Bindung des C 1-Carriers Tetrahydromethanopterin und seiner Derivate an Enzyme des Energiestoffwechselweges methanbildender Archaeen

In dieser Arbeit sollte die Bindung von Tetrahydromethanopterinderivaten an zwei Enzyme des methanogenen, CO2-reduzierenden Energiestoffwechselweges strukturell charakterisiert werden. In jenem Stoffwechselweg verläuft d
In dieser Arbeit sollte die Bindung von Tetrahydromethanopterinderivaten an zwei Enzyme des methanogenen, CO2-reduzierenden Energiestoffwechselweges strukturell charakterisiert werden. In jenem Stoffwechselweg verläuft die schrittweise Reduktion von CO2 über die Bindung an den C1-Carrier Tetrahydromethanopterin (H4MPT), ein Tetrahydrofolat-Analogon, welches unter anderem in methanogenen Archaeen zu finden ist. Die thermophilen bzw. hyperthermophilen Ursprungsorganismen der untersuchten Enzyme, Methanothermobacter marburgensis, Methanocaldococcus jannaschii und Methanopyrus kandleri, sind aufgrund ihrer Anpassung an extreme Habitate durch spezielle genomische, strukturelle und enzymatische Eigenschaften von strukturbiologischem Interesse. Beim ersten in dieser Arbeit untersuchten Enzym handelte es sich um den aus acht Untereinheiten bestehenden membrangebundenen N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M-Methyltransferasekomplex (MtrA-H). Dieser katalysiert in einem zweistufigen Mechanismus den Methyltransfer von H4MPT zum Co(I) der prosthetischen Gruppe 5’-Hydroxybenzimidazolylcobamid (Vitamin B12a), um die Methylgruppe dann auf Coenzym M zu übertragen. Gleichzeitig findet ein der Energiekonservierung dienender vektorieller Natriumtransport über die Membran statt. Für den Mtr-Komplex aus M. marburgensis (670 kDa) lag bereits ein Protokoll zur Reinigung unter anaeroben Bedingungen vor. Dieses wurde im Rahmen dieser Arbeit verbessert, für die Isolierung und Reinigung unter aeroben Bedingungen vereinfacht und für die Erfordernisse der zur Strukturbestimmung verwendeten elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung optimiert. Neben der Präparation des kompletten Komplexes MtrA-H wurde als Alternative die Präparation des Enzymkomplexes MtrA-G unter möglichst vollständiger Abtrennung der hydrophilsten Untereinheit MtrH gewählt. Mit der zu diesem Zweck entwickelten Methode konnte das Abdissoziieren von MtrH besser als im etablierten Protokoll kontrolliert und somit die Homogenität der Probe deutlich verbessert werden. Dies schafft zum einen die Vorraussetzungen für eine Kristallisation zur Röntgenstrukturanalyse, zum anderen war auch in bei der elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung erkennbar, dass mit dem Mtr-Komplex ohne MtrH bessere Ergebnisse zu erzielen sind. Parallel zu den Untersuchungen am Gesamtkomplex sollten die den Cobamid-Cofaktor bindende Untereinheit MtrA sowie die H4MPT-bindende Untereinheit MtrH in für die Kristallisation und röntgenkristallographische Untersuchung ausreichender Menge und Qualität gereinigt werden. Hierfür wurden MtrA und MtrH aus oben genannten Organismen für die heterologe Expression in E. coli kloniert, die Expressionsbedingungen optimiert und Reinigungsprotokolle etabliert. Anschließend wurden die Untereinheiten umfangreichen Kristallisationsversuchen unterzogen. Die Untereinheit MtrA aus M. jannaschii konnte ohne die C-terminale Transmembranhelix als lösliches Protein in E. coli produziert und als Holoprotein bis zur Homogenität gereinigt werden. Bei M. kandleri MtrA gelang die Herstellung von geringen Mengen teilweise löslichen StrepII-Fusionsproteins ohne C-terminale Transmembranhelix in E. coli. Eine Produktion der Untereinheit MtrH in E. coli als lösliches Protein war bei keiner der in dieser Arbeit getesteten Varianten möglich. Mit dem in Einschlusskörperchen exprimierten Protein aus M. marburgensis wurde eine Reinigung und Rückfaltung versucht. Auch eine Co-Expression der Untereinheiten MtrA und MtrH, durch welche eine bessere Faltung und Löslichkeit erreicht werden sollte, war nur in Einschlusskörperchen möglich. Das zweite in dieser Arbeit untersuchte Enzym, die F420 abhängige N5,N10 Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (Mtd), katalysiert den reversiblen, stereospezifischen Hydrid-Transfer zwischen reduziertem F420 (F420H2) und Methenyl-H4MPT+, welches hierbei zu Methylen-H4MPT reduziert wird. Die Reaktion verläuft über einen ternären Komplex bestehend aus Protein, Substrat (Methylen-H4MPT) und Cosubstrat (F420), welcher strukturell charakterisiert werden sollte. Das gereinigte, rekombinante Enzym aus M. kandleri wurde mit verschiedenen H4MPT- und F420-Derivaten co-kristallisiert, die Struktur des ternären Komplexes röntgenkristallographisch bestimmt und die Bindung von H4MPT und F420 analysiert. Methenyl-H4MPT+ und F420H2 sind in der in dieser Arbeit gelösten Kristallstruktur in katalytisch aktiver Konformation gebunden, jedoch kann bei einer Auflösung von 1,8 Å nicht beurteilt werden, ob Methylen-H4MPT und F420 oder Methenyl-H4MPT+ und F420H2 vorlagen. Ein Vergleich mit der Struktur von M. kandleri-Mtd (KMtd) ohne Substrat und Cosubstrat ergab nur äußerst geringe Abweichungen in der Proteinkonformation, sodass sich KMtd überraschenderweise als Beispiel für ein Enzym mit ungewöhnlich starrer, vorgegebener Bindetasche erwies.
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The aim of this study was a structural characterization of the binding of tetrahydromethanopterin derivatives to enzymes of the energy conserving CO2-reducing methanogenic pathway. In this pathway the stepwise reduction 
The aim of this study was a structural characterization of the binding of tetrahydromethanopterin derivatives to enzymes of the energy conserving CO2-reducing methanogenic pathway. In this pathway the stepwise reduction of CO2 proceeds via binding to the tetrahydrofolate analog tetrahydromethanopterin (H4MPT) which is found i. a. in methanogenic archaea. Due to the adaptation of the thermophilic and hyperthermophilic source organisms (Methanothermobacter marburgensis, Methanocaldococcus jannaschii and Methanopyrus kandleri) to their extreme habitats by genomic, structural and enzymatic features, they are of special interest for structural biology. The first enzyme investigated in this study is the eight subunits containing membrane bound complex of N5-methyl-H4MPT:coenzyme M methyltransferase (MtrA-H). Firstly, it catalyzes the methyl group transfer from H4MPT to the Co(I) of the prosthetic group (5’-hydroxybenzimidazolylcobamide; vitamin B12a). In a second step, it transfers the methyl group to coenzyme M, which is coupled to an energy conserving vectorial sodium ion transport across the membrane. The purification protocol for Mtr complex from M. marburgensis (670 kDa) previously established under anaerobic conditions was enhanced, simplified for isolation and purification under aerobic conditions and optimized for electron microscopic single particle reconstruction. Besides the preparation of the complete complex MtrA-H, the preparation of enzyme complex MtrA-G without the most hydrophilic subunit MtrH was chosen as a second approach. The purification method developed for this purpose improved the control over dissociation of MtrH from complex MtrA-G and enhanced the homogeneity of the sample significantly. Thus, the prerequisites for crystallization and subsequent X-ray studies were created as well as for electron microscopic single particle reconstruction, which was confirmed by experiments with MtrA-G (without MtrH) promising far better results. Concurrently to the studies on the complete Mtr complex, cobamide containing subunit MtrA and H4MPT binding subunit MtrH should be purified to homogeneity in quantities sufficient for crystallization and X-ray analysis. Therefore, MtrA and MtrH from source organisms mentioned above were cloned for heterologous expression in E. coli, expression conditions were optimized and purification protocols were established. The purified proteins were used for extensive crystallization experiments. MtrA from M. jannaschii without its transmembrane helix could be produced in E. coli as a soluble protein. The holoprotein could be purified to homogeneity but crystallization failed presumably due to its exceptionally high solubility. MtrA from M. kandleri was produced in E. coli as a StrepII fusion protein without transmembrane helix only in marginal amounts. The production of subunit MtrH in E. coli as a soluble protein was not possible regardless of the variants tested in this thesis. Attempts to refold and purify to homogeneity the M. marburgensis protein expressed in inclusion bodies were without success. Co-expression of MtrA and MtrH with the objective of improving folding and solubility also led to the production of inclusion bodies which could not be refolded and purified together. The second enzyme analyzed in this thesis, F420-dependent N5,N10-methylene-H4MPT dehydrogenase (Mtd), catalyzes the reversible stereospecific hydride transfer between reduced F420 (F420H2) and methenyl-H4MPT+, the latter being thereby reduced to methylene-H4MPT. The ternary complex involved in this reaction consists of the protein part, substrate (methylene-H4MPT) and co-substrate (F420) and was structurally characterized in this thesis. The purified recombinant enzyme from M. kandleri was co-crystallized with several H4MPT and F420 derivatives, the structure of the ternary complex was determined by X-ray crystallography and the binding of H4MPT and F420 was analyzed. In the structure solved in the thesis methenyl-H4MPT+ and F420H2 are bound in a catalytically active conformation, but a resolution of 1.8 Å precludes a discrimination between either methylene-H4MPT and F420 or methenyl-H4MPT+ and F420H2. Compared to the structure of M. kandleri Mtd (KMtd) without substrate and co-substrate bound, only marginal variations of the protein conformation were visible. Thus KMtd can be considered as a surprising and extreme example of an enzyme with an exceptionally rigid, preformed binding pocket.
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Metadaten
Author:Katharina Elisabeth Ceh
URN:urn:nbn:de:hebis:30-87390
Referee:Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/02/25
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2009/07/10
Release Date:2011/02/25
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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