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Ching-Ju Tsai

• The soil bacterium Corynebacterium glutamicum has five secondary transporters for compatible solutes allowing it to cope with osmotic stress. The most abundant of them, the transporter BetP, performs a high affinity uptake of glycine-betain when encountering hyperosmotic stress. BetP belongs to the betaine/carnitine/choline/transporter (BCCT) family, and is predicted to have twelve transmembrane helices with both termini facing the cytoplasm. The goal of this thesis is to facilitate understanding of BetP function by determining a three dimensional (3D) model of its structure. Two-dimensional (2D) crystallization of wild-type (WT) BetP has been successfully performed by reconstitution into a mixture of E. coli lipids and bovine cardiolipin, which resulted in vesicular crystals diffracting to 7.5 Å resolution (Ziegler, Morbach et al. 2004). Diffraction patterns of these crystals however showed unfocused spots, generally due to high mosaicity. Better results were obtained by using the constitutively active mutant BetPdeltaC45 in which the first 45 amino acids of the positively charged C-terminus were removed. BetPdeltaC45 crystals obtained under the same conditions for BetP WT were concluded to be pseudo crystals, based on the inconsistence of symmetry. These crystals had BetPdeltaC45 molecules randomly up/downwards inserted into membrane crystals, and cannot be used for structure determination, even though they diffracted up to 7 Å. The problem of pseudo crystal formation could be solved by changing the lipids used for 2D crystallization to a native lipid extract from C. glutamicum cells. This change of lipids improved the crystals to well-ordered packing with exclusive p121_b symmetry. To understand the role of lipids in crystal packing and order, lipids were extracted at different stages during crystallization, and identified by using multiple precursor ion scanning mass spectrometry. The results show that phosphatidyl glycerol (PG) 16:0-18:1 is the most dominant lipid species in C. glutamicum membranes, and that BetP has a preference for the fatty acid moieties 16:0-18:1. Crystallization with synthetic PG 16:0-18:1 proved that an excess of this lipid prevents pseudo crystal formation, but these crystals did not reach the quality as previously achieved by using the C. glutamicum lipids. Apart from the effect of lipids in crystallinity, the concentration and type of salts influenced crystal growth and morphology. High salt conditions (>400 mM LiCl or KCl) yielded tubular crystals, whereas low salt conditions (<300 mM LiCl, NaCl or KCl) led to formation of up to 10 µm large sheet-like crystals. The intermediate concentration gave a mixture of sheet-like and tubular crystals. In terms of resolution, sheets diffracted better than tubes. The sheet-like crystals used for 3D map reconstruction were obtained from a dialysis buffer containing 200 mM NaCl combined with using C. glutamicum lipids. Electron microscopic images were taken from frozen-hydrated crystals using a helium-cooled JEOL 300 SFF microscope or a liquid nitrogen-cooled FEI Tecnai G2 microscope at 300 kV, which allowed optimal data collection and minimized radiation damage to the sample. More than 1000 images of tilt angles up to 50° were taken and evaluated using optical diffraction of a laser beam. The best 200 images were processed with the MRC image processing software package, and 79 images from different tilt angles were merged to the final data set used for calculation of a 3D map at a planar resolution of 8 Å. The structure shows BetPdeltaC45 as a trimer with each monomer consisting of 12 transmembrane alpha-helices. Protein termini and loop regions could not be determined due to the limited resolution of the map. Six of the twelve helices line a central cavity forming a potential substrate-binding chamber. Each monomer shows a central cavity in different sizes and shapes. Thus, the constitutively active BetPdeltaC45 thus forms an unusual asymmetric homotrimer. BetP most likely reflects three different conformational states of secondary transporters: the cytoplasmically open (C), the occluded (O), and the periplasmically open (P) states. The C and O states are similar to BetP WT projection structure, while the P state is discrepant and highly flexible due to the shape and size of the central cavity as well as the lowest intensity of the density. The observation of the P state corresponds well to the constitutively active property of BetPdeltaC45. For the high resolution structure of the C and O states are available, this work presents the first structural information of the P state of a secondary transporter.
• Thema dieser Arbeit sind die Struktur/Funktionsprinzipien des osmoaktiven Betaintransporters BetP aus Corynebacterium glutamicum, eines Proteins aus der Familie der Betain/Carnitine/Cholin Transporter (BCCT) welches das kompatible Solut Betain unter Ausnutzung eines Natriumgradienten in die Zelle importiert. Gleichzeitig dient BetP auch als Osmolaritäts- und Temperatursensor der die Menge an importierten Solut ohne Umwege anpassen kann, wenn es z.B. als Folge von Überflutungen oder Dürren zu starken Schwankungen in der Wasseraktivität des bakteriellen Lebensraums kommt. Zum besseren Verständnis von osmoregulatorischen Sekundärtransportern und der BCCT Proteinfamilie wurde die dreidimensionale (3D) Struktur von BetP mittels Elektronenkristallographie bestimmt. Der BetP Wildtyp und eine konstitutiv aktive Mutante mit einem um 45 Aminosäuren gekürzten C-Terminus (BetPdeltaC45) wurden in E. coli überexprimiert und mittels Streptavidin-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die C-terminal gekürzte Mutante wurde gewählt da sie konstitutiv aktiv ist und Betain weitestgehend unabhängig von der Osmolarität der Umgebung über die Membran transportiert, was sie hervorragend geeignet macht den aktiven Zustand von BetP strukturell zu charakterisieren. Sowohl der BetP Wildtyp als auch die BetPdeltaC45 Mutante formten die für die Elektronenkristallographie nötigen zweidimensionalen (2D) Kristalle. Die Entfernung des positiv geladenen C-Terminus in der BetPdeltaC45 Mutante hatte jedoch einen starken Effekt auf die Kristallisierung und führte reproduzierbar zur Bildung von besser geordneten Kristallen mit niedrigerer Mosaizität. Die BetPdeltaC45 Mutante wurde daher für die weitere Optimierung und die 3D Strukturaufklärung verwendet. Neben dem Protein, sind die verwendeten Lipide für die Bildung von geordneten 2D Kristallen von entscheidender Bedeutung. Während der Optimierung wurde BetPdeltaC45 mittels dreier verschiedener Lipidpreparationen kristallisiert. Zum besseren Verständnis des Lipideinflusses auf das Kristallisationsverhalten wurden außerdem Lipidextrakte aus verschiedenen Stadien der Kristallisation hergestellt und die enthaltenen Lipide mittels quantitativer Massenspektrometrie bestimmt. Die Ergebnisse zeigen die Präferenz von BetP für 16:0-18:1 Fettsäurereste und das eine an diesen Resten reiche Lipidmischung die Bildung von Pseudokristallen verhindert. Die besten Kristallisationsergebnisse wurden mit dem nativen C. glutamicum Lipidextrakt erzielt. Die mit dieser Lipidmischung gezüchteten Kristalle formten großflächig kristallin geordnete Platten, die besonders für die Aufnahme von 3D Daten geeignet sind. Wichtiger noch als die Größe war der höhere Ordnungsgrad, welcher die Datenaufnahme bis zu einer Auflösung von 7-8 Å erlaubte und damit die Identifizierung von Transmembranhelices, den grundsätzlichen Strukturbausteinen von Membranproteinen ermöglicht. Zur Bestimmung der 3D Struktur von BetPdeltaC45 wurden elektronenkristallographische Aufnahmen von mehr als 200 Kristallen aufgenommen und die zur Strukturaufklärung nötigen Phasen und Amplituden mittels Bildbearbeitung extrahiert. Die 3D Information wurde aus zwischen 0 und 50 Grad gekippten Aufnahmen der 2D Kristalle gewonnen. Alle Daten wurden unter Einhaltung der p121_b Symmetrie zu einem einheitlichen Datensatz vereinigt, der mit einem mittlerem Phasenresidual von 20.4° eine hohe Qualität aufzeigt. Amplituden und Phasen dieses Datensatzes wurden für die Errechnung einer 3D Dichtekarte verwendet. Die bestimmte Dichte hat eine planare Auflösung von 8 Å und zeigt BetP als Trimer mit 12 länglichen Dichten pro Monomer, welche den 12 mittels Hydrophobizitätsplot vorhergesagten Transmembranhelices zugeordnet wurden. Interessanterweise ist die Anordnung dieser Dichten unterschiedlich für alle drei Monomere, wie eindeutig mittels Analyse einer Kreuzkorrelations-Dichtekarte zwischen den Monomeren und anhand der möglichen Kristallsymmetrien gezeigt werden konnte. Die Unterschiede dieses äußerst ungewöhnlichen asymmetrischen Homotrimers konzentrieren sich um einen von vier Helices umrahmten Hohlraum mit unterschiedlich großen Eintrittsöffnungen für jedes Monomer. Basierend auf der Anordnung des BetP asymmetrischen Homotrimers und bekannten biochemischen Daten wurde ein Modell erstellt in dem sich die Substratbindungstellen in den zentralen Hohlräumen befinden und in dem jedes Monomer des asymmetrischen Homotrimers einen unterschiedlichen Aktivierungszustand einnimmt. Die drei Aktivierungszustände wurden als die cytoplasmatisch offene, die geschlossene und periplastisch offene Konformation von sekundären Transportern interpretiert. Die vorliegende Arbeit liefert die ersten Strukturinformationen für einen Transporter der BCCT Familie und die periplastisch offene Konformation eines Sekundärtransporters und liefert damit wichtige Bausteine für das bessere Verständnis dieser für alle Zellen überlebenswichtigen Klasse von Transportern.