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Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Auswirkungen von Feldenkrais-Bewegungsübungen auf ein Klientel, dass aus freien Stücken an Feldenkraiskursen eines niedergelassenen Feldenkraislehrers teilnimmt, wobei insbesondere gesundheitliche und psychosomatische Aspekte betrachtet werden. Feldenkrais formulierte die theoretischen Grundlagen der Methodik auf einem breiten wissenschaftlichen Fundament verschiedener Fachrichtungen, wie Medizin, Neurobiologie, Psychologie, Physik, Systemtheorie und Anthropologie und lieferte damit eine Erklärung, wie die von ihm entwickelte Bewegungsmethodik Ein uss auf die Entwicklung und die Lernfähigkeit eines jeden Individuums nehmen kann. Der Mensch wird dabei, im Gegensatz zur dualistischen Sichtweise, die in der klassischen Schulmedizin vorherrscht, als ein Ganzes gesehen, in dem die Bereiche Körper und Seele nicht zu trennen sind. Die moderne Neurobiologie bestätigt mit der Anwendung neuer Messmethoden, wie dem funktionellen Magnetresonanztomogramm bedeutende Aussagen der Theorie von Feldenkrais. Systemtheorie und Konstruktivismus sind dabei grundlegend für den feldenkrais'schen Denkansatz und für die heutige Psychosomatik, wie sie unter anderem von von Uexküll beschrieben wird. Der Mensch wird hier als autopoietisches System betrachtet, welches sich selbst ständig reguliert. Somit kann er sich wechselnden Umweltein flüssen anpassen und ist zur Selbstheilung fähig, worin Feldenkraislehrer, respektive Psychotherapeuten ihn unterstützen können. Zunehmend suchen Menschen zur Förderung der persönlichen Weiterentwicklung, wie gleichzeitig zur Bewältigung gesundheitlicher und insbesondere psychosomatischer Probleme Feldenkraiskurse auf. Vor diesem Hintergrund wurden in der Praxis eines niedergelassenen Feldenkraislehrers die Kursteilnehmer vor- und direkt nach der Teilnahme an zehn Feldenkraisstunden, sowie im Langzeitverlauf zu den Auswirkungen befragt. Die 82 erwachsenen Probanden der Studie waren zu 2/3 weiblich, bei einem Durchschnittsalter von 46 Jahren. Die Stichprobe glich in ihrem psychosomatischen Beschwerdestatus der durchschnittlichen Allgemeinbevölkerung, wohingegen ein überdurchschnittlich hohes Schulbildungs- und Berufsausbildungsniveau vorlag. Die Motivation der Kursteilnehmer lag gleichermaßen im Wunsch, die Fähigkeit der Körperwahrnehmung und die Beweglichkeit zu steigern, wie verschiedene Beschwerden und Erkrankungen zu verbessern. Anhand zweier standardisierter psychometrischer Fragebögen, dem Giessener Beschwerdebogen und der Symptom-Checkliste SCL-90-R konnte eine signifikante Verbesserung psychosomatischer und somit gesundheitlicher Beschwerden direkt nach dem Kurs, wie auch im Langzeitverlauf ein halbes Jahr nach Kursende beschrieben werden. Dazu zählen im Einzelnen Gliederschmerzen, Herzbeschwerden, Somatisierungstendenz, Zwanghaftigkeit, Depressivität, Aggressivität und die grundsätzliche psychische Belastung. Mithilfe des neu entwickelten Selbsteinschätzungsfragebogens des Verfassers ergaben sich weitere Hinweise auf die positiven Langzeitauswirkungen nicht nur im seelischen Bereich, sondern in weiteren zentralen Bereichen menschlichen Handelns, namentlich dem Wahrnehmungsbereich, dem kognitiven Bereich und der Beweglichkeit. Die Verbesserungen betrafen mehrere Lebensbereiche, den privaten, wie auch den beruflichen Bereich. Die Sicherheit der Feldenkraismethode gegenüber dem Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen wurde ebenfalls dokumentiert. Anhand kontrollierter randomisierter Folgestudien sollten die Ergebnisse abgesichert werden. Der kreative Wissensaustausch von Neurobiologen mit moderner Messtechnik und wissenschaftlich arbeitenden Feldenkraislehrern, die zur Entwicklung spezieller Messmethodik einen Beitrag leisten können, kann zu neuen Erkenntnissen auf den Gebieten des Lernverhaltens, der Reifung und der Gesundheit des Menschen führen.
Die mitochondriale Atmungskette und insbesondere die Cytochrom c Oxidase als deren terminales Enzym sind essentiell für den Energiestoffwechsel eukaryotischer Zellen. Die Assemblierung der mitochondrialen Cytochrom c Oxidase mit ihren bis zu 13 Untereinheiten ist noch nicht bis ins Detail aufgeklärt, aber es handelt sich um einen geordneten, stark regulierten Prozess, und Defekte der Assemblierung sind häufig Ursache für neurodegenerative und myopathische Erkrankungen. In Eukaryoten sind bisher mehr als 30 Proteine identifiziert worden, die an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt sind, darunter Surf1. Beim Menschen führt der Verlust von Surf1 zu einer letalen neurodegenerativen, als Leigh-Syndrom bezeichneten Krankheit, wobei die genaue Rolle von Surf1 bei der Assemblierung der Cytochrom c Oxidase unklar ist. Das Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans kann als Modellorganismus für die mitochondriale Atmungskette dienen, da seine aeroben Atmungskettenkomplexe eine deutliche Homologie zu denen der Mitochondrien auf weisen. P. dentrificans besitzt zwei homologe Gene für Surf1, die in Operons mit terminalen Oxidasen assoziiert sind: surf1c ist im cta-Operon lokalisiert, das für Untereinheiten der aa3-Cytochrom c Oxidase kodiert, und surf1q im qox-Operon, das die Gene für die ba3-Ubichinoloxidase enthält. Vorrangiges Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Gene und ihre Translationsprodukte zu charakterisieren und auf ihre Funktion hin zu untersuchen. Chromosomale Einzel- und Doppeldeletionen beider surf1-Gene führten zu einem spezifischen Aktivitätsverlust der jeweiligen Oxidase in Membranen, wobei surf1c und surf1q unabhängig von einander für ihre korrespondierenden Oxidasen zuständig sind und keine überlappenden Funktionen besitzen. Dies war der erste experimentelle Hinweis, dass ein Surf1-Protein auch bei der Assemblierung einer Chinoloxidase eine Rolle spielt. Untersuchungen an aufgereinigter aa3-Cytochrom c Oxidase ergaben, dass der Hämgehalt im Fall der surf1c-Deletion stark vermindert ist. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Vermutungen, dass Surf1 eine Rolle beim Häm-Einbau in UEI spielt. Diese Arbeit untersuchte zum ersten Mal aufgereinigtes Surf1-Protein und lieferte mit der Charakterisierung weitere Hinweise auf seine Rolle beim Häm a-Einbau in terminale Oxidasen. So konnte gezeigt werden, dass sowohl Surf1c und als auch Surf1q Häm a in vivo binden. Mit Hilfe spektroskopischer Methoden und der isothermen Titrationskalorimetrie konnte die Bindung von Häm a an apo-Surf1c und Apo-Surf1q quantifiziert werden. Beide Proteine binden Häm a mit submikromolaren Affinitäten in einer 1:1 Stöchiometrie. Ligandenbindungspektren wiesen weiterhin darauf hin, dass das Eisenatom des Häm a in Surf1 nur über fünf Liganden koordiniert ist. Über gerichtete Mutagenese konnte der konservierte Histidinrest His193 für Surf1c und His202 für Surf1q als möglicher fünfter Ligand des Eisenatoms identifiziert werden. Untersuchungen zur Wechselwirkung mit anderen Proteinen zeigten eine direkte Interaktion zwischen der Häm a Synthase und den beiden Surf1-Proteinen in vivo und in vitro, die zuvor noch für kein anderes Surf1-Homolog beschrieben war. Zusätzlich konnte ein Transfer von Häm von der Häm a Synthase auf Surf1c bzw. Surf1q in vitro erreicht werden. Für Surf1c ließ sich außerdem eine Interaktion mit Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase nachweisen. Obwohl die Funktion von Surf1 im Rahmen der Biogenese der Cytochrom c Oxidase noch nicht abschließend geklärt werden konnte, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit nichtsdestotrotz klare Hinweise auf eine direkte Beteiligung von Surf1 beim Einbau der Häm a-Kofaktoren, und ein neues Modell für die Funktion von Surf1 konnte erstellt werden.
Es war das Ziel dieser Untersuchung, die Güte der Behandlung im Stammzelltransplantationszentrum Frankfurt a.M. zu eruieren. Besonderer Wert wurde auf die Analyse von Infektionen und TRM gelegt. Dabei sollten zwei Zeiträume miteinander verglichen werden. Es wurde gefunden, dass trotz Zunahme des Risikoprofils der Patienten sowie der Schwere der Erkrankungen im Zeitraum II die Inzidenz der Infektionen sowie die Rate an TRM stabil blieb. Die bei der Auswertung der Daten aufgetretenen Schwierigkeiten hinsichtlich der Erfassung der Daten und hinsichtlich der Vielfalt der erhobenen Daten zeigte uns, dass es eventuell sinnvoll ist, eine Studie mit ähnlichen Endpunkten anhand verschiedener, definierter Patientenkollektive zu erheben. Leider ist es nicht möglich gewesen, unser Patientenkollektiv zum Beispiel nach Erkrankungen zu separieren, weil die Fallzahlen für die Erkrankungen zu gering gewesen wären. Desweiteren war ja das Ziel der Studie, alle Patienten einzubinden und ein repräsentatives Bild der Transplantationen in Frankfurt am Main zu schauen. Wir haben in unserer Studie den Riskscore angewandt, um die Effizienz herauszufinden. Wir konnten zeigen, dass der Riskscore durch ein objektiviertes Verfahren eine realistische Einschätzung der Komplikationen und Überlebenswahrscheinlichkeiten bietet und in Zukunft für alle zu transplantierenden Patienten zur Risikostratifizierung eingesetzt werden sollte. Anhand des geschätzen Risikos lässt sich zum Beispiel das Verfahren der Konditionierung (intensivere Chemotherapie), des Monitorings oder der zusätzlichen Behandlungsmöglichkeiten (Prophylaxe,DLI, Immunmodulatoren) ändern. Außerdem erleichtert der Riskscore die Vergleichbarkeit mit anderen Studien.
Ein bekanntes Beispiel für regulatorische RNA-Protein-Wechselwirkung stellt der Komplex der TAR-RNA von HIV-1 und dem viralen Protein Tat dar. Dieser Komplex ist wichtig für die effiziente Transkription des viralen Genoms. Essentiell für die Erkennung der Stem-Loop Struktur ist die Wechselwirkung des Tat-Proteins mit dem aus drei Nukleotiden bestehenden Bulge der TAR-RNA. Das Wissen über die Prinzipien der Erkennung von Tat zu TAR-RNA sollte es möglich machen, spezifische Liganden zu designen, die als antivirale Tat Antagonisten angreifen können. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese von RNA Liganden für die Festphasenpeptidsynthese (FPPS) basierend auf heteroaromatischen Bausteinen. Als Strategie wurde gewählt, die heteroaromatischen Reste über Amid-Bindungen an ein Fmoc geschütztes (2-Aminoethyl)glycin-Rückgrat einzufügen. Die peptidomimetischen Bausteine X konnten in der FPPS zur Synthese von Tripeptiden mit der allgemeinen Struktur Arg-X-Arg und Modifikationen mit Lysin eingesetzt werden. Die Bindungsaffinitäten der Tripeptide und kleinen Moleküle zur TAR-RNA von HIV-1 wurden über einen fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Der Assay verwendet ein doppelt endmarkiertes Tat-Peptid mit Fluorescein und Rhodamin als Farbstoff. Durch Verdrängung des Tat-Peptides durch einen konkurrierenden Liganden kommt es zur Konformationsänderung des Peptides, die zur Löschung der Lichtemmission führt. Dabei zeigen die Tripeptide H2N-(D)Arg-Lactam-(D)Arg-CONH2 (154) und H2N-(D)Arg-Amidin-(D)Arg-CONH2 (158) IC50-Werte von 2-3 mikroM, die auch durch Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) bestätigt wurden. In massenspektrometrischen Untersuchungen von 158 bzw. Tat-Protein mit TAR-RNA konnten bei beiden Peptiden 1:1 und 1:2-Komplexe beobachtet werden. 158 zeigt antivirale Eigenschaften (IC50 = 10-50 mikroM) in HeLa P4-Zellassays. Durch NMR-Untersuchungen und molekulardynamische Berechnungen war es möglich, eine Konformationsänderung der TAR-RNA durch eine Wechselwirkung mit Guanidinium-Gruppen festzustellen. Ein weiteres Ziel der Arbeit war daher ausgehend von den gewonnenen Daten die Untersuchung des Bindungskonzeptes von Diaminopyrazolen und Indazolen. Diaminopyrazole mit kleinen Resten und Triaminopyrazol übertreffen im protonierten Zustand den dikationischen Liganden Argininamid. In Übereinstimmung mit dem Bindungsmodell verhalten sich protonierte Aminopyrazole wie „Super-Guanidine“ hinsichtlich der TAR-RNA. Das Einfügen des Triaminopyrazols in ein Phenazin-Grundgerüst führt zu Verbindungen, die im protonierten und reduzierten Zustand zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können und nicht planar, aber lipophil sind. Der Austausch von Stickstoff zu Sauerstoff im Phenazinring sollte den reduzierten Zustand stabilisieren. Die resultierende Struktur ist jedoch zersetzlich, so dass auf weitere Untersuchungen verzichtet wurde.
Um die Bedeutung bestimmter Neurone oder Klassen von Neuronen innerhalb von Nervensystemen zu untersuchen, sind Methoden, die eine Manipulation der Aktivität der Neurone in vivo erlauben, besonders nützlich. Die bisher zur Verfügung stehenden Methoden haben jedoch Einschränkungen in beispielsweise der Zelltypspezifität, der zeitlichen Präzision, der Reversibilität oder der Anwendbarkeit in frei beweglichen Tieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden optogenetische, d.h. auf der Expression lichtempfindlicher Proteine basierende Methoden entwickelt, um eine präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone durch Licht zu ermöglichen. Die Techniken wurden daraufhin zur Untersuchung z.B. der Neurotransmission sowie der Funktion kleiner Netzwerke im Nervensystem des Nematoden Caenorhabditis elegans verwendet. Die zelltypspezifische heterologe Expression des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ermöglichte es, Muskel- oder Nervenzellen der Nematoden durch blaue Beleuchtung innerhalb weniger Millisekunden zu depolarisieren. Dadurch ließen sich spezifische Verhaltensweisen in frei beweglichen Tieren auslösen. Dieser Ansatz wird in Zukunft die Untersuchung der Bedeutung einzelner Neurone innerhalb ihrer Schaltkreise deutlich erleichtern. So konnte hier gezeigt werden, dass die Photostimulation des propriorezeptiven Neurons DVA eine signifikante Erhöhung der mittleren Körperbiegungswinkel während der sinusförmigen Fortbewegung der Tiere zur Folge hatte. Außerdem wurde versucht, die Anwendbarkeit von ChR2 durch die gezielte Manipulation der subzellulären Lokalisation mittels Fusion mit speziellen Peptiden oder Proteinen zu erhöhen. Des Weiteren wurde eine zur Verwendung von ChR2 analoge Methode zur Hemmung von Neuronen durch Licht entwickelt. Hierfür wurde die lichtgetriebene Cl--Pumpe Halorhodopsin aus Natronomonas pharaonis (NpHR) zelltypspezifisch in C. elegans exprimiert. Durch Photoaktivierung von NpHR mit gelbem Licht war es möglich, Muskelzellen und cholinerge Neurone zu hyperpolarisieren und somit in ihrer Aktivität zu hemmen. Dies führte in frei beweglichen Tieren zu einer augenblicklichen Paralyse verbunden mit einer drastischen Reduktion der Schwimmfrequenz und einer Erhöhung der Körperlänge. Die Aktionsspektren von ChR2 und NpHR sind unterschiedlich genug, um eine unabhängige Photoaktivierung der beiden Proteine mit blauem und gelbem Licht zu ermöglichen. Dadurch konnte die Aktivität von Muskelzellen und cholinergen Neuronen nach Koexpression der beiden Proteine bidirektional kontrolliert werden. Es wurden somit Methoden entwickelt, die in vivo eine zeitlich äußerst präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone mit Licht verschiedener Wellenlängen ermöglichen. Die Beobachtung der dadurch induzierten Verhaltensänderungen erlaubt es, zuverlässige Aussagen über die Bedeutung einer Nervenzelle für die Ausprägung eines Verhaltens zu treffen und wird die Erforschung der Nervensysteme von C. elegans und anderen Modellorganismen deutlich vereinfachen. Schließlich wurden in dieser Arbeit optogenetische Methoden zur Untersuchung der synaptischen Übertragung an neuromuskulären Synapsen (neuromuscular junctions, NMJs) von C. elegans entwickelt. Hierfür wurde ChR2 in GABAergen oder cholinergen Neuronen exprimiert, um eine lichtgesteuerte Freisetzung des inhibitorischen Neurotransmitters GABA bzw. des exzitatorischen Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) an NMJs zu erreichen. Die Methode wurde OptIoN getauft, ein Akronym für „Optogenetic Investigation of Neurotransmission“, also „optogenetische Untersuchung der Neurotransmission“. Die GABA-Freisetzung hatte ähnlich wie die NpHR-vermittelte Photoinhibition von Muskelzellen eine Reduktion der Schwimmfrequenz und Erhöhung der Körperlänge zur Folge. Die Ausschüttung von ACh verursachte hingegen starke Muskelkontraktionen verbunden mit einer Reduktion der Körperlänge. Die Änderungen der Körperlänge waren bei Mutanten mit verschiedenen Neurotransmissionsdefekten signifikant unterschiedlich im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem kam es während längerer Beleuchtungsphasen in Mutanten mit defektem Recycling der synaptischen Vesikel (SV) zu einer verstärkten Abnahme der lichtinduzierten Effekte. OptIoN ermöglicht es dadurch erstmals, die Mechanismen des SV-Recyclings in C. elegans Verhaltensexperimenten zu untersuchen. In elektrophysiologischen Messungen ließen sich durch kurze Lichtpulse wiederholt und mit hoher Frequenz Neurotransmitter-spezifische postsynaptische Ströme evozieren. Diese Ströme waren in Mutanten mit gestörter SVExozytose reduziert und gingen bei wiederholter Stimulation in Mutanten mit defektem SVRecycling schneller zurück. Die Verwendung von OptIoN erleichtert die elektrophysiologische Untersuchung neuronaler Defekte und stellt erstmals eine Möglichkeit dar, Vorgänge der neuronalen Plastizität in dem genetischen Modellsystem C. elegans zu untersuchen. Das Potential von OptIoN zeigte sich unter anderem auch in der Identifizierung eines neuen, über metabotrope GABA-Rezeptoruntereinheiten vermittelten Mechanismus zur heterosynaptischen Hemmung cholinerger Neurone.
Die mechanischen Belastungen auf die einzelnen Implantatkomponenten sind durch die Zunahme von implantatgetragenen Einzelzahnversorgungen gestiegen. Die Erforschung von effizienten Implantat-Abutment-Verbindungen (IAV) gewinnt daher stetig an Bedeutung. Die Rotationssicherung des Abutments im Implantat, insbesondere unter exzentrisch einwirkender Kaukraft, stellt dabei einen möglichen Schwerpunkt dar. Viele Implantathersteller propagieren die Rotationssicherheit bzw. -stabilität der von ihnen produzierten Implantat-Abutment-Verbindungen. Veröffentlichungen zu diesem Forschungs-schwerpunkt liegen dagegen nur im geringen Maße vor. Daher sollte die vorliegende Arbeit zu diesem Aspekt einen Beitrag leisten. Zur Bewertung des Verhaltens von Implantat-Abutment-Verbindungen bezüglich ihrer Rotationsfestigkeit bei zentrischer und exzentrischer Belastung wurden 17 handelsübliche Implantatsysteme in die vorliegende Versuchsreihe einbezogen. Die Implantatsysteme werden nach ihrer Verbindungsgeometrie in konische, Stoß- und andersartige Verbindungen unterschieden. Insgesamt wurden sieben konische (Ankylos®, Astra Tech®, Bego®, ITI Straumann® Bone Level, ITI Straumann® Massiv Abutment, Nobel Biocare™ Nobel Active, Osstem Co. Ltd.), sechs Stoß- (Bredent medical, Camlog®, Nobel Biocare™ Replace Select, SICace® 4.0, SICace® 5.0 und Xive® S plus) und vier andersartige (Heraeus IQ:Nect®, ITI Straumann® synOcta® (Fräszylinder mit Oktagon), ITI Straumann® synOcta® (Fräszylinder ohne Oktagon)) Verbindungen getestet. Für jedes System sind fünf Prüfkörper hergestellt worden, um den bleibenden Versatz zwischen dem Implantat und dem Abutment bei insgesamt acht Kraftstufen zwischen 25N-200N zu ermitteln. Jeder der 85 Prüfkörper wurden mit speziell angefertigten Edelstahlrohren versehen. Auf diese Rohre wurde Reflektoren aus Kunststoff aufgebracht. Die Kaufunktion ist dabei mit einem zweidimensionalen Kausimulator imitiert worden. Der „Frankfurter Kausimulator“ wurde speziell für die Testung von Implantat-Abutment-Verbindungen konstruiert und gebaut. Die Simulation des exzentrischen Kraftvektors wurde durch das Verschieben von Krafteinleitungsstäben (KES) in der Horizontalebene simuliert. An die Zahnbreite (in mesiodistaler Richtung) eines menschlichen Prämolars angelehnt, ist eine Verschiebung der Krafteinleitungsstäbe bis maximal 3,5mm jeweils zu jeder Seite vorgenommen worden. Zwei Laserwegsensoren erfassten die Positionsänderung der Reflektoren. Insgesamt fanden pro Reflektor zwei Messungen statt. Die erste Messung erfolgte vor der Belastung, wohingegen die zweite Messung nach der Belastung vorgenommen wurde. Die Differenz beider Messungen ergab so den zurückgelegten Weg der Reflektoren. Daraus lässt sich dann der Winkel α ermitteln und durch Anwendung einer trigonometrischen Formel der bleibende Versatz in Grad bestimmen. Nach statistischer Auswertung der gewonnen Daten stellte sich heraus, dass die giebelförmige Implantat-Abutment-Verbindung des BPI®-Implantatsystems aus der Gruppe der andersartigen Verbindungen den kleinsten bleibenden Versatz (0,047°) zwischen dem Implantat und dem Abutment zeigte. Die konischen Implantat-Abutment-Verbindungen zeigten zwar einen größeren bleibenden Versatz (0,05°-0,373°), konnten sich dennoch von der schraubenlosen Verbindung des Heraeus IQ:Nect®-Systems (0,46°) und den Stoßverbindungen (0,471°-0,99°) abheben. Bei zwei Verbindungen (ITI Straumann® synOcta® (Fräszylinder mit Oktagon) und das ITI Straumann® synOcta® (Fräszylinder ohne Oktagon)) aus der Gruppe der andersartigen Implantat-Abutment-Verbindungen kam es bei allen Prüfkörpern zu einer Lockerung der Aufbauteile. Die Ergebnisse der Rotationsfestigkeit für die in dieser Untersuchung geprüften Implantat-Abutment-Verbindungen liegen innerhalb der von Binon 1996 formulierten Stabilitätsrichtwerte von bis zu 5° Rotationsfreiheit an der Implantat-Abutment-Verbindung. In der Publikation von Binon aus dem Jahre 1996 konnten bei genauerer Betrachtung aus methodischen Gründen Rotationsveränderungen erst ab einem Wert von 1,94° gemessen werden. Somit könnte eine Erklärung für den von Binon angegebenen Richtwert einer komplikationslosen Rotation von 2º, welche eine zusätzliche Stabilisierung des "screw joint" bewirke, vorliegen. Ein Fokus der Implantathersteller liegt seither auf der Weiterentwicklung der Konstruktionsprinzipien und Fertigungs-möglichkeiten für Implantat-Abutment-Verbindungen und implantatgetragenen Suprastrukturen. Eine rotationsfreie Verbindung scheint nach den Ergebnissen dieser Untersuchung dennoch bis heute nicht erreicht. Die geometrische Ausgestaltung des Implantat-Abutment-Komplexes ist für das Ausmaß des bleibenden Versatzes einer der entscheidenden Einflussgrößen. Der Konus als Grundgeometrie wirkt einem Verdrehen des Abutments effizienter entgegen als horizontal gefügte Flächen. Schlussfolgernd könnte, auch anhand der ermittelten Ergebnisse sowie nach weiterführenden Forschungen, in Betracht gezogen werden, dass die von Binon 1996 formulierten Richtwerte heute nicht mehr bindend sind.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
Neurosphären-bildende Zellen mit dem Potential zur Selbsterneuerung, sowie zur vielseitigen Differenzierung, wurden bereits aus diversen peripheren und zentralen Geweben isoliert. Auch von der Neuralleiste abstammende NCSCs wurden in verschiedenen embryonalen und adulten, peripheren Geweben im Nager-Modell identifiziert und als Neurosphären (NS) kultiviert. In der vorliegenden Arbeit konnten nun erstmals auch aus Zellen des peripheren Nervensystems von Huhn-Embryonen NS gebildet werden. Zudem wurde das Selbsterneuerungspotential der NS-bildenden Zellen analysiert und über 10 Passagen, beziehungsweise mehrere Monate hinweg quantifiziert. Durch eine selektive Isolierung O4-positiver Gliazellen aus Huhn DRGs, konnte der Anteil NS-generierender Zellen gegenüber unsortierten DRG-Zellen signifikant erhöht werden. Aufgrund dieser Beobachtung können im Gewebe verbliebener NCSCs als Ursprung NS-generierender Zellen ausgeschlossen werden. Die von Gliazellen abstammenden NS-Zellen wurden im Weiteren auf ihr Entwicklungspotential hin untersucht. Sowohl über Antikörperfärbungen, als auch auf Nukleinsäurebasis in RT-PCR-Analysen, konnte für die NS-Zellen ein oligopotentes Differenzierungspotential nachgewiesen werden. Auch in klonalen NS-Kulturen wurde die Differenzierung zu Neuronen, Gliazellen und Melanozyte bestätigt. Aufgrund des Selbsterneuerungspotentials, sowie des oligopotenten Entwicklungspotentials O4-sortierter NS-generierender Zellen, wurden die in dieser Arbeit identifizierten und charakterisierten NS-bildende Zellen GDSCs (glial-derived stem cells) benannt. Die im Huhn-Modell beschriebenen NS-bildenden PNS-Zellen wurden anschließend auch im Nager-Modell nachgewiesen. NS-generierende Zellen sind in prä- und postnatalen Maus-DRGs vorhanden und zeigen ein Selbsterneuerungspotential, das für Stammzellen charakteristisch ist. In Zusammenarbeit mit Dr. Verdon Taylor (Freiburg) konnten die aus DRGs von transgenen EGFP-Mäusen gewonnene NS-Zellen in utero in die Hirnventrikel von E10.5 Mausembryonen injiziert werden. Die implantierten, grünfluoreszierenden Zellen wurden noch 5 Monate nach dem Eingriff in großer Zahl im Hirngewebe nachgewiesen und konnten als Neurone, Astrozyten und OLPs/Oligodendrozyten identifiziert werden. Die Entstehung neuraler ZNS-Zelltypen beruht hierbei vermutlich auf einer Änderung der regionalen Identität der Zellen durch die NS-Kultivierung. Obwohl sich einige implantierte Zellen auch 5 Monate nach dem Eingriff noch im Zellzyklus befanden, konnte in keinem der analysierten Gehirne hyperplastisches Gewebe oder tumorassoziiertes Wachstum beobachtet werden. Die in dieser Arbeit nachgewiesene Möglichkeit NS-bildende Zellen aus dem PNS zu gewinnen und durch eine selektive Sortierung für O4-positive Gliazellen zusätzlich anzureichern, stellt einen wichtigen Schritt in Richtung gezielter Generation diverser neuronaler und glialer Subtypen des peripheren Nervensystems dar. Zusammen mit der durch die Neurosphären-Kultivierung erzielten Änderung der regionalen Identität muriner NS-Zellen, könnte diese Arbeit außerdem einen wichtigen Grundstein für weiterführende Arbeiten in Richtung Stammzell-Therapien, z.B. in Multiple-Sklerose-Modellen darstellen.
Brustkrebs repräsentiert die häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Der Estrogen Rezeptor α (ERα) ist hier als ein wichtiger prognostischer Marker für Mammakarzinome etabliert, der die Homonsensitivität des Tumors determiniert. Dieser impliziert den Einsatz von Anti-Estrogenen, die die wachstumsfördenden Funktionen von ERα blockieren können. Übergewicht erhöht deutlich das Risiko einer Brustkrebserkrankung bei postmenopausalen Frauen. Übergewicht geht generell mit einem erhöhten Serumleptinspiegel einher. Das Zytokinhormon Leptin ist ein zentraler humoraler Faktor bei der Wahrnehmung und Steuerung der körpereigenen Energiereserven im Gehirn, das darüber hinaus auch pleiotrope Funktionen in der Angiogenese, Hämatopoese, Reproduktion und im Immunsystem ausübt. Leptin bindet an den Transmembranrezeptor Ob-RL (Obese-Rezeptor, lange Isoform) und aktiviert unter anderem den Januskinase (Jak)- „signal transducer and activator of transcription“ (Stat)-Signalweg, der mit neoplastischen Veränderungen assoziiert ist. Weil der kausale Zusammenhang zwischen Übergewicht und Krebserkrankungen gut belegt ist, während die molekularen Mechanismen jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt sind, sollte daher in der vorliegenden Arbeit die mögliche Wechselwirkung des leptininduzierten Jak-Stat-Signalwegs und des ERα´s untersucht werden. Ein Zusammenspiel der Ob-RL- und ERα-abhängigen Signalwege wurde einerseits mit Luziferase-Reporter-Konstrukten untersucht, die unter der Kontrolle eines Stat3-responsiven Elements standen. Dabei konnten zelltyp-spezifsche Unterschiede in der leptinabhängigen Stat3-Aktivierung beobachtet werden. Die endogen ERα-exprimierenden Brustkrebszellen MCF-7 wiesen eine wesentlich stärkere Stat3-Aktiverung und Phosphorylierung nach Leptinapplikation auf, als ERα-negative HeLa Zervixkarzinomzellen oder die Brustkrebslinie MDA-MB-231. Dieser Effekt konnte durch die Hemmung der ERα-Expression mittels siRNA in MCF-7 Zellen revertiert werden. Die ERα Überexpression in HeLa Zellen resultierte in einer verstärkten Stat3-Transaktiverung nach Leptinbehandlung. Diese Zunahme in der Stat3-Aktivierung konnte nicht durch eine Kostimulation der Zellen mit einem ERα-Agonisten oder Antagonisten beeinflusstwerden. Weiterhin konnte eine gesteigerte Zellviabilität nach Leptinstimulation in ERα-positiven Zellen detektiert werden. Durch Koimmunpräzipitationsstudien konnte direkte Interaktion von ERα, Jak2 und Stat3 nachgewiesen werden, was auf einen zytoplasmatisch lokalisierten Komplex hindeutet. Eine Mikroarray-Analyse von leptinstimulierten Zellen ergab eine differentielle Regulation von 133 Genen in Abhängigkeit ihres ERα-Expressionstatus. Von den 133 Zielgene sind 42 in der Literatur bereits in Zusammenhang mit malignem Wachstum beschrieben und könnten somit die erhöhte Viabilität der ERα-exprimierenden Zellen in Reaktion auf Leptin erklären. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse deuten auf eine entscheidende Rolle des ERα´s in der Verstärkung der leptininduzierten Stat3-Aktiverung hin. Diese Daten zur Interaktion von ERα mit einem wachstumsfördernden Signalweg können zur Entwicklung neuartiger Behandlungsmöglichkeiten in der Brustkrebstherapie von übergewichtigen Patientinnen beitragen.
By adopting a variety of shapes, proteins can perform a wide number of functions in the cell, from being structural elements or enabling communication with the environment to performing complex enzymatic reactions needed to sustain metabolism. The number of proteins in the cell is limited by the number of genes encoding them. However, several mechanisms exist to increase the overall number of protein functions. One of them are post-translational modifications, i.e. covalent attachment of various molecules onto proteins. Ubiquitin was the first protein to be found to modify other proteins, and, faithful to its evocative name, it is involved in nearly all the activities of a cell. Ubiquitylation of proteins was believed for a long time only to be responsible for proteasomal degradation of modified proteins. However, with the discovery of various types of ubiquitylation, such as mono-, multiple- or poly-ubiquitylation, new functions of this post-translational modification emerged. Mono-ubiquitylation has been implicated in endocytosis, chromatin remodelling and DNA repair, while poly-ubiquitylation influences the half-life of proteins or modulates signal transduction pathways. DNA damage repair and tolerance are example of pathways extensively regulated by ubiquitylation. PCNA, a protein involved in nearly all types of DNA transaction, can undergo both mono- and poly-ubiquitylation. These modifications are believed to change the spectrum of proteins that interact with PCNA. Monoubiquitylation of PCNA is induced by stalling of replication forks when replicative polymerases (pols) encounter an obstacle, such as DNA damage or tight DNA-protein complexes. It is believed that monoubiquitylation of PCNA stimulates the exchange between replicative pols to one of polymerases that can synthesize DNA across various lesions, a mechanism of damage tolerance known as translesion synthesis (TLS). Our work has helped to understand why monoubiqutylation of PCNA favours this polymerase switch. We have identified two novel domains with the ability to bind Ub non-covalently. These domains are present in all the members of Y polymerases performing TLS, and were named Ub-binding zinc finger (UBZ) (in polη and polκ) and Ub-binding motif (UBM) (in polι and Rev1). We have shown that these domains enable Y polymerases to preferentially gain access to PCNA upon stalling of replication, when the action of translesion polymerases is required. While the region of direct interaction between Y pols and PCNA had been known (BRCT domain in Rev1 and PIP box motif (PIP) in three others members), we propose that Ub-binding domains (UBDs) in translesion Y pols enhance the PIP- or BRCT-domain-mediated interaction between these polymerases and PCNA by binding to the Ub moiety attached onto PCNA. Following these initial studies, we have also discovered that Y polymerases themselves undergo monoubiquitylation and that their UBDs mediate this modification. This auto-ubiquitylation is believed to lead to an intramolecular interaction between UBD and Ub attached in cis onto the UBD-containing protein. We have mapped monoubiquitylation sites in polη in the C-terminal portion of the protein containing the nuclear localization signal (NLS) and the PIP box. Beside PIP, the NLS motif is also involved in direct interaction of polη with PCNA. Based on these findings, we propose that monoubiquitylation of either NLS or PIP masks them from potential interaction with PCNA. Lastly, using several functional assays, we have demonstrated the importance of all these three motifs in the C-terminus of polη (UBZ, NLS and PIP) for efficient TLS. We have also constructed a mimic of monoubiquitylated polη by genetically fusing polη with Ub. Interestingly, this chimera is deficient in TLS as compared to the wild-type protein. Altogether, these studies demonstrate that the C-terminus of polη constitutes a regulatory module involved in multiple-site interaction with monoubiquitylated PCNA, and that monoubiquitylation of this region inhibits the interaction between polη and PCNA. Our work has also revealed that the UBDs of Y pols as well as of other proteins implicated in DNA damage repair and tolerance, such as the Werner helicase-interacting protein 1 (Wrnip1), are required for their proper sub-nuclear localization. All these proteins localize to discrete focal structures inside the nucleus and mutation of their UBDs results in inability to accumulate in these foci. Interestingly, by exchanging UBDs between different proteins we have learned that each UBD seems to have a distinct functional role, surprisingly not limited to Ubbinding ability. In fact, swapping the UBZ of Wrnip1 with the UBM of polι abolished the localization of Wrnip1 to foci despite preserving the Ub-binding ability of the chimeric protein. In summary, this work provides an overview of how post-translation modification of proteins by Ub can regulate several DNA transactions. Firstly, key regulators (e.g. PCNA) can be differentially modified by Ub. Secondly, specialized UBDs (e.g. UBM, UBZ) embedded only in a subset of proteins act as modules able to recognize these modifications. Thirdly, by means of mediating auto-ubiquitylation, UBDs can modulate the behaviour of host proteins by allowing for either in cis or in trans Ub-UBD interactions.