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Filmische Biografien von Musikern gibt es schon seit dem Stummfilm. Aus dem Bereich klassischer Musik haben es Ludwig van Beethoven, Franz Liszt und Wolfgang Amadeus Mozart auf die meisten Filme gebracht. Aber auch ihre Kollegen Mahler, Schubert oder Wagner können filmische Darstellungen ihres Lebens vorweisen. Für das Massenmedium Film waren und sind Musikerbiografien als Stoffe für Spielfilme aus zweierlei Gründen interessant: zum einen, wenn es sich dabei um besonders populäre Vertreter handelt, und zum anderen, wenn mit den Musikernamen ein hohes kulturelles Ansehen verbunden ist. Die beiden Pole Entertainment und Hochkultur sind für das Mainstream-Kino, insbesondere für Hollywood, gleichermaßen faszinierend, erfüllen sie doch die unterschiedlichen, aber ebenso wichtigen Funktionen von Massentauglichkeit und kultureller Respektabilität. Für letzteres sind die filmischen Biografien klassischer Komponisten ein Beispiel, für ersteres ebensolche Filme, in deren Mittelpunkt die Walzerkönige und Operettenkaiser wie Johann Strauss Jr. und Franz Lehár stehen. Die filmische Biografie eines bestimmten Musikers hebt nicht nur diesen selbst aus der Masse hervor, sondern auch das musikalische Genre, das er repräsentiert.
Introduction: Hypothermia improves survival and neurological recovery after cardiac arrest. Pro-inflammatory cytokines have been implicated in focal cerebral ischemia/reperfusion in-jury. It is unknown whether cardiac arrest also triggers the release of cerebral inflammatory molecules, and whether therapeutic hypothermia alters this inflammatory response. This study sought to examine whether hypothermia or the combination of hypothermia with anes-thetic postconditioning with sevoflurane affect cerebral inflammatory response after cardio-pulmonary resuscitation. Methods: Thirty pigs (28 - 34kg) were subjected to cardiac arrest following temporary coro-nary artery occlusion. After 7 minutes of ventricular fibrillation and 2 minutes of basic life support, advanced cardiac life support was started according to the current AHA guidelines. Return of spontaneous circulation was achieved in 21 animals who were randomized to ei-ther normothermia at 38degreesC, hypothermia at 33degreesC or hypothermia at 33degreesC combined with se-voflurane (each group: n = 7) for 24 hours. The effects of hypothermia and the combination of hypothermia with sevoflurane on cerebral inflammatory response after cardiopulmonary resuscitation were studied using tissue samples from the cerebral cortex of pigs euthanized after 24 hours and employing quantitative RT-PCR and ELISA techniques. Results: Global cerebral ischemia following resuscitation resulted in significant upregulation of cerebral tissue inflammatory cytokine mRNA expression (mean +/- SD; interleukin (IL)-1beta 8.7 +/- 4.0, IL-6 4.3 +/- 2.6, IL-10 2.5 +/- 1.6, tumor necrosis factor (TNF)alpha 2.8 +/- 1.8, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) 4.0 +/- 1.9-fold compared with sham control) and IL-1beta protein concentration (1.9 +/- 0.6-fold compared with sham control). Hypothermia was associated with a significant (P <0.05 versus normothermia) reduction in cerebral inflammatory cytokine mRNA expression (IL-1beta 1.7 +/- 1.0, IL-6 2.2 +/- 1.1, IL-10 0.8 +/- 0.4, TNFalpha 1.1 +/- 0.6, ICAM-1 1.9 +/- 0.7-fold compared with sham control). These results were also confirmed for IL-1beta on protein level. Experimental settings employing hypothermia in combination with sevoflurane showed that the volatile anesthetic did not confer additional anti-inflammatory effects com-pared with hypothermia alone. Conclusions: Mild therapeutic hypothermia resulted in decreased expression of typical ce-rebral inflammatory mediators after cardiopulmonary resuscitation. This may confer, at least in part, neuroprotection following global cerebral ischemia and resuscitation.
Das vergangene Jahr hat uns ein neues Schuldverschreibungsgesetz beschert. Dadurch wurde das alte „Gesetz betreffend die gemeinsamen Rechte der Besitzer von Schuldverschreibungen“ vom 14. 12. 1899 abgelöst, dem praktisch keine große Bedeutung zukam. Einen Vorläufer haben diese Gesetze im preußischen Schuldverschreibungsgesetz, das Friedrich Wilhelm III. am 17. 6. 1833 für die preußische Monarchie in Kraft gesetzt hat. Dieses Gesetz, das bisher selbst in historischen Darstellungen des Schuldverschreibungsrechts kaum gewürdigt wird, ist aus mehreren Gründen von Interesse. Zum einen hatte die zeitgenössische Geldtheorie die Bedeutung des Papiergeldes und die angemessene Rolle des Staates bei der Schöpfung von Papiergeld und der Kontrolle der Geldmenge noch nicht erfaßt. Verschiedene Konzepte wurden erörtert und waren auch in der Praxis der Staaten anzutreffen. Noten privater Zettelbanken waren ebenso im Umlauf wie staatliche Schatzanweisungen und Schuldverschreibungen ohne und mit Gold- oder Silberdeckung. Mit dem Schuldverschreibungsgesetz von 1833 unterwarf Preußen die Emission von Schuldverschreibungen einschließlich der Noten privater Banken einer Genehmigungspflicht. Parallel hierzu findet sich eine auf wenige Einzelfälle beschränkte Bewilligung an „staatsnahe“ Banken, Banknoten auszugeben, die von staatlichen Stellen als Zahlungsmittel angenommen werden oder mit denen Steuerschulden beglichen werden mußten. Mit diesen parallelen Maßnahmen hat die Staatsführung Preußens im Vormärz den in der Literatur debattierten und politisch vielfach befürworteten Weg eines Wettbewerbs privater Papiergeldemittenten („Zettelbanken“) verworfen. Letzten Endes hat sie sich damit das Emissionsmonopol nicht nur für Metallgeld, sondern auch für Papiergeld und die Steuerung der Geldmenge aus papiergeldähnlichen privaten Banknoten gesichert. Ein weiterer leitender Gesichtspunkt bei der Abfassung des Schuldverschreibungsgesetzes war die Lenkung des privaten Anlagekapitals. Preußen wollte im Wettbewerb mit ausländischen Staaten um anlagesuchendes Kapital nicht ins Hintertreffen geraten und unterstellte deshalb auch die Emission und den Umlauf ausländischer Schuldverschreibungen im Inland der Genehmigungspflicht. Schließlich enthält das Schuldverschreibungsgesetz von 1833 auch privatrechtliche Vorschriften zum Schutz der Investoren. Obwohl seit langem Inhaberpapiere im Umlauf waren und sich auch das preußische ALR von 1794 mit Einzelfragen der Übertragung solcher Papiere, ihrer Vindikation, Amortisation und Funktion als Zahlungsmittel befaßt hatte,5 war bis dahin kein konsistentes Konzept entwickelt worden, das eine überzeugende und bruchfreie Lösung der praktisch auftretenden Fragen zur Rechtsstellung der Beteiligten – Aussteller, erster Nehmer und spätere Investoren – gestattet hätte. Auch das Schuldverschreibungsgesetz von 1833 stellt insoweit nur eine weitere Zwischenetappe dar, die in der Entwicklung dieser Finanzierungsinstrumente erreicht wurde. Die vorliegende Studie versucht, die angedeuteten Linien nachzuzeichnen.
The purpose of this essay is to assess the automatic exchange of information as described in EU Directive 2003/48 of 3 June 2003 on taxation of savings income in the form of interest payments with regard to the fundamental right of the individual to a private life, to banking secrecy and the freedoms on which the European internal market is based. The assessment reveals the conflicts of interests and values involved in the holding by banks (particularly those offering private banking services) of increasingly extensive, detailed and intimate information about their clients and in the automatic processing of that information by ever more powerful and sophisticated systems. Banking secrecy plays an essential role in protecting clients against the dangers which the disclosure of such information without their permission might produce. Banking secrecy exists not only in Luxembourg but also in many other European countries, and in Germany and France in particular it is not very different from the system applying in Luxembourg. While the French and German tax authorities do have some investigative powers not enjoyed by their Luxembourg counterparts, those powers are strictly circumscribed and cannot rely on the electronic exchange of information set out in EU Directive 2003/48/EC. While banking secrecy is totally incompatible with the electronic exchange of information, the core question is whether the latter can be reconciled with the respect for private life. In a Europe that sets itself up as the cradle of human rights, the general and en-masse exchange of private information cannot provide adequate and sufficient guarantees that the information exchanged will not be misused. The amount of interference in private life is clearly out of proportion to the public interest involved and is contrary to sub-section 2, article 8 of the European Convention for the Protection of Human Rights and Fundamental Freedoms and to articles 7 and 8 of the Charter of Fundamental Rights of the European Union. Since the automatic exchange of information at least potentially risks restricting the free flow of capital among Member States and discouraging the use of transborder banking services, its compliance with the fundamental principles of the internal market also needs to be closely examined. The restrictions imposed by such exchange very probably go beyond the limits within which the free movement of capital and services is possible. The European Court of Justice has found that there is no proportionality if the measures supposedly undertaken in the general interest are actually based on a general presumption of tax evasion or tax fraud. However, it would be true to say that the ECJ does not always examine the tax restrictions placed on the free movement of capital particularly thoroughly to ensure that they are necessary or proportionate. The economic effectiveness of the automatic exchange of information is far from being proved and involves significant cost to the banks providing the information and to the tax authorities using it. To date the system does not appear to have produced any significant new tax revenue nor does it prevent the continuing outflow of capital from Europe. Yet withholding at source, which respects individual and economic freedoms, does generate tax revenue that is cost-free to the State. Exchange of information on request in justified cases using the OECD Tax Convention on Income and Capital model does also fight tax fraud while at the same time providing citizens with the guarantees required to ensure their private lives are respected. A combination of these two systems - withholding at source and exchange of information on request in justified cases - would create the proper balance between the public and private interest that the automatic exchange of information cannot provide.
Der Deutsche Corporate Governance – Kodex empfiehlt seit seiner jüngsten Änderung im Juni 2009, dass der Aufsichtsrat auf die „Unabhängigkeit“ eines von ihm herangezogenen externen Vergütungsberaters achten soll. Dieses Unabhängigkeitserfordernis wirft mehrere Fragen auf, denen im Folgenden nachgegangen werden soll. Außerdem entwickelt der Beitrag Vorschläge, wie Aufsichtsrat und Vergütungsberater verfahren sollten, um der Empfehlung des Corporate Governance-Kodex zu genügen.
Die Motivation dieser Arbeit lag in der Formulierungsentwicklung eines nanopartikulären Systems auf Basis von Poly(D,L Milch-co-Glykolsäure) (PLGA) zum Transport eines antiangiogenen Antikörpers zur spezifischen Anreicherung in malignen Tumoren. Durch das partikuläre System soll eine optimierte Therapie mit erhöhten pharmazeutischen Wirkkonzentrationen am Wirkort bei gleichzeitig reduzierten Nebenwirkungen erreicht werden. In der Literatur wurden schon mehrfach unterschiedliche Herstellungsmethoden sowie diverse Untersuchungen der PLGA-Nanopartikel (NP) beschrieben. Dennoch fehlen bisher von Antikörperbeladenen PLGA-NP zur Tumortherapie systematische Untersuchungen der Herstellung, der Charakterisierung physikochemischer Eigenschaften, der Lagerstabilität und der Wirkung in biologischen Systemen. Diese Untersuchungen wurden in dieser Arbeit durchgeführt und die Ergebnisse in vier Teilbereiche gegliedert. Im ersten Teilbereich wurde die Herstellung und Charakterisierung der PLGA-NP etabliert. Dabei wurde zunächst der Einfluss unterschiedlicher Herstellungsparameter und Formulierungen auf unbeladene und Proteinbeladene PLGA-NP untersucht. Charakterisiert wurden die Nanopartikel anhand der Partikelgröße und Polydispersität, dem Zetapotential und den bildgebenden Verfahren TEM und SEM. Neben der Reproduzierbarkeit der physikochemischen Eigenschaften ist für die Entwicklung nanopartikulärer Systeme die exakte Bestimmung der Einbettungseffizienz hochpotenter Proteine von größter Bedeutung. Da an dieser Stelle keine normierten Methoden zur Verfügung standen, wurden drei Bestimmungsmethoden bewertet und die Einbettungseffizienzen untersucht. Im zweiten Teilbereich wurden die Lyophilisation und die Lagerstabilität der PLGA-NP untersucht. Um die kritischen Faktoren wie Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung bis zur Applikation gewährleisten zu können, wurde die Lyophilisation der entwickelten PLGA-NP anhand unterschiedlicher Kriterien analysiert. Die Stabilität des erhaltenen Lyophilisats wurde durch eine anschließende Lagerstabilitätsstudie bei unterschiedlichen Klimabedingungen bewertet. Die Charakterisierung der Partikelgrößen und Partikelgrößenverteilungen mittels PCS, AUZ und TEM der PLGA-NP in Gegenwart unterschiedlicher Stabilisatoren erfolgte vor und nach der Lyophilisation sowie nach 4, 8 und 13 Wochen Lagerung bei Klimabedingungen von 4°C, 25°C/60rF und 40°C/75rF. Im dritten Teilbereich der Arbeit werden Ergebnisse zum Freisetzungsverhalten der Proteine aus den PLGA-NP dargestellt. Für die kontrollierte Freigabe der Proteine aus den Nanopartikeln spielt der Abbaumechanismus der Partikel und damit des Polymers eine bedeutende Rolle. Das Abbauverhalten der PLGA-NP wurde daher zunächst über die Veränderung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung mittels PCS und AUZ untersucht. Dafür wurden PLGA-NP unterschiedlichster Formulierungen bis zu 100 Tage beobachtet und analysiert. Ein wichtiges Ziel dieser nanopartikulären Systeme ist die Freisetzung des Antikörpers über die gewünschte Zeit, damit eine pharmakologische Wirkung erzielt werden kann. Dafür wurden ebenso PLGA-NP unterschiedlichster Formulierungen in einem geeigneten Freisetzungsmedium mittels verschiedener Freisetzungsmodelle und analytischer Methoden untersucht. Neben unterschiedlichen Proteinen wurde auch der Proteinzustand, das Polymer sowie der Zusatz von Hilfsstoffen variiert. Im letzten Teil der Arbeit wurde die biologische Wirkung der Antikörperbeladenen PLGA-NP in Zellkulturversuchen ermittelt. Die Nanopartikel wurden hier auf ihren antiangiogenen Effekt mittels „Attachment- und Detachment-Assay“ sowie auf zellspezifische Bindung und Zellaufnahme mittels FACS und CLSM untersucht. Des Weiteren wurde ein präklinischer Transwell-Versuch entwickelt, um einen biologischen Nachweis des „sustained release“-Effektes der PLGA-NP zu erbringen. Auf Basis dieser Arbeit und der Erkenntnisse vorangegangener Studien scheint es möglich, gut charakterisierte Antikörper-beladene PLGA-NP zur Tumortherapie mit einer pharmakologischen Wirkung zu etablieren und für weiterführende präklinische Untersuchungen einzusetzen.
Proliferation and apoptosis are fundamental cellular processes that are important for the development and homeostasis of multi-cellular organisms. Deregulation of these processes plays an important role in tumor formation. Often, genes that control homeostasis by regulating proliferation and apoptosis are mutated or improperly expressed in tumors. In this project, the physiological and pathological functions of FUSE Binding Protein 1 (FBP1) were studied to elucidate the involvement of this gene in the context of embryonic development and tumorigenesis. Two reasons led to the hypothesis that FBP1 might be relevant in this context. FBP1 was isolated in the group of PD Dr. Martin Zörnig using a functional yeast survival screen for the identification of anti-apoptotic genes involved in tumorigenesis, and the anti-apoptotic function of FBP1 was confirmed in the human colon carcinoma cell line RKO. In addition, FBP1 had been published to function as a transcriptional regulator that activates expression of the proto-oncogene c-myc. This gene stimulates cell proliferation and is overexpressed in many tumors. Analysis of FBP1 expression by immunhistochemistry in normal and tumor tissue samples revealed frequent and significant overexpression of FBP1 in Hepatocellular Carcinoma (HCC). To study the functional relevance of FBP1 activity for this tumor type, apoptosis and proliferation of the HCC cell line Hep3B were studied in dependence of FBP1 expression. Downregulation of FBP1 by lentiviral expression of FBP1-specific short hairpin RNA (shRNA) reduced proliferation and increased sensitivity to apoptosis. Subcutaneous injection of FBP1-deficient Hep3B cells into immunodeficient NOD/SCID mice demonstrated that tumor growth was strongly decreased in comparison to control cells. mRNA expression studies by quantitative real time PCR showed reduced mRNA levels of the pro-apoptotic genes Bik, Noxa, TRAIL and TNF-􀀁 in the absence of FBP1. In addition, the cell cycle inhibitors p21 and p15 were repressed by FBP1 while Cyclin D2 expression was decreased in the absence of FBP1. Surprisingly, expression of c-myc was not altered by FBP1 downregulation, indicating a different mechanism of c-myc regulation in HCC cells. These results demonstrate that overexpression of FBP1 inhibits apoptosis and stimulates proliferation in HCC cells by regulating the transcription of relevant target genes. Therefore, FBP1 might represent a promising therapeutic target for the treatment of HCC. For analysis of the physiological function of FBP1, a gene trap mouse model was established. In these mice, the gene trap vector pT1􀀂geo is inserted in intron 19 of the FBP1 locus, leading to the expression of a fusion protein consisting of a truncated FBP1 (lacking the last 62 amino acids), 􀀁-Galactosidase and Neomycin Phosphotransferase. Luciferase reporter assays demonstrated that the fusion protein was not capable of activating the c-myc promoter and even showed a dominant negative effect. Thus, this gene trap mouse serves as a functional FBP1 knockout model. Phenotyping of the FBP1 gene trap mice showed that homozygous mutation of FBP1 resulted in embryonic lethality at late stages of embryonic development (E15.5-E16.5). Heterozygous mice were viable, but born at lower frequencies, indicating a gene dosage- or a dominant negative effect of the FBP1 fusion protein. The cellular effects of FBP1 inactivation were tested in mouse embryonic fibroblasts isolated from FBP1 gene trap mice. While proliferation was reduced in the absence of wildtype FBP1, apoptosis was not affected. Expression analysis showed that in homozygous MEFs p15 and p21 transcripts were upregulated, while decreased cmyc mRNA levels were measured. Closer inspection of homozygous gene trap embryos revealed an anemic phenotype that appeared most pronounced around embryonic day 15.5. Analysis of fetal livers, the main site of hematopoiesis at this stage of development, showed a strongly reduced total cell number in homozygous embryos. Evaluation of the different hematopoietic cell lineages did not reveal significant changes in particular differentiated cell types. Instead, all cell lineages seemed to be affected equally by FBP1 inactivation. In contrast, analysis of hematopoietic progenitor cell populations showed an increased percentage of multipotent progenitor cells (MPPs) and a strongly reduced number of long-term hematopoietic stem cells (LT-HSCs). Functional analysis of MPPs by in vitro colony formation assays demonstrated that the FBP1-mutant cells possess a normal colony formation potential while their expansion capacity was reduced. Competitive transplantation of lineage negative fetal liver cells into irradiated recipient mice resulted in reduced engraftment of liverderived progenitor cells from homozygous FBP1 gene trap mice. However, stable engraftment was observed over a period of 12 weeks, demonstrating that the FBP1-deficient LT-HSCs are in principle capable of long-term repopulation. These results demonstrate that FBP1 exerts an essential function during definitive hematopoiesis. It can be speculated that FBP1 influences proliferation, apoptosis and possibly also stem cell self-renewal through the regulation of specific target genes within the hematopoietic progenitor cells. Alternatively, extrinsic effects caused by the absence of FBP1 activity could impair the function of the progenitor cells.
Mit der Identifizierung des Histamin-H3-Rezeptorsubtyps im Jahr 1983 begann eine umfangreiche Erforschung seiner Bedeutung und die Suche nach spezifischen Liganden. Die genaue Sequenzaufklärung und Klonierung des humanen Histamin-H3-Rezeptors (hH3R) erst 16 Jahre später ermöglichte eine detaillierte Aufklärung molekularer Vorgänge, deren Auswirkungen auf physiologische und pathophysiologische Prozesse sowie die Entwicklung selektiver hH3R-Liganden. Es zeigte sich, dass der Rezeptor nicht nur die zentrale und periphere Histaminkonzentration im Körper reguliert, sondern auch die Ausschüttung weiterer Neurotransmitter moduliert und damit Einfluss auf zahlreiche neurologische Prozesse nimmt. Diese Erkenntnis macht ihn zu einer wichtigen Zielstruktur bei der Erforschung neuer Therapieansätze verschiedener Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Demenz, Schizophrenie, Narkolepsie, Epilepsie, Adipositas oder neuropatischer Schmerz. Obwohl bereits mehrere Liganden bekannt sind, die diesen Rezeptor adressieren, stellt die Entdeckung alternativer Leitstrukturen und neuer Strukturklassen ein wichtiges Ziel für die Entwicklung potentieller Wirkstoffe dar. Auch das Defizit an bildgebenden Liganden und deren stetig wachsende Nachfrage für eine effiziente Wirkstoffentwicklung und eine detaillierte Rezeptoraufklärung machen den Bedarf an neuen hochselektiven hH3R-Liganden deutlich. Ausgehend von der im eigenen Arbeitskreis etablierten antagonistisch/invers agonistisch selektiv wirkenden 1-(3-Phenoxypropyl)piperidin-hH3R-Leitstruktur wurden zunächst rechtsseitige Strukturerweiterungen in para-Position des zentralen Phenylringes durchgeführt (Abb. 4.1). Hauptbestandteile dieser Substituenten waren basische Strukturelemente oder Heterozyklen mit starker Wasserstoffbrücken-Akzeptorfunktion...
Etablierung eines universellen Testsystems zur funktionellen Analyse neuer MLL-Fusionspartner
(2010)
Leukämische Erkrankungen entstehen häufig aufgrund genetischer Aberrationen. Dabei handelt es sich in den meisten Fällen um reziproke chromosomale Transloka-tionen, die an der Entstehung chimärer Fusionsgene mit intaktem Leserahmen betei-ligt sind und letztendlich zur Expression neuartiger Fusionsproteine führen. Das auf Chromosom 11 Bande q23 lokalisierte MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) spielt bei einigen dieser chromosomalen Aberrationen eine wichtige Rolle. Es entstehen Fusi-onsproteine, die phänotypisch sowohl mit akuten myeloischen Leukämien (AML) als auch mit akuten lymphatischen Leukämien (ALL) assoziiert sind. Diese hämatopoie-tischen Erkrankungen werden aufgrund ihrer ungünstigen Prognose und schlechter Heilungschance als Hochrisiko-Leukämien klassifiziert. Neben Translokationen des MLL-Gens sind für die Leukämogenese noch weitere genetische Aberrationen von Bedeutung. Ebenso spielen, allerdings in geringerem Maße, Deletionen, Inversionen sowie Insertionen eine Rolle. Allen chromosomalen Translokationen sowie den übrigen chromosomalen Veränderungen geht mindestens ein DNA-Doppelstrangbruch voraus. Dieser findet sowohl beim MLL als auch beim Partnergen in sogenannten Bruchpunktsregionen statt. Inzwischen sind 104 verschiedene Veränderungen des MLL-Gens bekannt, von de-nen 64 auf molekularer Ebene charakterisiert wurden. Allein über 20 Partnergene wurden in den letzten fünf Jahren im Diagnostikzentrum DCAL (Diagnostic Center of Acute Leukemia) des Universitätsklinikums Frankfurt identifiziert. Allerdings sind bis heute noch keine universellen Ansätze zur Etablierung eines Tiermodells zur Unter-suchung neuer Partnergene bekannt. Somit ist es von großem Interesse möglichst schnell und zuverlässig dieses Ziel zu erreichen, um weitere Informationen über das onkogene Potential der beteiligten MLL-Partner zu erhalten. Als neue Kandidaten wurden im Rahmen dieser Arbeit DCPS, MAML2 sowie NRIP3 untersucht, die auf die Positivkontrolle ENL und auf die Negativkontrolle LASP1 bezogen wurden. Zunächst wurde ein universelles retrovirales Vektorsystem entwickelt, welches den MLL-N-Terminus (Exon 1 - Exon 9) trägt. Das zu untersuchende Partnergen kann durch Einklonieren der entsprechenden DNA-Sequenz in diesen Vektor eingefügt werden. Um ein authentisches Fusionsprodukt mit durchgehendem Leserahmen zu erhalten, sind die beiden Gene durch eine intronische Sequenz voneinander separiert. Die korrekte Fusion konnte auf Transkriptebene via RT-PCR nachgewiesen werden. In Vorversuchen wurden die Konstrukte MLL•DCPS, MLL•ENL (Positivkontrolle), MLL•LASP1 (Negativkontrolle), MLL•MAML2 sowie MLL•NRIP3 in murine hämato-poietische Progenitorzellen (Ba/F3 und 32D) transduziert. Die erfolgreiche Infektion konnte sowohl fluoreszenzmikroskopisch als auch auf Transkriptebene nachgewie-sen werden. Des Weiteren zeigten die Konstrukte unterschiedliche Einflüsse auf die Hox-Genexpression der Hox-Gene a5, a7, a9, a10, b3 und b4. Zur Untersuchung wachstumstransformierender und proliferierender Eigenschaften der Fusionsproteine folgten nach Abschluss der Vorversuche erste Transduktionsex-perimente mit murinen Lin-/Sca1+-hämatopoietischen Zellen. Mittels eines Methylcel-lulose-Assays sollten die transformierenden Eigenschaften der MLL-Fusionen über-prüft werden. Lediglich die Positivkontrolle wies wachstumstransformierende Eigen-schaften auf. Somit legen die bisherigen Ergebnisse die Vermutung nahe, dass noch weitere Faktoren für die Leukämogenese relevant sein müssen. Um Aussagen über das Verhalten der zu untersuchenden MLL-Fusionen in vivo tref-fen zu können, wurden retroviral infizierte, Lin-/Sca1+-aufgereinigte hämatopoietische Stammzellen in Empfängermäuse transplantiert. Bis zum jetzigen Zeitpunkt konnten bei den Mäusen noch keinerlei Symptome einer leukämischen Erkrankung diagnosti-ziert werden. Es ist abzuwarten, ob die transplantierten Mäuse in den nächsten Wo-chen leukämische Verhaltensauffälligkeiten aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erfolgreich ein Testsystem etabliert werden, das es ermöglicht, neue Partnergene in kürzester Zeit funktionell zu analysieren. So können in Zukunft hoffentlich neue Erkenntnisse zur Leukämogenese gewonnen werden, die eventuell neue Therapieansätze ermöglichen.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien assoziiert und gelten in den meisten Fällen als Erkrankungsursache. Das MLL-Gen auf der Chromosomenbande q23 des Chromosoms 11 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt, und die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusionsgene sind ausschließlich mit Hochrisikoleukämien assoziiert. Die häufigste Aberration ist eine reziproke Translokation zwischen den beiden Genen MLL und AF4 (4q21), die t(4;11)-Translokation, die in ca. 80% aller Akuten Lymphatischen Leukämien bei Kleinkindern, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie, auftritt. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapien resistent, so dass t(4;11) Leukämien mit einer ungewöhnlich schlechten Prognose verbunden sind. Welches der beiden Fusionsproteine, MLL-AF4 oder AF4-MLL, die bei der t(4;11)-Translokation entstehen für die Entstehung der Leukämie verantwortlich ist, wird noch kontrovers diskutiert. Bisherige Publikationen zeigen die Onkogenität beider Fusionsproteine, und ihr Potential, Leukämien im Mausmodell hervorzurufen. Frühere Studien dieser Arbeitsgruppe zeigen die onkogene Wirkung des AF4-MLL Fusionsproteins, dessen Expression zur Wachstumstransformation von murinen Zellen und einer Akuten Lymphatischen Leukämie in der Maus führt. Die onkogene Wirkung von AF4-MLL entsteht, sobald das Fusionsprotein nach seiner Prozessierung durch die Endopeptidase Taspase1 heterodimerisiert und dadurch vor SIAH-vermitteltem proteasomalen Abbau geschützt wird. So kann sich das heterodimerisierte Protein - anders als das AF4-Wildtyp Protein - in den Zellen anhäufen und zu unkontrolliertem Wachstum führen. Um die Heterodimerisierung des AF4-MLL Fusionsproteins kompetitiv zu inhibieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit kleine Fragmente aus der C-terminalen Interaktionsdomäne FYRC von MLL exprimiert. Dazu wurde die Interaktion kleiner Peptide aus der FYRC-Domäne mit dem N-terminalen Fragment des AF4-MLL Proteins mithilfe eines Biosensorsystems und Co-Immunopräzipitationen getestet. Anschließend wurden die kleinsten Peptide, die noch an das N-terminale Fragment binden können (B1 und B3), ausgewählt, und zusammen mit AF4-MLL co-exprimiert. Mithilfe von Western Blot-Analysen von gereinigtem AF4-MLL·N konnte gezeigt werden, dass die Expression dieser Peptide dazu führt, dass das C-terminale Fragment nicht mehr an das N-terminale Fragment binden kann. Durch diese Inhibition der Heterodimerisierung kann der AF4-MLL Multiproteinkomplex nicht vollständig aufgebaut werden, da auch die C-terminalen Komplexpartner WDR5 und RBBP5 nur noch eingeschränkt binden können. Zusätzlich wurde die Stabilität der prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C im Falle einer Inhibition der Dimerisierung untersucht. Offensichtlich sind beide Fragmente nur stabil, wenn sie miteinander heterodimerisiert sind. Eine Blockierung der Interaktion durch kompetitive Peptide führt dazu, dass sowohl AF4-MLL·N als auch MLL·C proteasomal degradiert werden. Da auch das MLL-Wildtyp Protein über die Interaktionsdomänen FYRN und FYRC heterodimerisiert, wurde zusätzlich der Effekt der Expression der Peptide auf die Viabilität von MLL-exprimierenden Zellen untersucht. Dazu wurden die Peptide B1 und B3 in sechs unterschiedlichen Zelllinen, von denen zwei die t(4;11)-Translokation tragen, exprimiert. Anschließend wurde nach einer PI-Färbung der Anteil apoptotischer Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers ermittelt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass keines der beiden Peptide einen starken Einfluss auf Zelllinien hat, die das Wildtyp-MLL Gen besitzen. Die Apoptose der vier untersuchten Zelllinien war kaum erhöht, wenn diese Peptide exprimiert wurden. Interessanterweise scheint das Peptid B1 dagegen einen Apoptosefördernden Effekt auf diejenigen Zellen zu haben, die das AF4-MLL Protein exprimieren. Basierend auf den vorliegenden Daten kann die Aussage getroffen werden, dass es prinzipiell möglich ist, das AF4-MLL Fusionsprotein spezifisch anzugreifen. Eine Blockierung der Heterodimerisierung blockiert die Ausbildung des onkogenen AF4-MLL Multiproteinkomplexes. Dies führt zudem dazu, dass die beiden Taspase1-prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C proteasomal degradiert werden. Die Inhibition der Heterodimerisierung von AF4-MLL ist mit einer leicht erhöhten Apoptoserate in t(4;11)-positiven Zellen verbunden. Diese Beobachtung könnte in Zukunft von Bedeutung sein, wenn über neue Therapieansätze bei t(4;11) Leukämien nachgedacht werden sollte.
Yonasi
(2010)