 von 30 Patienten). Von den 27 Patienten, bei denen eine Energieapplikation stattfand, konnten 16 PFOs (59,3%) erfolgreich verschlossen werden. Von den Patienten, die einen implantierbaren Schirm erhielten, wies ein Patient direkt nach dem Eingriff noch einen Restshunt auf. Die durchschnittliche Dauer des stationären Aufenthalts zum PFO- Verschluss betrug in der Gesamtgruppe 25,7± 11,4 Stunden. Die Patienten wurden im Mittel 5,8 Monate nachbeobachtet. 9 der 14 Patienten, deren PFO durch den ersten Eingriff nicht verschlossen werden konnte, gaben ihr Einverständnis für einen erneuten Eingriff mit dem PFX- 15 Katheter. 2 der Patienten erhielten während des zweiten Eingriffs ein implantierbares Okklusionssystem, nachdem die erneute Energieapplikation nicht zu einem Verschluss des PFO führte. 6 der restlichen 7 Patienten wiesen zum Zeitpunkt der 30 Tage- Nachuntersuchung keinen Restshunt mehr auf. Nimmt man die Erst- und Zweiteingriffe zusammen, fand in 36 Eingriffen eine Energieapplikation statt. Die sekundäre Verschlussrate, das heißt der erfolgreiche PFOVerschluss durch den Erst- oder Zweiteingriff, lag bei 63% (19 von 30). Alle 30 Patienten (100%) waren während der Nachuntersuchungszeit frei von schwerwiegenden unerwünschten Ereignissen. Es traten keine mit dem PFXVerschlusssystem oder dem PFO in Zusammenhang stehende Komplikationen auf. Eine an der Punktionsstelle entstandene arterio- venöse Fistel führte zu einer Verlängerung des Krankenhausaufenthalts. Andere Komplikationen waren ein Leistenhämatom, eine Infektion der Einstichstelle, eine transiente ST- Hebung, 2 transiente supraventrikuläre Bigemini und eine gastrointestinale Blutung, die auf die Einnahme von ASS zurückzuführen war, welches daraufhin abgesetzt wurde. Außerdem erlitt ein Patient, dessen PFO nach dem Eingriff noch einen großen Restshunt aufwies eine TIA. Keines der Ereignisse führte zu Folgeschäden für die Patienten. Die Arbeit zeigt, dass der PFO- Verschluss ohne Implantation eines permanenten Systems technisch möglich ist. Die primären und sekundären Verschlussraten lagen zwar unter denen von implantierbaren Verschlusssystemen, potentielle Vorteile liegen aber in der Tatsache, das kein Fremdmaterail im Körper verbleibt und somit Komplikationen wie Device assoziierte Thrombusformationen oder Device- Brüche nicht vorkommen und möglicherweise auch Vorhofflimmern weniger häufig auftritt. Die bedeutendsten periinterventionellen Komplikationen waren nicht mit dem PFXKatheter selbst oder der Energieapplikation assoziiert, sondern mit der Notwendigkeit der Verwendung einer 16 French Schleuse. Im Großen und Ganzen waren die Komplikationen vergleichbar mit denen anderer großer Studien über implantierbare Verschlusssysteme. Sobald die primären Verschlussraten durch technische Modifikationen verbessert wurden, werden randomisierte Studien folgen, die das Okklusionssystem mit implantierbaren Systemen vergleichen werden.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren spielen eine kritische Rolle in der Blutstammzellhomöostase und bei hämatopoietischem Stress. Ein Teil dieser GPCR-Signale wird durch den Chemokinrezeptor CXCR4 vermittelt; welche weiteren GPCRs beteiligt sind, ist hingegen unklar. Auf reifen hämatopoietischen Zellen wurden Expression und Funktion von Mitgliedern einer GPCR-Familie, den Cannabinoid-Rezeptoren, nachgewiesen. Zur initialen Prüfung der Hypothese, dass die Rezeptorfamilie auch für die Funktion unreifer hämatopoietischer Zellen eine Rolle spielen könnte, untersuchten wir in murinen primitiven hämatopoietischen Zellen die Expression von Cannabinoid-Rezeptoren auf mRNA- und Protein-Ebene. Zusätzlich wurde die Genexpression von Cannabinoid-Rezeptoren in weiteren murinen Geweben analysiert. Das vorbeschriebene organspezifische Expressionsmuster der Cannabinoid-Rezeptoren wurde weitgehend bestätigt. Für angereicherte Fraktionen primitiver hämatopoietischer Zellen wurde Expression von CB2 und CNRIP1 mRNA sowie die relativ homogene Expression von CB2 Protein nachgewiesen. Die Bedeutung dieses Rezeptors für homöostatische und Stress-Hämatopoiese wird derzeit in weiterführenden Experimenten untersucht.
Thalassämia major und Sichelzellanämie sind hereditäre Erkrankungen, die zu der Gruppe der quantitativen bzw. qualitativen Hämoglobinsynthesestörungen gehören und in unterschiedlichem Maße mit einer chronischen Anämie einhergehen. Dabei besteht die Therapie der Anämie in regelmäßigen Bluttransfusionen. Im Falle der Thalassämia major sind regelmäßige Bluttransfusionen alle 2-4 Wochen notwendig. Dabei übersteigt die damit zugeführte Eisenmenge bei weitem die Eisenausscheidungskapazität des Körpers, die limitiert und passiver Natur ist. Es kann dadurch zur Eisenüberladung des Körpers mit Erschöpfung der Eisenbindungskapazität und Nachweisbarkeit von freiem Eisen kommen. Freies Eisen generiert über die Fenton-Reaktion freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies, die ihrerseits in der Lage sind, biologische Moleküle sowie Zellstrukturen zu schädigen. Der Organismus verfügt über Mechanismen um diese Schäden zu verhindern bzw. den Ausmaß der Schäden zu begrenzen, die als antioxidativen Abwehrmechanismen bezeichnet werden. In dieser vorliegenden Arbeit wurden Blutproben von 22 Patienten mit ß-Thalassämia major und 16 Patienten mit Sichelzellanämie Patienten untersucht. Bei ihnen wurde das Vorliegen der pathologischen Modellsituation einer Eisenüberladung angenommen. Als Kontrollgruppe wurden 16 phänotypisch gesunde Geschwister der beiden Patientenkollektive herangezogen. Hauptziele dieser Arbeit war, die Bleomycin-Methode im Stoffwechsellabor des Zentrums für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität zu etablieren und dabei die folgenden Fragen zu klären: 1. Entsteht freies Eisen bei polytransfundierten Patienten? 2. Ist die Bleomycin-Assay zur Bestimmung des freien Eisens geeignet? 3. Welche Zusammenhänge bestehen zwischen den Parametern des Eisenstoffwechsels und können diese zur Abschätzung des freien Eisens genutzt werden? Freies Eisen entsteht dann, wenn die Eisenbindungskapazität des Transferrins überschritten wird. Bei gesunden Menschen liegt eine Transferrinsättigung im Durchschnitt bei unter 30%. Es ist also eine wertvolle Reserve vorhanden, um effektiv die Enstehung des freien Eisens zu verhindern. Bei bestimmten pathologischen Situationen, wie sie auch bei polytransfundierten Patienten bei Thalassämie vorliegen, wird dem Körper massiv Eisen zugeführt. Wir konnten bei 18 von 22 Patienten in der Thalassämiegruppe freies Eisen nachweisen. Der Median der freien Eisenkonzentration lag bei 1,25 μmol/l bei einer Spannbreite von 5,3μmol/l. In der Sichelzellanämiegruppe konnte nur bei einem Patienten freies Eisen nachgewiesen werden. Dieser hatte ebenfalls häufig Bluttransfusionen erhalten. Zur Messung des freien Eisens wurde die Bleomycin Methode nach Gutteridge et al angewandt. Es ist eine nasschemische Methode (Messung erfolgt via Spektroskopie) und erfordert keinen hohen technischen Aufwand. Da bei der Bestimmung des freien Eisens im mikromolaren Bereich geschieht, ist das Hauptproblem die Kontamination der Reagenzien durch das ubiquitär vorkommende Eisen. Durch höchste Sorgfalt und genaues Arbeiten im staubfreien Milieu und Behandlung der Reagenzien mit einem geeigneten Eisenkomplexbildner, wie z.B. Chelex100®, ist dieses Problem beherrschbar. Dennoch erfordert die Methode einen enormen Zeitaufwand, weshalb nach Parametern gesucht wurde, die zur Abschätzung oder zur Vorselektion der geeigneten Blutproben zur Bestimmung des freien Eisens herangezogen werden können. Wie oben schon erwähnt, hatten 18 von 22 Thalassämiepatienten freies Eisen im Blut. Davon hatten 15 eine Transferrinsättigung über 100% und 2 knapp unter 100%. Lediglich ein Patient, bei dem aber auch nur freies Eisen von 0,05 μmol/l gemessen wurde, hatte eine Transferrinsättigung deutlich unter 100%. Ein Patient aus der Sichelzellanämiegruppe, bei dem auch freies Eisen gemessen wurde, hatte ebenfalls eine Transferrinsättigung über 100%. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass eine hoch signifikante positive Korrelation zwischen dem freien Eisen und der Transferrinsättigung festegestellt wurde (r = 0,63, p = 0,002). 95% der Patienten, die freies Eisen im Blut hatten, wiesen auch Transferrinsättigungswerte über bzw. knapp unter 100% auf. Es besteht auch ein statistisch signifikanter positiver Zusammenhang zwischen der Serumeisenkonzentration und freiem Eisen. Alle Patienten mit freiem Eisen im Blut hatten Serumeisenwerte über 170 μg/dl. Damit konnte die Arbeitshypothese bestätigt werden, dass es bei polytransfundierten Thalassämiepatienten zu einer Eisenüberladung mit in der Folge entstehendem freiem Eisen kommt; bekannterweise induziert zweiwertiges Eisen die Fenton-Reaktion bzw. Haber-Weiss-Reaktion und damit oxidativen Stress. Bei Sichelzellanämiepatienten , die keine regelmäßigen Hochregimebluttransfusionen erhalten, die ebenso, wie in der Literatur beschrieben, oxidativem Stress ausgesetzt sind, müssen auch andere Pathomechanismen angenommen werden.
Die Brustdrüse (glandula mammaris) bietet ein einzigartiges Modellsystem zum Studium der adulten Stammzellen und der molekularen Signalwege, welche die Selbsterneuerung dieserZellen sowie die Proliferation und Differenzierung der Vorläuferzellen kontrollieren. Die Brustdrüse besteht aus dem Brustepithel und dem Stroma, das zum größten Teil aus dem Fettgewebe gebaut ist. Es enthält auch andere Zelltypen z. B. Fibroblasten und Makrophagen. Die Entwicklung der Brustdrüse findet hauptsächlich nach der Geburt, während der Pubertät, Schwangerschaft und Laktation statt. Ein funktionelles Brustepithel wird während der aufeinander folgenden Zyklen von Schwangerschaft, Laktation und Abstillen auf- und wieder abgebaut. Diese Regenerations-Kapazität kann für die Organrekonstitution genutzt werden. Die Transplantation der kleinen Anzahl von Brustepithelzellen oder des Drüsenfragments in das Fettgewebe einer Empfängermaus, deren eigenes Brustepithel entfernt wurde (cleared fat pad), führt zur vollständigen Epithelregeneration. Die zyklische Entwicklung und Regenerations-Fähigkeit des Epithelgewebes lässt auf die Existenz von Stammzellen schließen, die im Verbund der Epithelzellen überdauern. Diese gewebespezifischen Stammzellen sind in der Lage sich durch asymmetrische Zellteilung zu erneuern (self-renewal) und gleichzeitig die differenzierenden Vorläuferzellen zu bilden. Die während der Pubertät und Schwangerschaft erhöhten systemischen Hormone, lokalen Wachstumsfaktoren und Zytokine kontrollieren die Stammzellen-Proliferation und die Differenzierung der Vorläuferzellen in den verschiedenen Brustepithel-Zelllinien: Myoepithel-, Luminal- und Alveolarzellen. Aufgrund der Tatsache, dass die Entstehung von Brustkrebs mit aberranten Proliferations- und Differenzierungsprogrammen in malignanten Stamm-/ Vorläuferzellen (cancer stem cells) einhergeht, ist die Identifizierung der Signalwege, die diese Prozesse regulieren, für die Stammzellen- und Krebs-Forschung sehr bedeutend. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden im Rahmen des vorliegenden Projektes die Methoden zur genetischen Manipulation von nicht-angereicherten Brustdrüsen-Stammzellen entwickelt. Durch effiziente lentivirale Transduktion von adhärenten Primärzellen wurden nahezu 90% der Zellen, einschließlich der Stammzellen, transduziert. Diese Optimierung erfolgte durch 1) die Anwendung von konzentrierten Lentiviren mit hoher Qualität, 2) Passagierung der Primärzellen und Entfernung von Gewebeklumpen von den VIII Primärzellkulturen, und besonders 3) durch die Reduzierung der Zelldichte während der viralen Transduktion. Für Brust-Stammzellen sind keine spezifischen Oberflächen-Marker bekannt und daher ist ihre Isolierung deutlich erschwert. Man konnte sie bis jetzt nur anhand der moderaten Expression von CD24 (hitzestabilen Antigen) und hoher Expression von CD49f oder CD29 (α6- oder β1-Integrin) ungefähr 10-fach anreichern. Allerdings haben andere Studien gezeigt, dass die Transplantation der FACS-sortierten Stammzellen zu einer Schädigung der Stammzellen und folglich zu einer Reduktion der Repopulation-Frequenz führen kann. Aus diesem Grund wurden die genetisch modifizierten Stammzellen nicht sortiert. Durch die Transplantationen der transduzierten Primärzellen wurde ihr Stammzellen-Anteil in ihrer natürlichen Nische (cleared fat pad) selektiert. Die transplantierten Stammzellen sind in der Lage duktale Auswüchse zu entwickeln. Mit dieser Strategie konnten Transplantate mit homogener Expression von Fluoreszenz-Markergenen, wie z. B. GFP, erzielt werden. FACS Analysen der Zellen, die aus Transplantaten isoliert werden, haben gezeigt, dass alle drei Brustepithelzell-Populationen, nämlich Luminal-, Basal- und Stammzellen, transduziert waren und GFP exprimierten und daher aus transduzierten Zellen hervor gingen. Die Transplantationen einer Mischung der unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Stammzellen ergaben einzelne verzweigte Auswüchse, in denen jeweils nur ein Fluoreszenz-Markerprotein exprimiert wurde. Sie stammen sehr wahrscheinlich von einzelnen transduzierten Stammzellen ab und wachsen jeweils in einem begrenzten Bereich des Brustfettgewebes aus. Die Immun-Antwort der Empfängermäuse gegen Fluoreszenz- Markerproteine könnte das Auswachsen der Transplantate inhibieren. Brustepithelium-Rekonstitutionen waren daher in den Rag2-/-γc-/- Empfängermäusen mit geschwächtem Immunsystem besonders effiziert. Die lentivirale Manipulation von Stammzellen und deren Einsatz in Brustepithelium-Rekonstitutionen kann als alternative Methode zur gewebsspezifischen Knockout-Technik angesehen werden. Für die Etablierung dieser Methode wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zentraler Transkriptionsfaktor in der Brustentwicklung, signal transducer and activator of transcription 5 (Stat5), untersucht. (...)
Bioaktive Sphingolipide spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation vieler entscheidender Prozesse in Endothelzellen. Speziell dem S1P wird eine Schlüsselfunktion in der Regulation der Proliferation und Migration von Endothelzellen beigemessen. Diese Prozesse sind notwendige Teilschritte in der Angiogenese, welche eine wichtige biologische und medizinische Bedeutung hat. So ist die umorangiogenese eine Voraussetzung für die adäquate Versorgung des Tumors mit Sauerstoff und Nährstoffen und trägt des Weiteren zu dessen Aggressivität bei. Ein weiteres Merkmal vieler solider Tumoren ist das Vorkommen hypoxischer Bereiche und erhöhter NO-Spiegel, die zudem, je nach Konzentration, als proangiogene Faktoren wirken können. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung des Einflusses hypoxischer Bedingungen und des Signalmoleküls NO auf das Sphingolipidgleichgewicht in der humanen Endothelzelllinie EA.hy 926. Ein spezieller Fokus wurde dabei auf die Regulation der S1P synthetisierenden Sphingosinkinasen (SK) und der daraus resultierenden Beeinflussung angiogener Zellantworten gelegt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl Hypoxie als auch NO die Aktivität der SK-1, jedoch nicht der SK-2, langanhaltend erhöhten. Dieser Aktivitätsanstieg wurde durch eine Aktivierung des SK-1-Promotors mit einer nachfolgenden verstärkten mRNA- und Proteinexpression vermittelt. Dabei war unter Hypoxie der Transkriptionsfaktor HIF-1α der entscheidende SK-1 regulierende Faktor. Zusätzlich führte die durch Hypoxie ausgelöste Hochregulation der SK-1 zu einem Anstieg der zellulären S1P-Spiegel und zu einer Reduktion der Sphingosinkonzentration. Mechanistische Untersuchungen des Effekts von NO auf die SK-1 zeigten, dass dieser unabhängig von erhöhten cGMP-Konzentrationen aufgrund einer Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) durch NO war. Zum einen hatte die Verwendung des cGMP-Analogons 8-Bromo-cGMP und des Aktivators der sGC YC-1 keinen Einfluss auf die SK-1-Proteinexpression, und zum anderen hatte die Kostimulation mit dem sGC-Inhibitor ODQ keinen hemmenden Effekt auf die durch NO ausgelöste Hochregulation der SK-1. Demgegenüber ist die klassische MAPK-Kaskade essenziell für die Wirkung von NO auf die SK-1, da der MEK-Inhibitor U0126 die erhöhte Proteinexpression der SK-1 verhindern konnte. Die Aktivierung des vorgeschalteten kleinen GTP-bindenden Proteins p21ras ist ein möglicher Mechanismus, über den NO die Aktivierung der MAPKKaskade verursachen könnte (Lander et al, 1995). In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die funktionelle Konsequenz einer Regulation der SK-1 durch Hypoxie und NO in EA.hy 926 Zellen untersucht. Sowohl Hypoxie als auch NO wurden als pro-angiogene Faktoren beschrieben. Daher wurde anhand von Migrationsassays und in-vitro-Angiogeneseassays untersucht, ob die SK-1 bei diesen Zellantworten eine Rolle spielt. Die Depletion der SK-1 durch die Verwendung einer spezifischen siRNA oder mit Hilfe von lentiviralen shRNA-Konstrukten zeigte, dass die Hochregulation der SK-1 unter Hypoxie und NO essenziell für die erhöhte Migration der Endothelzellen ist. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass hypoxische Bedingungen und NO zu einer Hochregulation der SK-1 in EA.hy 926 Zellen führten und eine erhöhte Migrationsrate dieser Zellen zur Folge hatten. Somit ist die SK-1 ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer pathologischen Angiogenese einhergehen, wie es im Tumorgeschehen der Fall ist.
Benzodiazepine stehen in den Medikamentenmissbrauchslisten an erster Stelle und sind deswegen auch von Interesse in der Kriminalistik. Grundlage der vorliegenden Arbeit war die Analyse sämtlicher Benzodiazepin-Fälle, die in den Jahren 1998 bis 2003 im Institut für Forensische Toxikologie, Zentrum der Rechtsmedizin der Johann Wolfgang Goethe Universität in Frankfurt am Main untersucht wurden. Zur Auswertung kamen insgesamt 2695 Fälle, wobei das Hauptaugenmerk auf die 410 Personen gelegt wurde, bei denen Flunitrazepam nachgewiesen werden konnte. Anhand der gesammelten Daten war es möglich, Flunitrazepam unter verschiedenen Gesichtspunkten zu betrachten: 1. Welche Bedeutung hat Flunitrazepam in der Gruppe der Benzodiazepine und kann man im Laufe der Jahre Änderungen im Konsummuster feststellen? 2. Wie ist die Geschlechtsverteilung? 3. Gibt es im Untersuchungszeitraum monokausale Flunitrazepam – Todesfälle? 4. Lassen sich anhand des Vergleichs zwischen Flunitrazepam und Diazepam Unterschiede im Beigebrauch feststellen? 5. Lassen sich anhand des Vergleichs zwischen Flunitrazepam und Benzodiazepinen-Gesamt Unterschiede in der Deliktart feststellen? 6. Gibt es einen Zusammenhang zwischen Konzentration und Deliktart? 7. Welche Bedeutung hat Flunitrazepam in der Drogenszene? Die Auswertung der Daten erbrachte folgende Resultate: 1. Der Pharmakonzern Hofmann La-Roche führte an seinem Produkt Rohypnol® einige Veränderungen durch, um den zunehmenden Missbrauch zu verhindern. 1994 wurde die Darreichungsform von 2 mg auf 1 mg reduziert und 1998 wurde der Farbstoff Indigocarmin hinzugefügt. Von Interesse bei der Analyse der Daten war, ob sich diese Änderungen auf den Konsum von Flunitrazepam auswirkten. Aus diesem Grund wurde zusätzlich noch eine Auswertung über die Benzodiazepinverteilung der Jahre 1993 bis 1997, in denen insgesamt 1630 Benzodiazepin-Fälle registriert wurden, durchgeführt. Bei der Analyse der Benzodiazepinverteilung konnte in den Jahren 1993 bis 1997 und 1998 bis 2003 ein ständiger Zuwachs der Gesamtbenzodiazepin-Fälle festgestellt werden. Dieser Zuwachs ist auf den Anstieg der Untersuchungszahlen im Institut zurückzuführen. Jedoch ließen sich bei den Flunitrazepam-Fällen, gerade in den Jahren 1994 und 1998, Abweichungen im Konsumverlauf feststellen, welche auf die Veränderungen des Pharmakonzerns zurückzuführen sein könnten. Bei den Fragebögen, die mit 15 Schwerstabhängigen aus der Frankfurter Drogenszene durchgeführt wurden, kam es zu folgenden Ergebnissen: nach 1994 wurde der Konsum erhöht, nach 1998 gab es bei den meisten entweder gar keine Veränderung oder die Tabletten wurden anfangs vermehrt oral konsumiert. 2. Aufgrund der Kriminalitätsrate mit überwiegend männlicher Beteiligung lag der Frauenanteil der erfassten Personen bei nur etwa 1/5 (Benzodiazepine-Gesamt: 21,8%, Flunitrazepam: 15,9%). 3. Während des Untersuchungszeitraums konnten keine „reinen“ Flunitrazepam –Todesfälle festgestellt werden. 4. Im Vergleich der Cobefunde waren die Substanzen THC, Morphin, Codein und Methadon in der Diazepam-Gruppe häufiger anzutreffen als in der Flunitrazepam-Gruppe. Lediglich Kokain wurde in der Flunitrazepam-Gruppe vermehrt konsumiert. 5. Als führende Deliktart konnten in der Flunitrazepam-Gruppe die Eigentumsdelikte ermittelt werden. In der Benzodiazepin-Gruppe kam es am häufigsten zu Verkehrsdelikten. 6. Die höchsten Flunitrazepam - Konzentrationen im Blut wurden ebenfalls bei den Eigentumsdelikten gefunden. 7. Aufgrund seiner stärkeren euphorisierenden und hypnotischen Wirksamkeit steht Flunitrazepam in der Frankfurter Drogenszene an erster Stelle unter den Benzodiazepinen. Das Erleben eines Rauschzustandes als Euphorie, als ein unendliches und allumfassendes Glücksgefühl, ist ein - vorrangig bei uns Menschen - bestehendes Phänomen. Den Drang dieses Gefühl zu erleben und beizubehalten gab es seit jeher und wird es auch immer geben werden. Übermäßiges Verlangen und das Nachgeben dieses Impulses führen zu Abhängigkeit und Sucht. Die aus diesem Zustand resultierenden sozialen Auswirkungen äußern sich in Dissozialität und Kriminalität. „Ein süchtig gewordener hat nur eine fixe Idee: das Gift! Seine Sucht treibt ihn zur Unehrlichkeit und zu Verbrechen“ (Georg Siegmund, 1962). Sucht und Abhängigkeit sind Tatsachen die sich nicht verleugnen lassen. Um den Missbrauch eines Medikamentes verhindern zu können, genügt es nicht, nur seine Form zu verändern, es bedarf vielmehr einer umfangreicheren Aufklärung und einer generell bewussteren Umgangsweise mit potentiell suchterzeugenden Substanzen.
Die genetische Information innerhalb einer Zelle kodiert nicht nur die spezifische Struktur und Funktion von Proteinen, sondern auch die Entstehung dieser Struktur durch den Prozess der Proteinfaltung. Aus zahlreichen experimentellen und theoretischen Studien wurde offensichtlich, dass Faltung und Entfaltung von Proteinen in vielen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielt. Diese Beobachtungen führten zu der zwangsläufigen Erkenntnis, dass das Unvermögen von Proteinen sich korrekt zu falten oder korrekt gefaltet zu bleiben der Auslöser für viele verschiedene Arten biologischen Fehlverhaltens ist und infolgedessen unterschiedliche Krankheitsformen mit sich bringt. Die strukturelle und dynamische Charakterisierung von nicht-nativen Proteinzuständen ist daher eine wichtige Grundlage einerseits zur Erforschung der krankheitsauslösenden Prozesse, andererseits aber auch zum generellen Verständnis der Proteinfaltung an sich. Allein hochauflösende NMR-Experimente können detaillierte Informationen über Struktur und Dynamiken solcher Zustände auf atomarer Ebene liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde die C-terminale Domäne des humanen Prionenproteins [hPrP(121-230)] unter Bedingungen untersucht, bei denen dieses Protein permanent in einem nicht-nativen Zustand vorliegt. Dies wurde durch die Verwendung einer hochmolaren Harnstofflösung (8 M, pH 2,0) erreicht. Zur Untersuchung dieses nicht-nativen Zustands mittels NMR wurde das PrP(121-230) in E.coli-Zellen isotopenmarkiert exprimiert und in Mengen von einigen Milligramm aufgereinigt. Nach der sequentiellen Zuordnung der 13Ca-, 13Cb-, 13CO-, 1Ha- und 1HN-Resonanzen konnte aus den sekundären chemischen Verschiebungen auf Regionen innerhalb der Polypeptidkette geschlossen werden, die erhöhte b-faltblattartige Konformationsanteile enthalten. Heteronukleare Relaxa-tionsraten wurden zur Untersuchung der konformationellen Dynamik herangezogen. Auch hier konnten Regionen verminderter Mobilität (hydrophobe Cluster) nachgewiesen werden, die mit den zuvor entdeckten Bereichen aus der Analyse der chemischen Verschiebungen übereinstimmten. Die Messung von R1r-Relaxationsraten erbrachte zudem keine Hinweise auf konformationellen Austausch auf der μs-ms-Zeitskala. Weiterhin wurde der Einfluss der Disulfidbrücke auf Konformation und Dynamik des hPrP(121-230) untersucht. Dies wurde durch die Reduktion der Disulfidbrücke und die anschließende Methylierung der beiden Cysteine erreicht. Im Gegensatz zu der Analyse der chemischen Verschiebungen zeigte die Auswertung der konformationellen Dynamiken dramatische Unterschiede zwischen den oxidierten und reduzierten Zuständen des hPrP(121-230). Insbesondere im Bereich um die beiden Cysteine konnten große Unterschiede festgestellt werden; im reduzierten Zustand führte die zusätzliche Bewegungsfreiheit zu erhöhten Dynamiken und gab den Blick auf zusätzliche hydrophobe Bereiche frei, die im oxidierten Zustand durch hohe Relaxationsraten verdeckt geblieben waren. Ein weiterer wesentlicher Unterschied zwischen dem oxidierten und dem reduzierten Zustand des hPrP(121-230), der mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes Thioflavin T beschrieben werden konnte, bestand in der Fähigkeit Fibrillen auszubilden; während das oxidierte hPrP diese Eigenschaft besaß, führte der Verlust der intakten Disulfidbrücke zu einer Proteinkonformation, die nicht mehr zur Bildung von fibrillären Strukturen im Stande war. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die strukturellen, dynamischen und kinetischen Charakteristika des hPrP(121-230) mit denen des murinen Prionenproteins mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand verglichen. Auf der Basis der chemischen Verschiebungen und der heteronuklearen Relaxationsdaten konnte gezeigt werden, dass beide Proteine in den jeweiligen komplementären Zuständen (oxidiert bzw. reduziert) sehr ähnliche strukturelle und dynamische Eigenschaften besitzen. Aufgrund einiger Aminosäureaustausche in den beiden Proteinsequenzen kommt es jedoch zu kleineren Unterschieden, die jedoch nur in lokalen Bereichen der Polypeptidkette zum Tragen kommen. Somit konnte gezeigt werden, dass das mPrP(121-232) als ein geeignetes Modellsystem für das humane Prionenprotein dienen kann. Abschließend wurde der Einfluss von insgesamt zwölf verschiedenen Punktmutationen, die beim Menschen mit Prionenerkrankungen assoziiert sind, auf das Aggregationsverhalten des mPrP(121-232) untersucht. Dabei fiel zum einen auf, dass die Aggregation mit zunehmender Proteinkonzentration schneller verlief, zum anderen aber auch, dass es insbesondere bei geringen Proteinkonzentrationen zu signifikanten Unterschieden in der Aggregationsgeschwindigkeit der verschiedenen mutierten Proteinkonstrukte kommt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in dieser Arbeit strukturelle und dynamische Eigenschaften der nicht-nativen Zustände von hPrP(121-230) und mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand durch die Verwendung von NMRspektroskopischen Experimenten charakterisiert werden konnten. Zudem konnte mit Hilfe von Fluoreszenzspektroskopie das Aggregationsverhalten der einzelnen Proteinzustände beschrieben und in einem ersten Schritt der Einfluss von verschiedenen Punktmutationen auf die Aggregationsgeschwindigkeit ermittelt werden.
Vorarbeiten hatten eine Interaktion zwischen KCNQ1 und KCNH2 gezeigt. Die vorliegende Arbeit zielte darauf, den Mechanismus der Interaktion mittels elektrophysiologischer und pharmakologischer Methoden zu ermitteln. Die in dieser Arbeit vorgelegten Resultate schließen eine Bildung von Hetero-Tetrameren zwischen KCNH2 und KCNQ1 α-Untereinheiten weitgehend aus. Der Effekt von KCNQ1 auf KCNH2 vermittelte Ionenströme scheint mehr als nur eine Addition von KCNQ1 Strom darzustellen. Diese Ergebnisse könnten Relevanz für physiologische und pathologische Zustände aufweisen.
Die allogene Stammzelltransplantation (SZT) nach Hochdosischemotherapie ist oft die einzige Therapieoption für pädiatrische Patienten, die an einer Hochrisikoleukämie erkrankt sind. Bei Patienten mit einer sehr schlechten Prognose und ohne Aussicht auf einen passenden Spender werden auch haploidente SZT durchgeführt, bei der meist die Eltern als Spender dienen. Aufgrund der HLA-(Human Leukocyte Antigen) Inkompatibilität zwischen Spender und Empfänger birgt die haploidente SZT jedoch einerseits das hohe Risiko einer Abstoßung des Transplantats sowie andererseits die Gefahr einer lebensbedrohlichen Spender-gegen-Wirt Reaktion (Graft-versus-Host Disease, GvHD). Das Risiko für die Entstehung einer GvHD kann durch die selektive Anreicherung von CD34 positiven Stammzellen deutlich verringert werden. Dabei werden unter anderem immunkompetente T-Zellen entfernt, die maßgeblich an der Entstehung einer GvHD beteiligt sind. Diese Zellen spielen aber auch bei der Immunrekonstitution und der Reaktivität gegen residuale leukämische Blasten (Graft-versus-Leukemia (GvL) Effekt) nach SZT eine wichtige Rolle. Aufgrund dessen ist die SZT mit CD34-selektionierten Präparaten häufig mit schweren Infektionen und einer erhöhten Rezidivrate verbunden. Des Weiteren wächst das Transplantat deutlich schlechter an. Immuntherapeutische Ansätze mit Spenderlymphozyten-Infusionen (Donor Lymphocyte Infusion - DLI) können das Anwachsen des Transplantates und den GvL-Effekt fördern, steigern jedoch gleichzeitig das Risiko einer GvHD. Um die Entstehung einer GvHD zu kontrollieren, ohne dabei auf den Nutzen einer DLI verzichten zu müssen, wurde bereits vor über 10 Jahren ein aussichtsreicher Ansatz entwickelt. Hierbei werden Spender-T-Zellen vor der Infusion in den Patienten genetisch so modifiziert, dass sie ein Selbstmordgen („suicide gene“) exprimieren. Im Falle einer aufkeimenden GvHD ermöglicht die Aktivierung des Suizidmechanismus eine gezielte Eliminierung der alloreaktiven Spender-T-Zellen. Das zurzeit am häufigsten verwendete Selbstmordgen leitet sich von der Thymidinkinase (TK) des Herpes Simplex Virus (HSV) ab. In einer Reihe von klinischen Studien mit erwachsenen Patienten konnte nach allogener SZT die prinzipielle Wirksamkeit dieses Sicherheitskonzeptes bereits gezeigt werden. Im Verlauf der klinischen Anwendung wurde allerdings eine Reihe von Nachteilen festgestellt. So führte zum Beispiel die Immunogenität der HSV-TK in immunkompetenten Patienten zur Abstoßung der modifizierten T-Zellen. Des Weiteren zeigte sich eine mangelnde Effizienz hinsichtlich des Abtötens der T-Zellen. Außerdem ist die für die T-Zell-Eliminierung benötigte Menge an Ganciclovir (10 mg/kg Körpergewicht pro Tag) stammzelltoxisch, wodurch die Immunrekonstitution nach SZT deutlich vermindert sein kann. Ferner wurde beobachtet, dass die ex vivo modifizierten und expandierten T-Zellen in ihrer biologischen Funktionalität deutlich eingeschränkt waren. Um den immuntherapeutischen Ansatz der DLI vor allem hinsichtlich der Sicherheit weiter zu verbessern, wurden in den vergangenen Jahren verschiedene Suizidstrategien entwickelt und die Bedingungen der ex vivo Modifikation optimiert. Eine aussichtsreiche Suizidstrategie verwendet das B-Zell-Oberflächenantigen CD20 in Kombination mit einem bereits für die Klinik zugelassenen, monoklonalen anti-CD20 Antikörper (Rituximab). Im Gegensatz zu TK-modifizierten Zellen, deren Beseitigung in vivo mehrere Tage in Anspruch nimmt, können CD20 positive B-Zellen innerhalb weniger Stunden eliminiert werden. Der tatsächliche Wirkmechanismus von Rituximab in vivo ist bisher noch nicht vollständig aufgeklärt, allerdings konnte in vitro bereits gezeigt werden, dass die Eliminierung CD20 positiver Zellen mittels eines komplement-abhängigen (CDC) und/oder eines antikörperabhängigen Zelltodes (ADCC) erfolgt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Optimierung eines CD20-abhängigen Suizid-Vektorsystems für die effiziente Transduktion von primären T-Zellen und deren selektive Eliminierung mittels Rituximab. Dazu mussten verschiedene Teilziele erreicht werden: (1) Da nur genetisch modifizierte T-Zellen, die in vivo abgeschaltet werden können, infundiert werden dürfen, ist eine ex vivo Anreicherung der CD20 positiven Zellen zwingend erforderlich. Dementsprechend sollte untersucht werden, inwieweit sich CD20 als Oberflächenmarker für eine MACS- (Magnetic Associated Cell Sorting) basierte Aufreinigung eignet und gegebenenfalls alternative Ansätze geprüft werden. (2) Weiterführend sollte ein Transduktionsprotokoll etabliert werden, welches hohe Transduktionseffizienzen ermöglicht und die Funktionalität der genetisch modifizierten T-Zellen weitestgehend erhält. (3) Bezüglich der Wirksamkeit des CD20-Rituximab-Systems liegen bisher nur veröffentlichte in vitro Daten vor. Daher sollte die Effektivität des neu entwickelten Suizidsystems in einem GvHD-ähnlichen Mausmodell in vivo charakterisiert werden. Zu Beginn dieser Arbeit wurde ein gammaretroviraler Vektor verwendet, welcher die Wildtypsequenz des CD20 Gens unter der Kontrolle eines vom Myeloproliferativen Sarcoma Virus (MPSV) abgeleiteten LTR (long terminal repeat) exprimiert (M71CD20). Mit diesem Vektor konnten mit Hilfe einer 3-Plasmid-Transfektion von 293T-Zellen lediglich Virusüberstände mit einem sehr niedrigen Titer hergestellt werden (<1 x 105/ml). Demzufolge war es zwar möglich die humane T-Zelllinie HuT 78 durch eine RetroNectin-assistierte Transduktion genetisch zu modifizieren, primäre T-Zellen hingegen konnten gar nicht transduziert werden. Aufgrund der schwachen Expression von CD20 an der Zelloberfläche zeigten die transduzierten HuT 78 Zellen nur eine geringe Empfindlichkeit gegenüber der Rituximab-vermittelten Lyse. Unter Verwendung von humanem Serum als Komplementquelle konnte eine maximale Lyse von 20% erreicht werden. Zusätzlich war die immunomagnetische Aufreinigung der CD20 positiven Zellen mit Hilfe des anti-CD20 MACS Systems durch eine geringe Ausbeute (<1%) und einen niedrigen Reinheitsgrad (<90%) geprägt. Um die Suizidgenstrategie für eine potentielle klinische Anwendung weiterzuentwickeln, wurde eine Codon-Optimierung des CD20 Transgens vorgenommen (CD20op). Die Optimierung zielte darauf ab, selten verwendete Basentripletts (Codons) innerhalb der CD20 cDNA mit von Säugetierzellen häufig genutzten zu ersetzen und somit die Translationsrate zu steigern. Ferner wurde der GC-Gehalt auf 60% erhöht und einige RNA-Instabilitätsmotive entfernt, um die Stabilität der mRNA zu verbessern. Aufgrund dieser Optimierungen wurde ein 35-facher Anstieg des Virustiters beobachtet. Dies ermöglichte die Transduktion von HuT 78 Zellen mittels einer standardmäßig durchgeführten Zentrifugationsmethode. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass die Oberflächenexpression der Codon-optimierten CD20 Variante im Vergleich zur Wildtypsequenz um ein Dreifaches gesteigert werden konnte. Die verbesserte Oberflächenexpression erhöhte die Rituximab-vermittelte Lyse deutlich. In vitro konnten so bis zu 80% der transduzierten HuT 78 Zellen eliminiert werden. Die geringe Ausbeute der immunomagnetischen anti-CD20-Selektion konnte allerdings nicht verbessert werden. Weiterführend wurde daher im Rahmen dieser Arbeit der CD20op Vektor mit einem zweiten Oberflächenmarker kombiniert, um eine effiziente Anreicherung der genetisch modifizierten Zellen zu gewährleisten. Da im klinischen Maßstab bereits ein System zur Aufreinigung von Stammzellen über den Oberflächenmarker CD34 etabliert ist, wurde eine C-terminal verkürzte Variante des CD34 Moleküls (tCD34) als Selektionsmarker gewählt. Für eine optimale Koexpression von CD20op und tCD34 wurde eine Fusionskassette unter Verwendung des 2A-Elementes des Thosea asigna Virus generiert (T2A). Dieses Element ermöglicht die effiziente Expression beider Transgene von einem Vektor. Im Verlauf der Translation kommt es innerhalb des T2A-Elementes zu einem ribosomalen Sprung und folglich zur Generierung von zwei voneinander unabhängigen Proteinen. Mit dem neu klonierten bicistronischen Vektor M71CD20opT2AtCD34 konnten gute Virustiter im Bereich von 2,3 ± 0,9 x 106/ml erzielt werden. Dies ermöglichte die Transduktion von HuT 78 Zellen durch Zentrifugation. Mittels Durchflusszytometrie und protein-biochemischer Methoden konnte gezeigt werden, dass CD20op und tCD34 korrekt in der Zelllinie exprimiert wurden. Die Anreicherung von CD20op/tCD34 positiven HuT 78 Zellen mit Hilfe immunomagnetischer anti-CD34-Selektion resultierte in einer deutlich verbesserten Ausbeute; ebenso konnte eine Reinheit von über 98% erreicht werden. In vergleichenden Analysen wurde gezeigt, dass die CD20op/tCD34 transduzierten Zellen eine ähnliche Sensitivität gegenüber Rituximab aufwiesen wie Zellen, die mit dem monocistronischen M71CD20op Vektor transduziert wurden. Nachdem die Effizienz des bicistronischen Vektors in der humanen T-Zelllinie HuT 78 nachgewiesen werden konnte, wurden weiterführende Versuche mit humanen primären T-Zellen initiiert. Für die genetische Modifikation von primären T-Zellen mit gammaretroviralen Vektoren ist die Aktivierung und eine damit einhergehende Proliferation der T-Zellen zwingend erforderlich. Deswegen wurden zunächst die Aktivierungs- und Kulturbedingungen für eine optimale Transduktion der T-Zellen bestimmt. In dieser Arbeit wurden die T-Zellen ausschließlich mit anti-CD3/anti-CD28 Antikörpern stimuliert, die auf paramagnetischen Partikeln immobilisiert wurden und dadurch eine dreidimensionale Aktivierung ermöglichten. Diese Art der Stimulation wird bereits in klinischen Studien verwendet und sollte im Gegensatz zu löslichen Antikörpern die biologische Funktionalität der T-Zellen weitestgehend erhalten. Primäre T-Zellen wurden mittels RetroNectin-beschichteter Platten an zwei aufeinander folgenden Tagen transduziert, dabei konnte eine durchschnittliche Transduktionseffizienz von 65% erzielt werden. Die korrekte Expression von CD20op und tCD34 konnte, wie bereits für HuT 78 Zellen beschrieben, ebenfalls in primären T-Zellen nachgewiesen werden. Mittels immunomagnetischer anti-CD34 Selektion von CD20op/tCD34 positiven primären T-Zellen wurde eine sehr gute Anreicherung mit 98%iger Reinheit und einer Ausbeute von 45% erreicht. Unter Verwendung von humanen natürlichen Killerzellen konnte eine Sensitivität der genetisch modifizierten Zellen gegenüber Rituximab-vermittelter zellulärer Toxizität (ADCC) nachgewiesen werden. Da die Funktionalität der T-Zellen aufgrund der benötigten Aktivierung und der Expansion ex vivo beeinträchtigt sein kann, wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit die T-Zellen phänotypisch und funktionell genauer charakterisiert. Es konnte durchflusszytometrisch gezeigt werden, dass die Mehrheit der naiven T-Zellen aufgrund der anti-CD3/anti-CD28 Aktivierung einen „central memory“ Phänotyp erworben hatte, welcher durch die Expression des „Homing“-Oberflächenmarkers CD62L (L-Selectin) und den Verlust des Markers CD45RA gekennzeichnet war. Es ist bekannt, dass dieser T-Zell-Phänotyp ein hohes alloreaktives Potential sowie eine lange Lebensdauer in vivo aufweist. Da für eine effektive Immunantwort CD4 positive Helferzellen und CD8 positive zytotoxische T-Zellen essentiell sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Transduktionseffizienz in beiden Subpopulationen bestimmt. CD4 positive und CD8 positive T-Zellen ließen sich gleichermaßen gut transduzieren und es konnte demonstriert werden, dass ein physiologisches CD4/CD8 Verhältnis von 1-2 erhalten blieb. Im Vergleich dazu wurde in veröffentlichten Studien häufig eine verstärkte Transduktion von CD8 positiven T-Zellen verzeichnet, was zu einer Verschiebung des CD4/CD8 Verhältnisses und somit zu einer beeinträchtigten Immunantwort führte. Des Weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit in vergleichenden Analysen das alloreaktive Potential der genetisch modifizierten Zellen bestimmt. Zur Charakterisierung der Alloreaktivität wurde eine „Mixed Lymphocyte Reaction“ (MLR) verwendet. Hierfür wurden die T-Zellen mit CFSE (Carboxy-Fluorescein Succinimidyl Ester) gefärbt und mit bestrahlten, allogenen mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) kultiviert. Das Maß der Alloreaktivität ließ sich durch die Verringerung des CFSE Signals bestimmen. In einer Reihe von Experimenten konnte gezeigt werden, dass der prozentuale Anteil an alloreaktiven, transduzierten T-Zellen vergleichbar zu frisch isolierten T-Zellen war. Auch wenn ein geringeres Proliferationspotential der genetisch modifizierten T-Zellen festgestellt wurde, deutet dieses Ergebnis dennoch auf einen teilweisen Erhalt der T-Zell-Funktionalität hin. Im letzten Drittel der vorliegenden Arbeit wurde neben der Langzeitexpression von CD20op und tCD34 ebenfalls die Effizienz des CD20op-Rituximab-Systems in vivo untersucht. Hierfür wurde ein Rag-1 defizientes Mausmodell verwendet. Aufgrund der vorliegenden Lymphopenie ermöglichte dieses Modell ein gutes Anwachsen der Spenderlymphozyten. Reife murine T-Zellen wurden an zwei aufeinander folgenden Tagen mit dem gammaretroviralen Vektor M71CD20opT2AtCD34 transduziert und vor der Transplantation mittels immunomagnetischer anti-CD34 Selektion angereichert (Reinheit: 98%). Fünf Wochen nach Transplantation wurde ein Teil der Mäuse mit 150 μg Rituximab pro Maus i.v. behandelt, als Negativkontrolle wurde Mäusen ein monoklonaler anti-HER2/neu Antikörper (Herceptin) gespritzt, der in diesem Zusammenhang nicht relevant war. Das Behandlungsschema wurde in zwei darauf folgenden Wochen wiederholt. Jeweils zwei Tage nach der Antikörperinjektion wurde der Anteil an transduzierten Spenderzellen im peripheren Blut durchflusszytometrisch bestimmt. Bereits nach der ersten Rituximab-Injektion konnte eine 95%ige Depletion der genetisch modifizierten T-Zellen gezeigt werden. Die beiden nachfolgenden Injektionen beeinflussten den Anteil der modifizierten T-Zellen im peripheren Blut nur noch geringfügig. In Herceptin behandelten Mäusen blieb der Anteil an genetisch modifizierten Zellen konstant. Am Ende der Untersuchungen (Woche 17) wurde in Rituximab behandelten Mäusen nur noch ein minimaler Prozentsatz an modifizierten Zellen nachgewiesen, welche durch eine geringe Oberflächenexpression von CD20op und tCD34 charakterisiert waren. Abschließend konnte die effektive Eliminierung der T-Zellen aus der Milz und den Lymphknoten sowohl durchflusszytometrisch als auch per quantitativer PCR nachgewiesen werden. Die erfolgreiche Depletion der T-Zellen wurde im weiteren Verlauf der Arbeit durch eine Zeitkinetik nach Rituximab Gabe genauer untersucht. Bereits zwei Stunden nach der Injektion des Antikörpers konnte im peripheren Blut nur noch ein kleiner Anteil an genetisch modifizierten Zellen nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis entspricht Daten aus klinischen Studien mit Rituximab und verdeutlicht das Sicherheitspotential des CD20-Rituximab-Systems, geprägt durch eine schnelle und effiziente Eliminierung von reaktiven T-Zellen. Der adaptive Transfer von Spender T-Zellen führte in den Empfängertieren zur Entwicklung einer massiven Kolitis, die durch Gewichtsabnahme und Durchfall charakterisiert war. In dieser Arbeit konnte dies durch die Rituximab-vermittelte Eliminierung der reaktiven Zellen verhindert werden; Rituximab behandelte Mäuse zeigten keine Kolitissymptome, wohingegen Herceptin behandelte Tiere stetig an Gewicht verloren. Diese Gewichtsabnahme konnte zu einem späteren Zeitpunkt auch in der Herceptin Gruppe nach Behandlung mit Rituximab gestoppt werden. Außerdem wurde daraufhin in diesen Tieren eine schnelle Gewichtszunahme von bis 34% beobachtet. Die erfolgreiche Depletion der CD20op/tCD34 positiven T-Zellen stellte in den Rag-1 defizienten Empfängertieren vorübergehend erneut eine Lymphopenie her. Dabei kam es aber auch zur Expansion nichttransduzierter T-Zellen, welche mit einem Anteil von 2% im CD34-selektionierten T-Zell-Transplantat vertreten waren. Da diese T-Zellen nicht durch Rituximab eliminiert werden konnten, entwickelten die Empfängertiere unweigerlich Kolitissymptome. Mittels quantitativer PCR wurde anschließend nachgewiesen, dass es sich bei den in vivo expandierten Zellen zum Großteil um nicht-transduzierte T-Zellen handelte, da keine proviralen Integrationen nachgewiesen werden konnten. Das in dieser Arbeit verwendete Mausmodell lieferte wichtige Informationen hinsichtlich der Langzeitexpression der beiden Transgene sowie der Effizienz des CD20-Rituximab-Suizidsystems. Auch wenn die in dem verwendeten Modell induzierte Kolitis als Äquivalent einer GvHD angesehen werden kann, sollte die Effizienz des entwickelten Systems in einem klassischen bzw. haploidenten GvHD Modell verifiziert werden. Darauf aufbauend könnten dann prä-klinische Studien zur Effektivität und Sicherheit des optimierten Suizidansatzes initiiert werden. Zusammenfassend bietet das neue, in dieser Arbeit stufenweise optimierte CD20-Rituximab-System eine vielversprechende Alternative zu dem HSV-TK System. Im Hinblick auf die derzeitigen Entwicklungen bezüglich der Funktionalität der genetisch modifizierten Zellen und der schnellen Beseitigung durch Rituximab wäre die Weiterentwicklung des CD20op/tCD34 Ansatzes zur effektiven Kontrolle einer GvHD nach DLI im Rahmen einer allogenen Stammzelltransplantation wünschenswert.
Einleitung: Aufgrund von steigendem internationalen Reiseverkehr werden tropentypische Erkrankungen wie Malaria auch nach Deutschland importiert. Dadurch gewinnen Maßnahmen zur Vorbeugung und Behandlung der Malaria zunehmend an Bedeutung. Wir untersuchten, wie eine medikamentöse Malariaprophylaxe bei Reisen in Malariahochrisikogebiete (WHO Zone- C) von den Reisenden tatsächlich vertragen wurde, um Informationen über die Häufigkeiten und Gründe für prophylaxeassoziierte Nebenwirkungen zu erhalten und somit eine Verbesserung der Beratungen zu ermöglichen. Methoden: Mefloquin (Lariam®), Doxycyclin (Doxycyclin®), Chloroquin+Proguanil (Resochin®+Paludrine®) oder Atovaquon/Proguanil (Malarone®) wurden bei Reisenden im Alter von 18-80 Jahren (Durchschnittsalter 40 Jahre) zur Prophylaxe eingesetzt. Die Reisenden wurden im Zeitraum Mai 2001 bis September 2004 in der Impfambulanz des Instituts für Medizinische Virologie der Universität Frankfurt am Main beraten und retrospektiv mittels eines Fragenbogens zur individuellen Verträglichkeit befragt. Ergebnisse: Insgesamt wurden 850 Fragebögen ausgegeben, 483 konnten ausgewertet werden. Unter den Teilnehmern waren 248 (51,35%) weibliche und 215 (44,51%) männliche Teilnehmer. Lariam® erhielten 228 (47,20%) Teilnehmer, Malarone® 194 Personen (40,17%) Resochin®+Paludrine® verwendeten 32 (6,63%) Reisende, Doxycyclin® 29 Personen (6,00%). Die Anwender von Resochin®+Paludrine® hatten den geringsten Anteil an Nebenwirkungen (21,88 %), die Anwender von Doxycyclin® den höchsten Anteil (48,28%). Bei den Anwendern von Malarone® oder Lariam®, gaben 23,20% bzw. 37,28% Teilnehmer Nebenwirkungen an. Die höchste Compliance zeigten die Reisenden, die Malarone® (87,63%) einnahmen, die niedrigste Compliance die Anwender von Resochin®+Paludrine® (56,25%). Die Compliance unter Lariam® und Doxycylin® betrug 78,07% bzw 68,96%. Der Nebenwirkungsanteil war unter den weiblichen Reisenden (71,11%) gegenüber den männlichen Reisenden (26,67%) nur in der Gruppe, die Malarone® einnahm, erhöht. Die Mehrzahl aller Teilnehmer (n=320) nahm die Prophylaxe zu den Mahlzeiten ein. In allen Prophylaxegruppen war der Anteil an Nebenwirkungen bei mahlzeitenunabhängiger Einnahme (n=128) geringer mit Ausnahme der Untergruppe der männlichen Probanden, die Malarone® einnahmen. Hier lag der Anteil an Nebenwirkungen bei mahlzeitenabhängiger Einnahme bei 14,29%, bei mahlzeitenunabhängiger Einnahme bei 25%. Die Mehrheit der Teilnehmer nahm während der Einnahme der Prophylaxe Alkohol zu sich (n=361), dabei gaben die Anwender von Lariam® (36,97%) und Doxycyclin® (38,10%) seltener Nebenwirkungen an. Bei den alkoholabstinenten Teilnehmern (n=90) lag der Nebenwirkungsanteil bei Lariam® bei 40,82% und bei Doxycyclin® bei 66,67%. Bei Resochin®+Paludrine® fand sich kein Unterschied, bei Malarone® waren die Nebenwirkungen bei den alkoholabstinenten Teilnehmern geringer. Bei den weiblichen Teilnehmerinnen zeigte sich, dass die Teilnehmerinnen der Lariam® (36,59%) der Doxycyclin® (50,0%) und der Resochin®+Paludrine® (16,67%) Gruppe, die während der Einnahmezeit der Prophylaxe Alkohol zu sich genommen hatten, seltener Nebenwirkungen hatten. Bei Malarone® konnte kein bedeutender Abfall der Nebenwirkungshäufigkeit beobachtet werden (32,50% gegenüber 31,25%). Bei den alkoholabstinenten Teilnehmerinnen lag der Nebenwirkungsanteil bei Lariam® bei 45,83%, bei Resochin®+Paludrine® bei 50% und bei Doxycyclin® bei 75%. In der Doxycyclin®-Gruppe war der Anteil an Nebenwirkungen bei den Teilnehmern erhöht (77,75%), die das Auftreten von Nebenwirkungen vorab befürchtet hatten. Dies konnte in den anderen Prophylaxegruppen nicht beobachtet werden. In der Lariam®-Gruppe traten gastrointestinale Symptome, neurologisch-psychiatrische Nebenwirkungen (34,62%) sowie Beschwerden des Herz-Kreislaufsystemes (8,65%) auf. Die Anwender von Malarone® gaben gastrointestinale (35,71%) und neurologisch-psychiatrische Beschwerden (18,37%) sowie Kreislaufstörungen, ohne kardiale Symptome, an. Bei den Reisenden, die Resochin® +Paludrine® oder Doxycyclin® verwendeten, traten überwiegend gastrointestinale Beschwerden (28,57% bzw. 48%) auf. Neurologisch-psychiatrischen Symptome oder Beschwerden des Herzkreislaufsystemes wurden nicht genannt. Unter den Teilnehmern, die über psychiatrische Nebenwirkungen berichtet hatten, war der Anteil an weiblichen und männlichen Reisenden gleich. Insgesamt 16 Teilnehmer (3,29%), aus allen Prophylaxegruppen, erkrankten an Malaria. Reiseziel war stets das tropische Afrika. Bei den Anwendern von Lariam® traten sechs Erkrankungen (2,63%) auf, dabei wurden von vier Teilnehmern hatten die Prophylaxe korrekt duchgeführt. In den Gruppen mit Malarone®- oder Doxycyclin®-Prophylaxe berichtete jeweils ein Teilnehmer (0,51% bzw. 3,45%) bei korrekter Prophylaxe über eine Malariaerkrankung. Bei den Reisenden, die Resochin+Paludrine® verwendet hatten, traten in zwei Fällen (6,25%) Malariaerkrankungen auf. Ein Reisender hatte die Prophylaxe korrekt durchgeführt. Diskussion: Bei Reisen in Malariahochrisikogebiete, mit einer Aufenthaltsdauer von mindestens fünf Tagen, sind eine Expositions- und Chemoprophylaxe empfehlenswert. 31,47% unserer Probanden gaben Nebenwirkungen an, 2,07% der Teilnehmer erkrankten an Malaria. Die Auswahl der Chemoprophylaxe muss unter Berücksichtigung der individuellen Kontraindikationen sowie der jeweils vorherrschenden Resistenzsituationen in den Malariaendemiegebieten erfolgen. Wichtig ist dabei eine umfassende Information der Reisenden um die Akzeptanz zu steigern und die Eigenverantwortung zu stärken.
Die Behandlungsoptionen für Tumorerkrankungen haben sich in den letzten Jahren stetig weiter entwickelt und verbessert und dadurch teilweise zu einer längeren Überlebenszeit der Betroffenen geführt. Dennoch bleiben viele Erkrankte weiterhin ungeheilt. Diese Patienten benötigen eine palliative Behandlung, die vor allem ihre Lebensqualität in der verbleibenden Lebenszeit verbessert und ihnen - soweit realisierbar - ein Sterben zu Hause ermöglicht. In der hier vorliegenden Arbeit wurden retrospektiv 360 Akten von Patienten, die in der chirurgisch-onkologischen Ambulanz der Universitätsklinik behandelt wurden und die im Zeitraum von 1992-1998 verstarben, auf ihren Sterbeort und auf Faktoren, die einen Einfluss auf ein Versterben im häuslichen Umfeld möglich gemacht hatten, untersucht. Die überwiegende Anzahl der Patienten litt an Dickdarmtumoren (55%) und hepatozellulären Karzinomen (24,2%). 62,2% der Patienten waren Männer und 37,8% Frauen. Das Alter der Patienten lag im Mittel bei 61,7 Jahren. Die Betreuungszeit in der chirurgisch-onkologischen Ambulanz betrug im Mittel 12,5 Monate. Bei 82,5% der Patienten lagen Metastasen vor, 80% erhielten eine Chemotherapie an der Universitätsklinik Frankfurt. Der überwiegende Anteil der Patienten verstarb zu Hause (47,5%). 41,9% der Patienten verstarben in einer Klinik (weniger als für diese Zeit im Bundesmittel mit 47,1%), 4,4% in einem Hospiz oder Pflegeheim und bei 6,1% konnte der Sterbeort nicht aufgeklärt werden. An Faktoren, die einen Einfluss auf die Möglichkeit zu Hause zu versterben hatten, fanden sich: die familiäre Einbindung, die Schwere der Symptomlast und die Einbeziehung von Angehörigen. Es konnten deutliche Hinweise festgestellt werden, dass Überlastungssituationen von Angehörigen eine ambulante Betreuung deutlich erschwerten und z. B. zu überstürzten Klinikeinweisungen führen konnten. Patienten, die zu Hause verstarben, mussten nach Ende der Chemotherapie seltener stationäre Behandlungen in Anspruch nehmen (12,9%), bei den in einer Klinik Verstorbenen waren es 51,7%. Bei den zu Hause Verstorbenen standen Operationsindikationen und abdominelle Symptome im Vordergrund. Bei den in einer Klinik Verstorbenen fanden sich mehr Faktoren, die in einem Progress der Erkrankung begründet waren und in ambulant schwerer zu beherrschenden Symptomen wie Atemnot, Infektionen, Fieber und Bewusstseinsveränderungen. Nur in dieser Gruppe fanden sich Einweisungen im präfinalen Zustand, am ehesten bei unzureichender Versorgungslage. Pflegebedürftigkeit im Sinne einer bewilligten Pflegestufe fand sich bei 13,6% der zu Hause Verstorbenen und nur bei 2,5% der in einer Klinik Verstorbenen. Der Zeitraum zwischen Eintreten von Pflegebedürftigkeit und dem Versterben betrug in der Subgruppe zu Hause im Mittel 1,6 Monate, in der Subgruppe Klinik nur 0,5 Monate, so dass in der letzteren Gruppe kaum Handlungsspielräume für die Organisation einer angemessenen Betreuung bestanden. Bei 39,8% der zu Hause Verstorbenen wurden Angehörigengespräche geführt, teilweise auch tägliche Telefonate, bei den in einer Klinik Verstorbenen war dies nur zu 27,8% der Fall. Nur 5 Patienten aus dem Gesamtkollektiv, die zur Subgruppe „zu Hause“ gehören, wirkten lebensfroh und aktiv. Bei den meisten Patienten fanden sich Hinweise auf psychische Belastungen, am häufigsten in Form von depressiven Verstimmungen, gefolgt von Ängsten. Auch die Angehörigen wirkten sehr belastet, teilweise überfordert. Bei vielen Angehörigen zeigte sich im Zusammenhang mit Telefonaten im Rahmen der Recherche für diese Arbeit ein deutlicher Gesprächsbedarf noch Jahre nach dem Verlust und es fanden sich Anzeichen auf fortbestehende Trauer. Eine hohe Verfügbarkeit von Ärzten in Kontakten zu Patienten, Angehörigen und weiteren an der Behandlung beteiligten Gruppen kann wesentlich dazu beitragen, dass Patienten zu Hause versterben können. Herausforderungen für die weitere palliativmedizinische Entwicklung liegen insbesondere in den Bereichen Verbesserung der Lebensqualität, Symptomkontrolle, Einbeziehung der Angehörigen und kommunikative Kompetenzen. Es gilt psychische Belastungen bei den Patienten und ihren Angehörigen zu erkennen und frühzeitig z. B. psychotherapeutisch zu behandeln. Der Bedarf, Angehörige über den Tod des Betroffenen hinaus zu begleiten, ist bei weitem noch nicht gedeckt. Handlungsnotwendigkeit besteht auch darin, Formalia z. B. für die Anerkennung einer Pflegestufe an den sehr variablen Krankheitsverlauf von Krebskranken anzupassen, um frühzeitig Handlungsspielräume für alle Beteiligten zu schaffen. Die demographische Entwicklung mit einem Überwiegen an älteren, erfahrungsgemäß multimorbiden Menschen, bedeutet eine große gesellschaftliche und palliativmedizinische Herausforderung, um flächendeckend tragfähige soziale Netzwerke und palliativmedizinische Versorgungsmöglichkeiten zur Verfügung zu haben.
Riboswitche – Vorbilder für die Konstruktion synthetischer RNA Schalter Riboswitche sind natürliche RNA Regulatorelemente. Sie sind in den nicht kodierenden Regionen von messenger RNAs (mRNAs) lokalisiert und beeinflussen die Expression nachfolgender Gene. Riboswitche bestehen aus zwei Domänen. Die Binde- oder Aptamerdomäne bildet eine Bindetasche, die einen Liganden ohne die Hilfe zusätzlicher Faktoren hoch spezifisch und affin binden kann. Die zweite Domäne, die sogenannte Expressionsplattform, interpretiert den Bindestatus der Aptamerdomäne und beeinflusst die Expression der nachfolgenden Gene. Liganden sind meist kleine, organische Moleküle wie Nukleotide, Aminosäuren oder Vitamine. Riboswitche regulieren Gene, die für die Synthese oder Verwertung ihres jeweiligen Liganden in der Zelle von Bedeutung sind. Kontrolliert wird die Genexpression meist durch Transkriptionstermination oder durch Maskierung der ribosomalen Bindestelle (SD = Shine Dalgarno Sequenz). Auch Eukaryoten nutzen das Prinzip der direkten RNA-Ligand-Interaktion zur Genregulation, wenn gleich in geringerem Ausmaß. In Pilzen und Pflanzen wird durch Ligandenbindung alternatives Spleißen von prä-mRNAs induziert, was entweder zur mRNA Degradation durch alternative Polyadenylierung oder der Repression der Translation durch alternative Leserahmen (uORFs) führt. Charakteristisch für eine Regulation über Riboswitche ist die direkte Wechselwirkung des niedermolekularen Liganden mit der RNA. In trans kodierte Proteinfaktoren sind aufgrund dieser direkten Bindung nicht notwendig. Dies macht natürliche Riboswitche zu geeigneten Vorbildern für die Entwicklung künstlicher RNA Schalter. Synthetische Riboswitche Aptamere sind kleine, synthetisch hergestellte, einzelsträngige RNA oder DNA Moleküle, die hochaffin und sehr spezifisch ein Zielmolekül binden können. Man kann Aptamere gegen nahezu jedes Molekül der Wahl über einen Prozess der in vitro Selektion gewinnen (SELEX = systematic evolution of ligands by exponential enrichment). Eine Eigenschaft der meisten Aptamere ist, dass sie ihre endgültige Struktur erst in Gegenwart des spezifischen Liganden ausbilden („induced fit“). Dies kann ausgenutzt werden, um RNA Aptamere als regulatorische Elemente einzusetzen. Hierzu inseriert man Aptamere in nicht translatierte Regionen einer mRNA. In Abwesenheit des Liganden bildet sich die Struktur nur teilweise aus und interferiert nicht mit zellulären Funktionen. Erst im Komplex mit einem Liganden kommt es zur effizienten Beeinflussung der Genexpression. Inseriert man ein regulatorisch aktives Aptamer in den 5’ nicht translatierten Bereich (5’UTR) einer eukaryotischen mRNA, erlaubt das Aptamer in der nicht ligandengebundenen Form die Translation nachfolgender Gene. Erst der Aptamer-Ligand-Komplex interferiert mit der Translationsinitiation. Ist das Aptamer nahe der cap-Struktur positioniert, behindert es die initiale Bindung des Ribosoms an die mRNA. Bei einer weiter stromabwärts gelegenen Insertion interferiert es mit dem Scannen der kleinen ribosomalen Untereinheit nach dem Startcodon. Die beste Regulationseffizienz wird hierbei bei einer Insertion direkt vor dem Startcodon erreicht. Es zeigte sich jedoch, dass nur eine sehr geringe Anzahl an Aptameren in der Lage ist, als RNA Schalter aktiv zu sein. Dies führte dazu, dass bis heute nahezu alle Systeme entweder auf dem Theophyllin oder dem Tetrazyklin Aptamer basieren. Ziele dieser Arbeit In dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum nur wenige Aptamere regulatorisch aktiv sind und was diese von inaktiven Varianten unterscheidet. Dafür wurden ein Tetrazyklin und ein Neomycin Aptamer detailliert charakterisiert. Desweiteren wurden neue RNA-basierte Regulationssysteme aufgebaut und ihr regulatorischer Mechanismus analysiert. Innerhalb dieser Arbeit wurde dabei ein System zur aptamerabhängigen Regulation des prä-mRNA Spleißens in Hefe etabliert. Außerdem konnte das bekannte Translationssystem für die Regulation essentieller Gene in Hefe weiter entwickelt werden. Folgende Ergebnisse wurden in dieser Arbeit erhalten: 1.Das Tetrazyklin Aptamer – In vitro Charakterisierung eines synthetischen Riboswitches. Das Tetrazyklin Aptamer ist 69 Nukleotide lang. Es besteht aus drei Stämmen (P1, P2 und P3) sowie drei einzelsträngigen Bereichen (J1/2, J2/3 und die Schleife L3; siehe Abbildung 1, links). Die Domäne oberhalb von P2 ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und kann ausgetauscht werden. Die Stämme P1-P3 sind bereits vor Ligandenbindung ausgebildet. Tetrazyklin wird über die drei einzelsträngigen Bereiche gebunden (siehe Abbildung 1, rechts). Durch fluorimetrische und kalorimetrische Methoden wurde eine Bindekonstante von Tetrazyklin an das Aptamer von 770 pM ermittelt. Diese Affinität ist außergewöhnlich hoch. Vergleichbare Aptamere und natürliche Riboswitche binden niedermolekulare Liganden 10- bis 1000-fach schlechter. Wir konnten zeigen, dass hohe Affinität eine Grundvoraussetzung für die regulatorische Aktivität ist, da Aptamermutanten mit verschlechterten Bindekonstanten keine in vivo Aktivität mehr aufweisen sind (Seiten 19-29). Durch Größenausschlußchromatographie konnte gezeigt werden, dass das Tetrazyklin Aptamer durch Ligandenbindung keine größeren globalen Konformationsänderungen erfährt. Dies weist auf eine weitgehende Vorformung der Bindetasche bereits ohne Tetrazyklin hin. Bei Ligandenbindung nimmt das Aptamer eine pseudoknotenähnliche Tertiärstruktur an, welche wahrscheinlich für die inhibitorische Wirkung auf das Ribosom verantwortlich ist (Seiten 19-29). Im Laufe dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur des Aptamers im Komplex mit Tetrazyklin in der Arbeitsgruppe von A. R. Ferré-D’Amaré gelöst. Die Struktur zeigt, dass die Stämme P1 und P3 aufeinander gestapelt sind (Abbildung 1, rechts). Stamm P2 bildet die Verlängerung einer irregulären Helix, die aus den einzelsträngigen Bereichen J1/2 und J2/3 gebildet wird. Nukleotide der Schleife L3 interagieren mit dieser irregulären Helix und bilden mit ihr zusammen die Bindetasche für Tetrazyklin. Diese hochauflösende Struktur diente uns in weiteren Arbeiten als Ausgangspunkt für die detaillierte Charakterisierung von ligandeninduzierten Änderungen (siehe 6.). 2. Das Tetrazyklin Aptamer ist in der Lage, prä-mRNA Spleißen in Hefe zu inhibieren. Der Aptamer-Tetrazyklin-Komplex kann nicht nur mit der Translationsinitiation, sondern auch mit dem Spleißen der prä-mRNA in Hefe interferieren (Seiten 31-37). Dazu wurde ein Hefe-Intron in den Leserahmen von GFP inseriert. Nur bei korrektem prä-mRNA Spleißen wird die reife mRNA aus dem Kern transportiert und GFP exprimiert. Für eine RNA-basierte Regulation des Spleißens wurde die Konsensussequenz der 5’ Spleißstelle in den Stamm P1 des Tetrazyklin Aptamers integriert. Dieser ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und seine Sequenz daher variabel. Es konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von Tetrazyklin das Intron vom Spleißosom erkannt und entfernt wird. Die Expression des Gens ist dann möglich. Durch die Zugabe von Tetrazyklin wird das Spleißen inhibiert und GFP nicht länger exprimiert. Biochemische Strukturkartierungen der RNA in An- und Abwesenheit von Tetrazyklin zeigten, dass der Stamm P1 durch Ligandenbindung verfestigt wird. Die Ligandenbindung beeinflusst also nicht nur die Struktur der Bindetasche, sondern wird auch auf angrenzende Stammbereiche übermittelt. Durch Stabilisierung des Stammes P1 wird die 5’ Spleißstelle für das Spleißosom maskiert. Somit konnten wir den Mechanismus für die Aptamer basierte Regulation des prä-mRNA Spleißens aufklären. 3. Die Tetrazyklin Aptamer basierte Inhibition der Translationsinitiation ermöglicht die Regulation essentieller Gene in Hefe. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Insertion mehrerer Aptamerkopien in den 5’UTR zu einem effizienten Abschalten der Genexpression führt. Dies wurde genutzt, um ein neuartiges System für die konditionale Expression essentieller Gene in Hefe zu etablieren. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. K.-D. Entian wurden Insertionskassetten für eine PCR-basierte chromosomale Integration von Tetrazyklin Aptameren unter Kontrolle verschieden starker Promotoren konstruiert. Dafür wurden 1-3 Kopien des Tetrazyklin Aptamers unter Kontrolle des hoch exprimierenden TDH3-Promoters und des etwas schwächeren ADH1-Promoters gestellt. Außerdem wurde eines HA-tag angefügt, um die Genexpression mittels Westernblot verfolgen zu können. Zur Überprüfung der chromosomalen Insertion diente eine Kanamycin-Resistenz. Das neue System wurde erfolgreich an von fünf essentiellen Genen getestet. Es zeigte sich, dass die Zugabe von Tetrazyklin zu einem schnellen und effizienten Abschalten aller getesteten Gene führt. Die Vorteile dieses neuartigen konditionalen Genexpressionssystems in Hefe liegen in der einfachen Handhabung und der Unabhängigkeit vom verwendeten Stamm. Es müssen keine in transkodierten Proteinfaktoren coexprimiert werden. Durch dieses System konnte zum ersten Mal die Aptamer-basierte Regulation endogener, essentieller Gene gezeigt werden (Seiten 49-57). 4. Die Kombination von in vitro Selektion und in vivo Screening ermöglicht die Identifikation neuer regulatorisch aktiver Aptamere – ein Neomycin Riboswitch. Nur wenige in vitro selektierte Aptamere sind als synthetischer Riboswitch aktiv. In unserer Arbeitsgruppe wurde daher ein in vivo Screeningsystem zur Identifizierung neuer Aptamere in Hefe entwickelt. Eine Bibliothek in vitro selektierter Aptamere wurde hierzu in den 5’UTR des GFP Gens kloniert und die Aktivität einzelner Kandidaten durch Vergleich der Fluoreszenz in An- und Abwesenheit des Liganden überprüft. Wir verwendeten eine Bibliothek aus Neomycin-bindenden Aptameren und analysierten 5000 Hefeklone. Hierbei konnten zehn Sequenzen isoliert werden, die abhängig von Neomycin die Initiation der Translation inhibieren. Das 33 Nukleotid lange Aptamer N1 zeigt eine 7,5-fache Regulation und wurde näher charakterisiert. Es besteht aus einer internen asymmetrischen und einer terminalen Schleife, die durch zwei GC Basenpaare getrennt sind. Enzymatische Strukturkartierung und Mutationsanalyse zeigten, dass beide einzelsträngigen Bereiche für die Ligandenbindung wichtig sind. Der abschließende Stamm ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und hat geringen Einfluss auf die regulatorische Aktivität. N1 kann außerdem gegen andere Aminoglykosidantibiotika diskriminieren (Seiten 39-47). Interessanterweise sind die regulatorisch aktiven Aptamere in der in vitro selektierten Bibliothek stark unterrepräsentiert und konnten durch zufälliges Sequenzieren nicht identifiziert werden. Dieses Beispiel verdeutlicht eindrucksvoll die Notwendigkeit eines Screenings in vivo. 5. Regulatorisch aktive Neomycin Aptamere unterscheiden sich von inaktiven durch eine größere thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung. Durch weitere Mutationsanalysen von N1 konnte ein aktivitätsvermittelndes Element im Neomycin Riboswitch identifiziert werden. Dazu wurde entweder die terminale oder die interne asymmetrische Schleife mutiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Sequenz der terminalen Schleife nur einen modulierenden Einfluss auf die Aktivität hat, wobei die Asymmetrie der internen Schleife (aber nicht deren exakte Sequenz) ausschlaggebend für die regulatorische Aktivität ist. Für weitere Analysen wurde N1 mit fünf mutierten Varianten und dem inaktiven Neomycin bindenden Aptamer R23 verglichen. Alle sieben Aptamer haben eine ähnliche Sekundärstruktur und Ligandenaffinität, zeigen aber unterschiedliche Aktivität in vivo. Durch Bestimmung des Schmelzpunktes der verschiedenen Aptamere in An- und Abwesenheit von Neomycin zeigte sich, dass aktive Aptamere thermisch deutlich mehr durch Ligandenbindung stabilisiert werden als inaktive. Dabei ist die thermische Stabilität der Aptamer-Neomycin-Komplexe ähnlich. Jedoch ist die Stabilität ohne Ligand bei aktiven Aptameren gegenüber inaktiven Varianten deutlich erniedrigt. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in Zusammenarbeit mit Prof. J. Wöhnert konnte bestätigt werden, dass aktive Aptamere weniger stark vorgeformt sind als inaktive. Das in den Mutationsanalysen identifizierte Element nimmt nicht an der Ligandenbindung teil, sondern dient als Schalter, der den freien Zustand das Aptamers destabilisiert. Damit sorgt es für den großen Unterschied in der thermischen Stabilität des freien und des gebundenen Zustandes aktiver Aptamere. Dies zeigt, dass Unterschiede in der Stabilität die regulatorische Aktivität vermitteln (Seiten 73-102). Laufende Arbeiten sollen nun klären, ob thermische Stabilisierung durch Ligandenbindung ein allgemeingültiger Vermittler von regulatorischer Aktivität ist. Dazu werden weitere Aptamere überprüft, welche in Abwesenheit des Liganden unterschiedlich stark strukturiert sind und eventuell durch Ligandenbindung unterschiedlich stabilisiert werden. Außerdem werden wir testen, ob es die gewonnen Erkenntnisse erlauben, durch rationelles Design synthetische Riboswitche zu verbessern oder inaktive Aptamere in aktive zu verwandeln. 6. Was macht ein Aptamer zu einem regulatorisch aktiven Riboswitch? Für das Tetrazyklin Aptamer konnten wir zeigen, dass zum einen eine extrem hohe Bindekonstante und zum anderen eine hoch komplexe Bindetasche für die regulatorische Aktivität entscheidend sind. Dabei ist die Bindetasche in Abwesenheit des Liganden stark vorstrukturiert und erfährt keine globalen strukturellen Änderungen (Seiten 19-29). In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wachtveitl untersuchen wir den Einfluss von Bindekinetik und Lebensdauer des Aptamer-Tetrazyklin-Komplexes auf die regulatorische Aktivität. Dafür vergleichen wir das Tetrazyklin Aptamer mit drei regulatorisch inaktiven Mutanten. Für die Messungen nutzen wir die Eigenfluoreszenz des Tetrazyklins. Diese ist in wässriger Lösung geqenched und steigt bei Bindung an die RNA deutlich an. Erste Ergebnisse zeigen große Unterschiede zwischen den Aptameren in der Geschwindigkeit der Ligandenbindung. Außerdem zeigen sich geringe Unterschiede in der Lebensdauer der verschiedenen Komplexe. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert können die Veränderungen einzelner Basen bei Ligandenbindung untersucht werden. Hierbei zeigen erste Messungen am Tetrazyklin Aptamer, unterschiedliches Verhalten einzelner an der Bindung beteiligter Nukleotide. Eine detaillierte Aufklärung der ligandeninduzierten Veränderungen gewährt uns weitere Einblicke, warum das Tetrazyklin Aptamer als Riboswitch aktiv ist. Die regulatorische Aktivität Neomycin abhängiger Riboswitche wird durch thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung vermittelt. Dabei zeigte sich, dass durch Neomycin neue Basenpaare und Basenstapelungen entstehen. Durch weiterführende strukturelle Untersuchungen sollen nun ligandeninduzierte Veränderungen in N1 detailliert geklärt werden. Größere globale Änderungen konnten bereits durch EPR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. T. F. Prisner ausgeschlossen werden. Hierzu wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. J. W. Engels spinmarkierte Neomycin Aptamere hergestellt und die Abstände der Sonden in An- und Abwesenheit von Neomycin bestimmt. Es zeigte sich, dass sich der Abstand der Spinmarkierungen durch Zugabe von Neomycin (oder anderen Aminoglykosiden) nicht ändert (Seiten 59-72). Dies weist auf eher lokale Änderungen in der Bindetasche hin. Durch NMR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert werden im Moment die Strukturen verschiedener N1-Aminoglykosid-Komplexe gelöst. Dabei zeigt sich, dass in vivo aktive und inaktive Liganden eine ähnliche Struktur im Aptamer induzieren. Was die einzelnen Komplexe unterscheidet und damit die verschiedene Aktivität begründet ist Ziel der Analyse. Insgesamt konnte in dieser Arbeit ein Regulationssystem für die Aptamer-basierte Kontrolle des prä-mRNA Spleißens in Hefe entwickelt und das bestehende Translationssystem für die Applikation auf essentielle Gene angewendet werden. Außerdem wurden wichtige Punkte, warum Aptamere als Riboswitch funktionieren aufgeklärt. Damit legt diese Arbeit einen wertvollen Grundstein für die Weiterentwicklung RNA-basierter Genregulationselemente für die Anwendung in der synthetischen Biologie.
In der vorliegenden retrospektiven Studie wurde der Zusammenhang zwischen Knochenstoffwechsel und Frakturrate von Nierentransplantierten Patienten untersucht. Aus einem Patientenkollektiv von 1600 Patienten des Kuratoriums für Dialyse und Nierentransplantation Frankfurt am Main wurden 122 Patienten ausgewählt, die nach Dialyse und anschließender Nierentransplantation sich einer Knochendichtemessung unterzogen haben. Stattgefundene pathologisch zu wertende Frakturen wurden in Zusammenhang mit epidemiologischen Faktoren, Medikamenteneinnahme und Blutparametern gesetzt. Die statistische Auswertung erfolgte mit SPSS 13, wobei ein p< 0,05 als statistisch signifikant gewertet wurde. Die Daten wurden auf bis zu fünfzehn Jahre nach Transplantation untersucht, als Untersuchungszeitpunkt möglicher Zusammenhänge verschiedener Parameter untereinander wurde der Zeitpunkt zwei Jahre post Tx gewählt, da hier die Datenlage am besten war. Betrachtet man das untersuchte Patientengut, so sind trotz teilweise langer Dialysezeit, Immunsuppression und eingeschränkter Lebensweise die meisten Blutparameter weniger pathologisch als erwartet bzw. im Rahmen der eingeschränkten Nierenleistung erklärlich. Beachtenswert ist das Parathormon: die signifikant positive Korrelation mit der Alkal. Phosphatase ist ein deutlicher Hinweis dafür, dass gerade in den ersten 24 Monaten nach Transplantation der Einfluß auf den Knochenstoffwechsel massiv zu sein scheint. Im Laufe der Zeit findet allerdings eine Entkoppelung statt, sodass ein weiterhin hoher Parathormonwert nicht mehr gleichbedeutend für einen starken Knochenkatabolismus ist. Die Knochendichte ist im Verhältnis zu gesunden Dreißigjährigen vermindert, aber im Vergleich zu Gleichaltrigen nur diskret reduziert. Eine Knochendichtemessung kann hinweisend auf eine Osteoporose sein, läßt aber nicht eine schlechte, frakturgefährdete Knochenqualität bei mäßiger bis guter Dichte erkennen. Zwischen Knochendichte und Frakturen fanden wir keine signifikante Korrelation, und somit gewinnt wieder die Klinik der Patienten an Gewicht: Knochenschmerzen, stattgefundene pathologische Frakturen ohne adäquates Trauma, Minderung der Körpergröße weit über die 97. Perzentile hinaus etc. scheinen weitaus bedeutungsvoller und folglich eine Indikation für eine medikamentöse knochenprotektive Therapie zu sein. Doch wie funktioniert eine solche Therapie? Calcium und Vitamin D3 verbessern bei geringen Nebenwirkungen, Medikamenten-Interaktionen und Kosten zwar nachweislich die Dichtewerte, allerdings nicht evident die Frakturrate. Die hier verabreichten Dosen könnten allerdings deutlich zu niedrig sein, neuere Studien zeigen jedenfalls Optimierungsmöglichkeiten im Sinne einer positiven Beziehung zwischen Dosis und sinkender Frakturrate auf. Anders sieht es mit den Bisphosphonaten aus, bei denen zukünftig nochmals das Wirkungs-Nebenwirkungs-Verhältnis in prospektiven Studien eruiert werden sollte. Es gilt als bewiesen, betrachtet man die BMD als quantitativen Erfolgsparameter, dass diese effizient bezüglich der Behandlung einer Steroid-induzierten Osteoporose sind, allerdings stehen die Nachfolger anderer Wirkungsgruppen schon parat, gekoppelt an ein anderes Nebenwirkungsspektrum. Eine rein protektive Dosis an Risikopatienten zum Zwecke einer niedrigen BMD, die allerdings nicht zwangsläufig ein damit verbundenes Frakturrisiko beinhaltet, ist fraglich. Die Glukokortikoide wirken interindividuell stark unterschiedlich, können allerdings bereits in sehr geringen Mengen knochenschädigend sein (tägliches Prednisolonäquivalent von 2,5mg). Hier scheint also die Dauer der Gabe im Verhältnis zur Gesamtdosis deutlich einflussreicher zu sein. Tatsache ist, dass wir keine Korrelation der Glukokortikoidgabe mit der BMD, der Frakturrate oder des PTH nachweisen konnten. Dennoch könnte ein Verzicht dieser und somit der Bisphosphonate bei entsprechender Alternative eine Gewinn-Situation für den Patienten darstellen. Die zur Einsparung verwendeten Immunsuppressiva gelten als ein weiterer Unsicherheitsfaktor, da kaum verwertbare Studien am Menschen bezüglich deren Auswirkungen auf den Knochenstoffwechsel existieren. Aus Gründen des häufigen Therapieregime-Wechsels ließen sich keine Daten erheben. Beachtlich ist die signifikante Korrelation des Serum-Eiweiß/Albumin-Spiegels bezüglich der Frakturen. Ein niedriger Wert hängt offensichtlich mit einer erhöhten Frakturzahl zusammen, was ernährungsphysiologische sowie endokrinologische Einflüsse stärker unterstreichen könnte. . Eine bessere Ernährung und die Vermeidung von Eiweißverlusten könnten langfristig hilfreich sein, ebenso wie die konsequente Therapie des Hyperparathyreoidismus v.a. in den ersten Monaten nach Transplantation mit (höheren) Vitamin-D- sowie gegebenenfalls Cinacalcet-Applikationen. Der Zeitpunkt einer medikamentösen knochenprotektiven Therapie scheint wichtiger als die Gesamtdauer zu sein, wobei Arzt und Patient stets die Multikausalität des bis heute noch nicht vollständig verstandenen Krankheitsbildes bedenken sollten.
Konuskronen verankerter Zahnersatz hat sich seit mehreren Jahrzehnten als hervorragende Therapieform zur Versorgung des reduzierten Restgebisses bewährt und verbindet zahlreiche Vorteile des festsitzenden mit denjenigen des herausnehmbaren Zahnersatzes. Vor dem Hintergrund einer steigenden Relevanz ästhetischer Versorgungen sowie einer größer werdenden Ablehnung der Patienten hinsichtlich der Verwendung metallischer Werkstoffe, gewann das Ziel, auch kombiniert festsitzend-herausnehmbaren Zahnersatz metallfrei zu fertigen, zunehmend an Bedeutung. Ziel der vorliegenden prospektiven klinischen Studie war die Evaluation des klinischen Langzeitverhaltens von keramischen Primärkronen aus IPS Empress 2® kombiniert mit Sekundärkronen und Prothesengerüsten aus faserverstärktem Kunststoff (Vectris®) sowie die Untersuchung der Patientenzufriedenheit. Als Kontrollgruppe dienten keramische Primärkronen mit Sekundärkronen aus Galvanogold und metallischen Gerüsten. Dazu wurden 29 Patienten mit insgesamt 37 Konusprothesen auf 165 keramischen Primärkronen versorgt, 27 (73%) Prothesen entfielen auf die Kontrollgruppe und 10 (27%) Prothesen auf die Testgruppe. Eingebunden in ein Recall-System, wurden die Patienten in halbjährigen Abständen über einen Zeitraum von 5 Jahren nachuntersucht. Zur Evaluation der Patientenzufriedenheit erhielten die Studienteilnehmer jeweils vor Therapiebeginn, nach Fertigstellung der Konusprothesen und im einjährigen Abstand einen Fragebogen. Die Zeit unter Risiko betrug durchschnittlich 59 ± 22 Monate (min. 16, max. 96 Monate), Befragungen hinsichtlich der Patientenzufriedenheit wurden über 46 ± 18 Monate durchgeführt (min. 15, max. 66 Monate). Beide Gruppen zeigten eine vergleichbar hohe Reparaturanfälligkeit. 88,9% der Restaurationen in der Kontrollgruppe, sowie 90% der Restaurationen in der Testgruppe mussten mindestens einmal instand gesetzt werden (Mann-Whitney-U-Test, p = 0,121). Auch das Schadensrisiko der vollkeramischen Primärkronen zeigte keine statistischen Unterschiede (Testgruppe: 10,81%; Kontrollgruppe: 10,16%; exakter Fisher-Test, p > 0,05). Die Häufigkeit einer Neuanfertigung der Konusprothese war bei der Test-Gruppe (40%) höher als bei der Kontroll-Gruppe (14,8%), ein statistisch signifikanter Unterschied war zwischen beiden Gruppen nicht nachzuweisen (exakter Fisher-Test, p = 0,16). Die Erfolgsrate zeigte in Abhängigkeit der Zeit unter Risiko jedoch ab 2,5 Jahren schlechtere Werte bei metallfreien Prothesen als bei der Kontrollgruppe, nach etwa 5 Jahren nahm dieser Unterschied deutlich zu (Kontrollgruppe: 86%, Testgruppe: 24%) und unterschied sich statistisch signifikant (Log-Rank-Test, p=0,041). Bei drei der 128 Galvano-Matrizen kam es zu einer Beschädigung an den Sekundärstrukturen, bei 9 von 37 Matrizen aus glasfaserverstärktem Kunststoff trat ein Schaden auf. Dieser Unterschied war statistisch hochsignifikant und belegt, dass Vectris®-Mesostrukturen eher zum Versagen neigen als Galvano-Sekundärkronen (exakter Fisher-Test, p = 0,00008). Im Gegensatz zu den durchaus unterschiedlichen klinischen Ergebnissen und den unbefriedigend hohen Reparaturzahlen war die Patientenzufriedenheit mit den jeweiligen Studienprothesen für beide Gruppen vergleichbar gut. Zu keinem Zeitpunkt zeigte sich eine relevante Personenzahl in einer der Gruppen mit dem erhaltenen Zahnersatz unzufrieden. So war in der Testgruppe initial lediglich eine Person unzufrieden, änderte diese Einstellung jedoch im Rahmen der weiteren Kontrollen. Eine weitere Person war anfangs zufrieden, dann vorübergehend unzufrieden, um im Weiteren erneut ihre Zufriedenheit zu äußern. Für die Metallgruppe ergab sich lediglich in der letzten Nachkontrolle eine Person, die unzufrieden mit dem Zahnersatz war. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen waren somit zu keinem Zeitpunkt nachzuweisen (exakter Fisher-Test, alle p > 0,05). Die vorliegende Untersuchung bestätigt, dass sich die Verwendung keramischer Primärkronen in Doppelkronenrestaurationen prinzipiell bewährt und die Anforderungen an die gestellten Parameter wie Haftkraftstabilität, Biokompatibilität und Ästhetik erfüllt. Jedoch weist die Lithiumdisilikat-Glaskeramik IPS Empress 2® eine unzureichende Stabilität auf, für diesen Indikationsbereich sind daher ausschließlich hochfeste Zirkoniumdioxid-Keramiken zu empfehlen. Mit diesem Material ist ein wesentlich geringeres Reparaturrisiko zu erwarten. Als Matrizenwerkstoff zeigten galvanogeformte Sekundärkappen sehr gute klinische Ergebnisse. Die hohe Passungspräzision, welches durch die intraorale Fügung erreicht wird, gewährleistet eine ideale Lagerung des Zahnersatzes und reduziert kinetikbedingte Schäden auf ein Minimum. Das Ziel der Untersuchung, die dauerhafte klinische Bewährung metallfreier Konusprothesen aus dem Glasfaserverbundmaterial Vectris® nachzuweisen, konnte nicht erreicht werden. Die Ergebnisse dieser prospektiven klinischen Studie belegen eine Überlegenheit der metallischen Konusprothese. Somit bedarf die Realisation einer klinisch verlässlichen metallfreien Konusprothese noch erheblichen Forschungs- und Entwicklungsbedarf. Insbesondere die Substitution von galvanogeformten Feingoldmatrizen stellt eine große Herausforderung dar.
Ein neues kombiniertes pulse-wave Doppler- und M-Mode Ultraschallgerät zur semiinvasiven Messung des arteriellen Blutflusses (ABF) in der thorakalen Aorta descendens bei koronaren Revaskularisationseingriffen ohne Einsatz des kardiopulmonalen Bypass (off-pump coronary artery bypass grafting (OPCAB)) wurde untersucht und mit der Thermodilutionsmethode zur Bestimmung des cardiac output (CO) verglichen. Bei 45 Patienten, die sich einem OPCAB-Eingriff unterzogen, wurden ABF und CO gleichzeitig mittels des kombinierten Ultraschall-Dopplergerätes und der Thermodilutionsmethode bestimmt zu den folgenden fünf Messzeitpunkten: nach Anästhesieeinleitung (1), nach Sternotomie (2), nach Eröffnung des Perikards (3), nach Luxation des Herzens mittels eines speziellen Sperrersystems (4), nach Entfernen des Thoraxsperrers (5). Die Teilnehmer der Studie wurden in zwei Subgruppen unterteilt, entsprechend dem Typ des Thoraxsperrers, der eingesetzt wurde. Infolge einer Änderung des Operationsverfahrens wurden 15 Teilnehmer mittels des Octopus-Sperrers, 30 mittels des CTS-Sperrers revaskularisiert. Wir führten insgesamt 225 Messungen durch. Die Korrelationskoeffizienten und die linearen Regressionsgleichungen wurden berechnet. Alle Messungen und die Messwerte der Subgruppen getrennt wurden im Bland-Altman-Diagramm dargestellt. Der Korrelationskoeffizient für alleMesswerte war r = 0,66 (CO = 0,6508xABF+2,386) bzw. r = 0,66 (CO= 0,7499xABF+2,386) für dieOctopus-Sperrer Subgruppe und r = 0,65 (CO = 0,5583xABF+2,5281) für die CTS-Sperrer Subgruppe. Der Bias (Mittelwert der Differenzen) aller Messwerte betrug 0,8l/min (0,88l/min in der Octopus-Sperrer Subgruppe und 0,75l/min in der CTS-Sperrer Subgruppe) und die „limits of agreement“ (Mittelwert der Differenzen +-2SD)+-2,38l/min (2,07l/min in der Octopus-Sperrer Subgruppe und 2,52l/ min in der CTS-Sperrer Subgruppe). Demzufolge misst das Ultraschall-Dopplergerät den ABF während eines OPCAB-Eingriffes nicht mit ausreichender Genauigkeit. Weitere Untersuchungen in anderen klinischen Situationen sollten durchgeführt werden.
Mycophenolat-Mofetil (MMF) hemmt die Aktivität von Mikrogliazellen und verringert den exzitotoxischen neuronalen Schaden in organotypischen hippocampalen Schnittkulturen (OHSC). Der Tractus perforans ist die wichtigste neuronale afferente Verbindung zwischen entorhinalem Kortex (EC) und Gyrus dentatus (GD) im Hippocampus. Er besteht aus Axonen, deren Ursprungsneurone im EC liegen und die im GD terminieren. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von MMF auf den Erhalt dieser Projektion zu untersuchen. Methodisch wurde zu diesem Zweck die Fluoreszenzmarkierung des Tractus perforans in der organotypischen hippokampalen Schnittkultur (OHSC) etabliert. Die von uns angestrebte retrograde Färbemethode sollte entorhinale Neurone unter der Voraussetzung markieren, dass deren Axone (Tractus perforans) intakt waren. Ein guter neuronaler Erhalt sollte sich in einem entsprechend erhaltenen Tractus perforans und retrograd markierten entorhinalen Neuronen wiederspiegeln. OHSC aus 8 Tage alten Wistar Ratten wurden für 9 div (days in vitro) mit oder ohne MMF (100 mikro g/ml) kultiviert. Zunächst wurde methodisch die retrograde Markierung des Tractus perforans mit dem lipophilen Farbstoff DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindo-carbocyaninperchlorat) in der OHSC etabliert und mit dem hydrophilen Dextranamin Mini Ruby versucht. Die retrograde Markierung entorhinaler Neurone und die durchgängige Darstellung des Tractus perforans in der OHSC mit Mini Ruby gelang in unseren Versuchen nicht, während die Markierung mit DiI erfolgreich war. Nach der Fixierung wurde die retrograde Markierung des Tractus perforans durch das Platzieren eines DiI-Kristalles im GD eingeleitet. Die auf diese Weise mit DiI markierten entorhinalen Neurone wurden mit neuronenspezifischen Antikörpern gegen NeuN gegengefärbt und somit zweifelsfrei als Neurone identifiziert. An diesem Modell wurde der Einfluß von MMF auf die Zahl DiI/NeuN doppelmarkierter entorhinaler Neurone quantitativ ausgewertet. Die quantitative Analyse erfolgte an Bildern, die mit einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop gewonnen wurden. Die quantitative Auswertung retrograd mit DiI markierter OHSC zeigte, dass die Anzahl der DiI-NeuN doppelmarkierten entorhinalen Neurone in den MMF behandelten OHSC 19fach höher war als in den unbehandelten OHSC (p<0,05). Unsere Ergebnisse zeigen, dass MMF den Erhalt ganzer neuronaler Fasertrakte und Projektionen in der OHSC verbessert. Vor dem Hintergrund vorhandener Arbeiten, die auf neuroprotektive Effekte der MMF deuten, scheint MMF ein aussichtsreicher Kandidat für die Reduzierung des Sekundärschadens im Rahmen von Verletzungen des zentralen Nervensystems zu sein.
Die vorliegende Studie führte einen Vergleich zwischen Lokalanästhesie (LA) und Allgemeinanäthesie (GA) hinsichtlich der Entwicklung früher postoperativer kognitiver Dysfunktion (POCD) nach Carotis-Thrombendarterektomie (Carotis- TEA) durch. Es handelt sich hierbei um eine prospektive, extern randomisierte Studie, die als Teil einer Subgruppenanalyse der europaweiten GALA-Studie (General Anaesthesia versus Local Anaesthesia) durchgeführt wurde. Es wurden insgesamt 40 Patienten in die Studie eingeschlossen (GA n = 23, LA n = 17). Die kognitive Leistungsgeschwindigkeit wurde mittels Zahlen-Verbindungs-Tests (ZVT) und die Befindlichkeit wurde durch die Befindnisskalierung durch Kategorie und Eigenschaftswörter (BSKE(EWL)) zu jeweils vier Messzeitpunkten (MZP) (am Vorabend der Operation, 5, 29 und 77 Stunden postoperativ) bestimmt. Das Ausmaß der neuronalen Schädigung wurde mittels des biochemischen Markers Protein S-100b zu drei MZPs bestimmt (präoperativ, vor Unclamping der A. carotis interna und am Ende der Operation). Die Geschwindigkeit im ZVT nahm in der GA-Gruppe postoperativ signifikant ab (p = 0,0001). Sowohl fünf (p = 0,023) als auch 29 Stunden (p = 0,043) postoperativ zeigten sich signifikante Gruppenunterschiede. Die S-100b-Konzentration zeigte in der GA-Gruppe am zweiten MZP einen signifikanten (p < 0,001) Anstieg von 0,086 ± 0,038 mikro g/l, im Vergleich zum Ausgangswert von 0,061 ± 0,024 mikro g/l. Signifikante Gruppenunterschiede konnten wir hier am Ende der Operation messen (p = 0,006). Bei der Befindlichkeitsskalierung waren keine signifikanten Gruppenunterschiede messbar. Anhand unserer Ergebnisse können wir eindeutig die Thesen widerlegen, dass das verwendete Anästhesieverfahren keinen Einfluss auf die Entwicklung früher POCD hat und dass es nicht das Ausmaß der neuronalen Schädigung beeinflusst. Wir schließen daraus, dass die Lokalanästhesie einen positiven Effekt auf die Entwicklung früher POCD und das Ausmaß der neuronalen Schädigung hat. Eingeschränkt wird die Aussagekraft dieser Ergebnisse durch eine kleine Fallzahl, ein kurzes Follow-up und ein nicht standardisiertes Neuromonitoring und Shunting unter Allgemeinanästhesie.
Ziel dieser Nachuntersuchung war es zu zeigen, ob Patienten mit einer rheumatischentzündlichen Grunderkrankung und rein degenerativ veränderten Hüftgelenken im Langzeitverlauf von einer Hüft-Totalendoprothese über den dorsalen Zugang profitieren. Zugrunde lag ein Kollektiv von 109 degenerativ veränderten Patienten- Hüften (108 Patienten) und 22 rheumatische Patientenhüften (21 Patienten), die in den Jahren 1995 bis 1998 in der orthopädischen Universitätsklinik von einem einzigen Operateur eine Hüft-Totalendoprothese über den dorsalen Zugang erhielten. Der Untersuchungszeitraum beläuft sich auf durchschnittlich 9,2 Jahre. Neben der klinischen Untersuchung mittels des Harris-Hip-Scores wertete die Arbeitsgruppe radiologische Beckenübersichtsaufnahmen und Lauensteinaufnahmen der endoprothetisch versorgten Hüftgelenke aus. Hierfür eignete sich der Mayo-Hip- Score mit dem das Ablöseverhalten der Prothese vom Knochen in Form einer Saumbildung ermittelt wurde. Es wurden 42 rein degenerativ veränderte Patienten-Hüften klinisch nachuntersucht, von denen 23 radiologische Bilder ausgewertet werden konnten. Bei Patienten aus dem rheumatischen Formenkreis lagen von zehn klinisch nachuntersuchten Patienten sechs radiologische Bilder vor. Ein gutes Ergebnis (84%) wird für die Gruppe der Patienten mit einer rein degenerativen Hüftgelenkserkrankung (Arthrose) und ein mittleres Ergebnis (78%) für Patienten aus dem rheumatischen Formenkreis evaluiert. Der Zusammenhang zwischen einer besseren Funktionsfähigkeit und geringeren Schmerzen nach 10 Jahren post operationem bei einem minimalinvasiven dorsalen Zugang kann nicht nachgewiesen werden. Dennoch erscheint es früh-postoperativ einige Vorteile für das Verwenden des minimal-invasiven Zugangs zum Hüftgelenk zu geben: Laut o. a. Studien liegt der intraoperative Blutverlust unter den Mengen von konventionellen Schnitten und die mögliche frühere Rehabilitationsfähigkeit bei kleineren Zugängen spricht ebenfalls für das Verwenden eines minimal-invasiven Zugangs. Insgesamt sind 92% der Patienten mit dem heutigen postoperativen Ergebnis zufrieden. Eine kleine Operationsnarbe, die weit dorsal liegt, könnte laut Patientinnen-Angaben sehr gut durch die Badebekleidung verdeckt werden, was bei antero-lateralen Zugängen nicht der Fall zu sein scheint. Dies erhöht eindeutig die Lebensqualität von Patientinnen, insbesondere von jungen Rheumatikerinnen. In Folge einer Nachbeobachtungszeit von durchschnittlich 9,2 Jahren lässt sich sagen, dass die Implantation einer Hüft-Totalendoprothese über den dorsalen Zugang sowohl bei degenerativ veränderten als auch bei rheumatisch-entzündlichen Hüftgelenken eine gute Alternative zu den Operationstechniken über den anterioren oder antero-lateralen Zugang darstellt. Die anfänglich beschriebene Ablehnung den dorsalen Zugang zu nutzen - weil über einen dorsaler Zugang das stützende Gewebe traumatisiert und damit die dorsale Luxationstendenz auf lange Sicht begünstigt werden und zu einer chronischen Instabilität des Hüftgelenkes führen könnte – konnte in unserer Studie nicht nachgewiesen werden. Zwar traten Luxationen auf, die dann teilweise operativ korrigiert werden mussten, aber es kam in keinem Fall während der Nachbeobachtungszeit zu einer Revision aufgrund einer Luxation und folgender Instabilität. Aufgrund dieser Daten- und Informationslage kann der dorsale Zugang zur Implantation einer Hüft-Totalendoprothese bei Patienten mit Arthrose und Patienten des rheumatischen Formenkreises als gute und sichere Alternative betrachtet werden.
In der vorliegenden Untersuchung wurden die im Zeitraum von 1984 bis 2006 an der Universitätsklinik Frankfurt am Main aufgrund von nicht-kolorektalen Lebermetastasen durchgeführten Leberteilresektionen untersucht. Ziele dieser Arbeit sind die Darstellung des Patientenkollektivs einschließlich der operativen Faktoren der Lebermetastasenresektion, die Ermittlung von Langzeitergebnissen nach der Resektion und die Feststellung von Prognosefaktoren im Hinblick auf das postoperative Überleben dieser Patienten. Das untersuchte Patientenkollektiv (n = 69) umfasste 31 Männer und 38 Frauen mit einem medianen Alter von 52 Jahren zum Zeitpunkt der Leberresektion. Am häufigsten waren folgende Primärtumore vertreten: Magenkarzinom, Mammakarzinom, Malignes Melanom, Neuroendokriner Tumor und Nierenzellkarzinom. Der größte Anteil der Primärtumore wurde als mäßig differenziert (G2) eingestuft. 55,1 % der Patienten zeigten eine solitäre Lebermetastasierung. Der mediane Tumordurchmesser betrug 5 cm. Bei 14,5 % der Patienten wurden bilobäre und bei 85,5 % unilobäre Lebermetastasen festgestellt. 20,3 % der Patienten präsentierten sich mit einer synchronen und 73,9 % mit einer metachronen Metastasierung (unbekannt: 5,8 %). Zur Resektion der Metastasen wurden atypische Segmentektomien (n = 25), typische Segmentektomien (n = 22) und (erweiterte) Hemihepatektomien (n = 22) durchgeführt. Bei einer medianen Operationsdauer von 195 min erfolgte bei 69,6 % der Patienten ein zusätzlicher Eingriff. Der mediane Sicherheitsabstand zum Resektionsrand lag bei 10 mm. Die Liegedauer auf der Intensivstation betrug im Median einen Tag. Bei 39 Patienten traten postoperative Komplikationen auf. Ein Fortschreiten der Tumorerkrankung war bei 30 Patienten dokumentiert. Das mediane tumorspezifische Überleben nach Resektion nicht-kolorektaler Lebermetastasen lag bei 4,3 Jahren. Die dazugehörigen 1-, 5- und 10-JahresÜberlebensraten betrugen 80,1 %, 47,9 % und 35,5 %. Die mediane tumorspezifische Überlebenszeit nach Resektion nicht-kolorektaler, nicht-neuroendokriner Metastasen stellte sich mit 2,0 Jahren und folgenden 1-, 5- und 10-Jahres-Überlebensraten dar: 76,8 %, 43,1 % und 27,9 %. Nach der Leberresektion aufgrund von Metastasen eines Magenkarzinoms ergaben sich tumorspezifische 1-, 5- und 10-Jahres-Überlebensraten von 80,8 %, 23,1 % und 11,5 % (mediane ÜLZ: 18 Monate). Die 1-, 5- und 10-Jahres-Überlebensraten nach der Resektion von Filiae eines Mammakarzinoms betrugen 74,6 %, 51,1 % und erneut 51,1 %. Die mediane Überlebenszeit nach Operation von Metastasen eines Malignen Melanoms lag bei 22 Monaten: 1-JÜR: 66,7 %, 5-JÜR: 33,3 %, 10-JÜR: 0,0 %. Nach der Resektion von Filiae eines Neuroendokrinen Tumors betrug die 1- 5- und 10-Jahres-Überlebensrate 100,0 %, 80,0 % und erneut 80,0 %. Bei Patienten mit primärem Nierenzellkarzinom ergab sich nach der Resektion eine mediane Überlebenszeit von 44 Monaten und die dazugehörige 1-Jahres-Überlebensrate lag bei 75,0 %. Die folgenden Faktoren zeigten sich in den Resultaten der univariaten Analyse als signifikante Prädiktoren für das tumorspezifische Überleben der Patienten: Primärtumorgruppe8, Grading des Primärtumors, zusätzliche Eingriffe neben der Leberresektion und Sicherheitsabstand zum Resektionsrand. In der multivariaten, tumorspezifischen Analyse wurden zwei Determinanten als unabhängige Prognosefaktoren für das Überleben nach der Leberresektion identifiziert: Der kleinste Sicherheitsabstand der Leberfiliae zum Resektionsrand und die Durchführung eines zusätzlichen Eingriffs neben der Leberresektion. Bei Durchführung eines solchen Eingriffs war das Risiko für die Patienten, an der Tumorerkrankung zu versterben, 3,5mal so groß im Vergleich zu Patienten, bei denen kein zusätzlicher Eingriff erfolgt ist. Bei Annahme eines Sicherheitsabstandes von mindestens 10 mm als Referenz, errechnete sich im Vergleich dazu für Patienten, bei denen kein Sicherheitsabstand eingehalten werden konnte, ein 6,3mal so großes Risiko an der Tumorerkrankung zu versterben. Bei Einhaltung eines kleinen Abstandes zum Resektionsrand (0,1 mm - 9,9 mm) war das entsprechende Risiko für die Patienten 4,9mal so groß. Die Resektion nicht-kolorektaler Lebermetastasen erscheint in ausgewählten Fällen sinnvoll. Um die Prognose der operierten Patienten zu verbessern, sollte entsprechend den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ein Sicherheitsabstand von mindestens einem Zentimeter angestrebt werden.
By adopting a variety of shapes, proteins can perform a wide number of functions in the cell, from being structural elements or enabling communication with the environment to performing complex enzymatic reactions needed to sustain metabolism. The number of proteins in the cell is limited by the number of genes encoding them. However, several mechanisms exist to increase the overall number of protein functions. One of them are post-translational modifications, i.e. covalent attachment of various molecules onto proteins. Ubiquitin was the first protein to be found to modify other proteins, and, faithful to its evocative name, it is involved in nearly all the activities of a cell. Ubiquitylation of proteins was believed for a long time only to be responsible for proteasomal degradation of modified proteins. However, with the discovery of various types of ubiquitylation, such as mono-, multiple- or poly-ubiquitylation, new functions of this post-translational modification emerged. Mono-ubiquitylation has been implicated in endocytosis, chromatin remodelling and DNA repair, while poly-ubiquitylation influences the half-life of proteins or modulates signal transduction pathways. DNA damage repair and tolerance are example of pathways extensively regulated by ubiquitylation. PCNA, a protein involved in nearly all types of DNA transaction, can undergo both mono- and poly-ubiquitylation. These modifications are believed to change the spectrum of proteins that interact with PCNA. Monoubiquitylation of PCNA is induced by stalling of replication forks when replicative polymerases (pols) encounter an obstacle, such as DNA damage or tight DNA-protein complexes. It is believed that monoubiquitylation of PCNA stimulates the exchange between replicative pols to one of polymerases that can synthesize DNA across various lesions, a mechanism of damage tolerance known as translesion synthesis (TLS). Our work has helped to understand why monoubiqutylation of PCNA favours this polymerase switch. We have identified two novel domains with the ability to bind Ub non-covalently. These domains are present in all the members of Y polymerases performing TLS, and were named Ub-binding zinc finger (UBZ) (in polη and polκ) and Ub-binding motif (UBM) (in polι and Rev1). We have shown that these domains enable Y polymerases to preferentially gain access to PCNA upon stalling of replication, when the action of translesion polymerases is required. While the region of direct interaction between Y pols and PCNA had been known (BRCT domain in Rev1 and PIP box motif (PIP) in three others members), we propose that Ub-binding domains (UBDs) in translesion Y pols enhance the PIP- or BRCT-domain-mediated interaction between these polymerases and PCNA by binding to the Ub moiety attached onto PCNA. Following these initial studies, we have also discovered that Y polymerases themselves undergo monoubiquitylation and that their UBDs mediate this modification. This auto-ubiquitylation is believed to lead to an intramolecular interaction between UBD and Ub attached in cis onto the UBD-containing protein. We have mapped monoubiquitylation sites in polη in the C-terminal portion of the protein containing the nuclear localization signal (NLS) and the PIP box. Beside PIP, the NLS motif is also involved in direct interaction of polη with PCNA. Based on these findings, we propose that monoubiquitylation of either NLS or PIP masks them from potential interaction with PCNA. Lastly, using several functional assays, we have demonstrated the importance of all these three motifs in the C-terminus of polη (UBZ, NLS and PIP) for efficient TLS. We have also constructed a mimic of monoubiquitylated polη by genetically fusing polη with Ub. Interestingly, this chimera is deficient in TLS as compared to the wild-type protein. Altogether, these studies demonstrate that the C-terminus of polη constitutes a regulatory module involved in multiple-site interaction with monoubiquitylated PCNA, and that monoubiquitylation of this region inhibits the interaction between polη and PCNA. Our work has also revealed that the UBDs of Y pols as well as of other proteins implicated in DNA damage repair and tolerance, such as the Werner helicase-interacting protein 1 (Wrnip1), are required for their proper sub-nuclear localization. All these proteins localize to discrete focal structures inside the nucleus and mutation of their UBDs results in inability to accumulate in these foci. Interestingly, by exchanging UBDs between different proteins we have learned that each UBD seems to have a distinct functional role, surprisingly not limited to Ubbinding ability. In fact, swapping the UBZ of Wrnip1 with the UBM of polι abolished the localization of Wrnip1 to foci despite preserving the Ub-binding ability of the chimeric protein. In summary, this work provides an overview of how post-translation modification of proteins by Ub can regulate several DNA transactions. Firstly, key regulators (e.g. PCNA) can be differentially modified by Ub. Secondly, specialized UBDs (e.g. UBM, UBZ) embedded only in a subset of proteins act as modules able to recognize these modifications. Thirdly, by means of mediating auto-ubiquitylation, UBDs can modulate the behaviour of host proteins by allowing for either in cis or in trans Ub-UBD interactions.
Humane endogene Retroviren (HERVs) sind Relikte von Infektionen der Keimzellen von Primatenvorläufern mit exogenen Retroviren vor 40 Millionen Jahren. Die meisten HERV Elemente sind defekt durch die Akkumulation von Mutationen, Deletionen und Rearrangements. Lediglich einige Proviren der HERV-K/HML-2 Familie enthalte noch offenen Leserahmen für alle retroviralen Proteine. Die Expression repetitiver endogener Elemente wird in somatischen Zellen unterdrückt. Transkription und Translation von HERV-K Genprodukten tritt in Keimzelltumoren, Melanomen und Eierstockkrebs auf. In der vorliegenden Arbeit wurde die HERV-K exprimierende Melanomlinie UKRV Mel 2-C9 etabliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die HERV-K Expressionen durch die dominante Aktivität des Provirus 108 bedingt ist. Die Expression und korrekte Prozessierung der viralen Proteine konnte nachgewiesen werden. Durch Elektronenmikroskopie wurde bestätigt, dass HERV-K 108 virale Partikel mit charakteristischen Strukturen der Hüllproteine produziert. Diese Partikel enthalten virale Volllängen RNA-Genome. Da HERV-K 108 in der Linie UKRV Mel 2-C9 eine Mutation im aktiven Zentrum der Reversen Transkriptase zeigt, sind die Partikel nicht infektiös. Um Einblicke in die der HERV-K Expression in Keimzelltumoren und Melanomen zu Grunde liegenden transkriptionellen Regulationsmechanismen zu erhalten, wurden mittels 5’ und 3’ RACE (rapid amplification of cDNA ends) der Transkriptionsstart und die Terminationsstelle bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass der HERV-K Promotor in den untersuchten Zelllinien TATA-unabhängig agiert obwohl die HERV-K LTR (long terminal repeat) ein TATA-Motiv aufweist. Die transkriptionelle Aktivität des HERV-K Promotors ist abhängig von einer GC-Box in unmittelbarer Nähe zu einem Initiatorelement am Startpunkt der Transkription. Das GC-Sequenzmotiv ist die Bindestelle für die Transkriptionsfaktoren SP1 (specific protein) und SP3. Mutationen des Bindemotivs führten zu einem drastischen Abfall der Promotoraktivität im Luziferaseassay. Durch Proteinknockdown mittels spezifischer siRNA gegen SP1 und SP3 konnte die Promotoraktivität ebenso deutlich reduziert werden. Elektrophoretic mobility shift assays und Chromatinimmunopräzipitationen bestätigten eine Bindung von SP1 und SP3 an die HERV-K LTR. Die Transkriptionsfaktoren SP1 und SP3 sind an der Initiation der basalen Transkription von HERV-K maßgeblich beteiligt.
Enantioselective carbon-carbon bond-forming reactions, particularly, using organocatalysts represent one of the most important areas in modern synthetic chemistry. New concepts and methods in organocatalysis are emerging continuously, allowing more selective, economically more appealing and environmentally friendlier transformations. Chiral Brønsted-acid catalysts have recently emerged as a new class of organocatalysts for a number of enantioselective carbon-carbon bond-forming reactions. The first part of this thesis focused on the new development of new Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclizations. The Nazarov reaction belongs to the group of electrocyclic reactions and is one of the most versatile methods for the synthesis of five-membered rings, which are the key structural elements of numerous natural products. In general, the Nazarov cyclization can be catalyzed by Brønsted or Lewis acids. However, only a few asymmetric variations have been described, of which most require the use of large amounts of chiral metal complexes. The reactivities of Nazarov cyclizations are also depending on the substituents of the divinyl ketone substrates as described in the first chapter. The substrates to study Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclization were prepared following the known procedures. The dihydropyran was treated with tBuLi in THF at –78 oC and then the α,β-unsaturated aldehydes 1 were added to the reaction mixture to afford the corresponding alcohols 2 in moderate to good yields. The alcohols 2 were oxidized to divinyl ketones 3 employing Dess-Martin periodinane/pyridine (DMP/py) in CH2Cl2 at room temperature to obtain the divinyl ketones 3 in moderate to good yields (Scheme 1). Scheme 1. Preparation of substrates in order to study Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclization and subsequent transformations. At the starting point, an evaluation of suitable Brønsted acid catalysts for the enantioselective Nazarov cyclization of divinyl ketone 3a was performed. The initial reactions conducted with various BINOL-phosphoric acids 4a-4e in toluene at 60 oC provided the mixture of cis and trans cyclopentenones 5a with enantioselectivities of up to 82% ee (Table 1, entries 1-5). Eventually, improved reactivity could be achieved by using the corresponding N-triflylphosphoramides 4f and 4g, which even at 0 oC gave complete conversion after ten minutes. Additionally, it was shown that the use of these catalysts significantly enhanced both the diastereoselectivity (cis/trans ratio up to 7:1) and the enantioselectivity (up to 96% ee; Table 1, entries 6 and 7). Table 1. Evaluation of Brønsted acids 4a-4g in the enantioselective Nazarov cyclization. The scope of the Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclization of various divinyl ketones 3 was explored under an optimized reaction condition (Scheme 2). Treatment of divinyl ketones 3 in CHCl3 in the presence of 2 mol% chiral BINOL-Ntriflylphosphoramide 4g at 0 oC for 1-6 h provided the corresponding cyclopentenone 5 in good yields (45-92%) with excellent enantioselectivities (up to 93% ee) (Scheme 2). Furthermore, the isomerization of cis-cyclopentenone under basic condition led to the corresponding trans-cyclopentenone without loss of enantiomeric purity. This efficient method introduced here was not only the first example of an organocatalytic electrocyclic reaction but also represented the first enantioselective activation of a carbonyl group catalyzed by a chiral BINOL phosphoric acid. Compared to the metal-catalyzed reaction, special features of this new Brønsted acid-catalyzed electrocyclization are the lower catalyst loadings (2 mol%), higher enantioselectivities, accessibility to all possible stereoisomers, as well as the mild conditions. ....
An eclogite barometer has profound importance in the study of upper mantle processes and potential application to diamond prospecting. Studies on the partitioning of Li between clinopyroxene (cpx) and garnet (grt) in natural samples have shown that this particular element is very sensitive to changes in pressure and could be calibrated as the barometer demanded for bimineralic eclogites. Experiments were performed from 4 to 13 GPa and 1100 to 1400°C in the CMAS (CaO, MgO, Al2O3, SiO2) system with Li added as Li3PO4 to quantify this pressure dependence into a barometer expressed in the following equation: P= (0.00255*T-lnKd)/0.2351 where P is in GPa, T is in °C and Kd is defined as the partition coefficient of Li (in ppm) between clinopyroxene and garnet. The experimental pressures are reproduced to ± 0.38 GPa (1σ) by this equation. This barometer is strictly applicable only to CMAS. Experiments at 1300°C, 8-12 GPa showed that Henry’s Law is fulfilled for Li partitioning between cpx and grt in the concentration range of approximately 0.01 – 1 wt% Li. Direct application of the equation to experiments in natural systems performed at 1300°C from 4 GPa to 13 GPa consistently overestimates pressures by approximately 2 GPa. Our previous experiments in the system CaO-MgO-Al2O3-SiO2 + Li3PO4 showed that the partitioning of Li between garnet and clinopyroxene is pressure dependent in eclogitic bulk compositions. This supports experimentally the hypothesis of Seitz et al. (2003), based on the analysis of Li in eclogitic xenoliths and inclusions in diamond, that the partitioning of this particular element between clinopyroxene and garnet is very sensitive to changes in pressure and could be calibrated as a barometer for bimineralic eclogites. In order to calibrate this pressure dependence into a barometer, experiments were performed in natural systems using starting materials sourced from a well preserved eclogitic xenolith from the Roberts Victor kimberlite pipe (South Africa) to extrapolate our findings in CMAS to natural systems. Sixteen multianvil experiments were performed from 4-13 GPa and 1100-1500°C. Our findings reinforced the general trend we observed in the CMAS system, that KdLi cpx-grt for Li decreases with increasing P, and that at P ≥ 12 GPa, garnet is able to incorporate more Li than clinopyroxene. Multiple linear regression was applied to our experimental results to create the barometer: P = (0.000963*T – ln KdLi cpx-grt + 1.581) / 0.252 Where P is pressure in GPa, T is temperature in °C and KdLi cpx-grt is defined as the partitioning coefficient of Li obtained by dividing the concentration of Li in cpx by the concentration of Li in garnet. This barometer reproduces the experimental conditions to ± 0.2 GPa. It is applicable to eclogitic xenoliths, to garnet pyroxenites and to peridotitic and eclogitic inclusions in diamond. Application of the barometer to diamond bearing xenoliths results in pressures in the diamond stability field. Clinopyroxene is easily corrupted in xenoliths and also preferentially takes in Li during short lived metasomatic processes. Care must be taken therefore to analyse primary, unaltered clinopyroxene. Our preliminary application to natural samples shows that the barometer can be applied beyond the experimental range to pressures down to 3 GPa. Seventeen eclogitic xenoliths were chosen from a sample set of greater than 200 for their fresh microscopic and macroscopic appearance and were analyzed for Li content in coexisting garnet (grt) and clinopyroxene (cpx). These samples can be subdivided into two groups on the basis of Mg in cpx (cpfu: cations per formula unit, based on 6 oxygens): Group 1 with Mg > 0.75, and Group 2 with Mg < 0.75. Group 1 xenoliths show lower Li contents in both grt and cpx compared to Group 2. The Li barom ter calibrated in Hanrahan et al. (2009b)/Chapter 3 was applied to these samples as well as available literature data to obtain pressures of provenance - Group 2 xenoliths often provide pressures that appear unrealistic for eclogitic xenoliths. In light of observed crystal chemical relations in the natural samples, a new fitting procedure was applied to the experimental data presented in Chapter 3. This new fit appears to be more realistic than the previous fit, although a strong relationship with Mg# remains present, suggesting that Li-barometry is, at present, only applicable to Mg-rich eclogites. Inclusions in diamond, with the exception of eclogitic inclusions of coexisting majorite and cpx, often yield pressures that are inconsistent with the pressures required for diamond formation. Although an interesting observation when comparing all of the data is that inclusions in diamond have significantly higher average Li concentrations compared to xenoliths, which suggests that Li is highly present in the fluids from which diamonds form in the mantle, an observation which was previously made for the deep mantle as a result of high Li in ferropericlase inclusions in diamond (Seitz et al. 2003).
The physiology of our most complex organ, the brain, is still not comprehensively understood. The brain basically serves the processing, storing and binding of external and internal information, and thereby generates amazing phenomena like the understanding of oneself as an individual entitiy. How exactly information is encoded and represented, how individual neurons or networks of neurons actually interact, is a gigantic puzzle, whose pieces were collected since many decades. Subject of scientific discussions are the basic spatiotemporal structures of neuronal representations. Suggestions and observations reach hereby from simple rate coding of individual neurons to synchronous activity of larger ensembles. To approach answers to these questions, our working group has used a combination of different recording techniques that allowed for the comparison of neuronal interactions on different spatial scales. We focused on prefrontal neuronal interactions during visual short-term memory. Herefore two rhesus monkeys had been trained to perform a visual short-term memory task. We measured and recorded their neuronal activity by means of a microelectrode matrix that could be inserted into the cortex via a closable chamber, which had been previously implanted above prefrontal cortex. The acquired signal was separated into two components: a high-frequency component, that represents the spiking output activity of few neurons in the vicinity of each electrode tip (multi-unit activity), and a low-frequency component, that results from dendritic input activity of larger neuronal assemblies (local field potential). From one of the experimental animals we also recorded mass signals of even larger neuronal populations by means of small silverball electrodes, that had been implated into the skull above prefrontal cortex (skull EEG) in the context of a pilot project. In the first subproject, we analyzed the selectivity of output signals with respect to the memorized stimulus and task performance. We compared selectivities of local recording sites (multi-unit activity) with the selectivities of patterns created by the combined activity of all recording sites, thus representing the activity of large and distributed ensembles. Local neuronal activity correlated with the course of the visual short-term memory task, but was not highly discriminative with respect to different visual stimuli. We could show that the population activity was significantly more specific. Concerning task performance, we obtained the same result, albeit less pronounced. Further analyses revealed that the patterns of distributed ensemble activity were only partly based on realtime coordination of neuronal activity, and in addition, did not remain stable across the time course of the short-term memory task. In the second subproject, we focused on the oscillatory behavior of the local field potential. After a time-frequency analysis, we studied different frequency bands concerning stimulus selectivity and task performance of the monkey. We hereby found significant modulations of oscillations in the beta- and gamma-frequency range, that correlated with different periods of the task. Especially for oscillations in beta- and low-gamma-range, we observed phase-locking of oscillations between different recording sites, which could play an important role as internal clock to coordinate spatially separate activity. Local high-gamma oscillations themselves seemed to be important for the maintenance of information. These results could be partly confirmed by mass signals of EEG. In sum, our results support the hypothesis that information is represented in the brain by means of concerted activity of spatially distributed neuronal ensembles. This activity again appears to be coordinated by oscillatory activity in beta- and low-gamma-frequency ranges. A deeper understanding of central nervous information processing could contribute to better treatment of diseases like Parkinson’s, Alzheimer’s as well as epilepsy, and neuropsychiatric disorders like schizophrenia.
Typ 1 Diabetes mellitus (T1D), Hashimoto-Thyreoiditis (HT) und Morbus Addison (AD) sind autoimmunvermittelte Erkrankungen mit multifaktorieller und polygener Ätiologie. Die gemeinsamen prädisponierenden genetischen Merkmale (HLA Klasse II-Moleküle und CTLA-4) bedingen eine Störungen in der T-Zell-Aktivierung und Homöostase. Es mehren sich Hinweise, dass PTPN22 ein weiterer genereller Risikofaktor für Autoimmunität ist. PTPN22 kodiert für eine intrazelluläre Tyrosin-Phosphatase, die als Suppressor der T-Zell- Aktivierung wirk. In der vorliegenden Arbeit wurde die Verteilung des PTPN22 1858 C/T Polymorphismus in deutschen Patienten mit T1D (n = 220), AD (n = 121) und HT (n = 116) sowie gesunden Kontrollen (n = 239) untersucht. Hierbei konnte eine signifikante Assoziation der Genvariation und den Erkrankungen T1D und HT bestätigt werden. PTPN22 1858 T wurde häufiger bei Patienten mit T1D (19,3% vs. 11,3%; p = 0,001; OR für Allel T = 1,88, 95% CI [1,30-2,72]) und HT (18,1% vs. 11,3%; p = 0,0129; OR für Allel T = 1,74, 95% CI [1,12-2,69]) beobachtet. Erstmals konnte eine exklusive Assoziation zum weiblichen Geschlecht bei Patientinnen mit T1D beobachtet werden (p = 0,0001). Ein signifikanter Unterschied zwischen männlichen Typ 1 Diabetikern und Kontrollen war nicht nachweisbar. Für eine Assoziation von PTPN22 1858 C/T und AD fanden sich keine Hinweise. Zusammenfassend ist der Polymorphismus PTPN22 1858 C/T in der Pathogenese von HT und T1D in der deutschen Bevölkerung involviert, beim T1D durch einen geschlechtsspezifischen Mechanismus, der zu einer Risikoerhöhung im weiblichen Geschlecht führt. Diese Ergebnisse werden durch aktuelle Studien bestätigt. Der Vitamin D-Stoffwechsel ist ein weiteres System mit einem klar belegten Einfluss auf das Immunsystem. Die Gabe von aktivem Vitamin D zeigte im Tiermodell eine Protektion vor T1D. Der modulierende Einfluss auf T-Zell-Differenzierung und Aktivität von dendritischen Zellen mittels Zytokinausschüttung bewirkt ein Verschiebung des Gleichgewichts von T-Helferzellen in Richtung Th2-Zellen und regulatorischen T-Zellen. Zusätzlich belegen epidemiologische Daten eine Verbindung von Vitamin D Ernährungsstatus in der frühen Kindheit und der Prävalenz von T1D. Ein genetisches Risiko für T1D konnte für die folgenden Komponenten des Vitamin D-Systems identifiziert werden: Vitamin D bindendes Protein (DBP), CYP2R1, CYP27B1 und CYP24 sowie Vitamin D-Rezeptor (VDR). Ein weiteres Makromolekül mit essentieller Bedeutung für die Aufrechterhaltung des Vitamin D-Metabolismus ist Megalin. Der endozytotische Multiliganden-Rezeptor gehört zur Familie der low-density Lipoprotein (LDL)-Rezeptoren und wird hauptsächlich in den Zellen des proximalen Tubulus der Niere exprimiert, zusätzlich aber auch in anderen resorptiven Epithelien. Megalin liefert den größten Beitrag zur Protein-Aufnahme aus dem glomerulären Filtrat in die Zellen des proximalen Tubulus. Neben einer relativ unspezifischen Bindung vieler Proteine (z.B.: Albumin, ベ1- und ベ2-Mikroglobulin) bindet Megalin einige Liganden mit hoher Affinität. Hierzu zählen Hormone, Vitamin-bindende Proteine und Lipoproteine. Megalin gewinnt durch die zelluläre Aufnahme von Vitamin D im Komplex mit seinem Transportprotein DBP eine große Bedeutung im Vitamin D-Stoffwechsel. Die Endozytose ist notwendig um 25 OH D3 zu konservieren und um Zellen mit der Vorstufe zur Generierung von 1,25 (OH)2 D3, der biologisch aktiven Form von Vitamin D, zu versorgen. Weiterhin ist die Aufnahme möglicherweise direkt mit der Aktivierung des nukleären VDR verbunden, als Vorbereitung auf kommende Liganden In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Bedeutung von genetischen Polymorphismen des Megalingens bei Patienten mit T1D und gesunden Kontrollen der deutschen Bevölkerung untersucht. Die Analyse von neun SNPs erbrachten interessante Erkenntnisse: Genvariationen von Megalin sind mit T1D assoziiert, wobei MegE36 A, ein SNP auf Exon 36, das Risiko einer Erkrankungsmanifestation erhöht. Allel »A« wurde häufiger bei Patienten mit T1D beobachtet (95,6% vs. 92,2%; OR für Allel A = 1,85, 95% CI [1,18-2,91]). In der geschlechtsgetrennten Analyse beschränkten sich die gefundenen Differenzen der Allelfrequenzen lediglich auf das männliche Geschlecht (p = 0,0014; OR für Allel A = 2,67, 95% CI [1,43 – 4,98]). Bei Frauen war kein signifikanter Unterschied nachweisbar. Da dieser exonische SNP still ist, d.h. durch einen synonymen Aminosäurenaustausch keinen Einfluss auf die Rezeptorfunktionalität hat, treten mögliche Effekte auf RNA-Ebene auf. Denkbar ist auch eine Kopplung mit einem benachbarten Marker. Drei weitere nicht synonyme exonische SNPs (MegE03 A/G, MegE66 A/G and MegE69 A/C) weisen eine grenzwertige Assoziation zu T1D auf und haben zugleich einen funktionellen Einfluss auf die Proteinstruktur. Bemerkenswerterweise zeigt MegE66, wie auch MegE36 A, lediglich bei Männern ein genetisches Risiko für T1D. Diese Geschlechtsspezifität wird möglicherweise durch eine Interaktion von Megalin mit Androgenen und Östrogenen in Verbindung mit dem Transportprotein (SHBG) begründet. Die Aufklärung des molekularen Mechanismus wird Gegenstand künftiger Studien sein.
Die Magnetresonanzspektroskopie (MRS) ist eine nicht-invasive Methode zur Quantifizierung metabolischer Änderungen des Gehirnstoffwechsels. Einige dieser Metaboliten wie N-Acetyl-Aspartat (tNAA), Myo-Insoitol (mI), Kreatin (tCr) und Cholin (Cho) können auch als Marker für neurodegenerative Erkrankungen (z.B. Morbus Alzheimer) dienen. Bislang haben nur wenige Studien MR-spektroskopische Veränderungen bei Patienten mit der Diagnose einer „leichten kognitiven Beeinträchtigung“ (Mild Cognitive Impairment = MCI) untersucht. Entsprechend sollten in dieser Untersuchung MR-spektroskopische Veränderungen bei MCI-Patienten erfasst und in Abhängigkeit vom klinischen Verlauf in einer Längsschnittstudie analysiert werden. Fünfzehn MCI-Probanden und zwölf gesunde ältere Kontrollpersonen wurden jeweils zweimal innerhalb eines Zeitraumes von ca. 40 Monaten klinisch, neuropsychologisch sowie MR-spektroskopisch untersucht. Die MR-Spektroskopie wurde als Einzelvolumenspektroskopie (SVS) mit kurzer Echozeit (TE = 30 ms) durchgeführt. Als VOI wurde ein Bereich im Parietallappen ausgewählt, der den Gyrus cinguli mit einschloss. Der Anteil an CSF wurde aus der Dekonvolution der T2-Dephasierung des Wassersignals ermittelt. Die Auswertung der Spektren erfolgte mit dem Programm LCModel, das eine Analyse des Spektrums mittels einer Linearkombination von Modellspektren durchführt. Die ermittelten Werte für die Signalintensitäten wurden in absolute Metabolitenkonzentrationen (mmol/l) unter Berücksichtigung entsprechender Korrekturen umgerechnet. Der Mittelwert des MMSE-Scores der MCI-Patienten lag zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung bei 26,4 (Bereich 20 - 30) und fiel im Verlauf auf 23,3 (Bereich 14 - 28) ab. Sechs der MCI-Patienten entwickelten im zeitlichen Intervall ein dementielles Syndrom (MCIKonverter). Alle Kontrollpersonen hatten einen MMSE-Score von mehr als 29 in beiden Untersuchungen. Bei den MRS-Untersuchungen wurde bei Erstuntersuchung ein signifikanter Unterschied für den CSF-Anteil des Messvolumens im Vergleich der Patientengruppe und der Probanden festgestellt. Für die MR-spektroskopisch erhobenen Metabolitenkonzentrationen ergaben sich bei der Erstuntersuchung keine signifikanten Unterschiede. Bei der zweiten Untersuchung zeigte sich dagegen eine signifikante Erniedrigung der Konzentrationen von tCr und tNAA der Gruppe der MCIKonverter im Vergleich zu den entsprechenden Konzentrationen der anderen Gruppen. In der MCI-Gruppe war eine Abnahme der tNAA-Konzentgration signifikant mit einer Abnahme der kognitiven Leistung korreliert. Dieser Effekt war im Wesentlichen auf metabolische Änderungen in der Gruppe der MCIKonverter zurückzuführen. Für die Metaboliten Cho und mI konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Diese Pilotstudie zeigt, dass MR-spektroskopisch gemessene Metaboliten (insbesondere tNAA) bei der MCI als Surrogatmarker eines (in Richtung Demenz) fortschreitenden neurodegenerativen Krankheitsprozesses eingesetzt werden können. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie sind mit anderen Publikationen (Ackl et al., 2005; Adalsteinsson et al, 2000; Chao et al, 2005; Kantarci et al., 2000) in Einklang zu bringen. Da auch die tCr-Konzentration im Verlauf Schwankungen unterliegt, wird klar, dass eine Quantifizierung in absoluten Konzentrationen einem relativen Vergleich von tNAA zu tCr vorzuziehen ist.
Im Forschungsgebiet des Wissensmanagements ist der Teilbereich des Wissenstransfers von großer Bedeutung, jedoch gleichzeitig auch mit vielen Problemen verbunden, die es auf dem Weg zu einem erfolgreichen Wissenstransfer zu identifizieren und zu lösen gilt. Die vorliegende Arbeit stellt einen Ordnungsrahmen vor, mit dessen Hilfe ein detailliertes Gesamtbild des Wissenstransfers innerhalb einer beliebigen Organisation erstellt werden kann. Der Ordnungsrahmen bildet Rollen, Objekte und Handlungen des Wissenstransfers ab und setzt diese miteinander in Beziehung. Diesen Konstrukten des Ordnungsrahmens sind potentielle Probleme zugeordnet, die im Rahmen einer Literaturrecherche identifiziert werden und die einen reibungslosen Ablauf des Wissenstransfers innerhalb von Organisationen behindern können. Eine für den Ordnungsrahmen entwickelte Handlungsanleitung beschreibt, wie dieser als Basis für die konkrete Untersuchung der aktuellen Situation des Wissenstransfers in Organisationen eingesetzt werden kann. Im Rahmen der Forschungsarbeit wird anhand von mehreren Praxisfällen gezeigt, dass der Ordnungsrahmen mit Hilfe der Handlungsanleitung dazu eingesetzt werden kann, den Ist-Zustand des Wissenstransfers in Organisationen zu erheben sowie vorhandene Probleme im Wissenstransfer aufzudecken. Das Vorgehen der Forschung ist an den Grundsätzen des Design Science ausgerichtet. Der Beitrag zur Forschung als Ergebnis des Design Science-Prozesses ist der Ordnungsrahmen, dessen Validität und Relevanz anhand mehrerer Kriterien gezeigt wird.
Gibt es zwischen Rauchern und Nichtrauchern einen Unterschied in der Husteninzidenz nach Fentanyl?
(2009)
Fragestellung: Die Inzidenz von fentanylinduziertem Husten soll von Injektionsgeschwindigkeit und Raucherstatus des Patienten abhängen und bis zu 18% betragen. Wir konnten vorher bei Nichtrauchern zeigen, dass die Inzidenz an fentanylinduziertem Husten lediglich 3% beträgt und unabhängig von der Injektionsgeschwindigkeit ist. In der vorliegenden Untersuchung haben wir die Inzidenz von fentanylinduziertem Husten bei Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern und bei unterschiedlichen Injektionsgeschwindigkeiten geprüft. Material und Methoden: Mit Zustimmung der Ethikkommission erhielten 530 konsekutive ASA l-lll Patienten (Raucheranteil unseres regionalen Patientenkollektivs 25%) randomisiert, einfach blind entweder 0,15 μg.kgKG Fentanyl über 2, 5 oder 10 Sekunden oder Kochsalz intravenös injiziert. Patienten mit akuten Infekten der Luftwege wurden ausgeschlossen. Primärer Endpunkt: Husten innerhalb von 5 Minuten nach Fentanyl-lnjektion. Null-Hypothese: kein signifikanter Unterschied zwischen Rauchern und Nichtrauchern und zwischen Fentanyl und Placebo. Statistik: Faktorielle ANOVA und chi- Quadrat-Test, p < 0,001. Ergebnisse: Unter der Annahme einer Hustenlnzidenz von 5% nach Fentanyl und 0% nach Plazebo errechneten sich 340 Patienten / Gruppe, also 1360 Patienten. Die geplante Zwischenauswertung nach 530 Patienten ergab eine Husteninzidenz von 2% sowohl in der Raucher- (n=176) als auch in der Nicht-Rauchergruppe (n= 356, p= 0,970 Raucher vs. Nichraucher). Die Husteninzidenz wurde weder in der Raucher- noch in der Nichtrauchergruppe durch die Injektionsgeschwindigkeit beeinflusst, betrug zwischen 1 und 3 % (p= 0,999 und 0,848 für Husteninzidenz vs. Injektionsgeschwindigkeit in der Raucher- bzw. Nichrauchergruppe) und unterschied sich nicht von Placebo. Die Rekalkulation der notwendigen Gruppengröße auf der Basis dieser Ergebnisse ergab 10449 Patienten / Gruppe, also 41794 Patienten für einen möglicherweise signifikanten aber klinisch irrelevanten Unterschied, so dass die Untersuchung beendet wurde. Schlussfolgerungen: Im Gegensatz zu den bisherigen Daten bei asiatischen oder chinesischen Patienten konnten wir in unserer Untersuchung keinen Einfluss des Raucherstatus auf die Inzidenz an fentanylinduziertem Husten feststellen. Die Husteninzidenz war bei Rauchern und bei Nichtrauchern unabhängig von der Injektionsgeschwindigkeit und nicht verschieden von Placebo.
Mechanismus der Inhibition APOBEC3-vermittelter Restriktion durch das Bet Protein der Foamyviren
(2009)
Der Selektionsdruck seitens der Pathogene führte im Laufe der Evolution zur Entwicklung verschiedener Abwehrmechanismen. Neben der angeborenen und adaptiven Immunabwehr rückte in den letzten Jahren ein neuer Immunitätszweig in den Fokus der Wissenschaft, die sogenannte intrinsische Immunität. Dieser Begriff geht einher mit der Entdeckung zellulärer, antiviral wirkender Deaminasen aus der Familie der APOBEC3 Proteine (A3A, -B, -C, -DE, -F, -G und -H). Diese Proteine übten einen starken Selektionsdruck aus, so dass nur die Viren überleben konnten, die einen Weg gefunden haben diesen zellulären Replikationsblock zu umgehen. Die komplexen Retroviren, wie Lenti- und Foamyviren, haben dazu Proteine entwickelt, welche in der Lage sind die A3 vermittelte, zelluläre Abwehr auszuhebeln. Während das Vif Protein des HI-Virus, das den proteasomalen Abbau des Zielproteins induziert, intensiv erforscht wurde, ist die Wirkungsweise des foamyviralen Bet noch unbekannt und Gegenstand dieser Arbeit. Die Aufklärung der Wirkungsweise des Bet Proteins erforderte zunächst die Etablierung eines experimentellen Systems, das die Messung antiviraler Aktivität verschiedener A3 Proteine, sowie deren Neutralisation durch Bet erlaubt. Bet zeigt sich aktiv gegen die meisten Deaminasen der Primaten, nicht aber gegen die Deaminasen der Katze und der Maus. Da die Aktivität sowohl im homologen (PFV), als auch heterologen (SIV) System bestimmt wurde, wird eine Beteiligung anderer viraler Komponenten ausgeschlossen. Aus dem breiten Spektrum sensitiver A3 Proteine wurden das humane A3B, -C und –G für weitere Untersuchungen verwendet. Durch Titrationsexperimente mit huA3C und –G zeigte sich, dass Bet dosisabhängig agiert und unterschiedliche A3 Proteine unterschiedlich empfänglich sind. Die mittels Immunopräzipitation untersuchte Bindung zwischen Bet und den empfänglichen A3 Proteinen korreliert mit deren Neutralisierung. Die Bindungsstudie mit in vitro hergestelltem huA3C deutet auf eine direkte, RNase unabhängige Interaktion hin. Die Bet-bedingte Inhibition der Dimerisierung von huA3C und -G konnte mittels Immunopräzipitation und chemischer Quervernetzung gezeigt, sowie die Bet-Bindestelle mithilfe eines Rekombinationsansatzes innerhalb der Dimerisierungsfläche von huA3C lokalisiert werden. Fraktionierungen der Proteine nach Löslichkeit bzw. Dichte, sowie Immunofluoreszenzstudien und FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) zeigten Bet-abhängige Änderungen der Lokalisierung, Komplexbildung und zytoplasmatischen Beweglichkeit von huA3B, -C und –G. Als Resultat dieser veränderten Eigenschaften Bet-sensitiver A3 Proteine wird ihre Inkorporation in Virionen verhindert, was zum Verlust der antiviralen Aktivität führt. Damit beschreiben die Ergebnisse dieser Arbeit einen neuen Weg, den Viren beschreiten um die A3 vermittelte Immunität auszuschalten.
Auswirkungen einer Mutation des Adhäsionrezeptors PSGL-1 bei humanen neutrophilen Granulozyten
(2009)
Der VNTR Polymorphismus des PSGL-1 ist schon seit längerer Zeit Gegenstand wissenschaftlicher Untersuchungen. Der Rezeptor weist je nach Genotyp eine unterschiedliche Länge auf. Dabei ist der Rezeptor mit dem Allel A der längste, das C-Allel weist phänotypisch den kürzesten Rezeptor auf. Der Rezeptor mit dem B-Allel liegt mit der Länge in der Mitte der drei Rezeptoren. In dieser Studie wurde das Roll- und das Adhäsionsverhalten von Leukozyten mit den Genotypen AA bzw. BB mit Hilfe eines Flusskammermodells untersucht. Dieses Verhalten kommt im Rahmen der Bindung zustande, welche P-Selektin und PSGL-1 miteinander eingehen. Das Blut von acht Probanden wurde untersucht, vier Probanden wiesen den Genotyp AA, die anderen vier den Genotyp BB auf. Die Leukozyten wurden aus dem Vollblut isoliert, verdünnt und in das Flusskammermodell eingespeist. Die verdünnte Zellsuspension wurde mittels einer Pumpe über ein Schlauchsystem durch eine Messkammer befördert, welche im Vorfeld mit P-Selektin beschichtet wurde. Dort konnten die Zellen mikroskopisch untersucht und videotechnisch dokumentiert werden. Anschließend konnte die Rollgeschwindigkeit der neutrophilen Granulozyten und die Anzahl der adhärenten Zellen an der Oberfläche durch Computerprogramme ermittelt werden. Als Resultat ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen der Rollgeschwindigkeit der Zellen des Genotyps AA und der Zellen des Genotyps BB. Dabei wiesen die Zellen mit dem B-Allel wegen der geringeren Länge des PSGL-1 eine höhere Rollgeschwindigkeit auf, als die Zellen mit dem AAllel, deren PSGL-1 länger ist. Zudem blieben signifikant weniger Leukozyten mit dem BAllel an der Oberfläche haften als die Leukozyten der anderen Gruppe. Daraus lässt sich schließen, dass die Bindungskraft zwischen PSGL-1 und PSelektin von der Länge des PSGL-1 abhängig ist. Der kürzere Rezeptor (B-Allel des PSGL-1) weist also eine geringere Bindungskraft auf als der längere Rezeptor (A-Allel des PSGL-1). Die Bindung zwischen PSGL-1 und PSelektin lässt sich wahrscheinlich pharmakologisch beeinflussen. Es wurden Antikörper entwickelt, die in klinischen Studien Erfolg versprechende Ansätze bei der Entzündungshemmung gezeigt haben. Die aktuelle Literatur zu klinisch pharmakologischen Behandlungsansätzen wurde in dieser Arbeit diskutiert.
Tumoren epithelialen Ursprungs weisen häufig eine vermehrte Expression und/oder Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) auf. Durch die übermäßig starke bzw. permanente Vermittlung von Überlebens- und Proliferationssignalen an die betroffene Zelle trägt dies direkt zum Voranschreiten der Tumorerkrankung bei. Für eine Reihe von Tumorentitäten ist bekannt, dass eine abnorme Expression von EGFR mit einer schlechteren Prognose für den Krankheitsverlauf und die mittlere Überlebenszeit betroffener Krebspatienten korreliert. Begleitend zur systemischen Chemotherapie solcher Tumoren wird eine gerichtete Therapie zur Eindämmung der EGFR-vermittelten Signaltransduktion durch den Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI) oder EGFR-spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb) erzielt. Bei der therapeutischen Anwendung monoklonaler anti-EGFR Antikörper wurden in einigen Fällen lediglich milde Nebenwirkungen wie z.B. Hautausschläge beobachtet, wobei das Auftreten dieser Effekte mit dem Therapieerfolg korrelierte. Eine Reihe von monoklonalen Antikörpern, die gegen ErbB Rezeptor-Tyrosinkinasen gerichtet sind, sind mittlerweile zur Tumortherapie zugelassen, darunter der chimäre anti-EGFR Antikörper Cetuximab (Erbitux®, ImClone/BMS/Merck) zur Behandlung von metastasierenden Kolonkarzinomen sowie Karzinomen des Kopf- und Halsbereichs, der humane anti-EGFR Antikörper Panitumumab (Vectibix®, Amgen) bei metastasierenden Kolonkarzinomen, und der humanisierte anti-ErbB2 Antikörper Trastuzumab (Herceptin®, Genentech/Roche) bei Brustkrebs. Weitere Antikörper befinden sich derzeit in fortgeschrittenen Phasen der klinischen Entwicklung, darunter der humanisierte anti-EGFR Antikörper Matuzumab (Merck/Takeda). Klinische Daten zeigen, dass Patienten mit EGFR positiven Tumoren, die gegenüber etablierter Chemotherapie resistent sind, von der Behandlung mit anti-EGFR Antikörpern profitieren. Durch aktivierte EGF-Rezeptoren induzierte mitogene Signale werden vermindert bzw. blockiert, indem die Antikörper mit hoher Affinität an ErbB Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden und die Ligandenbindung bzw. die Dimerisierung verhindern, die zur Bildung aktivierter Rezeptor Dimere nötig ist. Auf diese Weise wird die mitogene Signalübertragung aktivierter ErbB-Rezeptor Dimere verhindert und die Proliferation der Tumorzelle wird verlangsamt oder kommt zum Stillstand. Es gibt Hinweise, dass darüber hinaus sekundäre Effektormechanismen des Immunsystems wie die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) oder die komplementabhängige Zytotoxizität (CDC) gegen Antikörper-markierte Tumorzellen die anti-tumorale Wirksamkeit dieser Antikörper noch verstärken. Die lebensverlängernde Wirkung der Behandlung mit diesen Antikörpern ist ein Beispiel für die erfolgreiche Anwendung einer zielgerichteten Krebstherapie durch passive Immuntherapie. Zu Beginn dieser Arbeit waren die genauen Bindungsstellen der therapeutischen anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab noch unbekannt. Die Kenntnis der Lage der Epitope auf dem EGFR Molekül könnte wichtige Hinweise zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen dieser Antikörper liefern und Ansätze zur weiteren Optimierung dieser Therapeutika aufzeigen. Aus vorangegangenen Experimenten war bekannt, dass Cetuximab und Matuzumab Epitope auf dem EGFR erkennen, die eine intakte Raumstruktur des Rezeptors voraussetzen. Diese Beobachtungen konnten in dieser Arbeit bestätigt werden, ferner konnte die Lage der Epitope auf die EGFR Ektodomäne III/L2 eingegrenzt werden. Da sowohl Cetuximab als auch Matuzumab nicht-lineare, konformationelle Epitope erkennen, wurde eine Variante der Phage Display Methode zur Identifizierung von Peptiden gewählt, die mit den hypervariablen Regionen (CDR) dieser Antikörper interagieren, welche die Bindungsspezifität der Antikörper vermitteln. Ziel dieser Experimente war die Identifizierung von Peptiden, welche die konformationellen Epitope von Cetuximab bzw. Matuzumab in linearer bzw. zyklisch restringierter Form nachbilden. Die Aminosäuresequenzen solcher sogenannter Mimotope könnten zur Identifizierung entsprechender Oberflächenstrukturen am EGFR Molekül herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden aus kommerziell erhältlichen Bibliotheken genetisch modifizierter M13 Bakteriophagen, die randomisierte lineare bzw. zyklische Peptide als N-terminale Fusion am Oberflächenprotein pIII exponieren (M13KE), unter Anwendung der „Delayed Infectivity Panning“ (DIP) Methode Peptide angereichert, die von Cetuximab bzw. Maztuzumab erkannt werden. Zur Anreicherung von M13KE Bakteriophagen mit CDR-spezifischen Fusionspeptiden mittels DIP wurde zunächst ein „single-chain“ Antikörperfragment aus der cDNA von Matuzumab konstruiert und in den bakteriellen Expressionsvektor pIB-Tx kloniert. Mit dem resultierenden Konstrukt pIB-Tx-scFv(E72K) bzw. dem bereits vorhandenen analogen Konstrukt pIB-Tx-scFv(225), welches das „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab enthält, wurden E. coli HB101 Bakterien transformiert, um die bakterielle Oberflächenexpression dieser Antikörperfragmente zum Einsatz in DIP Experimenten zu erreichen. In alternierenden positiven und negativen Selektionsrunden wurden unter Einsatz dieser scFv-exprimierenden E. coli HB101 Bakterien in Biopanning Experimenten Phagen mit solchen Fusionspeptiden angereichert, die selektiv an die „single-chain“ Antikörperfragmente von Cetuximab bzw. Matuzumab binden. Phagen ELISA Experimente mit M13KE Einzelklonen zeigten, dass aus allen eingesetzten Bibliotheken Phagen mit Fusionspeptiden isoliert werden konnten, die an den jeweiligen parentalen Antikörper des zur Selektion eingesetzten „single-chain“ Antikörperfragmentes binden. Ein Teil der Phagenklone wies eine zumindest partielle Kreuzreaktivität zu dem entsprechenden anderen anti-EGFR Antikörper auf, obwohl sie auf Bindung an diesen nicht selektioniert worden waren. Die Sequenzanalyse der Fusionspeptide lieferte keine gemeinsame Consensus Sequenz, es konnten jedoch kurze, gemeinsame Sequenzmotive identifiziert werden. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurden diese Klone als mögliche Kompetitoren der Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA in MTT-Zytotoxizitätsassays eingesetzt. Ein Teil der selektionierten Fusionspeptide war in der Lage, die Bindung der aus dem „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab scFv(225) bestehenden Zellbindungsdomäne des Immuntoxins scFv(225)-ETA an EGFR exprimierende Zellen zu kompetieren. Auch für einige Fusionspeptide, die zunächst nur auf Bindung an Matuzumab selektioniert worden waren, wurde dies beobachtet. Peptide, welche die Bindung des Immuntoxins an EGFR kompetieren, weisen in ihren pIII-Fusionspeptiden laut Sequenzanalyse die gemeinsamen Sequenzmotive KTL bzw. YPLG auf. Nach einem Abgleich der Sequenzen der kompetierenden, kreuzreaktiven Peptide mit KTL bzw. YPLG Motiven wurden zwei Peptide ausgewählt und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurde zunächst bestätigt, dass die synthetischen Peptide in der Lage sind, durch Kompetition spezifisch die Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA und dessen zytotoxische Wirkung auf EGFR exprimierende Zellen zu verhindern. Kaninchenseren und aus diesen affinitätsgereinigte anti-Peptid Antikörper zeigten in ELISA Experimenten konzentrationsabhängige Bindung an die immobilisierten synthetischen Peptide. Die Bindung der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab an die synthetischen Peptide konnte ebenfalls bestätigt werden. In einer Reihe von Experimenten wurde untersucht, ob die Immunisierung mit potentiellen Mimotopen der anti-EGFR Antikörper eine endogene humorale Immunantwort gegen den humanen EGFR bewirkt hatte. Die Bindung der affinitätsgereinigten anti-Peptid Antikörper an den Rezeptor auf der Oberfläche EGFR-exprimierender Tumorzellen wurde zunächst in Durchflusszytometrie (FACS) Experimenten analysiert. Für die gereinigten anti-Peptid Antikörper wurde spezifische Bindung an murine Renca-lacZ/EGFR Zellen sowie an humane A431 Vulvakarzinomzellen detektiert, die den humanen EGFR auf der Oberfläche exprimieren. Die Bindung an A431 konnte durch Vorinkubation der Antikörper mit einem Überschuss der entsprechenden synthetischen Peptide vollständig verhindert werden. In einer weiteren Serie von FACS Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Bindung der Antikörper Cetuximab und Matuzumab an EGFR durch eine Vorinkubation von Renca-lacZ/EGFR Zellen mit den gereinigten anti-Peptid Antikörpern deutlich reduziert werden konnte. Dies ist ein Beweis für die Fähigkeit der in Immunisierungsexperimenten generierten anti-Peptid Antikörper, die Bindungsstellen von Cetuximab und Matuzumab am EGFR zumindest teilweise zu besetzen. Diese Beobachtungen zeigen, dass durch Immunisierung mit den hier ausgewählten synthetischen Peptiden in Versuchstieren die Bildung von Antikörpern mit ähnlichen Eigenschaften wie Cetuximab bzw. Matuzumab und somit eine endogene Immunantwort gegen den humanen EGFR ausgelöst werden konnte. In Immunfluoreszenz Experimenten wurde die Bindung der anti-Peptid Antikörper an Renca-lacZ/EGFR Zellen erneut überprüft und mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) visualisiert. In diesen Experimenten wurde für gereinigte anti-Peptid Antikörper (KTL Motiv bzw. YPLG Motiv) Bindung an die Zelloberfläche bzw. membrannahe intrazelluläre Strukturen beobachtet, die der Lokalisierung der Bindungssignale der parallel getesteten anti-EGFR Antikörper Cetuximab, Matuzumab und dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 entsprach. Die Bindung der anti-Peptid Antikörper konnte durch Zugabe eines Überschusses der jeweiligen synthetischen Peptide verhindet werden. In einer weiteren Serie von Immunfluoreszenz Experimenten wurde der humane EGFR auf Renca-lacZ/EGFR Zellen gleichzeitig mit anti-KTL bzw. anti-YPLG Peptid Antikörpern aus Kaninchen sowie dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 detektiert. Durch eine Überlagerung der Signale konnte eindeutig eine Kolokalisation nachgewiesen werden. Dies ist ein Beweis dafür, dass es sich bei der Bindung der anti-Peptid Antikörper an die Oberfläche von Renca-lacZ/EGFR um Bindung an den humanen EGFR handelt. In Lysaten von EGFR exprimierenden Zelllinien konnte mit gereinigten anti-Peptid Antikörpern ein Protein detektiert werden, dessen Größe dem humanen EGFR entspricht. Die durch Stimulation des humanen EGFR mit dem natürlichen Peptidliganden EGF hervorgerufene Autophosphorylierung des Rezeptors in A431 Zellen konnte durch Zugabe von anti-Peptid Antikörpern teilweise inhibiert werden, allerdings nicht in dem gleichen Ausmaß, wie dies für die als Positivkontrollen eingesetzten anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab beobachtet wurde. In MTT-Zytotoxizitätsassays konnte darüber hinaus eine teilweise Kompetition der Bindung des rekombinanten Toxins TGF!-ETA an EGFR-exprimierende A431 Zellen, und somit eine teilweise Kompetition des natürlichen Peptidliganden TGF! an EGFR durch Vorinkubation mit anti-Peptid Antikörpern nachgewiesen werden. Zur näherungsweisen Quantifizierung der Affinitäten der anti-Peptid Antikörper und der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab für die synthetischen Peptide (KTL Motiv und YPLG Motiv) bzw. für die gereinigte extrazelluläre Domäne des humanen EGFR (sEGFR) wurden ELISA Bindungstests durchgeführt. Die aus den Bindungskurven berechneten Affinitätswerte zeigen, dass die anti-Peptid Antikörper an sEGFR im nanomolaren Bereich binden und damit ca. 200-fach niedrigere Affinitäten für den Rezeptor besitzen als die affinitätsoptimierten anti-EGFR Antikörper Cetuximab bzw. Matuzumab. Die Affinitäten der anti- Peptid Antikörper für die synthetischen Peptide liegen ebenfalls im nanomolaren Bereich, während Cetuximab und Matuzumab lediglich mikromolare Affinitäten für die Peptide besitzen. Durch „Epitope Mapping“ in silico vorhergesagte mögliche Oberflächenstrukturen auf EGFR, welche die Peptidmimotope mit KTL bzw. YPLG Motiven nachbilden, sind direkt benachbart zu den mittlerweile publizierten Bindungsstellen von Matuzumab und Cetuximab bzw. EGF in der Ektodomäne III/L2 von EGFR (Li et al., 2005; Schmiedel et al., 2008) und zeigten im Falle des Peptides mit KTL Motiv Übereinstimungen mit Teilen beider Epitope. Möglicherweise ist dieses Peptid in der Lage, alternative Strukturen mit KTL bzw. KTI Motiven an der Oberfläche von EGFR nachzubilden, die Gemeinsamkeiten mit beiden Epitopen von Cetuximab bzw. Matuzumab besitzen und daher von beiden Antikörpern erkannt werden können. Eine endgültige Klärung der Bindung der hier identifizierten Peptide an Cetuximab bzw. Matuzumab bzw. der Bindung der anti-Peptid Antikörper an EGFR könnte in nachfolgenden Untersuchungen mittels Röntgenkristallographie bzw. NMR strukturell aufgeklärt werden – die hierzu nötigen Peptide bzw. Proteine liegen bereits in gereinigter Form vor. Eine Optimierung der hier identifizierten Mimotope zur Steigerung der Affinitäten der induzierten anti-Peptid Antikörper für EGFR könnte zur Entwickung von Vakzinen führen, die eine Alternative zur wiederholten, kostenintensiven passiven Immunisierung von Patienten mit EGFR-exprimierenden Tumoren mit monoklonalen Antikörpern darstellen könnte.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Eindimensionale Gelelektrophoresen Die Analyse mitochondrialer Proteine aus juvenilen und seneszenten P. anserina-Wildstämmen mit Hilfe von eindimensionalen SDS- und eindimensionalen Blau-Nativen-Gelelektrophoresen zeigt keine deutlichen, seneszenzspezifischen Unterschiede. Im Gegensatz dazu werden in initialen Versuchen der nicht-radioaktiven 2D-PAGE differentiell gebildete Proteine visualisiert. 2. 2D-PAGE mit radioaktiv-markierten, mitochondrialen Proteinen aus jungen und alten P. anserina-Wildstämmen In der ungerichteten Proteomanalyse wurden 29 differentiell-gebildete Proteine identifiziert und zusätzlich zahlreiche Isoformen einiger Proteine gezeigt. Von der ß-ATPase wurden modifizierte Isoformen gefunden. Außerdem wurde eine seneszenspezifisch verringerte Bildung von ROS-Abwehr-Proteinen in den Mitochondrien detektiert. Im Gegensatz dazu wurde eine größere Menge eines Chaperons gefunden, das bei der Proteinsynthese eine Rolle spielt: eine Protein-Disulfid-Isomerase, die die Umlagerung und Neubildung von Di-Sulfid-Brücken bei der Faltung von Proteinen katalysiert. Zusätzlich wurde eine erhöhte Menge des Proteins SSC1 identifiziert. Dieses gehört zur Hsp70-Hitzeschock-Proteinfamilie. Es wurde ebenfalls eine erhöhte Menge des Apoptosefaktors Cyclophilin D in den mitochondrialen Proben aus den seneszenten Wildstämmen identifiziert. Die Identifizierung dieses Proteins in Mitochondrien von P. anserina stellt neben der Charakterisierung der Metacaspasen (Hamann et al., 2007) einen weiteren Ansatzpunkt für die Apoptoseforschung in P. anserina dar. Die molekularbiologische Analyse dieses Proteins wurde aufgrund dieser Proteomanalyse im Arbeitskreis aufgenommen (Dissertation D. Brust). Ein weiteres Protein, das in stark erhöhter Menge in den Proteinisolaten identifiziert wurde, ist PaMTH1. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur und die Funktion dieser neu identifizierten differentiell-gebildeten Methyltransferase während der Alterung in P. anserina mit Hilfe molekularbiologischer, biochemischer und physiologischen Analysen untersucht. 3. Charakterisierung von PaMTH1 Im Rahmen von Northernblot-Analysen wurde gezeigt, dass die PaMth1-Transkriptmenge in drei unabhängigen alten Wildstämmen im Vergleich zu den entsprechenden jungen Wildtsämmen deutlich erhöht ist. In einer Westernblot-Analyse von Gesamtproteinen und Mitochondrien aus jungen und seneszenten Wildstämmen wird der seneszenzspezifische Anstieg der Proteinmenge verifiziert. Die genauere Einordnung von PaMTH1 in die Klasse I der Methyltransferasen und die Ergebnisse der Analyse der Substratspezifizität geben einen Hinweis auf eine Schutzfunktion durch die Verhinderung einer ROS-Entstehung unter der Beteiligung von Substanzen mit einer Catecholgruppe. Die Ergebnisse der Analyse der Modulation der PaMth1-Expression in P. anserina deuten ebenfalls auf eine Schutzwirkung von PaMTH1 hin: PaMth1-Überexpressionsstämme zeigen eine verbesserte Wuchsrate auf stress-induzierenden Medien, weniger carbonylierte Proteine und vor allem eine verlängerte Lebensspanne ohne physiologische Nachteile im Vergleich zum Wildstamm. Dagegen lebt die PaMth1-Deletionsmutante kürzer und wächst schlechter auf ROS-induzierenden Medien, sie zeigt allerdings keine erhöhte Menge von carbonylierten Proteinen im eindimensionalen „Oxyblot“. Die beobachtete Lebensspannenverkürzung der PaMth1-Deletionsmutante wird jedoch durch die Reversion dieser Stämme wieder aufgehoben, sodass die Hypothese des Schutzes vor der ROS-Generierung durch die Methylierung von Dihydroxylgruppen anhand der erhaltenen Daten unterstützt wird.
Veränderungen in der akustischen Umwelt sind häufig mit Ereignissen verbunden. Diese wiederum können für ein Tier eine besondere Verhaltensrelevanz haben, im Gegensatz zu einem gleichbleibenden akustischen Hintergrund, der mit keinem positiven oder negativen Ereignis verbunden ist. Es ist also naheliegend zu spekulieren, dass Veränderungen oder neue akustische Reize im zentralen Nervensystem anders repräsentiert werden als der kontinuierliche Hintergrund und dass diese Repräsentation sowohl von der Häufigkeit der Stimuli als auch vom Unterschied zum akustischen Hintergrund abhängt. In Elektroenzaphalografie-Messungen (EEG) am Menschen wurde eine besondere Aktivitätsänderung bei auditorischen Abweichungen erstmals 1978 nachgewiesen. Dabei wurde ein akustischer Reiz über einen längeren Zeitraum regelmäßig wiederholt (Standard) und in einigen, seltenen Fällen durch einen anderen Reiz (Deviant) ersetzt. Dieser Deviant löste eine zusätzliche negative Komponente im EEG aus (Mismatch negativity), die bei den Standard-Stimuli nicht vorhanden war. Eine Voraussetzung, um MMN auszulösen, ist die Präsentation von einigen Standard-Stimuli, sodass eine neuronale Repräsentation des Stimulus aufgebaut werden kann, gegen die jeder weitere Reiz abgeglichen wird. Die zelluläre Basis von MMN und des zugrunde liegenden Mechanismus zur Detektion von auditorischen Veränderungen ist nur wenig erforscht. Als möglicher zellulärer Detektionsmechanismus akustischer Veränderungen wurde die Stimulus-spezifische Adaptation (SSA) vorgeschlagen, die zugleich der Ursprung von MMN im primären auditorischen Kortex sein könnte. SSA beschreibt die Eigenschaft von Neuronen der Hörbahn, auf die Wiederholung von identischen Reizen mit abnehmender Aktivität zu antworten und zugleich die Fähigkeit beizubehalten, andere Stimuli weiterhin mit hoher Aktivität zu repräsentieren. Die veränderte neuronale Repräsentation von Tönen mit niedriger Auftrittswahrscheinlichkeit, im Vergleich zu Tönen mit hoher Auftrittswahrscheinlichkeit, wurde bereits sehr eindrücklich im auditorischen Kortex der anästhesierten Katzen demonstriert. Die vorliegende Arbeit hat es sich zum Ziel gesetzt, bei der Repräsentation von auditorischen Abweichungen die Lücke zwischen der Ebene aufsummierter Potenziale (EEG beim Menschen) und der Ebene einzelner kortikaler Neurone zu schließen. Gleichzeitig sollte dabei erstmalig SSA im auditorischen Kortex des wachen Tieres nachgewiesen und so eine pharmakologische Interaktion der normalerweise eingesetzten Anästhetika mit SSA ausgeschlossen werden. Der experimentelle Ansatz basierte auf elektrophysiologischen Messungen mit chronisch implantierten Mikroelektroden im wachen Tier. Die Elektroden waren im auditorischen Kortex positioniert und ermöglichten eine gleichzeitige Messung der lokalen aufsummierten Potenziale (lokale Feldpotenziale, LFP) und der Aktionspotenziale einzelner Neurone als extrazelluläre Potenzialveränderungen. Das Stimulationsparadigma bestand aus Folgen zweier Reintöne, die mit unterschiedlicher Auftrittwahrscheinlichkeit präsentiert wurden. Der Ton mit hoher Auftrittwahrscheinlichkeit bildete den akustischen Hintergrund, der Ton mit niedriger Auftrittswahrscheinlichkeit (Deviant) die akustische Abweichung. In dieser Arbeit konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass Neurone im auditorischen Kortex der wachen Ratte akustische Abweichungen mit einer höheren Aktivität repräsentieren als den auditorischen Hintergrund (bis zu 19,5% Aktivitätsunterschied). Stimulusspezifische Adaptation ist somit auch im wachen Tier Teil der neuronalen Codierung der akustischen Umwelt. Mithilfe der Signalentdeckungstheorie konnte des Weiteren gezeigt werden, dass die unterschiedliche neuronale Repräsentation von häufigen und seltenen Stimuli auch zu einer erhöhten neuronalen Unterscheidbarkeit zwischen beiden Stimuli führte. Auf der Ebene der ereigniskorrelierten LFPs konnte SSA in zwei Komponenten nachgewiesen werden: der ersten, negativen Auslenkung und der folgenden, positiven Auslenkung. Besonders in der ersten, negativen Komponente war SSA systematisch nachzuweisen und sie war zusätzlich starkmit der Aktivität der einzelnen Neuronen korreliert, während die positive Komponente der LFPs keine Korrelation mit den Messungen der einzelnen Nervenzellen zeigte. Der Grad der SSA hing von der Auftrittwahrscheinlichkeit und dem Frequenzabstand der beiden Töne ab. Keine der Messungen hatte die besondere Charakteristik von MMN. Zusammenfassend lässt sich die Aussage treffen, dass SSA auch im wachen Tier nachgewiesen wurde, sowohl auf der Ebene einzelner Neurone als auch in der aufsummierten Aktivität, wenn auch in einer schwächeren Ausprägung als in den bisher veröffentlichten Ergebnissen in anästhesierten Tieren. Ein direkter Beitrag der kortikalen Neurone zu MMN konnte nicht gezeigt werden, es gab aber einen starken Zusammenhang zwischen den einzelnen Neuronen und den LFPs.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Auswirkungen von Feldenkrais-Bewegungsübungen auf ein Klientel, dass aus freien Stücken an Feldenkraiskursen eines niedergelassenen Feldenkraislehrers teilnimmt, wobei insbesondere gesundheitliche und psychosomatische Aspekte betrachtet werden. Feldenkrais formulierte die theoretischen Grundlagen der Methodik auf einem breiten wissenschaftlichen Fundament verschiedener Fachrichtungen, wie Medizin, Neurobiologie, Psychologie, Physik, Systemtheorie und Anthropologie und lieferte damit eine Erklärung, wie die von ihm entwickelte Bewegungsmethodik Ein uss auf die Entwicklung und die Lernfähigkeit eines jeden Individuums nehmen kann. Der Mensch wird dabei, im Gegensatz zur dualistischen Sichtweise, die in der klassischen Schulmedizin vorherrscht, als ein Ganzes gesehen, in dem die Bereiche Körper und Seele nicht zu trennen sind. Die moderne Neurobiologie bestätigt mit der Anwendung neuer Messmethoden, wie dem funktionellen Magnetresonanztomogramm bedeutende Aussagen der Theorie von Feldenkrais. Systemtheorie und Konstruktivismus sind dabei grundlegend für den feldenkrais'schen Denkansatz und für die heutige Psychosomatik, wie sie unter anderem von von Uexküll beschrieben wird. Der Mensch wird hier als autopoietisches System betrachtet, welches sich selbst ständig reguliert. Somit kann er sich wechselnden Umweltein flüssen anpassen und ist zur Selbstheilung fähig, worin Feldenkraislehrer, respektive Psychotherapeuten ihn unterstützen können. Zunehmend suchen Menschen zur Förderung der persönlichen Weiterentwicklung, wie gleichzeitig zur Bewältigung gesundheitlicher und insbesondere psychosomatischer Probleme Feldenkraiskurse auf. Vor diesem Hintergrund wurden in der Praxis eines niedergelassenen Feldenkraislehrers die Kursteilnehmer vor- und direkt nach der Teilnahme an zehn Feldenkraisstunden, sowie im Langzeitverlauf zu den Auswirkungen befragt. Die 82 erwachsenen Probanden der Studie waren zu 2/3 weiblich, bei einem Durchschnittsalter von 46 Jahren. Die Stichprobe glich in ihrem psychosomatischen Beschwerdestatus der durchschnittlichen Allgemeinbevölkerung, wohingegen ein überdurchschnittlich hohes Schulbildungs- und Berufsausbildungsniveau vorlag. Die Motivation der Kursteilnehmer lag gleichermaßen im Wunsch, die Fähigkeit der Körperwahrnehmung und die Beweglichkeit zu steigern, wie verschiedene Beschwerden und Erkrankungen zu verbessern. Anhand zweier standardisierter psychometrischer Fragebögen, dem Giessener Beschwerdebogen und der Symptom-Checkliste SCL-90-R konnte eine signifikante Verbesserung psychosomatischer und somit gesundheitlicher Beschwerden direkt nach dem Kurs, wie auch im Langzeitverlauf ein halbes Jahr nach Kursende beschrieben werden. Dazu zählen im Einzelnen Gliederschmerzen, Herzbeschwerden, Somatisierungstendenz, Zwanghaftigkeit, Depressivität, Aggressivität und die grundsätzliche psychische Belastung. Mithilfe des neu entwickelten Selbsteinschätzungsfragebogens des Verfassers ergaben sich weitere Hinweise auf die positiven Langzeitauswirkungen nicht nur im seelischen Bereich, sondern in weiteren zentralen Bereichen menschlichen Handelns, namentlich dem Wahrnehmungsbereich, dem kognitiven Bereich und der Beweglichkeit. Die Verbesserungen betrafen mehrere Lebensbereiche, den privaten, wie auch den beruflichen Bereich. Die Sicherheit der Feldenkraismethode gegenüber dem Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen wurde ebenfalls dokumentiert. Anhand kontrollierter randomisierter Folgestudien sollten die Ergebnisse abgesichert werden. Der kreative Wissensaustausch von Neurobiologen mit moderner Messtechnik und wissenschaftlich arbeitenden Feldenkraislehrern, die zur Entwicklung spezieller Messmethodik einen Beitrag leisten können, kann zu neuen Erkenntnissen auf den Gebieten des Lernverhaltens, der Reifung und der Gesundheit des Menschen führen.
Diese Arbeit untersuchte die Epidemiologie und den Einfluss verschiedener Faktoren (Grunderkrankung, empirische Therapie, Schweregrad der Sepsis und Erreger mit Resistenz) auf das Überleben von Patienten mit Septikämien. Die häufigsten Grunderkrankungen dieses Kollektivs waren Leukämien (33%), solide Neoplasien (14%) sowie kardiale Vorerkrankungen (14%). Knapp die Hälfte der Patienten erwarb die Septikämie im Krankenhaus (47%). ...
The pictorial art of the Church, as a spiritual product of the Christian civilisation, has continually received great influences from its ecclesiastical tradition and it was defined by its formal aesthetical standards and its iconographic preferences. A more nuanced reading of the parallels can be attained by placing the images in their visual context, which would allow a better appreciation of the meanings within. The biblical story of Adam and Eve, which is the theme of the following thesis, reflects the differentiation between the Eastern and the Western understanding of the events of the history of the holy Oikonomia, a point, which is the major ground for the development of the relative pictorial motifs. The protoplasts are the protagonists from their creation and life in paradise, the fall and expulsion until their resurrection through Christ. Their story is visualised in a number of scenes and episodes, having thus their original sin and resurrection for specific reasons centralised. This doctoral thesis attempts to collect as many parallels of the scenes is possible, trying to collate the Eastern with the Western visual approach in a deductive way, in order to reach our constructive conclusions and make available the combination of the art, theology and liturgy in the scenes of Adam and Eve in Genesis and in Resurrection (Anastasis). The reading we tried to perform was based upon the specific iconographical elements, which were worth to be commented. Our aim was to detect the direct bond between the production of art and the relevant patristic and apocryphal writings or even the theological theories, by quoting texts from the ecclesiastical literature, as well as the liturgical praxis.
Streptomyces coelicolor ist der Modellorganismus der GC reichen, Gram+ Actinomyceten, die mehr als zwei Drittel aller bekannten Antibiotika produzieren. Phänotypisch zeichnet er sich durch die Bildung eines Substrat- und eines Luftmyzels aus, welches im Laufe der weiteren Differenzierung Sporen bildet. Streptomyceten produzieren neben Antibiotika noch eine Vielzahl biotechnologisch interessanter Metaboliten. Der komplexe Lebenszyklus und Stoffwechsel erfordern eine genaue Regulation der Genexpression. Die letzten Jahre haben gezeigt, dass neben Proteinen auch die RNA eine regulatorische Funktion hat. Verschiedene regulatorisch aktive RNA Elemente wie Riboswitche, RNA-Thermometer und kleine nicht kodierende RNAs (small noncoding RNAs – sRNAs) wurden identifiziert. sRNAs wirken meist als antisense Riboregulatoren, indem sie ihre Ziel-mRNA binden und dadurch die Translation hemmen oder fördern. In dieser Arbeit wurden verschiedene bioinformatische Methoden verwendet, um sRNAs im Genom von S. coelicolor vorherzusagen. Es wurden Terminatorstrukturen und konservierte Sekundärstrukturen in den intergenen Regionen vorhergesagt, die keinem Gen zuzuordnen waren. In einem weiteren Ansatz wurden Bindestellen des Regulatorproteins DasR vorhergesagt, um DasR kontrollierte sRNAs zu identifizieren. Zusätzlich wurde mittels 454 Sequenzierung erstmalig das Transkriptom von S. coeliocolor analysiert. Auf diese Weise konnten etwa 500 sRNAs vorhergesagt werden. Eine der beiden charakterisierten sRNAs, sc32, ist 139 nt lang. Ihr Promoter liegt im kodierenden Bereich des Gens bldC und sie wird spezifisch durch Kälteschock induziert. Die zweite charakterisierte sRNA, sc1, ist 159 nt lang und in allen sequenzierten Streptomyceten konserviert. Ihre Expression wird nur bei Stickstoffmangel in der Stationärphase reprimiert. Durch molekularbiologische Analysen konnte ein Zielgen von sc1 identifiziert werden, die extrazelluläre Agarase DagA. Es konnte gezeigt werden, dass sc1 an die dagA-mRNA bindet und dadurch die Translation inhibiert. Als zweites mögliches Ziel von sc1 konnte die Histidinkinase SCO5239 identifiziert werden. Hier wurde gezeigt, dass Koexpression von sc1 die Expression einer SCO5239 Reportergenfusion um den Faktor acht steigert. Durch Analyse des Proteoms von sc1 Mutanten, konnte die differenzierte Expression von elf weiteren Proteinen gezeigt werden. Sc1 scheint als Regulator zu agieren, indem es auf die Stickstoffversorgung der Zelle reagiert und den Sekundärmetabolismus deaktiviert.
Das Ziel dieser Studie war die Etablierung von Grenzwerten für die bronchiale Methacholinprovokation durch Vergleich des Aerosol Provokation Systems (APS-SC) mit einem ATS Standard (five-breath dosimeter method, SDM). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die APS-SC Methode unter Verwendung eines Kurzprotokolls und des Systems der Firma Cardinal Health eine sichere, schnelle und verlässliche Methode der bronchialen MCP darstellt. Im Schnitt erspart dieses Verfahren acht Minuten gegenüber der klassischen SDM gemäß dem von der ATS empfohlenen „short five breath dosimeter protocol“. Zudem entfallen in der Vorbereitung das Herstellen und die Lagerung mehrerer unterschiedlich konzentrierter Methacholinlösungen; während der Untersuchung existiert daher auch kein Verwechslungsrisiko. Der Test selbst ist für Untersucher und Patient weniger belastend. Die Verwendung einer Konzentration von 16,00 mg/ml für die Methacholin-Testlösung stellt einen guten Mittelweg zwischen akzeptablen Inhalationszeiten innerhalb der Stufen und einer nicht zu aggressiven Konzentration dar, mit der vom Anfang eines Tests bis zu seinem Ende gearbeitet werden kann. Zwischen den Kategorien der BHR für die SDM- und die APS-SC Methode besteht ein enger Zusammenhang. Als Grenzwert für die Annahme einer BHR – definiert als diejenige Methacholindosis bzw. -konzentration, die zu einem Abfall der FEV1 um 20 % vom Ausgangswert führt – stimmt der bestehende und von der ATS publizierte Grenzwert von 8,00 mg/ml am besten mit einer Dosis von 1,00 mg Methacholin in der APS-SC Methode überein.
Akute Hochrisiko-Leukämien oder deren Rezidive, chronische Leukämien, Myelodysplastische Syndrome und Hodgkin- und Non-Hodgkin-Lymphome sind Indikationen für hämatopoetische Stammzelltransplantationen. Das Verfahren ist mit einer hohen Therapie-assoziierten Morbidität und Mortalität (TRM), die bei 5-40% liegt, assoziiert. Hauptprobleme sind dabei neben Infektionen die akute und chronische Transplantatreaktion (Graft-versus-Host-Erkrankung, GvHD). Die TRM variiert je nach Grunderkrankung, Spender und Allgemeinzustand des Patienten. Um Risikofaktoren für die TRM zu identifizieren, analysierten wir in einer retrospektiven Studie 205 allogene pädiatrische SZT in 4 Kliniken, von denen jeweils 2 Kliniken ein hohes bzw. niedriges Risikoprofil hinsichtlich der TRM hatten. Wir überprüften die Anwendbarkeit und Validität des von Matthes-Martin et al. entwickelten Risikoscores (TRMScore), der aus drei Risiko-Punkten Patienten-spezifische (Alter, Grunderkrankung) und Therapie-spezifische (Spender) Charakteristika miteinander kombiniert. Dieser Score teilt die Patienten in 4 TRM–Risikogruppen ein mit einem Score von 0 Punkten (Patient unter 10 Jahren mit HLA-identischen Geschwister als Donor) bis zu 3 Punkten (Patient über 10 Jahren, CR3 und HLA-nicht passenden Spender). Wir modifizierten den TRM-Score von Matthes-Martin et al., indem wir die Patienten mit einem TRM-Score von 0 und 1 in eine erste Gruppe (TRM-Score I) und die Patienten mit dem TRM-Score von 2 und 3 in eine zweite Gruppe zusammen (TRM-Score II) zusammenfassten, und entwickelten den mTRM-Score (modifizierter TRM-Score). Die Indikationen zur SZT waren ALL, AML, CML, Non-Hodgkin-Lymphome, Hodgkin-Lymphome und MDS. Es gab 88 KMT und 115 PBSZT und in 2 Fällen war die Stammzellquelle eine Kombination aus Knochenmark und peripherem Blut. Das Patientenalter lag zwischen 0 und 23 Jahren. Spender waren MSD (26,8%), MRD (1%), MUD (53,2), MMUD (10,2%) und MMRD (8,8). Am LFU lebten 61% der Patienten. Von den 39% der verstorbenen Patienten sind 40% aufgrund eines Rezidivs verstorben und 60% transplantationsassoziiert. Die Gesamt-TRM lag bei 22,4%. Wir teilten transplantationsassoziierte Faktoren in folgende Gruppen ein: Patienten-assoziierte Variablen, Spender-assoziierte, Krankheits-assoziierte, Therapie-assoziierte Variablen und sonstige Variablen. Die logistische Regression zeigte signifikant prognostische Faktoren, die die TRM beeinflussen. Das waren die Klinik (P=0,0045), in der die SZT durchgeführt wurde, das Jahr der SZT (P=0,0457, ab 2001) und der Spendertyp (P=0,0083, kein MSD). Die Diagnose, der Remissionsstatus bei SZT und der TRM-Score waren keine prognostischen Risikofaktoren für die TRM. Bei Anwendung des mTRM-Scores kristallisierte sich dieser als ein Prädiktor für die TRM (P=0,0447) heraus. Ein TRM-Score von I ging mit einer niedrigen TRM-Rate einher. Der mTRM-Score kann aufgrund der Ergebnisse zur Therapieentscheidung herangezogen werden, da er eine Einschätzung der tatsächlichen Überlebenswahrscheinlichkeit für die Patienten möglich macht. Die Klinik als Risikofaktor für die TRM ist nicht alleine durch das Patientenkollektiv und durch die Auswahl des Spendertyps zu erklären. Anhand der 1-Jahres-TRM (23%) von Matthes-Martin et al. errechneten wir die zu erwartende TRM-Rate für unsere Kliniken. Die erwartete TRM wich in Klinik C und Klinik D stark von der beobachteten TRM ab, in Klinik A und Klinik B waren sie annähernd gleich. Ein signifikanter Unterschied bestand nur bei Klinik C mit einem p-Wert von 0,05 bei dem TRM-Score und 0,02 bei dem mTRM-Score. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass das Outcome der SZT von den Kliniken an sich bzw. deren Therapiemodalitäten beeinflusst wurde.
In this work we investigate phenomenological aspects of an anisotropic quark-gluon plasma. In the first part of this thesis, we formulate phenomenologicalmodels that take into account the momentumspace anisotropy of the system developed during the expansion of the fireball at early-times. By including the proper-time dependence of the parton hard momentum scale, phard(), and the plasma anisotropy parameter, Xi, the proposed models allow us to interpolate from 0+1 pre-equilibrated expansion at early-times to 0+1 ideal hydrodynamics at late times. We study dilepton production as a valuable observable to experimentally determine the isotropization time of the system as well as the degree of anisotropy developed at early-times. We generalize our interpolating models to include the rapidity dependence of phard and consider its impact on forward dileptons. Next, we discuss how to constrain the onset of hydrodynamics by demanding two requirements of the solutions to the equations of motion of viscous hydrodynamics. We show this explicitly for 0+1 dimensional 2nd-order conformal viscous hydrodynamics and find that the initial conditions are non-trivially constrained. Finally, we demonstrate how to match the initial conditions for 0+1 dimensional viscous hydrodynamics from pre-equilibrated expansion. We analyze the dependence of the entropy production on the pre-equilibrium phase and discuss limitations of the standard definitions of the non-equilibrium entropy in kinetic theory.
Large amplitude intramolecular motions in non-rigid molecules are a fundamental issue in chemistry and biology. The conventional approaches for study these motions by far-infrared and microwave spectroscopy are not applicable when the molecule is non-polar. Therefore, in the current thesis an alternative approach for the investigation of large amplitude intramolecular motions was developed and tested. This new method is based on femtosecond rotational degenerate four-wave mixing spectroscopy (fs DFWM), which is a particular implementation of rotational coherence spectroscopy. The method was successfully applied for the investigation of pseudorotation in pyrrolidine and the ring-puckering vibration in cyclopentene. Another important subject is the photophysics of molecules and molecular clusters which have an ultrashort lifetime of their electronically excited state (photoreactivity). These ultrashort lifetimes often represent a protective mechanism causing photostability. The photoreactivity is usually the manifestation either of an “elementary” reaction, such as proton or electron transfer, which occurs in the excited state or of a fast non-radiative deactivation processes, such as internal conversion via conical intersection of the electronically excited and ground state. Due to a short-lived excited state, the conventional vibrational spectroscopic methods, such as IR depletion detected by resonance two-photon ionization spectroscopy (IR/R2PI), are not applicable for the structural investigation of these systems. Therefore, new approach, termed IR depletion detected by multiphoton ionization with femtosecond laser pulses (IR/fsMPI), was developed for studying the structure of photoreactive microsolvated molecules. The IR/fsMPI technique was applied for investigating the clusters of 1H-pyrrolo[3,2-h]quinoline with water/methanol as well as adenine- and 9-methyl-adenine-hydrates. In addition, the excited state dynamics of bifunctional azaaromatic molecule 7-(2'-pyridyl)indole (7PyIn) was studied by femtosecond pump-probe resonance excitation multiphoton ionization technique (fs REMPI). Under electronic excitation of this molecule a fast proton transfer (phototautomerization) takes place, which is followed by radiationless excited state deactivation process. The fs REMPI spectra lead to the conclusion that the phototautomerization in 7PyIn is coupled with a twisting of the molecule, and that the twisting provides an efficient channel for ultrafast radiationless excited state deactivation. This pattern of excited-state tautomerization/deactivation might be quite general.
Nahrungsmittelallergikern steht aufgrund inakzeptabler Nebenwirkungen bei der spezifischen Immuntherapie zurzeit noch keine kausale Therapie dieser Erkrankung zur Verfügung. Demzufolge bleibt die Vermeidung der entsprechenden Lebensmittel für Nahrungsmittelallergiker der einzige Weg möglicherweise lebensbedrohlichen allergischen Reaktionen zu entgehen. Ziel dieser Arbeit war es, das Potential eines viralen Vektors für die Verwendung bei der spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie zu untersuchen. Die Überlegung dahinter war, das Risiko eines anaphylaktischen Schocks, der bei Injektion eines Allergens immer gegeben ist, durch intrazelluläre Expression des Proteins über das rekombinante Virus zu verringern. Zusätzlich dazu bringt das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) ideale Voraussetzungen für eine Allergievakzine mit: Die Infektion mit MVA führt zu einer stark Th1-gerichteten Immunantwort gegen die viral exprimierte Proteine, die möglicherweise die allergische Th2-gerichtete Immunantwort modulieren kann. Die prophylaktische Immunisierung mit MVA-OVA im Mausmodell der systemischen Sensibilisierung gegen Ovalbumin (OVA) führte dosisabhängig zur Suppression der spezifischen IgE-Antwort und somit zum Schutz vor allergischer Sensibilisierung. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Vakzinierung mit MVA-OVA eine dauerhafte spezifische IgG-Antwort induziert. Diese Daten unterstützen das Konzept einer Modulation der Sensibilisierung durch MVA-Vakzine. Weiterhin wurden zwei rekombinante Vakzinen generiert, mittels derer entweder das Tropomyosin aus Garnelen (Pen a 1) oder das Lipid-Transfer-Protein aus Haselnuss (Cor a 8) intrazellulär exprimiert werden konnte. Dass die Sensibilisierung gegen diese Allergene häufig mit schweren allergischen Reaktionen korreliert, unterstreicht die Notwendigkeit einer verbesserten Immuntherapie in diesem Bereich. Während MVA-Pen a 1 in ausreichender Menge und Qualität für die Verwendung im Mausmodell hergestellt werden konnte, gelang es nicht, eine homogene Population von MVA-Cor a 8 zu gewinnen, in der das Selektionsgen K1L nicht mehr vorhanden war. Parallel zur Virusherstellung wurden Mausmodelle der Sensibilisierung gegen Cor a 8 und Pen a 1 entwickelt. Vergleiche unterschiedlicher Mausstämme ergaben, dass sich Mäuse des Stammes CBA/J am empfänglichsten für eine systemische Sensibilisierung mit Cor a 8 sind. Aufgrund von Erfahrungen zur Sensibilisierung gegen Pen a 1 wurden Mäuse des Stammes C3H/HeJ bei der Etablierung eines Garnelenallergiemodells verwendet. Es zeigte sich, dass durch die intragastrale Applikation von 0,1 mg Pen a 1 sowie Choleratoxin als Adjuvanz (drei Gaben in dreiwöchigem Abstand), gefolgt von einer systemischen Gabe des Allergens mit Aluminiumhydroxid eine spezifische Sensibilisierung hervorgerufen werden konnte, die nach Exposition mit Pen a 1 zu allergischen Symptomen führte. Auch in diesem Modell bot die prophylaktische Immunisierung mit MVA-Pen a 1 Schutz vor Pen a 1spezifischer Sensibilisierung. Um die therapeutische Effektivität der Vakzine ermitteln zu können, muss die begonnene Etablierung eines Allergiemodells mit symptomauslösenden Provokationen und immunologischen Analysen weitergeführt werden. Der in dieser Studie beobachtete starke schützende Effekt einer Vakzinierung mit MVA vor allergischer Sensibilisierung und das sehr gute Sicherheitsprofil dieses Vektors in klinischen Studien zu anderen Erkrankungen belegt die Möglichkeit einer Verwendung von MVA zur erfolgreichen spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie.
Das Modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) entstand nach mehr als 500 Passagen des Chorioallantois Vacciniavirus Ankara (CVA) auf Hühnerembryofibroblasten. Mit der Passagierung ging u.a. der Verlust zahlreicher Vacciniavirus Virulenzfaktoren einher, wodurch MVA einen hochattenuierten Phänotyp aufweist. Bei mangelnder Pathogenität für humane Organismen verfügt das MVA jedoch über eine vollständig erhaltene Genexpression inklusive integrierter Fremdgene. Hierdurch bedingt ist MVA ein vielversprechender Kandidat nicht nur als Pockenimpfstoff der dritten Generation, sondern auch als Vektorvakzine gegen zahlreiche Infektionskrankheiten sowie in der Tumor-assoziierten Immunotherapie. Ein wesentliches Charakteristikum der Attenuierung von MVA ist seine fehlende Replikationsfähigkeit in humanen Zellen. Bislang ist es jedoch noch nicht möglich gewesen, die hierfür verantwortlichen genetischen Veränderungen eindeutig zuzuordnen. Vorangegangene Arbeiten wiesen darauf hin, dass sich der beschriebene Effekt zumindest teilweise auf die Zeitspanne zwischen zwei Vorläufern des MVA eingrenzen lässt. So zeigten sich humane HeLa Zellen für das CVA 152 permissiv, während gegenüber dem CVA 386 nur noch eine Semipermissivität bestand. Mit Hilfe einer vergleichenden Sequenzanalyse von CVA 152 und CVA 386 konnten verschiedene Deletionen identifiziert werden, deren Auftreten potentiell verantwortlich für den veränderten Phänotyp von CVA 386 ist. In diesem Zusammenhang wurden im Rahmen dieser Arbeit die Gene C12L, C14L, C15L und C16L der Deletion I und die Gene M1L, M2L und der OLR 037 der Deletion II charakterisiert. Durch Transfektion von Expressionsplasmiden wurden die entsprechenden Proteine bezüglich ihrer Expression und posttranslationalen Modifikation, sowie ihrer subzellulären Verteilung untersucht. So ließ sich für das Protein M2 eine posttranslationale N-Glykosylierung und die Lokalisation innerhalb des trans-medialen Golgiapparats nachweisen. Zusätzlich konnte eine Sekretion des M2 Proteins im Zellüberstand transfizierter 293T-Zellen gezeigt, sowie die bereits publizierte Inhibition der NF-:B-Aktivierung durch extrazellulär zugegebenes M2 Protein eingeleitet werden. Die Proteine C14 und C15 zeigten sich in der Laserscanmikroskopie mitochondrial lokalisiert; C16 dagegen kolokalisierte neben einer hauptsächlich intranukleären Verteilung zusätzlich mit F-Aktin. Ferner ergaben sich für die Proteine C14 und C15 erste Hinweise auf eine inhibitorische Funktion gegenüber Staurosporin-induzierter Apoptose.
In der Arbeit wird Fuzzy-Regression als mögliche ökonometrische Analysemethode bei fehlerbehafteten Daten modelliert und erprobt. Dazu ist die interpretatorische Lücke zu schließen, die einerseits zwischen den Datenproblemen in empirischen Datensätzen und ihrer Modellierung als Fuzzy-Daten und andererseits zwischen der Modellierung der Fehlereinflüsse in den Fuzzy-Daten und den Aussagen und Analysen besteht, die auf der Basis einer Fuzzy-Regression über die vorliegenden Daten getroffen werden können. Da bereits eine Vielzahl von Ansätzen zur Fuzzy-Regression entwickelt wurden, wird als das Hauptproblem nicht die Modellierung der Fuzzy-Methoden als solcher gesehen, sondern vielmehr die fehlende Vorstellung über die mögliche Bedeutung der Fuzzy-Modellierungen im konkreten Anwendungsfall. Die Arbeit vollzieht deshalb im Sinne einer Machbarkeitsstudie die verschiedenen Schritte von den Fehlereinflüssen in wirtschaftsbezogenen Datensätzen und deren Modellierung als Fuzzy-Daten bis hin zur explorativen Analyse mit Fuzzy-Regression nach. Dabei werden für jeden der Schritte exemplarische Beispiele ausgewählt, um die Denkweise der Fuzzy-Modellierung auszuarbeiten und die Möglichkeiten und Grenzen der Methoden aufzuzeigen. Die Untersuchungen zeigen, dass vor allem die Fuzzy-Modellierung von Fehlereinflüssen in den Merkmalsdaten und die Beschreibung von gleichförmigen Strukturen in den Fehlereinflüssen durch Fehlerszenarien als Analyseinstrumente geeignet sind, da sie eine Grundlage für eine weitergehende Untersuchung der Fehlereinflüsse bilden. Als Ausblick auf ein Schätzmodell für Fuzzy-Regression bei Fehlern in den Daten werden abschließend einige Ansätze für die Einbettung des Regressionsproblems für Fuzzy-Merkmalsvariablen in die Verteilungsmodelle für Fuzzy-Zufallsvariablen vorgestellt, die auf der Konstruktion der Fehlerszenarien basieren.
Ziel dieser Arbeit war es, zwei Atemtestverfahren in der Diagnostik der bakteriellen Fehlbesiedelung im Dünndarm bei Kindern mit Zystischer Fibrose miteinander zu vergleichen. Der moderne 13C-Xylose-Atemtest wurde dem bisher etablierten H2-Glukose-Atemtest gegenübergestellt. Dabei sollte zusätzlich die Suszeptibilität der CF-Patienten für eine IBF eruiert werden. Die Probanden absolvierten einen kombinierten 13C-Xylose-/H2-Glukose-Atemtest. Retrospektiv wurden zunächst die H2-Ergebnisse der einzelnen Probandengruppen analysiert und dann den maximalen PDR-, cPDR- und den DOB-Werten gegenübergestellt. Die Ergebnisse der aktuellen Studie sprechen für die Prädisposition der CF-Patienten, eine IBF zu entwickeln. Kliniker sollten aber bei der Interpretation der Atemtestergebnisse stets die beeinflussenden Faktoren, die vor allem die Erkrankung der Mukoviszidose mit sich bringt, berücksichtigen und therapeutische Konsequenzen vorsichtig umsetzen. So können die erhöhten Wasserstoffkonzentrationen im H2-Glukose-Atemtest bei CF-Kindern nicht ausschließlich einer IBF zugeschrieben werden. Die hohen Nüchternwerte sind auch Ausdruck der allgemeinen Maldigestion, Malabsorption und der intestinalen Motilitätsstörung, die bei diesen Patienten vorherrschen. Der 13C-Xylose-Atemtest lieferte in den Gruppen der Erwachsenen und Kinder ohne Zystische Fibrose repräsentative Ergebnisse, was für zukünftige Nutzung im Rahmen der Diagnostik einer IBF spricht. Bei heranwachsenden Kindern ist lediglich die altersabhängige endogene CO2-Produktion und orozökale Transitzeit zu berücksichtigen. Für die Diagnostik einer IBF speziell bei Patienten mit Mukoviszidose erscheint uns der 13C-Xylose-Atemtest nicht geeignet, was wir hauptsächlich der krankheitsspezifischen generellen Malassimilation, der Malabsorption und der intestinalen Motilitätsstörung zuschreiben. Wir beführworten daher aktuell weiterhin unter Berücksichtigung der ihn beeinflussenden Faktoren die Anwendung des H2-Glukose-Atemtests in der gastroenterologischen Diagnostik einer IBF wegen der einfachen, preiswerten und nichtinvasiven Anwendbarkeit. Weitere Studien sollen in Zukunft klären, ob der 13C-Xylose-Atemest trotz seiner hohen Kosten regelmäßig mit Nutzen im klinischen Alltag anzuwenden ist. Im Vergleich mit dem Goldstandard des Jejunalaspirates müssen Sensitivität und Spezifität des Isotopen-Atemtests in zukünftigen Studien erarbeitet werden.
In this thesis we have studied the physics of different ultracold Bose-Fermi mixtures in optical lattices, as well as spin 1=2 fermions in a harmonic trap. To study these systems we generalized dynamical mean-field theory for a mixture of fermions and bosons, as well as for an inhomogeneous environment. Generalized dynamical mean-field theory (GDMFT) is a method that describes a mixture of fermions and bosons. This method consists of Gutzwiller mean-field for the bosons, and dynamical mean-field theory for the fermions, which are coupled on-site by the Bose-Fermi density-density interaction and possibly a Feshbach term which converts a pair of up and down fermions into a molecule, i.e. a boson. We derived the self-consistency equations and showed that this method is well-controlled in the limit of high lattice coordination number z. We develop real-space dynamical mean-field theory for studying systems in an inhomogeneous environment, e.g. in a harmonic trap. The crucial difference compared to standard DMFT is that we are taking into account that different sites are not equivalent to each other and thus take into account the inhomogeneity of the system. Different sites are coupled by the real-space Dyson equation. ...