Entwicklung und Synthese spaltbarer Linker für den Einsatz in der DNA-Sequenzierung und der Zellaufnahme von Antisense-Oligonukleotiden

Development and synthesis of cleavable linkers for the use in DNA sequencing and cell uptake of antisense oligonucleotides

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Synthese von spaltbaren Linkern. Dabei wurden zwei unterschiedliche Themengebiete bearbeitet: 1) Entwicklung eines enzymatisch spaltbaren Safety-Catch-Linkers, der eine flex
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Synthese von spaltbaren Linkern. Dabei wurden zwei unterschiedliche Themengebiete bearbeitet: 1) Entwicklung eines enzymatisch spaltbaren Safety-Catch-Linkers, der eine flexible Modifizierung ermöglicht für den potentiellen Einsatz zur zielgerichteten Zellaufnahme von (Antisense-)Oligonukleotiden. 2) Entwicklung eines Fluorid-spaltbaren Linkers für die reversible Fluo¬reszenz¬markie¬rung von Triphosphaten zum Einsatz in einer neuen Methode der DNA-Sequenzierung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuer, variabler enzymatisch spaltbarer Safety-Catch-Linker entwickelt und es wurden drei Derivate synthetisiert. Die drei neuen Safety-Catch-Linker sind über Amid- bzw. Esterbindungen an die 5' Position von 2' Desoxythymidin angebunden und sind Substrate für zwei unterschiedliche Enzyme. Zwei der synthetisierten Derivate des Linkers sind Substrate der Penicillin G Acylase und eins ist ein Substrat für die Pyroglutamyl Aminopeptidase I. Sie wurden hinsichtlich ihrer Spaltungs- und Stabilitätseigenschaften intensiv untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Ester-verknüpften Linker für eine Anwendung unter physiologischen Bedingungen geeignet sind. Es wurden kinetische Spaltungsexperimente durchgeführt und dabei eine sehr effektive enzymatische Spaltung durch das entsprechende Enzym beobachtet. Es wurde außerdem der Mechanismus einer, bei höheren pH-Werten beobachteten, nicht-enzymatischen Spaltung aufgeklärt. Darüber hinaus konnte das sehr basenlabile, mit Pyroglutamyl Aminopeptidase I spaltbare Derivat unter Anwendung einer aminoschutzgruppenfreien Oligonukleotidsynthesemethode erfolgreich in ein Antisense-Oligonukleotid eingebaut werden. Für das EU-Projekt „ArraySBS“ wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neuer, hoch effizient mit Fluoridionen spaltbarer Linker für die reversible Anbindung eines Fluoreszenzfarbstoffs an die Baseneinheit eines Nukleotids entwickelt. Die spaltbare Einheit des Linkers basiert auf dem Strukturmotiv der 2-Cyanoethylgruppe, als Spacer zwischen dem Nukleotid und dem Fluoreszenzfarbstoff wurde eine Triglykoleinheit verwendet. Die Spaltungseigenschaften wurden an einer Modellverbindung, einem modifizierten Nukleosid und einem immobilisierten Oligonukleotid intensiv untersucht. Dabei wurde eine vollständige Spaltung mit 1 M TBAF in THF in weniger als einer Minute gefunden und die erwartete beta-Eliminierung als Spaltungsmechanismus bestätigt. Mit Hilfe des entwickelten Linkers wurden vier neue, Fluoreszenz-markierte, reversible Terminatoren in sehr hoher Reinheit hergestellt und analytisch eindeutig identifiziert. Dabei handelt es sich um ein Fluorescein-markiertes 2'-Desoxyuridin Derivat, ein Cy3-markiertes 2' Desoxycytidin, ein Cy5-markiertes 2'-Desoxyguanosin und ein TexasRed-markiertes 2' Desoxyadenosin Derivat. Diese wurden dann in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern des EU Projekts erfolgreich durch eine DNA-Polymerase in DNA-Template eingebaut und in einem ersten Anwendungsexperiment an immobilisierten Hairpin-Templaten in zwei Sequenzierungszyklen eingesetzt.
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The aim of this PhD thesis was to develop and synthesise cleavable linkers for two different applications: 1) Development of an enzymatically cleavable linker which easily enables versatile modifications for potential us
The aim of this PhD thesis was to develop and synthesise cleavable linkers for two different applications: 1) Development of an enzymatically cleavable linker which easily enables versatile modifications for potential use in targeted cell uptake of (antisense)oligonucleotides. 2) Development of a fluoride cleavable linker, enabling reversible fluorescence labelling of triphosphates for a new DNA sequencing method. During this work a new and variable, enzymatically cleavable safety-catch linker was developed and three derivatives were synthesised. These three new safety-catch linkers are attached to the 5' position of 2' deoxythymidine by an amide or ester bond. Two of these derivatives are substrates of the enzyme Penicillin G acylase and one is a substrate of pyroglutamyl aminopeptidase I. They were investigated intensively regarding their cleavage and stability properties. In kinetic cleavage studies the ester-coupled linkers were found to be suitable for the use under physiological conditions. They were cleaved efficiently by the designated enzymes. Further a non-enzymatic cleavage mechanism, which was observed at higher pH values, could be clarified. In addition the pyroglutamyl aminopeptidase I substrate, which is very base labile, could successfully be introduced into an oligonucleotide by applying a synthesis strategy without base protection. Within the framework of the EU-project “ArraySBS” a new linker was developed which is highly efficiently cleaved by fluoride ions. This cleavable linker serves for reversibly attaching a fluorescence dye to the base moiety of a nucleotide. The cleavable core of the linker is based on the structural motif of the 2-cyanoethyl group, as spacer between the fluorescence dye and the nucleotide a triglycol moiety was introduced. The cleavage properties of a model compound, a modified nucleoside and an immobilised oligonucleotide were intensively investigated and a complete cleavage in less than one minute could be demonstrated with 1 M TBAF in THF. Further the expected cleavage mechanism (beta-elimination) could be confirmed. By using this cleavable linker four new fluorescence labelled reversible terminators were synthesised in high purity and fully characterised. Each nucleotide analogue has a different fluorophore attached to the base; the 2'-deoxyuridine derivative was labelled with fluorescein, the 2'-deoxycytidine derivative with Cy3, the 2'-deoxyguanosine derivative with Cy5 and the 2'-deoxyadenosine derivative was labelled with TexasRed. Together with the collaborators of the EU-project these four fluorescence labelled reversible terminators were successfully introduced into a DNA template by a DNA polymerase and used in a first cyclic reversibly terminating approach by performing two cycles of elongation on immobilised hairpin templates.
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Metadaten
Author:Diana Caterina Knapp
URN:urn:nbn:de:hebis:30-85923
Referee:Joachim W. Engels
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/12/03
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2010/10/25
Release Date:2010/12/03
Tag:Fluorid spaltbarer Linker ; Sequenzierung durch Synthese ; Zellaufnahme; enzymatisch spaltbarer Linker ; reversible Terminatoren
Fluorescence labelling ; Fluorid cleavable linker ; cell uptake; enzymatically cleavable Linker ; reversible terminator ; sequencing by synthesis
SWD-Keyword:Antisense-Oligonucleotide; DNS-Sequenz ; Fluoreszenzmarkierung ; Linker
HeBIS PPN:229261116
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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