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Luzie Jessl

• Unter den weltweit in ständigem Gebrauch befindlichen Chemikalien befinden sich nicht nur Verbindungen mit akuter toxischer Wirkung, sondern auch solche mit Wirkung auf das endokrine System. Eine große Rolle spielt hier vor allem die Störung der Geschlechtsdifferenzierung und der Reproduktion, ausgelöst durch natürliche oder synthetische Chemikalien mit endokrinem Potential, sogenannte endokrine Disruptoren (ED). Diese Chemikalien können über unterschiedliche Eintragspfade in die Umwelt gelangen. Seit Mitte des 20. Jahrhunderts werden mehr und mehr Fälle bekannt, in denen anthropogene Chemikalien die Pflanzen- und Tierwelt belasten, darunter zahlreiche Befunde zu Störungen des Hormonsystems von Mensch und Tier. Im Rahmen der Gefahren- und Risikobewertung steht bereits eine Vielzahl harmonisierter Prüfrichtlinien für die Identifizierung und Evaluierung der Effekte von (potentiellen) ED zur Verfügung. Um die Gesamtheit aller potentiellen Interaktionen von ED mit dem Hormonsystem detektieren zu können, ist die In-vivo-Untersuchung an Vertebraten in der Chemikalienregistrierung bisher unabdingbar. Bei der Untersuchung endokriner Potentiale in höheren Vertebraten spielen vor allem nager- und vogelbasierte Testsysteme eine wichtige Rolle. Diese bergen jedoch einen hohen zeitlichen, personellen und finanziellen Aufwand und erfordern eine massive Zahl an Versuchstieren, die für diese Tests benötigt werden. Darüber hinaus beinhalten Tierversuche eine Vielzahl von Problemen einschließlich ethischer Bedenken, die sich als Konsequenz der Tierhaltung unter Versuchsbedingungen ergeben. Ein sehr interessanter und vielversprechender Ansatz zur Reduktion von Tierversuchen ist die Entwicklung eines standardisierten Verfahrens für die Untersuchung potentieller ED in Vogelembryonen. Auf Vogelembryonen basierende In-ovo-Modelle stellen einen Mittelweg zwischen In-vitro- und In-vivo-Testsystemen dar. Mit dem Vogeleitest wird der sich entwickelnde Embryo, das für ED sensitivste Entwicklungsstadium im Leben eines Organismus, berücksichtigt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Eignungsuntersuchung eines auf dem Embryo des Haushuhns (Gallus gallus domesticus) basierenden Testsystems für den Nachweis von ED. Das resultierende Testsystem soll als Alternativmethode zu bisher etablierten nager- und vogelbasierten Testsystemen für die Untersuchung der Effekte hormonell aktiver Substanzen auf die Geschlechtsdifferenzierung in höheren Wirbeltieren eingesetzt werden. Die im Rahmen der vorliegenden Dissertation durchgeführten Arbeiten umfassten sowohl die Charakterisierung der Normalentwicklung des Hühnerembryos, unbeeinflusst durch ED, als auch die morphologisch-histologischen Veränderungen der Gonaden von substanzexponierten Embryonen. Für die Untersuchung substanzbedingter Effekte, welche den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit darstellen, wurden die Embryonen gegenüber verschiedenen (anti)estrogenen und (anti)androgenen Substanzen exponiert. Unter Einfluss der Estrogene Bisphenol A (BPA) und 17α-Ethinylestradiol (EE2) entwickelten sich die Keimdrüsen der Männchen zu Ovotestes, während Weibchen ein Ovar mit deutlich schmalerem Cortex ausbildeten. Unter Einfluss der Antiestrogene Fulvestrant und Tamoxifen blieben Effekte auf die Gonaden männlicher Embryonen aus, eine durch das potente Estrogen EE2 hervorgerufene Feminisierung männlicher Gonaden konnte durch beide Substanzen jedoch effektiv antagonisiert werden. Weibchen bilden unter Einfluss von Tamoxifen deutlich schmalere linke Gonaden mit einem missgebildeten Cortex aus. Unter Einfluss der Androgene Tributylzinn (TBT) und 17α-Methyltestosteron (MT) blieben die Effekte auf männliche Embryonen aus, während die Weibchen anatomisch virilisierte Gonaden und eine Reduktion des linken gonadalen Cortex aufwiesen. Allein die untersuchten antiandrogenen Versuchssubstanzen Cyproteronacetat (CPA), Flutamid und p,p´-Dichlorodiphenyldichloroethen (p,p´-DDE) hatten keinen Effekt auf die gonadale Geschlechtsdifferenzierung männlicher und weiblicher Hühnerembryonen. Es konnte gezeigt werden, dass der Embryo von G. gallus domesticus einen sensitiven Organismus innerhalb des Tierreichs darstellt und hinreichend sensitiv auf eine Reihe von endokrin wirksamen und reproduktionstoxischen Chemikalien reagiert. Anatomische und histologische Änderungen der Gonaden können daher als Biomarker für die Wirkung von ED bei Vögeln nützlich sein. Die untersuchten Endpunkte beziehen sich jedoch auf apikale Effekte und liefern keine mechanistischen Informationen zu den untersuchten Substanzen. Der Hühnereitest ist eine sinnvolle Ergänzung zur bestehenden OECD-Testbatterie und zeichnet sich besonders durch seine kostengünstige und einfache Handhabung im Labor sowie einfach durchzuführende Tests aus. Durch die vergleichsweise kurze Versuchsdauer von nur 19 Tagen ist ein schnelles Substanzscreening möglich, welches zeitlich deutliche Vorteile gegenüber den etablierten nager- und vogelbasierten Testsystemen hat. Als Alternative zu bisherigen Assays könnte der vorgeschlagene Hühnereitest dazu beitragen, im Rahmen der (öko)toxikologischen Gefährdungs- und Risikobewertung von Chemikalien künftig weniger Versuchstiere zu verwenden.
• Among the chemicals in constant use worldwide, there are not only compounds with acute toxicity, but also compounds with effects on the endocrine system. In particular, the disruption of sex differentiation and reproduction, triggered by natural or synthetic chemicals with endocrine potential, so-called endocrine disruptors (ED), play a major role. These chemicals can enter the environment through different pathways. Since the mid-20th century, more and more cases have been reported in which anthropogenic chemicals have affected plant and animal life. There are numerous findings on endocrine disruption in humans and animals. In the context of hazard and risk assessment, a large number of harmonized test guidelines are already available for the identification and evaluation of (potential) ED. So far, for the registration of chemicals in vivo studies are indispensable to detect the totality of potential interactions of ED with the endocrine system. Investigating the endocrine potentials in higher vertebrates, especially rodent- and bird-based test systems play an important role. However, these test systems are time-, cost- and personnel-intensive. In addition, a high number of laboratory animals are required for these tests which involve a variety of issues such as ethical concern. A very interesting and promising approach to reduce animal testing is the development of a standardized procedure for testing potential ED in avian embryos. Bird based in ovo models represent a compromise between in vitro and in vivo assays. In addition, the most sensitive developmental stage for ED in the life of an organism, is considered - the developing embryo. The objective of the present work was the development and suitability testing of a bioassay for the detection of ED based on the embryo of domestic chicken (Gallus gallus domesticus). The resulting bioassay is intended to be used as an alternative method to previously established rodent- and bird-based test systems for investigating the effects of hormonally active substances on sex differentiation in higher vertebrates. The studies performed in the present work included both the characterization of the normal development of the chicken embryo, unaffected by ED, and the morphological-histological alterations of the gonads of substance-exposed embryos. For the investigation of substance-related effects, which are the main focus of the present work, embryos were exposed to different (anti)estrogenic and (anti)androgenic substances. Exposure to the xeno-estrogens bisphenol A (BPA) and 17α-ethinylestradiol (EE2) resulted in the development of ovotestes in males, whereas females formed an ovary with a significantly narrower cortex. Exposure to the antiestrogens fulvestrant and tamoxifen resulted in no effects on the gonads of male embryos,whereas EE2-induced feminization of male gonads could be effectively antagonized by both substances. Tamoxifen-treated females formed significantly narrower left gonads with a malformed cortex. Exposure to androgenic tributyltin (TBT) and 17α-methyltestosterone (MT) resulted in no effects on male embryos, while female embryos showed anatomically virilized gonads and a reduction of the left gonadal cortex. Exposure to antiandrogenic cyproterone acetate (CPA), flutamide and p,p´-dichlorodiphenyldichloroethylene (p,p´-DDE) had no effect on gonadal sex differentiation of male and female chicken embryos. These results show that the embryo of G. gallus domesticus is sufficiently sensitive to a range of endocrine disrupting and reproductive toxic chemicals. Anatomical and histological changes in the gonads may therefore be useful as biomarkers of ED effects in birds. However, the endpoints studied relate to apical effects and do not provide mechanistic information on the compounds studied. The chicken embryo-based bioassay is a useful addition to the existing OECD test battery. It is particularly characterized by its cost-effectiveness and the simple test implementation. Compared to established rodent- or bird-based test systems, the comparatively short test duration of 19 days allows rapid substance screening. In the context of (eco)toxicological hazard and risk assessment of chemicals, the proposed chicken embryo-based test system could help to consume fewer test animals in the future.