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Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen aufzuklären, die im Rahmen inflammatorischer Erkrankungen zur Expression sogenannter Akute Phase Proteine führen. Der Fokus lag hierbei auf der Untersuchung von Signaltransduktionkaskaden, die aktiviert durch proinflammatorische Zytokine in der Leber die Bildung proatherogener Plasmaproteine wie C-reaktives Protein zur Folge haben. Zu diesem Zweck sollten verschiedene in vitro Zellmodelle etabliert und evaluiert werden. Neben Genexpressionsanalysen in zytokin-stimulierten primären humanen Hepatozyten, sowie in den Hepatoma-Zellinien HepG2 und Hep3B sollte die Manipulation der CRP-Expression durch gezielten Gentransfer und die Anwendung der siRNA-Technologie im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen. Zu diesem Zweck sollten Transkriptionsfaktoren der NFKB-Familie, sowie der Familie der „Signal transducer and activator of transcription“ (STAT) und der CCAAT/Enhancer-bindenden Proteine (C/EBP) überexprimiert werden, bzw. deren Expression durch die Transfektion mit entsprechenden siRNA-Oligonukleotide gehemmt werden. Ein weiteres wichtiges Ziel war es, ein zelluläres Modellsystem zu generieren und zu charakt-erisieren, das zur Identifizierung von Substanzen geeignet ist, die die CRP-Expression modu-lieren oder inhibieren.
Protonen gekoppelter Elektronentransfer ist ein zentraler Bestandteil der chemiosmotischen Theorie. Die Beschreibung seiner Natur ist aufgrund seines transienten Charakters eine komplexe Aufgabe. Elektrometrische Messungen stellen hier eine große Hilfe in der Erfassung von Ladungsverschiebungen dar. Sie erlauben die zeitliche Beschreibung des Elektronen- und Protonentransportes, der mit kaum einer geeigneten Methode beobachtet werden kann, und geben Einblick in deren molekularen Mechanismus. Diese Technik wurde hier an drei verschiedenen Membrankomplexen der Atmungskette angewandt: der Cytochrom c Oxidase (COX) aus Paracoccus denitrificans, der Quinol-Fumarat-Reduktase (QFR) aus Wolinella succinogenes und dem bc(1)-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae. Hinsichtlich der experimentellen Vorgehensweise für kinetische Untersuchungen stellte sich ein übergreifendes Problem. Neben einer schnellen Aktivierung der Enzymsysteme bedurfte es eines definierten Ausgangszustands. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren von Bedingungen, die elektrometrische Messungen am bc(1) und der QFR erlauben, sowie die Fortführung dieser Methodik am bereits vorhandenen System der COX. Cytochrom c Oxidase Elektrometrische Untersuchungen an der COX wurden basierend auf Vorarbeiten weitergeführt. Insbesondere die Ladungsverschiebungen nach Photoreduktion ausgehend vom völlig oxidierten Zustand rückten in den Fokus. In diesem Schritt wird ein Proton aufgenommen, während Häm a vom angeregten Zustand eines Rutheniumkomplexes reduziert wird. Dieses Verhalten ist unabhängig vom heterogenen Ausgangszustand der COX, er wird jedoch durch eine Änderung des pH-Wertes beeinflußt. Der heterogene Ausgangszustand im O-E-Übergang wurde in einem sequentiellen Modell diskutiert. Dabei wurde auf die Diskrepanz zwischen den elektrometrischen und den publizierten spektroskopischen Messungen hingewiesen. Während spektroskopisch die Cu(A)-Oxidation und Häm a-Reduktion in einer Phase verliefen, wurde in den elektrometrischen Messungen eine zweite deutlich langsamere Phase für den Protonentransfer beobachtet. Ein sequentielles Reaktionsmodell führte hier zu einem Widerspruch. Die Auswirkungen auf die Natur der Kopplung von Häm a und dem aufgenommenen Proton wurden diskutiert. Die Kinetik der Ladungsverschiebung wurde detailliert anhand der Temperaturabhängigkeit und des Isotopeneffektes untersucht und mit den Ergebnissen aus den Messungen an einem thermophilen Enzym, der ba(3)-Oxidase aus Thermus thermophilus, verglichen. Quinol-Fumarat-Reduktase Für eine schnelle Aktivierung der QFR wurde ein caged Fumarat synthetisiert, das nach Photolyse zu einer schnellen Erhöhung der Fumaratkonzentration führte. Die neue Substanz wurde bezüglich einer möglichen Verwendung für die QFR charakterisiert. Die Freisetzung erfolgte mit einer Zeitkonstante von 0,1 ms und aktivierte die QFR nur im photolysierten Zustand. Aufgrund der Photochemie der metallischen Kofaktoren in der QFR konnten jedoch keine kinetischen Messungen durchgeführt werden. Da die photochemisch induzierten Elektronenbewegungen in der QFR mit zunehmender Wellenlänge abnahmen, wurde eine neue Substanz vorgeschlagen, die im sichtbaren Spektralbereich gespalten werden kann. bc(1)-Komplex Der bc(1)-Komplex kann wie die COX durch einen Rutheniumkomplex aktiviert werden. Ein dimerer sowie ein an Cytochrom c gekoppelter Rutheniumkomplex wurde hierfür anhand von Literaturdaten synthetisiert, und die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften nach Lichtanregung charakterisiert. Für die elektrometrischen Messungen wurde der bc(1)-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert, und der Ausgangszustand des bc(1)-Komplexes unter reduktiven und oxidativen Bedingungen eingestellt. Mit dem dimeren Rutheniumkomplex wurden elektrometrische Experimente durchgeführt, die zu zwei Phasen in der Spannungsantwort führten. Die Daten wurden zusammen mit den publizierten spektroskopischen diskutiert. Dabei wurde eine schnelle elektrogene Phase einem Elektronentransfers zwischen Häm c(1) und dem Eisen-Schwefel-Cluster des Rieske-Proteins zugeordnet. Eine langsamere Phase erwies sich sensitiv gegenüber Antimycin und spiegelt Vorgänge unter der Kontrolle der Q(i)-Bindungsstelle wider.
Aus Fruktose-gezogenen Zellen von A. woodii, die in Gegenwart von Caffeat als Elektronenakzeptor gewachsen waren, wurde durch Behandlung mit Lysozym und anschliessendem French-Press-Aufschluß bei niedrigem Druck ein zellfreier Rohextrakt unter strikt anaeroben Bedingungen hergestellt. Dieser katalysierte eine H2-abhängige Caffeatreduktion mit Raten von 8,7 – 18,7 nmol/min x mg Protein. Die Aktivität war strikt ATP-abhängig. Nach einer Auftrennung des Rohextraktes in Cytoplasma- und Membranfraktion war die H2-abhängige Caffeatreduktion ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert. Die Zugabe von Membranen führte zu keiner Stimulierung der Aktivität. Die Membranfraktion selbst wies keine Caffeatreduktionsaktivität auf. Verschiedene Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, als artifizielle Elektronendonatoren für die Caffeatreduktion zu fungieren. TMPD, 1,5-Diphenylcarbazid und reduziertes Methylviologen konnten Caffeat nicht reduzieren. In Gegenwart von Phenylendiamin wurde in zellfreiem Rohextrakt und in der Cytoplasmafraktion Caffeatreduktionsaktivität beobachtet. In der Membranfraktion wurde dagegen keine Reduktion von Caffeat mit Phenylendiamin als Elektronendonor nachgewiesen. NADH + H+ konnte als physiologischer Elektronendonor für die Reduktion von Caffeat fungieren. Die NADH-abhängige Caffeatreduktion war ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert und strikt abhängig von ATP. Die Beobachtung, dass NADH + H+ als Elektronendonor für die Caffeareduktion fungieren kann, führte zu der Frage, wie im Zuge H2-abhängiger Caffeatreduktion NADH + H+ gebildet wird und welche Enzyme daran beteiligt sein könnten. NAD+-abhängige Hydrogenaseaktivität wurde an Membranen und im Cytoplasma nachgewiesen. Rund 70% der Aktivität waren in der löslichen Fraktion lokalisiert. Die Gegenwart einer Elektronendonor:NAD+-Oxidoreduktase in A. woodii wurde untersucht. Gewaschene Membranen vermittelten die Oxidation von NADH + H+ mit Kaliumhexacyanoferrat oder Benzylviologen als Elektronenakzeptor. Diese Beobachtung wurde als Hinweis auf eine NAD+-Reduktase gewertet, da solche Enzyme in der Regel reversibel sind. Eine Hydrogenase konnte hierfür ausgeschlossen werden, da die NADH-oxidierende Aktivität Sauerstoff-unempfindlich war. Die Aktivität des NADH-oxidierenden Enzyms konnte durch zugesetztes Na+ nicht stimuliert werden. In Analogie zu Na+-translozierenden NADH:Chinon-Reduktasen wurde die NADH-oxidierende Aktivität an gewaschenen Membranen aber durch Ag+ oder Cu2+ in mikromolaren Konzentrationen vollständig inhibiert. Membranen von A. woodii vermittelten die Reduktion von NAD+ mit reduzierten Ferredoxin als Elektronendonor. Ob diese Aktivität durch das gleiche membranständige Enzyme katalysiert wurde, das auch die NADH-Oxidation bewerkstelligte, konnte nicht geklärt werden. Die Ferredoxin-abhängige NAD+-Reduktion wurde durch micromolare Konzentrationen Ag+ vollständig inhibiert. Die Inihibition war aber wahrscheinlich unspezifischer Natur. Mittels vergleichender 2D-Gelelektrophorese wurden zwei Caffeat-induzierte Proteine identifiziert. Ein Vergleich der Peptidsequenzen, die durch ESI-MS/MS-Analyse der Proteine erhalten wurden, mit in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen, ergab eine große Übereinstimmung zu der großen alpha- bzw. kleinen beta-Untereinheit von heterodimeren Elektronentransfer-Flavoproteinen (ETFP). Die Proteine wurden mit EtfA und EtfB bezeichnet. Anhand der Peptidsequenzen von EtfA und EtfB wurden degenerierte Oligonukleotide abgeleitet, die zur Amplifikation von Fragmenten der kodierenden Gene herangezogen wurden. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der erhaltenen PCR-Produkte untermauerte die Zuordnung von EtfA und EtfB als Untereinheiten eines ETFP. Die Fähigkeit zur Caffeatreduktion ist in A. woodii nicht konstitutiv vorhanden, sondern wird in erst durch Gegenwart des Phenylacrylats induziert. Die Spezifität dieser Induktion wurde untersucht. Suspensionen ruhender Zellen, die aus Caffeat-induzierten Zellen hergestellt worden waren, reduzierten neben Caffeat auch die Phenylacrylate Ferulat oder p-Cumarsäure mit H2 als Elektronendonor. Analoge Beoabachtungen wurden mit Ferulat-induzierten und p-Cumarsäure-induzierten Zellsuspensionen gemacht. Die Ergebnisse legen den Schluß nahe, dass in A. woodii die Reduktion von Phenylacrylaten durch ein induzierbares enzymatisches System bewerkstelligt wird. EtfA und EtfB wurden als MalE-Fusionsproteine dargestellt und gereinigt. Dagegen wurden Antiseren hergestellt. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass die Produktion von EtfA und EtfB durch Gegenwart verschiedener Phenylacrylate induziert wird. Die Induktion war unabhängig vom Wachstumssubstrat. In Gegenwart von zu Phenylacrylaten ähnlichen Verbindungen erfolgte keine Induktion. Für EtfA und EtfB wurde eine Funktion als universeller Elektronenüberträger des Phenylacrylat-Reduktionssystems in A. woodii postuliert. Für die H2-abhängige Reduktion von Caffeat und anderer Phenylacrylate wurde die folgende Reaktionssequenz postuliert: die Oxidation des Elektronendonors H2 durch eine Hydrogenase geht einher mit der Bildung von reduziertem Ferredoxin. Dieses wird durch eine membranständige Ferredoxin-NAD+-Oxidoreduktase oxidiert, die den Transfer der Elektronen auf NAD+ mit der Translokation von Na+ koppelt. Ein aus EtfA und EtfB gebildetes ETFP fungiert dann als Elektronenüberträger zwischen NADH + H+ und einer löslichen Phenylacrylatreduktase.
This work gives a detailed introduction into a fully new experimental method to investigate the quantum crystal behavior of solid Helium-4. It has been found that a fascinating new effect occurs in the expansion of solid Helium-4 into a vacuum through pinhole orifices with diameters between 1 and 5 µm. It is observed that the beam flux intensity shows a periodic behavior for source conditions corresponding to the solid phase of Helium-4. The period is in the range of seconds up to minutes. It shows a strong dependence on temperature and source pressure. The oscillating part of the beam flux intensity amounts several percent of the total flux. This new phenomenon has been studied for temperatures between 2.1 K and 1.3 K and pressures up to 30 bar above the melting pressure. The beam flux intensity has been recorded by the vacuum pressure in a pitot vacuum chamber. The jet velocity in the range of 200 m/sec indicates that surprisingly the beam is a liquid jet, whereas the conditions in the source correspond to the solid state. In this work mainly the behavior of the flux modulation has been studied as a function of pressure and temperature and the influence of the isotope Helium-3. Furthermore geometrical aspects such as the influence of the nozzle diameter d0 have been investigated. In order to explain this novel phenomenon a kinetic model based on the injection of excess vacancies into the solid is proposed. According to this model the vacancies are generated at a solid/liquid interface. Forced by drift and diffusion they accumulate at some distance from the orifice, leading to the collapse of the solid. With the subsequent re-injection of vacancies the effect repeats and turns out to be periodical. The reproducibility of the time dependent beam flux intensity is demonstrated for a wide range of temperatures and pressures and gives direct access to values such as the temperature and pressure dependence of the vacancy diffusion coefficient Dv in the range of 10 high -5 cm high 2/sec, the recombination time of vacancies with interstitials T r near 1-20 sec and the vacancy activation energy f near 20 K. The good agreement with former experimental results by Zuev et al. [131] confirms the applicability of the theoretical model. As a result from the kinetic model the vacancy concentration is increased above the equilibrium vacancy concentration, caused by the injection of excess vacancies. Therefore, the most important discovery is the possibility of generating a non-equilibrium quantum solid. The investigation of this non-equilibrium solid leads to the discovery of a fluid-like regime in the solid phase of Helium-4 at temperatures below T = 1.58 K. The result gives a strong indication for the supersolid state, especially because the fluid-like behavior of the solid can be eliminated with smallest concentrations of Helium-3.
Elche stellen eine Problemart in der Zootierhaltung dar. Sie erreichen im Zoo entgegen dem Trend, dass Tiere in Menschenobhut älter werden als ihre frei lebenden Artgenossen, meist weniger als die Hälfte des biologisch möglichen Alters. Besonders schwierig gestaltet sich die adäquate Fütterung, da die Tiere sehr stark von der Gabe frischer Laubäsung abhängen und die Fütterung mit Ersatzfuttermitteln, wie z.B. Heu, langfristig nicht erfolgsversprechend ist. Zudem sind die Tiere sehr anfällig für Parasiten und eine von Schafen übertragene Viruserkrankung (Bösartiges Katarrhalfieber). Ihr hoher Platzbedarf und das Problem der innerartlichen Aggression machen die Haltung dieser größten Hirschart zusätzlich kompliziert. In dieser Arbeit wird die Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung vorgestellt, die sich die von der Inneren Uhr gesteuerten Verhaltensrhythmen einer Tierart zur Beurteilung ihres Wohlbefindens und ihrer Haltungsbedingungen in der künstlichen Zooumwelt zu Nutze macht. Der Besitz einer Inneren Uhr stellt in der hochgradig rhythmisch organisierten Umwelt einen Selektionsvorteil im Sinne einer frühzeitigen Anpassung an wiederkehrende Umweltbedingungen dar. Die Innere Uhr ist so alt wie das Leben selbst, genetisch fixiert, über Zeitgeberreize mit ihrer Umwelt synchronisiert und regelt die Lebensvorgänge von Organismen auf allen organisatorischen Ebenen, auch auf der Ebene des Verhaltens. Ist der normale Verhaltensrhythmus einer Tierart bzw. eines Individuums bekannt, ist es möglich, aus Abweichungen von der Norm auf Störungen des Organismus - auf Unwohlsein - zu schließen. Anhand des Vergleiches von drei Elchhaltungen mit jeweils zwei Tieren, die unter verschiedenen Bedingungen gehalten wurden, konnten mit Hilfe zeitgeraffter Videoaufzeichnung und dem Einsatz eines Speichertelemetriesystems die folgenden Faktoren als einflussreich auf das Verhaltensmuster von Elchen in Menschenobhut identifiziert werden. Die nächtliche Aufstauung von Elchen ist aufgrund des Raum- und Reizmangels in den Boxen ein erheblicher Eingriff in das natürliche, gleichmäßig über Tag und Nacht verteilte Verhaltensmuster der Tiere. Außerdem sind sie in ihrem Verhalten hochgradig vom täglichen Ablauf des Pflegeralltags im Zoo beeinflusst. Feste Fütterungszeiten können einen starken Zeilgeberreiz darstellen- den die Elche in den beiden naturferneren Haltungen stärker zu antizipieren scheinen als den Zeitgeber „Licht". Größe und vor allem Strukturierung des Außengeheges haben einen Einfluss auf dessen zeitliche und räumliche Nutzung. Abschüssige Gehegeteile können die unerwünschte Verhaltensweise Grasen fördern. In unseren mitteleuropäischen Breiten leiden die Elche im Sommer unter Hitzestress, was sich in verringerter Aktivität widerspiegelt. Ein hohes Besucheraufkommen kann die Tiere ebenfalls in ihrem Verhalten beeinflussen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich der Elch schnell an die Zoogegebenheiten und viele Besucher gewöhnt. Durch den Vergleich der verschiedenen Haltungsbedingungen konnten in der vorliegen Arbeit Vorschläge zur Verbesserung der Haltung von Elchen in Menschenobhut und zu ihrem zeitlichen Management gemacht werden. Der Elch hat sich aufgrund des für Wiederkäuer typischen, sehr geregelten Verhaltensrhythmus aus alternierenden Aktivitäts- und Ruhephasen, der auch unter den verschiedenen Haltungsbedingungen prinzipiell bestehen bleibt, als sehr gut geeignetes Modelltier für die Anwendbarkeit der Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung herausgestellt. Abweichungen von der Norm können leicht erkannt werden. Änderungen im Verhaltensmuster m Form erhöhter lokomotorischer Aktivität lassen bei den untersuchten Tieren auf Unwohlsein (Krankheit, Abweichungen von der täglichen Routine, unterbundenes Brunftverhalten) schließen und können im Sinne eines chronoethologischen Paradigmas als eine indikative Verhaltensweise gewertet werden. Das Ziel einer vollständig automatisierten Verhaltenserfassung- und Auswertung mittels Bewegungsmeldern soll im restringierten Raum der Elchbox in einem weiteren Projekt verwirklicht werden, um damit Tierpflegern, Zooveterinären und Verantwortlichen ein gut handhabbares Mittel zur objektiven und langfristigen Beurteilung des Wohlbefindens ihrer Schützlinge zur Verfügung stellen zu können.
Um die Biodiversität Burkina Fasos darzustellen und auszuwerten, wurden umfangreiche Diversitätsdaten aus Sammlungsbelegen, Vegetationsaufnahmen und Literatur zusammengestellt. Die eigene Datenerhebung während dreier Feldaufenthalte hat mit > 300 Vegetationsaufnahmen (einschließlich der Biodiversitätsobservatorien) und > 1200 Herbarbelegen dazu beigetragen. Die Verwendung von relationalen Datenbanken (Microsoft Access) und GIS ermöglichte eine umfassende Analyse dieser enormen Datenmengen (> 100 000 Verbreitungspunkte) unter Einbeziehung von weiteren Art- oder ortsgebundenen Informationen. Datenbankstrukturen und Prozeduren wurden zu einem großen Teil selbst entwickelt. Unregelmäßigkeiten in den Primärdaten konnten durch Artverbreitungsmodelle ausgeglichen werden, die rasterbasierte Umweltdaten verwenden, insbesondere Satellitenbilder, Klima- und Höhendaten. Für die zusammenfassenden Analysen (Artenreichtum nach Familie, Lebensform, Photosynthesetyp; turnover) mussten wiederum eigene Prozeduren entwickelt werden. Räumliche Muster der Biodiversität wurden im landesweiten Rahmen, wie auch lokal für die Regionen Oudalan und Gourma, dargestellt. Die Zusammenfassung der Flora nach taxonomischen und ökologischen Gruppen gewährt dabei Einblicke in ökologische Zusammenhänge und die Eignung einzelner Gruppen als Indikatoren. Deutlich zeigen sich die Veränderungen des Lebensformspektrums und des Artenreichtums sowohl auf Landesebene im Zusammenhang mit dem Makroklima als auch in einer detaillierten Analyse des Oudalan – wo der Einfluss von Boden und Relief deutlich wird. Die großräumigen Muster der Artenvielfalt sind hauptsächlich durch klimatische Faktoren geprägt, auch der menschliche Einfluss ist in Form verschiedener Nutzungsformen vom Klima abhängig und schwer davon zu trennen. Umso deutlicher werden die Folgen intensiver Landnutzung aber in den Detailstudien der nordsudanischen Biodiversitätsobservatorien und des sahelischen Wiederbegrünungsprojektes. Über die in diesem Rahmen dargestellten Ergebnisse hinaus ergeben sich insbesondere aus der umfassenden Datenbasis und der interdisziplinären Zusammenarbeit mit Fernerkundung und Ethnobotanik weitere vielversprechende Möglichkeiten. Unter anderem wird auf der Grundlage der Datenbanken und ergänzender Literaturrecherchen eine aktualisierte Checklist der Gefäßpflanzen Burkina Fasos erstellt und eine Revision der phytogeographischen Zonen für Burkina Faso ist geplant.
Da viele Primärtumoren in die Leber metastasieren ist bei 30-50 % der Patienten, die an malignen Neoplasien leiden, mit Lebermetastasen zu rechnen. Die Leber ist dabei nach den Lymphknoten der Hauptsitz von Metastasen. Als einzige kurative Therapie ist bisher die chirurgische Resektion anzusehen, wobei weniger als 25 % der Lebermetastasen potentiell kurativ resezierbar sind. Falls der Tumor inoperabel ist werden viele Patienten einer systemischen Chemotherapie zugeführt. Alternativ kommen verschiedene minmal invasive Therapieformen zur lokalen Tumorablation zum Einsatz. Die LITT von Lebertumoren stellt als minimal invasive Therapie eine Alternative zur chirurgischen Resektion oder der systemischen Chemotherapie dar. Dabei führen koagulative Effekte zur Tumordestruktion in soliden Organen wie der Leber. Optische Fasern in einem wassergekühlten Applikatorset werden in die Läsion eingebracht. Das energiereiche Licht eines Nd:YAG-Lasers wird dann von dem Gewebe um den Applikator absorbiert und führt so zur Thermokoagulation des Tumors. Durch thermosensitive Gradientenecho-Sequenzen im MRT ist ein Online-Monitoring der Thermokoagulation möglich. Mittels TACE läßt sich das Volumen von Lebertumoren reduzieren, so daß auch Patienten mit primär zu großen Tumordurchmessern therapierbar werden. Durch die Embolisation der arteriellen Gefäße wird der Blutfluß eingeschränkt, was bei anschließender LITT zu einer größeren Hitzeeinlagerung und ausgedehnteren Nekrosebildung führt. In der vorliegenden Arbeit sollte gezeigt werden, daß die intensive Nekrosebildung bei vorembolisierten Patienten nicht durch mehr applizierte Energie während LITT, sondern durch eingeschränkte Durchblutung als TACE Effekt zustande kommt. Dazu wurden im Zeitraum zwischen Februar 2000 und Februar 2001 214 Patienten mit LITT behandelt. 64 Patienten wurden erst einer TACE unterzogen und anschließend mit LITT behandelt. Die applizierte Energie während der LITT Sitzung wurde jeweils aus der Laserleistung und der Einschaltdauer bestimmt. Mit T1- und T2- gewichteten Spin-Echo und Gradienten-Echo MR-Sequenzen in drei Ebenen wurde das Volumen der induzierten Nekrose gemessen. Es wurden Gruppen nach korrespondierendem Nekrosevolumen gebildet, jeweils getrennt nach Patienten die mit TACE und LITT therapiert wurden und denjenigen die nur mit LITT behandelt wurden. Die Nekroserückbildung im Verlauf wurde dann in dreimonatigen Abständen paarweise verglichen. Außerdem wurde die applizierte Energie in Beziehung gesetzt zum Nekrosevolumen. Auch hier wurde nach den Subgruppen getrennt ausgewertet, um Unterschiede in der Hitzeeinlagerung und Ausdehnung des nekrotischen Areals ausmachen zu können. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten bei gleicher applizierter Energie ein größeres Nekrosevolumen bei den vorembolisierten Patienten als bei der nicht embolisierten Gruppe. Im Mittel stieg das Nekrosevolumen in den einzelnen Größengruppen von 41,36 cm3 bis 343,29 cm3, bei den nicht embolisierten Patienten jedoch nur von 33,73 cm3 bis 117,96 cm3. Der Anteil um den sich das Nekrosevolumen von einer Verlaufskontrolle zur nächsten verringert war in beiden Therapiegruppen vergleichbar. Die Nekroserückbildung im Verlauf wurde durch neoadjuvante TACE demnach nicht beeinflußt. Die Analyse der Überlebenszeit erbrachte statistisch signifikante Unterschiede bezüglich der Aufschlüsselung nach der angewandten Therapie. Der p-Wert betrug im Log-Rank-Test 0,0151. Für die Patienten aus der Gruppe der LITT-Monotherapie ergab sich ein mittlerer Überlebensvorteil von 6 Monaten (Median 26) gegenüber der Gruppe mit der TACE&LITT-Kombitherapie (Median 20). Für kleine Läsionen die primär LITT-fähig sind und nicht neoadjuvant mit TACE behandelt werden müssen zeichnete sich ein besseres Outcome ab. Am Ende des Beobachtungszeitraums von 54 Monaten waren noch 38,32 % (n=82) Patienten aus der LITT-Monogruppe und 29,69 % (n=19) aus der TACE und LITT-Kombigruppe am Leben. Als Schlußfolgerung liegt nahe daß der verminderte Blutfluß in embolisierten Lebern tatsächlich zu stärkerer Hitzeeinlagerung und größerer Nekrosebildung führt. Durch TACE vor LITT lassen sich größere Nekrosen erzielen bei gleicher applizierter Energie als durch LITT alleine. Außerdem gibt es keine negativen Auswirkungen auf die Nekroserückbildung. Eine generelle Kombination aus neoadjuvanter TACE und LITT scheint aus Kostengründen und erhöhtem apparativen Aufwand sowie einer möglicherweise höheren Komplikationsrate nicht empfehlenswert. Dennoch bietet das kombinierte Therapieprotokoll denjenigen Patienten mit Läsionen über 5 cm Durchmesser eine palliative und potentiell kurative Therapieoption.
Im Rahmen dieser Dissertation sollte der Effekt der Zelldichte auf Proliferation und Apoptose bei der RKO-Rektumkarzinomzelllinie untersucht werden. Neben Invasion, Entdifferenzierung und Metastasierung kann bei Krebserkrankungen auch eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit zu den Charakteristika der Malignität gezählt werden. Bei Leukämien, Lymphomen und bestimmten soliden Tumoren, bei denen eine chirurgische Resektion nur eingeschränkt möglich ist, bedeutet jedoch ein langsames Wachstum, d.h. eine geringe Proliferation der Tumorzellen, in der Regel keine verbesserte Prognose, da sie mit schlechterem Ansprechen auf Chemotherapie und Bestrahlung einhergeht. Die molekularen Ursachen dieser Behandlungsresistenz sind bisher nicht vollständig geklärt und wahrscheinlich nicht bei allen Krebserkrankungen auf identischen Mechanismen beruhend. Vorstellbar ist, dass sich das Gesamtsystem der Zelle während des Teilungsprozesses sensibler gegenüber Schädigungen der DNA, wie sie durch Bestrahlung und die meisten Chemotherapeutika ausgelöst werden, präsentiert. Dies kann durch unterschiedlichste molekulare Mechanismen verursacht sein. Um den möglichen Einfluss des Proliferationsverhaltens einer Zellpopulation auf das Apoptose-Verhalten zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht, die Proliferationsgeschwindigkeit einer Zellkultur mittels Dichte-Arretierung zu senken. Hierzu wurden RKO-Zellen in konfluenter und subkonfluenter Dichte kultiviert. Ebenfalls wurden Unterschiede bei der Verteilung der Zellen auf die verschiedenen Zellzyklusphasen ermittelt. Durch Inkubation mit CD95L konnte dann ein Zusammenhang von Proliferation und Apoptosesensitivität ermittelt werden, d.h. die „Zellzyklusabhängigkeit“ der CD95L-induzierte Apoptose untersucht werden. Hierbei zeigten sich Zellen mit geringerer Proliferationsrate resistenter gegenüber CD95L. Verschiedene Methoden (z.B. Western-Blot-Analyse, FACS-Messungen) wurden zur Aufklärung der molekularen Ursachen genutzt. Die Arbeit zeigte auch das Vorhandensein eines molekular nicht identifizierten, autokrin in das Medium sezernierten Faktors, der zu verstärkter Resistenz gegenüber CD95L führte. Dieser Faktor erhöhte auch die Migration und Invasivität der RKO-Zellen und verstärkte damit die malignen Eigenschaften der Tumorzellen. Die zukünftige molekulare Identifikation dieses Faktors könnte therapeutisch bedeutsam sein.
The development of resistance to multiple drugs is a major problem in treatment of number of infectious diseases and cancer. The phenomenon of multidrug resistance (MDR) is based on the synergetic interplay of a number of mechanisms such as target inactivation, target alteration, prevention of drug influx as well as active extrusion of drugs from the cell. The latter is mediated by over-expression of multidrug efflux pumps. The first discovered and the best characterized until now the human MDR transporter is P-glycoprotein. It is a member of the ATP binding cassette (ABC) superfamily and acts as an active transporter for a variety of anticancer agents using the energy released by ATP hydrolysis. The closest structure and functional homologue of P-glycoprotein found in bacteria is LmrA from Lactococcus lactis. The major goals of this work are to establish the selective isotope labelling of LmrA in Lactococcus lactis, to optimize LmrA sample preparation for solid-state NMR, and finally to perform first solidstate NMR investigations on LmrA shedding light on its catalytic cycle and substrate binding. For a long time the solid-state NMR applications to biological science has been limited to investigation of small molecules mostly. Recently, the solid-state NMR methods have shown potential for structuraland non-perturbing, site directed functional studies of large membrane proteins as well as ligands bound to them. However, to our knowledge neither selective isotope amino acid labelling of any ABC transporter, nor NMR investigations on full-length ABC transporter have been reported to date. Solidstate NMR experiments on a membrane protein require reconstitution of purified proteins into a membrane environment at a high density and either isotopic enrichment of the protein or bound drugs or inhibitors. Therefore, the large quantities of LmrA reconstituted at a high density in lipid membranes, sufficient for advanced NMR studies have been produced and its functional state in reconstituted form has been assessed. In the next step, a procedure for cost effective selective amino acids isotope labelling of LmrA in Lactococcus lactis has been established. Using this protocol deuterium alanine labelled LmrA reconstituted into E. coli liposomes has been prepared. Deuterium NMR has been used extensively to assess the proteins dynamics in past. However, it has never been applied to ABC transporter. Here, we report 2H NMR on selective alanine isotope labelled LmrA which has been used to shed light on the dynamics changes in the protein occurred under AMP-PNP, non-hydrolysable ATP analogue, binding and in ATP/ADP-Vanadate trapped state. It has been found that the major conformation changes affecting the protein motional characteristics occur in the ATP binding domains but not in the transmembrane domains. Additionally, the binding of several substrates to LmrA has been studied by fluorescence spectroscopy as well as by 19F and 31P solid-state NMR. The binding constants for several LmrA substrates have been obtained by fitting the concentration dependant tryptophan intrinsic fluorescence quenching curves. Based on the fluorescence studies and solid-state NMR data, the conformation changes in LmrA under substrate binding have been discussed. In addition, the preferable location of nine LmrA and P-glycoprotein substrates within the model membrane has been studied via 1H-MAS-NOESY-NMR. The results have been interpreted with respect to LmrA and P-glycoprotein binding site accessibility from the membrane interface region.