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Background: Many disabling human retinal disorders involve the central retina, particularly the macula. However, the commonly used rodent models in research, mouse and rat, do not possess a macula. The purpose of this study was to identify small laboratory rodents with a significant central region as potential new models for macular research.
Methodology/Principal Findings: Gerbillus perpallidus, Meriones unguiculatus and Phodopus campbelli, laboratory rodents less commonly used in retinal research, were subjected to confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO), fluorescein and indocyanine green angiography, and spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) using standard equipment (Heidelberg Engineering HRA1 and Spectralis™) adapted to small rodent eyes. The existence of a visual streak-like pattern was assessed on the basis of vascular topography, retinal thickness, and the topography of retinal ganglion cells and cone photoreceptors. All three species examined showed evidence of a significant horizontal streak-like specialization. cSLO angiography and retinal wholemounts revealed that superficial retinal blood vessels typically ramify and narrow into a sparse capillary net at the border of the respective area located dorsal to the optic nerve. Similar to the macular region, there was an absence of larger blood vessels in the streak region. Furthermore, the thickness of the photoreceptor layer and the population density of neurons in the ganglion cell layer were markedly increased in the visual streak region.
Conclusions/Significance: The retinal specializations of Gerbillus perpallidus, Meriones unguiculatus and Phodopus campbelli resemble features of the primate macula. Hence, the rodents reported here may serve to study aspects of macular development and diseases like age-related macular degeneration and diabetic macular edema, and the preclinical assessment of therapeutic strategies.
The display of foreign polypeptides and proteins on the surface of viruses or cells provides an important tool for the engineering of biomolecules and the analysis of their interactions with binding partners. The most extensively used display platform is the coat protein of the filamentous bacteriophage (Smith, 1985). Phage display libraries have often been selected for polypeptides, e.g. single chain (sc) antibodies that bind to a protein of interest, but in vivo selection could only be demonstrated for peptides so far. An alternative display platform is the retrovirus murine leukemia virus (MLV). Here, polypeptides are displayed at the N-terminus of the viral envelope glycoprotein. Proof of principle for this platform was demonstrated for protease substrate libraries, which can be selected through coupling proteolytic activation with viral infectivity (Buchholz et al., 1998). Selection of the library CX4A on living cells resulted in viruses with more than three orders of magnitude improved spreading efficiency through tumor cells (Hartl et al., 2005). Also scAb libraries have recently been displayed and selected using retroviruses (Urban et al., 2005). The library scFvlibxMo displays the repertoire of phage display preselected sc antibodies for laminin-1 binding. The retrovirus based selection process resulted in laminin-specific sc antibodies with improved expression levels in mammalian cells.
This thesis describes the in vivo (i.e. in mouse tumor models) selection of the C-X4-A and scFvlibxMo for tumor homing upon systemic delivery.
For selection of the protease substrate library C-X4-A a subcutaneous tumor was induced in SCID mice followed by three systemic injections of the library. The selection process was monitored over a period of 34 days. After the incubation period mice were sacrificed and virus load in organs and tumor determined. PCR analysis after 34 days showed that virus from the library had preferentially infected the tumor. Sequence analysis showed the selection of protease substrates with the most prominent one with a frequency of over 65%. The four most prominent protease substrate variants where reconstituted into the original viral backbone for further investigation (C-SK-A, C-HI-A, C-HM-A and C-HS-A). Interestingly, these viruses exhibited a reduced spreading capacity in vitro on HT1080 cells as compared to the C-AK-A virus, which had previously been selected on HT1080 cells. When assayed for tumor homing, however, viruses C-HI-A and C-HS-A had clearly improved in comparison to C-AK-A. Tumor tissue had been infected at rates of over 55% while virus load of extratumoral organs was very low (infection rates <0.7 for C-HS-A and <0.02 for C-HI-A). Tumor targeting capacity had thus been improved over 10-fold by the in vivo selection of the C-X4-A library.
The experimental set up for the in vivo selection of the scFvlibxMo library was performed according to that of the C-X4-A library. Fingerprint analysis of the selected viruses that infected tumor tissue resulted in the identification of seven antibody variants showing unique CDR3 sequences. Two prominent clones (M49T-A and M49T-B) were cloned back into the MoMLV genome for further analysis of the reconstituted viruses. While variant B bound laminin-1 efficiently, variant A was unable to do so, although it was selected at highest frequency (76%). Both reconstituted viruses were equally well infectious and spread through HT1080rec1 cells at a similar efficiency as MoMLV. In an in vivo competition experiment the selected viruses clearly out-competed a laminin-1 binding reference virus L36xMo for tumor homing. To understand the molecular driving forces behind the in vivo selection process the epitope of the selected scFv M49T-A was identified using a phage peptide library approach. In silico analysis led to the identification of a small group of possible antigens, including tenascin, fibronectin and collagen.
The data described in this thesis demonstrate that the retrovirus display platform is capable of allowing the in vivo selection of protease substrates and scFvs. Notably, the replication competence of the system introduced an additional level of complexity to the library. The performed in vivo selections significantly enhanced tumor tropism. Selective infection of tumor cells combined with transfer of anti-tumoral genes is an attractive strategy for cancer therapy being in focus of current research. The viruses selected in this thesis build prime candidates for targeted retrovirus based tumor therapy.
Aufbau der Arbeit Auf der Grundlage einer Definition von Integrationsprozessen bzw. Integrationszuständen (Kap. 2.1) werden Heterogenitätsmerkmale diskutiert, die für Anerkennungsunterschiede zwischen Ingroup und Outgroup verantwortlich sein können (Kap. 2.1.2). Anschließend werden Integrations- und Desintegrationsmechanismen moderner Gesellschaften aufgezeigt und Erkenntnisse der Vorurteilsforschung zur Verbesserung der Outgroup-Anerkennung erörtert (Kap. 2.1.3 und 2.1.4). Im darauffolgenden Kapitel 2.2 werden Formen des Sports im Hinblick auf deren Integrations- und Desintegrationspotenziale diskutiert. Kapitel 2.3 beschäftigt sich zunächst mit der grundlegenden pädagogischen Rahmung des erziehenden Sportunterrichts, stellt einzelne Integrationsansätze vor und legt dabei den Fokus auf die Frage der bewussten oder unbewussten Auseinandersetzung mit Heterogenität. Da Kooperatives Lernen als eine erfolgversprechende Methode für gelingende Integration gehandelt wird und diese Methode zudem Integrationsmechanismen sowie Kontakthypothese berücksichtigt, wird sie in Kapitel 2.4 ausführlich beschrieben. Nachdem die wichtigsten Theorien zu heterogenitätsbedingten Anerkennungsunterschieden sowie integrationspädagogischen Überlegungen im Sportunterricht behandelt worden sind, schließt der Theorieteil mit der Ableitung der Fragestellungen (Kap. 2.5). Fragestellungen: In der soziologischen Untersuchung wird der Frage nach den tatsächlich desintegrierenden Heterogenitätsmerkmalen im Sportunterricht nachgegangen. In der pädagogischen Untersuchung wird erforscht, ob Kooperatives Lernen im Sportunterricht in der Lage ist, den selektiven Einfluss der desintegrierenden Heterogenitätsmerkmale abzubauen.
Wassergefiltertes Infrarot A (wIRA) ist eine spezielle Form der Wärmestrahlung mit hohem Penetrationsvermögen ins Gewebe bei geringer thermischer Oberflächenbelastung. wIRA entspricht dem Großteil der Sonnenwärmestrahlung, die in gemäßigten Klimazonen die Erdoberfläche wasserdampfgefiltert erreicht. wIRA steigert die drei energetisch für die Wundheilung wichtigen Faktoren Temperatur, Sauerstoffpartialdruck und Durchblutung im Gewebe. wIRA mindert Schmerzen, Entzündung und Wundsekretion. Entsprechend kann wIRA sehr gut zur Verbesserung der Wundheilung bei akuten und chronischen Wunden eingesetzt werden.
Poster presentation at 5th German Conference on Cheminformatics: 23. CIC-Workshop Goslar, Germany. 8-10 November 2009 We demonstrate the theoretical and practical application of modern kernel-based machine learning methods to ligand-based virtual screening by successful prospective screening for novel agonists of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) [1]. PPARgamma is a nuclear receptor involved in lipid and glucose metabolism, and related to type-2 diabetes and dyslipidemia. Applied methods included a graph kernel designed for molecular similarity analysis [2], kernel principle component analysis [3], multiple kernel learning [4], and, Gaussian process regression [5]. In the machine learning approach to ligand-based virtual screening, one uses the similarity principle [6] to identify potentially active compounds based on their similarity to known reference ligands. Kernel-based machine learning [7] uses the "kernel trick", a systematic approach to the derivation of non-linear versions of linear algorithms like separating hyperplanes and regression. Prerequisites for kernel learning are similarity measures with the mathematical property of positive semidefiniteness (kernels). The iterative similarity optimal assignment graph kernel (ISOAK) [2] is defined directly on the annotated structure graph, and was designed specifically for the comparison of small molecules. In our virtual screening study, its use improved results, e.g., in principle component analysis-based visualization and Gaussian process regression. Following a thorough retrospective validation using a data set of 176 published PPARgamma agonists [8], we screened a vendor library for novel agonists. Subsequent testing of 15 compounds in a cell-based transactivation assay [9] yielded four active compounds. The most interesting hit, a natural product derivative with cyclobutane scaffold, is a full selective PPARgamma agonist (EC50 = 10 ± 0.2 microM, inactive on PPARalpha and PPARbeta/delta at 10 microM). We demonstrate how the interplay of several modern kernel-based machine learning approaches can successfully improve ligand-based virtual screening results.
Eines der markantesten Symbole der Advents- und Weihnachtszeit sind die in unterschiedlichsten Farben, Formen und sogar Düften angebotenen Kerzen. Ihr Licht gibt der Jahreszeit eine besondere Atmosphäre, sie unterstützen neben anderen Dekorationsartikeln die erwünschte besinnliche Stimmung. Kerzen stehen traditionell sinnbildlich für Licht, Wärme und Reinheit und symbolisieren damit im Christentum das Lebenslicht des Menschen und Christus als das Licht der Welt. Man könnte nun meinen, dass Kerzen auf den Seiten des Bochumer Botanischen Vereins nichts zu suchen haben, sondern eher dem Bereich Chemie (Stearin) oder Zoologie (Bienenwachs) zugeordnet werden sollten. Aber die Botanik hat auch hier schon immer eine wesentliche Rolle gespielt und steht auch heute noch im wörtlichen Sinne im Zentrum jeder Kerze, denn Wachs brennt ohne sie nicht: die Kerzendochte. Dabei ist die Erfindung des Dochtes weitaus älter als die der Kerzen. Bei den alten Griechen z. B. waren Kerzen noch weitestgehend unbekannt, man verwendete Öllampen, die einen (meist) pflanzlichen Docht enthielten.
The TATA Box Binding Protein (TBP) is a 20 kD protein that is essential and universally conserved in eucarya and archaea. Especially among archaea, organisms can be found that live below 0°C as well as organisms that grow above 100°C. The archaeal TBPs show a high sequence identity and a similar structure consisting of α-helices and β-sheets that are arranged in a saddle-shape 2-symmetric fold. In previous studies, we have characterized the thermal stability of thermophilic and mesophilic archaeal TBPs by infrared spectroscopy and showed the correlation between the transition temperature (Tm) and the optimal growth temperature (OGT) of the respective donor organism. In this study, a “new” mutant TBP has been constructed, produced, purified and analyzed for a deeper understanding of the molecular mechanisms of thermoadaptation. The β-sheet part of the mutant consists of the TBP from Methanothermobacter thermoautotrophicus (OGT 65°C, MtTBP65) whose α-helices have been exchanged by those of Methanosarcina mazei (OGT 37°C, MmTBP37). The Hybrid-TBP irreversibly aggregates after thermal unfolding just like MmTBP37 and MtTBP65, but the Tm lies between that of MmTBP37 and MtTBP65 indicating that the interaction between the α-helical and β-sheet part of the TBP is crucial for the thermal stability. The temperature stability is probably encoded in the variable α-helices that interact with the highly conserved and DNA binding β-sheets.
Östlich des Rwenzori Gebirges im Westen Ugandas wurden magnetotellurische Messungen durchgeführt. An 23 Stationen wurden Übertragungsfunktionen und Phasen Tensor Elemente zwischen den gemessenen magnetischen- und tellurischen Feldern im Periodenbereich von 10s bis 10000s geschätzt. Die Übertragungsfunktionen deuten eine komplexe drei dimensionale Leitfähigkeitsstruktur innerhalb der Kruste an, insbesondere in der Verbindungszone zwischen dem Rwenzori Gebirge und der östlichen Riftschulter. In dieser Arbeit wird eine alternative Darstellung der Phasen Tensor Ellipsen als Balken eingeführt. Für Perioden größer 100s zeigen die maximalen Phasen der Phasen Tensor Balken aller Stationen einheitlich in SSW-NNE und die Phasen Tensor Invarianten f min und f max weisen eine Differenz von mindestens 20° auf. Dieses auffällige Verhalten und die kleinen vertikalen magnetischen Feldr im gleich Periodenbereich kann mit einer anisotropen Leitfähigkeit in einer Tiefenbereich zwischen 30-50km mit der gut leitenden Richtung senkrecht zur Riftachse erklärt werden. Die Anisotropie könnte ihren Ursprung in orientierten Olivien Kristallen im oberen Mantel haben, wobei die Orientierungsrichtung mit der Delamination der Unterkruste unter den Rwenzoris zusammen hängen kann. Eine gut leitende Zone süd-östlich der Rwenzoris wurde in 15km Tiefe gefunden, die mit einer seismischen low velocity zone übereinstimmt und partielle Schmelzen innerhalb der Kruste andeutet. An allen Stationen steigt die minimale Phase bei der Periode 200s über 45° und zeigt einen Anstieg der elektrischen Leitfähigkeit unterhalb der Lithosphäre an.
Die P-Typ-ATPasen finden sich in allen Domänen des Lebens und stellen die größte Gruppe aktiver Ionentransporter in Zellen dar. Es handelt sich bei den P-Typ-ATPasen um integrale Membranproteine, die eine große Anzahl verschiedenster Ionen aktiv über eine biologische Membran transportieren. Die für diesen Ionentransport notwendige Energie wird durch Bindung und Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) und durch Phosphorylierung des Enzyms gewonnen. Diese, im cytoplasmatischen Teil gewonnene Energie, muss für den Ionentransport von der Phosphorylierungsstelle zur räumlich entfernten transmembranen Ionenbindungsstelle übertragen werden, bei dem das Protein einem Reaktionszyklus mit zwei Hauptkonformationszuständen E1 und E2 unterliegt. Zwischen diesen beiden Zuständen finden große strukturelle Änderungen statt, durch die die Ionenaffintät und die Zugänglichkeit der Ionenbindungsstelle reguliert wird. Da dieser Mechanismus der Energiegewinnung für alle Ionenpumpen dieser Art ähnlich ist, wurde die Ca2+-ATPase und die Na+/K+-ATPase als Modellproteine für die Untersuchung molekularer Mechanismen in P-Typ-ATPasen ausgewählt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll die Energietransduktion in P-Typ-ATPasen im Allgemeinen und der Protonengegentransport bzw. ein potentieller Protonentransportweg in der Ca2+-ATPase im Speziellen untersucht werden. Die beiden oben genannten Mechanismen sollen mittels computergestützter Methoden analysiert werden. Vor allem die Ca2+-ATPase ist prädestiniert für computergestützte Untersuchungen, da für diese sehr viele hochaufgelöste Röntgenstrukturdaten vorliegen, wenn auch bisher aufgrund der Größe und Komplexität des Systems nur sehr wenige theoretische Arbeiten durchgeführt wurden. Um den Energietransduktionsmechanismus in P-Typ-ATPasen zu untersuchen, wurde mittels Elektrostatik-Rechnungen der Einfluss eines elektrischen Feldes auf die verschiedenen Transmembranhelices untersucht. Dazu wurde ein Simulationssystem entwickelt, welches aus einem molekularen Kondensator besteht, der im Modell das Anlegen eines homogenen elektrischen Feldes über den Transmembranbereich simuliert. Da es sich bei dem Energietransduktionsmechanismus um einen dynamischen Prozess handelt, wurden die Elektrostatik-Rechnungen um Molekulardynamik-Simulationen erweitert. Mit diesen kann die konformelle Dynamik der P-Typ-ATPasen während der Energietransduktion in die Elektrostatik-Rechnungen einbezogen werden. Aus Spannungsklemmen-Fluorometrie-Experimenten, bei denen eine Spannung über eine Membran angelegt wird, kann geschlossen werden, dass die Helix M5 für die Energietransduktion verantwortlich ist. Mit den in dieser Arbeit durchgeführten Elektrostatik-Rechnungen konnte für verschiedene Enzymzustände der Ca2+-ATPase und für die Na+/K+-ATPase gezeigt werden, dass die Helix M5 die größten Konformeränderungen aufgrund des elektrischen Feldes aufweist. Durch die Erweiterung der Elektrostatik-Rechnungen um die Methode der Molekulardynamik-Simulation konnte zusätzlich die elektrische Feldstärke reduziert werden. Auch dabei zeigte sich, dass auf der Helix M5 die meisten Rotameränderungen durch das elektrische Feld induziert werden. Die aus Experimenten vermutete Rolle der Helix M5 als wichtiges Energietransduktionselement ließ sich mit diesen Simulationsrechnungen bestätigen. Um einen möglichen Protonenweg durch den Transmembranbereich der Ca2+-ATPase aufzuklären, wurden explizite Wassermoleküle in sechs verschiedene Enzymzustände der Ca2+-ATPase eingefügt. Aus Experimenten ist bekannt, dass in der Ca2+-ATPase ein Protonengegentransport stattfindet. Deshalb wurden für verschiedene Enzymzustände der Ca2+-ATPase mittels Elektrostatik-Rechnungen die Protonierungen der eingefügten Wassermoleküle sowie der titrierbaren Aminosäuren bestimmt. Aus den Ergebnissen dieser Rechnungen kann geschlossen werden, dass es sich bei dem Protonentransfer nicht um einen linearen Transport der Protonen handelt. Die Untersuchungen zeigen einen mehrstufigen Prozess, an dem Protonen in verschiedenen Transmembranbereichen der Ca2+-ATPase beteiligt sind. Anhand der berechneten Protonierungszustände der eingefügten Wassermoleküle und der pK-Werte der Aminosäuren im Transmembranbereich konnte weiterhin ein möglicher Protonenweg identifiziert werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde in einer Fall-Kontroll-Studie mit 483 Fällen und 300 Kontrollen das Risiko für die berufsbedingte Supraspinatussehnenruptur durch Arbeiten auf oder über Schulterniveau untersucht. Dabei ergab sich eine statistisch signifikante Risikoerhöhung durch das Arbeiten auf oder über Schulterniveau. Eine Dosis-Antwortbeziehung zeigte einen Zusammenhang der Ereignisse. Am stärksten war die Risikoerhöhung bei Patienten, die lebenslang kumulativ mindestens 3195 Stunden auf oder über Schulterniveau arbeiteten. Die adjustierte Odds Ratio dafür betrug 2,1 (CI 1,2-3,7), das Ergebnis ist statistisch signifikant. Neben dem beruflichen Arbeiten auf oder über Schulterniveau gibt es andere Faktoren, die die Entstehung einer Rotatorenmanschettenruptur begünstigen. Dabei sind Alter, Heben/Tragen von Lasten über 20 kg und Arbeiten mit handgeführten vibrierenden Werkzeugen zu nennen. Deshalb wurden die Daten hinsichtlich dieser Faktoren adjustiert. Auch einige Sportaktivitäten können das Risiko für die Rotatorenmanschettenruptur erhöhen. Deshalb wurden die Daten auch für Geräteturnen, Kugelstoßen, Speer- und Hammerwerfen, Ringen und Tennis adjustiert, und die sportliche Anstrengung wurde als Confounder behandelt. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit Ergebnissen früherer Studien, die ebenfalls eine Risikoerhöhung für die Entstehung der Rotatorenmanschettenruptur durch Arbeiten auf oder über Schulterniveau zeigen. Eine genaue Dosis, die zu dieser Risikoerhöhung führt, wurde in der Literatur bisher nicht genannt. Die vorliegende Arbeit liefert die Evidenz für die Annahme eines erhöhten Risikos der Ruptur der Sehne des M. supraspinatus bei Arbeiten auf oder über Schulterniveau. Weiterhin besteht ein Potential für eine primäre Prävention, indem Arbeiten auf oder über Schulterniveau möglichst ganz vermieden wird. Daher sollte die Ruptur der Sehne des M. supraspinatus als eigene Berufskrankheit in die Liste der Berufskrankheiten aufgenommen und die Betroffenen bei kumulativem Arbeiten von mindestens 3200 Stunden auf oder über Schulterniveau entschädigt werden.