Charakterisierung der ba 3 Chinoloxidase aus Paracoccus denitrificans

Paracoccus denitrificans besitzt eine verzweigte Elektronentransportkette. Unter aeroben Bedingungen werden die Elektronen ausgehend von Ubichinol bevorzugt über den bc 1 ­ Komplex auf die aa 3 Cytochrom c Oxidase übertr
Paracoccus denitrificans besitzt eine verzweigte Elektronentransportkette. Unter aeroben Bedingungen werden die Elektronen ausgehend von Ubichinol bevorzugt über den bc 1 ­ Komplex auf die aa 3 Cytochrom c Oxidase übertragen. Alternativ können die Elektronen jedoch unter Umgehung des bc 1 ­Komplexes direkt auf die ba 3 Chinoloxidase transferiert werden. Diese gehört wie die Cytochrom c Oxidase zur Gruppe der Häm­Kupfer Oxidasen; sie reduzieren Sauerstoff zu Wasser und koppeln diese Reaktion an eine vektorielle Translokation von Protonen über die Membran. Die vorgelegte Dissertation befaßt sich mit der Charakterisierung der ba 3 Chinoloxidase. Mittels Mutationen sollen ausgesuchte Aminosäuren untersucht werden, die an der Protonen­ Translokation bzw. der Reduktion von Sauerstoff beteiligt sind. Zudem soll das Phänomen der heterogenen Untereinheit II geklärt sowie die Notwendigkeit für die Anwesenheit von Häm a in der high­spin Position untersucht werden. Dazu mußte zunächst das homologe Expressionssystem für die ba 3 Chinoloxidase verbessert werden. Zu diesem Zweck wurde ein aa 3 /ba 3 Paracoccus­Deletionsstamm geschaffen, der es ermöglicht, die Expression der auf einem Plasmid in trans angebotenen Gene der Chinoloxidase um den Faktor fünf zu erhöhen. In Anlehnung an ein bereits existierendes Reinigungsprotokoll ist es gelungen, die Chinoloxidase in einem zweistufigen säulenchromatographischen Verfahren zu isolieren. Das gereinigte Enzym oxidiert sein Substrat Ubichinol in einer pH­abhängigen, aber Ionenstärke­ unabhängigen Reaktion. Bis dato sind zwei Kanäle definiert, der D­ und der K­Kanal, über die Protonen ausgehend vom Cytoplasma bis zum binukleären Zentrum transportiert werden. Diese werden dann entweder für die Reduktion des Sauerstoffs verwendet oder gekoppelt an diesen Prozeß über die Membran transloziert. Durch gezielte Punktmutationen sowie Ganzzell­Pumpexperimente kann der Beginn eines weiterführenden Protonen­Ausgangskanals bestimmt werden, der durch die benachbarten Arginine 490, 491 und das D­Ring­Propionat des high­spin Häms gebildet wird. Durch Wasserstoffbrücken­Bindungen und Ladungsinteraktionen stabilisieren diese Arginine die deprotonierte, anionische Form der Propionat­Gruppe und erlauben somit eine transiente Bindung von Protonen an das Propionat. Für die Stabilisierung dieses Zustands bzw. die spätere Weiterleitung von Protonen scheint unter anderem die Aminosäure Aspartat 416 verantwortlich zu sein, da eine Mutation an dieser Position zu einem entkoppelten Phänotyp führen kann. Für die Reduktion des Sauerstoffs werden vier Elektronen benötigt. Da aber das vollständig reduzierte binukleäre Zentrum nur drei Elektronen liefern kann, wird ein Tyrosinradikal diskutiert, welches das benötigte vierte Elektron zur Verfügung stellen soll. Gezielte Punktmutationen und spektroskopische Analysen der ba 3 Chinoloxidase sollten zeigen, ob es sich dabei um Tyrosin 297 handelt, dessen Radikalform durch eine kovalente Bindung zu Histidin 293 stabilisiert wäre. Die Mutationen Y297H und Y297F führen in beiden Fällen zu einer enzymatisch inaktiven ba 3 Chinoloxidase. Durch FTIR­Spektroskopie kann gezeigt werden, daß Mutationen an dieser Position die Stabilität des binukleären Zentrums beeinflussen. Es läßt sich jedoch aufgrund der fehlenden Enzymaktivität sowie der Störung der geometrischen Struktur des binukleären Zentrums keine Aussage über die Bedeutung der Aminosäure Tyrosin 297 als Elektronendonor treffen. Die Verkürzung des C­Terminus der Untereinheit II durch das Einbringen von Stop­Codons zeigt, daß es sich bei der Heterogenität dieser Untereinheit um einen proteolytischen Abbau handeln muß. Dieser geschieht an spezifischen, aber bisher noch nicht näher charakterisierten Positionen, hat aber keinen Einfluß auf den Zusammenbau oder die Aktivität der Oxidase. Durch die heterologe Expression der bo 3 Chinoloxidase aus E. coli in Paracoccus kann gezeigt werden, daß eine Grundvoraussetzung für eine aktive Chinoloxidase ein farnesyliertes Häm b Derivat in der high­spin Häm­Position ist. Die dadurch gebildete Hydroxyl­Gruppe stellt eine Möglichkeit dar, wie die für die Reduktion des Sauerstoffs notwendigen Protonen das binukleäre Zentrum erreichen können. Ob es sich dabei um ein Häm a oder o handelt, ist wirtsspezifisch und eine Frage der Häm­Verfübarkeit bzw. des Häm­Einbaus.
show moreshow less

Download full text files

Export metadata

  • Export Bibtex
  • Export RIS

Additional Services

    Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author:Thomas Schröter
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000001421
Referee:Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2003/04/10
Year of first Publication:2000
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2001/02/01
Release Date:2003/04/10
SWD-Keyword:Chinoloxidase ba3; Paracoccus denitrificans
HeBIS PPN:096456140
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $