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Laura Marie Pöschel

• In view of a growing world population and the finite nature of fossil resources, the development of eco-friendly production processes is essential for the transition towards a sustainable industry. Methanol, which can be produced both petrochemically and from renewable resources, offers itself as bridging technology and attractive alternative raw material for biotechnological processes. This work describes developments for the progress of the well-studied methylotrophic α proteobacterium Methylorubrum extorquens AM1 towards an efficient methylotrophic cell factory. Although many homologous and heterologous production routes have already been described and realized for M. extorquens in a laboratory scale, no industrial process has yet been realized. Three major reasons can be identified for this: (1) A limited choice of tools for genetic modifications, (2) a lack of understanding of carbon fluxes and side reactions occurring in modified strains, such as product reimports, and (3) the lack of tailored production strains for profitable target products and optimized bioprocessing protocols. The aim of the present work was to achieve developments for the mentioned areas. As a model application, the high-level production of chiral dicarboxylic acids from the substrate methanol was chosen. Enantiomerically pure chiral compounds are of great interest, e.g., as building blocks for chiral drugs. The ethylmalonyl CoA metabolic pathway (EMCP) which is part of the primary metabolism of M. extorquens, harbors unique chiral CoA-ester intermediates. Their acid derivatives can be released by cleavage of the CoA-moiety using heterologous enzymes. The dicarboxylic acids 2 methylsuccinic acid and mesaconic acid were produced in a previous study by introducing the heterologous thioesterase YciA into M. extorquens. In the said study, a combined product titer of 0.65 g/L was obtained in shake flask experiments. These results serve as the basis for the developments in the present work. First, the previously described reuptake of products was thoroughly investigated and dctA2, a gene encoding for an acid transporter, was identified as target for reducing the product reuptake. In addition, reuptake of mesaconic acid was prevented by converting it to (S)-citramalic acid, a product not metabolizable by M. extorquens, by the introduction of a heterologous mesaconase. Together with 2-methylsuccinic acid, for which a high enantiomeric excess of (S)-2-methylsuccinic acid was determined, a second chiral molecule was thus added to the product spectrum. For the release of dicarboxylic acid products, YciA, a broad-range thioesterase that accepts a variety of CoA-esters with different chain lengths as substrates, was chosen. The enzyme should theoretically be able to hydrolyze all CoA-esters of interest present in the EMCP. However, in culture supernatants of M. extorquens strains that were overexpressing the corresponding yciA gene, only mesaconic acid and 2 methylsuccinic acid could be detected. To expand the substrate spectrum of YciA thioesterase with respect to other EMCP intermediates, semi-rational enzyme engineering was attempted. Screening of the corresponding strains carrying the respective YciA variants did not result in strains capable of producing new dicarboxylic acid products. However, the experiments revealed an amino acid position that strongly affected the production of mesaconic acid and 2-methylsuccinic acid in vivo. By substituting the according amino acid in YciA, the maximum titers of mesaconic acid and 2-methylsuccinic acid could be increased substantially. Application of an improved thioesterase variant in a second E. coli-based process confirmed the enhanced activity of the enzyme. The desired extension of the product spectrum by another chiral molecule (2-hydroxy-3-methylsuccinic acid, presumably the (2S,3R)-form) was finally achieved by using an alternative thioesterase. Tailored fermentation strategies were developed for the high-level production of the above-mentioned products. As second part of the work, two novel genetic tools for M. extorquens were developed and characterized. The pBBR1-derived plasmid pMis1_1B was shown to be stably maintained in M. extorquens cells. In addition, its suitability for co-transformations with other plasmids was demonstrated. The second tool, the cumate-inducible promoter Ps6, is tailored for expression of pathways with toxic products, as the transcription of genes controlled by Ps6 is strongly repressed in the absence of an inducer. Overall, the present work demonstrates the enormous potential of using M. extorquens as a methylotrophic cell factory. In the applications shown, the biotechnological production of high-priced chiral molecules is combined with the use of an attractive alternative substrate. In addition, new achievements and approaches are presented to facilitate the development of future M. extorquens production strains.
• Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung des α-Proteobakteriums Methylorubrum extorquens AM1 hin zu einer effizienten methylotrophen Zellfabrik. Obwohl bereits verschiedene heterologe Produktionswege im Labormaßstab mit M. extorquens beschrieben wurden, ist bisher noch kein industrieller Prozess realisiert worden. Dafür lassen sich drei Hauptgründe identifizieren: (1) eine relativ begrenzte Auswahl an gentechnischen Werkzeugen, (2) ein mangelndes Verständnis der Kohlenstoffflüsse und Phänomene, die in modifizierten Stämmen auftreten, wie z. B. der Reimport von Produkten, und (3) das Fehlen maßgeschneiderter Produktionsstämme für finanziell ertragreiche Zielprodukte und dafür optimierte Fermentationsprozesse. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Entwicklungen für die genannten Bereiche zu erzielen. Als Modellanwendung wurde die Produktion von hochpreisigen chiralen Dicarbonsäuren aus dem Substrat Methanol gewählt. Enantiomerenreine Verbindungen sind von großem wirtschaftlichem Interesse, beispielsweise als Bausteine für pharmazeutische Wirkstoffe. Der Ethylmalonyl-CoA-Stoffwechselweg (EMCP), der Teil des Primärstoffwechsels von M. extorquens ist, enthält seltene chirale CoA-Ester-Intermediate. Die entsprechenden Säurederivate können durch enzymkatalysierte Hydrolyse freigesetzt werden. Die Dicarbonsäuren Mesaconat und 2 Methylsuccinat wurden bereits in einer früheren Studie durch Einbringen des heterologen Thioesterase-Gens yciA in M. extorquens hergestellt. In der besagten Studie wurde ein kombinierter Produkttiter von 0,65 g/L Schüttelkolbenmaßstab erzielt. Diese Experimente dienen als Grundlage für die Entwicklungen der vorliegenden Arbeit. Die zuvor beobachtete Produktwiederaufnahme wurde eingehend untersucht, und dctA2, ein Gen, welches für einen Säuretransporter kodiert, als Ziel für die Verringerung der Aufnahme identifiziert. Darüber hinaus wurde die Wiederaufnahme von Mesaconat durch die Umwandlung in (S) Citramalat, ein von M. extorquens nicht-metabolisierbares Produkt, durch Einbringen eines weiteren Enzyms verhindert. Zusammen mit 2-Methylsuccinat, für das ein hoher Enantiomerenüberschuss an (S)-2-Methylsuccinat ausgewiesen wurde, wurde das Produktspektrum somit um ein weiteres chirales Molekül ergänzt. Für die Freisetzung der Produkte wurde YciA, eine Thioesterase die eine Vielzahl von CoA-Estern mit unterschiedlichen Kettenlängen akzeptiert, ausgewählt. Das Enzym sollte theoretisch in der Lage sein, alle im EMCP vorhandenen CoA-Ester von Interesse zu hydrolysieren. In Kulturüberständen von M. extorquens-Stämmen, die das entsprechende yciA-Gen überexprimierten, konnten jedoch nur Mesaconat und 2 Methylsuccinat nachgewiesen werden. Um das Produktspektrum zu erweitern, wurde daher versucht, das YciA mithilfe eines semi-rationalen Ansatzes zu modifizieren. Stämme, die daraus hervorgegangene Enzymvarianten trugen, produzierten zwar keine neuartigen Dicarbonsäuren, durch die Substitution einer bestimmten Aminosäure konnten aber die Maximaltiter von Mesaconat und 2 Methylsuccinat deutlich erhöht werden. Die Anwendung der neuen Thioesterase-Variante in einem zweiten, auf E. coli basierenden Prozess, bestätigte die erhöhte Aktivität des Enzyms. Die Erweiterung des Dicarbonsäure-Produktspektrums um ein weiteres Produkt (2-Hydroxy-3-methylsuccinat, mit hoher Wahrscheinlichkeit in der (2S,3R)-Form) wurde schließlich durch den Einsatz einer alternativen Thioesterase erreicht. Für die Skalierung der Produktion der oben genannten Produkte wurden maßgeschneiderte Fermentationsprozesse entwickelt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zwei neuartige Werkzeuge zur gentechnischen Modifikation von M. extorquens charakterisiert. Für das vorgestellte Plasmid pMis1_1B konnte eine stabile Vererbung in M. extorquens nachgewiesen werden. Zudem wurde das Plasmid erfolgreich zusammen mit dem häufig eingesetzten pCM-Plasmidsystem verwendet und eröffnet somit erstmals die Möglichkeit von Co-Transformationen von M. extorquens. Obwohl die Co-Transformation zu Wachstumsdefekten der Wirtszellen führte, konnte eine hohe Kopienzahl des neuen Vektors sowie eine starke Plasmid-basierte Genexpression nachgewiesen werden. Als zweites Werkzeug wird in der vorliegenden Arbeit der induzierbare Promotor Ps6 vorgestellt und charakterisiert. Durch die sehr starke Repression der Transkription in Abwesenheit des Induktors ist diese neue Promotorvariante besonders geeignet für die kontrollierte Expression von Genen mit toxischen Produkten in M. extorquens. Insgesamt zeigt die vorliegende Arbeit das enorme Potenzial der Nutzung von M. extorquens als methylotrophe Zellfabrik. In den gezeigten Anwendungen wird die biotechnologische Produktion von hochpreisigen chiralen Molekülen mit der Nutzung eines zukunftsfähigen, alternativen Substrats kombiniert. Darüber hinaus werden neue Entwicklungen und Ansätze vorgestellt, die die Herstellung und Optimierung zukünftiger M. extorquens Produktionsstämme deutlich vereinfachen.