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Adaptormoleküle zur Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren oder miRNAs an nicht native Bindestellen
(2020)
Die Kontrolle der Genexpression ist eines der großen Ziele der chemischen Biologie. Gemäß dem klassischen Dogma der Molekularbiologe verläuft der Fluss der genetischen Information über die Transkription von DNA zur messenger RNA (mRNA) und durch die Translation von mRNA zu Proteinen. Auch wenn der ursprünglichen Formulierung dieses Dogmas verschiedene Aspekte hinzugefügt wurden, bleibt die Kernaussage unverändert. Eine Störung der Genexpression ist in vielen Fällen die Ursache für schwerwiegende Erkrankungen. Klassische Therapeutika, die im Allgemeinen aus kleinen Molekülen bestehen, können pathogene Proteine spezifisch binden und inhibieren. Allerdings greifen diese Wirkstoffe am Ende der Produktionskette ein und nicht alle Proteine können adressiert werden. Im Gegensatz dazu könnte ein Eingriff auf der Ebene der Transkription oder Translation die Expression der pathogenen Proteine auf ein normales Maß senken oder ganz verhindern. Als entscheidende Regulatoren der Genexpression stellen Transkriptionsfaktoren (TFs) einen interessanten Angriffspunkt zur Kontrolle der Transkription dar. TFs können über den Kontakt zu weiteren Proteinen die RNA Polymerase II rekrutieren und so die Transkription starten. Für die Translation ist die Halbwertszeit der mRNA ein entscheidender Faktor. Die Lebensdauer wird durch eine Vielzahl an Proteinen und micro RNAs (miRNAs) reguliert. MiRNAs sind kurze Oligonukleotide, die in Argonautproteine eingebaut werden können. Die daraus resultierenden RNA-induced silencing complexes (RISCs) sind in der Lage, den Abbau der mRNA einzuleiten. Sowohl TFs als auch RISCs besitzen dabei Nukleinsäure-bindende Untereinheiten, die mit spezifische Sequenzen assoziieren. In gewisser Weise ist die molekulare Erkennung der Nukleinsäuren vergleichbar mit einer Postsendung, die aufgrund der Adresse korrekt zugestellt wird. Um in diesem Bild des täglichen Lebens zu bleiben: Bei einem Wechsel des Wohnorts ist es üblich, einen Nachsendeauftrag zu stellen. Dabei wird die alte Anschrift auf den Postsendungen mit einem neuen Adressetikett überklebt und die Zustellung erfolgt an den neuen Wohnort. Das zentrale Thema dieser Dissertation ist, dieses „Umetikettieren“ auch auf TFs und RISCs zu übertragen. Hierbei ist es notwendig, die Nukleinsäure-bindenden Untereinheiten der Komplexe, also die „alte Adresse“, vollständig zu blockieren und gleichzeitig eine hohe Affinität zu einer neuen Sequenz zu erzeugen. Hierzu könnten bifunktionale Adaptormoleküle verwendet werden.
Die Adaptoren für die Rekrutierung von TFs müssen in der Lage sein, sowohl die doppelsträngige DNA (dsDNA) als auch einen TF zu binden (Abbildung I). Dabei sollte eine Selbstbindung des Adaptors vermieden werden. In dieser Arbeit wurde der TF Sp1 als Ziel gewählt, da er an GC-reiche dsDNAs bindet. Dies ermöglicht die Wahl einer AT- oder GA reichen DNA-Sequenz als Ziel der Umleitung, wodurch eine Selbstbindung des Adaptors minimiert werden sollte. Zur Erkennung der DNA war geplant, Pyrrol-Imidazol-Polyamide (PIPs), triplexbildende Oligonukleotide (TFOs) oder pseudokomplementäre PNAs einzusetzen. Für Letztere war es möglich, eine neue Syntheseroute zu einem Fmoc geschützten Thiouracil-Monomer zu entwerfen. Dabei konnte eine selektive Alkylierung an der N1-Position des Thiouracils durchgeführt werden. Auf Basis der PIPs und der TFOs wurden jeweils verschiedene Adaptoren entworfen, deren Bindung zu ihren Zielen mit Band-Shift-Experimenten und im Fall der PIPs zusätzlich mit fluoreszenzbasierten Pulldown-Experimenten gezeigt wurde. Im Rahmen dieser Versuche zeigte sich, dass die PIP-basierten Systeme deutlich besser an die Zielsequenzen banden als die TFO-basierten Adaptoren. Das Konjugat K5a besaß hierbei die besten Eigenschaften. Weiterhin konnte mit diesem Adaptor in Pulldown-Experimenten gezeigt werden, dass Sp1 auf eine nicht kanonische AT-reiche Bindestelle umgeleitet wurde. Im Anschluss konnte das Sp1 in Western-Blots detektiert werden. Des Weiteren ließ sich zeigen, dass K5a in einem HeLa Lysat über mehrere Stunden stabil war und somit eine Anwendung in Zellkulturexperimenten möglich sein sollte.
Für die Rekrutierung der RISCs war lediglich eine Erkennung zweier einzelsträngiger RNA-Abschnitte notwendig. Hierzu wurden zwei LNAs oder LNA/DNA-Mixmere verwendet, die über einen Linker verknüpft waren (Abbildung I). Als Folge dieses Aufbaus mussten die beiden Adaptorhälften orthogonal sein, da eine Selbstbindung des Adaptors leichter als bei den TF-Adaptoren auftreten konnte. Diese Adaptoren wurden mit Band-Shift- und fluoreszenzbasierten Pulldown-Experimenten auf ihre Fähigkeit, eine Cy5-gelabelte miRNA auf eine Ziel-RNA umzuleiten, überprüft. Es konnte beobachtet werden, dass all-LNA Adaptoren sehr viele off-target-Effekt aufwiesen, welche die Umleitung von miRNAs verhinderte. Im Gegensatz dazu konnten mit DNA/LNA-Mixmeren eine vollständige Umleitung von miRNA-Modellen beobachtet werden. Es war ebenfalls möglich, spezifische RISCs aus HeLa-Lysaten mit unterschiedlichen Adaptoren in Pulldown-Experimenten zu isolieren und in nachfolgenden Western-Blots zu detektieren. Nachdem gezeigt war, dass eine Umleitung in vitro gelang, sollte die Funktion der Adaptoren in Zellkulturexperimenten geprüft werden. Allerdings konnten in diesen Versuchen keine eindeutigen Ergebnisse erhalten werden, sodass die biologische Relevanz der RISC-Umleitung bislang noch nicht bestätigt werden konnte.
Die vorliegende Studie befasst sich mit dem Einfluss minimalinvasiver Zugangswege zur Mitralklappe auf den Herzrhythmus, den Erfolg einer perioperativ durchgeführten Ablation und die postoperative Notwendigkeit eines Herzschrittmachers.
Mitralklappenvitien und deren herzchirurgische Versorgung sind in vielen Fällen mit präoperativ bestehendem oder postoperativ neu auftretendem Vorhofflimmern assoziiert. In den vergangenen Jahrzehnten haben sich neben der medikamentösen Therapie des Vorhofflimmerns und der durch die Mitralklappeninsuffizienz induzierten Herzinsuffizienz verschiedene minimalinvasive chirurgische Zugangswege zur Mitralklappe sowie Ablationsverfahren etabliert und einen kurativen Therapieansatz gebildet.
Die Ablation im Zuge einer Mitralklappenchirurgie ist zu einem alltäglich durchgeführten Verfahren geworden.
Neu auftretendes Vorhofflimmern im Rahmen der Mitralklappenchirurgie kann perioperativ begrenzt sein und konvertiert häufig innerhalb der ersten 6 Wochen spontan in den Sinusrhythmus. Es geht aber mit einer erhöhten Mortalität und Hospitalisierungszeit einher. Das neu auftretende Vorhofflimmern kann jedoch auch persistieren oder erst im Langzeitverlauf entstehen. Auch die Notwendigkeit eines Herzschrittmachers kann durch Mitralklappeneingriffe insbesondere mit additiver Ablation aufgrund der anatomischen Gegebenheiten erhöht sein.
In unserer Arbeit ist von Interesse, ob sich die unten genannten Zugangswege im Hinblick auf das Neuauftreten von Vorhofflimmern im Langzeitverlauf, die Vorhofflimmerrezidivrate nach Ablation und die Schrittmacherrate mit und ohne durchgeführte Ablation unterscheiden.
Die vorliegende Studie umfasst alle Mitralklappenoperationen, die zwischen 1998 und 2015 in der Klinik für Thorax-, Herz- und thorakale Gefäßchirurgie der Universitätsklinik Frankfurt am Main über die folgenden drei minimalinvasiven Zugangswege, durchgeführt wurden: Gruppe A bildeten 300 Patienten, die im genannten Zeitraum über eine anterolaterale Minithorakotomie mittels Chitwood-Klemme operiert wurden. Gruppe B bestand aus 687 Patienten, die über eine partielle obere Sternotomie mit superiorem transseptalem Zugang operiert wurden. Die 219 Patienten, bei denen eine partielle obere Sternotomie mit transcavalem Zugang angewandt wurde, bildeten Gruppe C.
Die Auswertung erfolgte anhand von Patientenakten, internen und externen Untersuchungsbefunden und eines standardisierten Fragebogens im Follow-up. Es erfolgte eine zweite Auswertung nach Propensity Matching, um präoperative signifikante Unterschiede der Gruppen zu egalisieren.
Im Ergebnis konnte in unserer Studie gezeigt werden, dass die atriale Inzision einen entscheidenden Einfluss auf den Ablationserfolg sowie auf die Schrittmacherinzidenz hat. Bekannt war dabei ein höheres Risiko für postoperatives Vorhofflimmern und Schrittmacherimplantationen aufgrund der anatomischen Gegebenheiten bei Gruppe B. Dass jedoch Gruppe C ein signifikant noch höheres Risiko für Schrittmacherimplantationen mit sich bringt, war überraschend und ist derzeit nicht in der Literatur beschrieben.
In der multivariaten Analyse nach Matching waren Gruppe C, eine additive Ablation und das Alter signifikante unabhängige Prädiktoren für Schrittmacherimplantationen. In der logistischen Regression war Gruppe A ein unabhängiger Prädiktor für den Ablationserfolg zum Zeitpunkt der Entlassung. In der Langzeitbeobachtung trat Gruppe C an Stelle von Gruppe A, möglicherweise aufgrund der bei Gruppe A vorliegenden längsten Follow-up-Zeit. Wie schon in der vorliegenden Literatur diskutiert waren auch in unserer Auswertung hohes Alter und eine präoperative linksatriale Vergrößerung unabhängige Prädiktoren für den langfristigen Ablationserfolg.
Es bedarf weiterer vergleichender Studien mit einheitlichen Follow-up-Zeiten, um die hier gezeigten Ergebnisse zu überprüfen. Insbesondere der transcavale Zugang, der sich im negativen Sinne auf die Zahl der Schrittmacherimplantationen auszuwirken scheint, gibt Anlass für weitere Untersuchungen.
Duale Thrombozytenaggregationshemmung (‚dual antiplatelet therapy‘: DAPT) erhöht das Risiko für eine hämorrhagische Transformation (HT) von ischämischen Schlaganfällen nach Thrombolyse mit gewebespezifischem Plasminogenaktivator (‚tissue plasminogen activator‘: tPA). Bisherige klinische Studien waren jedoch nicht vollends eindeutig, ob diese erhöhte Blutungswahrscheinlichkeit tatsächlich zu einer schlechteren Ausgangssituation für Patienten führt. Viele sehen die initiale klinische Verschlechterung im Rahmen einer potenziellen HT durch den Nutzen der wiederhergestellten Rekanalisation verschlossener Gefäße aufgewogen. Aus diesem Grunde sollte tPA auch in Patienten angewendet werden, die einen Schlaganfall unter DAPT erleiden. Bisher sind der Pathomechanismus und die beteiligten Mediatoren der HT unverstanden. Allerdings könnte die Reduktion der tPA-assoziierten HT zu einer sichereren Anwendung der Thrombolyse beitragen und ihren Nutzen insgesamt weiter steigern. Daher war es Ziel dieser Studie, ein Schlaganfallmodell mit tPA-assoziierter HT in Mäusen unter DAPT zu etablieren, um damit erste Bewertungen therapeutischer Ansätze zur Begrenzung der HT zu ermöglichen.
Ein entscheidender Aspekt vorab war die Bestimmung der Thrombozytenfunktion in den behandelten Mäusen, um damit die Wirksamkeit der DAPT zu messen. Dies war besonders vor dem Hintergrund wichtig, dass DAPT bei Patienten unterschiedlich wirksam ist. So gibt es einen gewissen Anteil Patienten, der resistent gegenüber Aspirin und/oder anderen Thrombozytenaggregationshemmern wie Clopidogrel zu sein scheint. Daher galt es, dieses Phänomen in unserem Modell zu kontrollieren und etwaige Non-Responder zu identifizieren und gegebenenfalls auszuschließen. Dies ist bei herkömmlichen Methoden der Aggregometrie (dem Standardverfahren zur Messung der Thrombozytenfunktion und Therapieüberwachung von Thrombozytenaggregationshemmern) eine Herausforderung, da im Handel erhältliche Aggregometer Blutvolumina erfordern, die für eine Maus tödlich wären. Auch Schwanzblutungstests (sog. „tail bleeding tests“) versagen häufig, wenn sie nach einer experimentellen Schlaganfalloperation durchgeführt werden. Wir haben daher einen Durchflusszytometrie-basierten Ansatz zur Messung der in vitro Thrombozytenfunktion modifiziert, der nur geringe Blutvolumina erfordert und von uns erstmals in einem experimentellen Schlaganfallprotokoll eingesetzt wurde. Dieser zeigte eine signifikant reduzierte Thrombozytenfunktion nach DAPT mit Aspirin und Clopidogrel (ASA+CPG) an. Die Methode korrelierte gut mit Ergebnissen von zusätzlich durchgeführten Schwanzblutungstests und wird künftige präklinische Studien zur DAPT in Mäusen erleichtern. Obwohl es eine gewisse Variabilität in der Thrombozytenfunktion der behandelten Mäuse gab, identifizierten wir letztendlich keine Non-Responder.
Als nächstes zeigten wir erfolgreich, dass DAPT mit ASA+CPG in Mäusen beim experimentellen Schlaganfall zu vermehrter HT beiträgt. Wurde die DAPT mit einer tPA-Thrombolyse verbunden, erhöhte sich die HT-Rate sogar signifikant im Vergleich zu unbehandelten Mäusen mit und ohne tPA-Thrombolyse. Unser Modell kann nun genutzt werden, um die Mechanismen der HT weiter zu untersuchen. Noch wichtiger ist, dass die Einrichtung eines solchen Modells es Forschern ermöglicht, mögliche Strategien zur Minderung des Blutungsrisikos bei Patienten mit DAPT zu testen.
Zur Verringerung der HT wählten wir zwei verschiedene pharmakologische Strategien. Zunächst untersuchten wir die Reduktion der tPA Dosis, welche allerdings nicht erfolgreich vor hämorrhagischen Komplikationen schützen konnte. Danach fokussierten wir uns auf die Rolle der 12/15-Lipoxygenase (12/15-LOX) in unserem Modell. Verschiedene Vorarbeiten hatten gezeigt, dass die 12/15-LOX zum Untergang von Endothelzellen im ischämischen Gehirn beiträgt und damit wahrscheinlich eine ursächliche oder zumindest unterstützende Rolle in der Entstehung der HT hat. So wiederholten wir unsere Versuche der tPA-assoziierten HT unter DAPT in LOX-knockout Mäusen und inhibierten die 12/15-LOX pharmakologisch mit ML351. Wir zeigten erfolgreich, dass die Hemmung von 12/15-LOX in Wildtyp-Mäusen die Blutungsrate signifikant reduzierte und identifizierten die 12/15-LOX damit als geeigneten Kandidaten für weiterführende Studien zur Eindämmung sekundärer Schäden nach ischämischen Schlaganfall. Zudem wäre neben der therapeutischen, auch die prophylaktische Gabe von 12/15-LOX Inhibitoren in Hochrisikopatienten additiv zur Thrombolyse denkbar. Eine solche Blutungsprophylaxe könnte zu einer Indikationserweiterung der Lysetherapie beitragen und das funktionelle Langzeit-Ergebnis der Patienten verbessern.
A large number of chemicals are constantly introduced to surface water from anthropogenic and natural sources. Although substantial efforts have been made to identify these chemicals (e.g potentially anthropogenic contaminants) in surface waters using liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (LC-HRMS), a large number of LC-HRMS chemical signals often with high peak intensity are left unidentified. In addition to synthetic chemicals and transformation products, these signals may also represent plant secondary metabolites (PSMs) released from vegetation through various pathways such as leaching, surface run-off and rain sewers or input of litter from vegetation. While this may be considered as a confounding factor in screening of water contaminants, it could also contribute to the cumulative toxic risk of water contamination. However, it is hardly known to what extent these metabolites contribute to the chemical mixture of surface waters. Thus, reducing the number of unknowns in water samples by identifying also PSMs in significant concentrations in surface waters will help to improve monitoring and assessment of water quality potentially impacted by complex mixtures of natural and synthetic compounds. Therefore, the main focus of the present study was to identify the occurrence of PSMs in river waters and explore the link between the presence of vegetation along rivers and detection of their corresponding PSMs in river
water.
In order to achieve the goals of the present thesis, two chemical screening approaches, namely, non-target and target screening using LC-HRMS were implemented. (1) Non-target analysis involving a novel approach has been applied to associate unknown peaks of high intensity in LC-HRMS to PSMs from surrounding vegetation by focusing on peaks overlapping between river water and aqueous plant extracts (Annex A1). (2) LC–HRMS target screening in river waters were performed for about 160 PSMs, which were selected from a large phytotoxin database (Annex A2 and A3) considering their expected abundance in the vegetation, their potential mobility, persistence and toxicity in the water cycle and commercial availability of standards.
In non-target screening (Annex A1), a high number of overlapping peaks has been found in between aqueous plant extracts and water from adjacent location, suggesting a significant impact of vegetation on chemical mixtures detectable in river waters. The chemical structures were assigned for 12 pairs of peaks while several pairs of peaks
whose MS/MS spectra matched but no structure suggestion were made by the implemented software tools for retrieving possible chemical structure. Nevertheless, the pairs of peaks with matching spectra represented the same chemical structure. The identified compound belonged to different compound classes such as coumarins, flavonoids besides others. For the identified PSMs individual concentration up to 5 µg/L were measured. The concentration and the number of detected PSMs per sample were correlated with the rain event and vegetation coverage.
Target screening unraveled the occurrence of 33 out of 160 target compounds in river waters (Annex A2 and A3). The identified compounds belonged to different classes such as alkaloids, coumarins, flavonoids, and other compounds. Individual compound concentrations were up to several thousand ng/L with the toxic alkaloids narciclasine and
lycorine recording highest maximum concentrations. The neurotoxic alkaloid coniine from poison hemlock was detected at concentrations up to 0.4 µg/L while simple coumarins
esculetin and fraxidin occurred at concentrations above 1 µg/L. The occurrence of some PSMs in river water were correlated to the specific vegetation growing along the rivers while the others were linked to a wide range of vegetation. As an example, narciclasine and lycorine was emitted by the dominant plant species from Amaryllidaceae family (e.g. Galanthus nivalis (snow drop), Leucojum vernum and Anemone nemorosa) while intermedine and echimidine were from Symphytum officinale. The ubiquitous occurrence of simple coumarins fraxidin, scopoletin and aesculetin could be linked to their presence in a wide range of vegetation.
Due to lack of aquatic toxicity data for the identified PSMs (in both target and non-target) and extremely scarce exposure data, no reliable risk assessment was possible.
Alternatively, risk estimation was performed using the threshold for toxicological concern (TTC) concept developed for drinking water contaminants. Many of the identified PSMs
exceeded the TTC value (0.1 µg/L) thus caution should be taken when using such surface waters for drinking water abstraction or recreational use.
This thesis provides an overview of the occurrence of PSMs in river water impacted by the massive presence of vegetation. Concentration for many of the identified PSMs are well within the range of those of synthetic environmental contaminants. Thus, this study adds to a series of recent results suggesting that possibly toxic PSMs occur in relevant concentrations in European surface waters and should be considered in monitoring and risk assessment of water resources. Aquatic toxicity data for PSMs are extensively lacking but are required to include these compounds in the assessment of risks to aquatic organisms and for eliminating risks to human health during drinking water production.
Hintergrund. Ziel dieser Studie war es, zu bewerten, ob die Datenübertragung während peripherer endovaskulärer Eingriffe durch ein sprachgesteuertes, optisches Head-Mounted Display verwirklicht, und ob hierdurch der Arbeitsablauf der Intervention verbessert werden kann.
Methoden. Wir benutzten die Google Glass® Explorer Edition in Verbindung mit einer eigens entwickelten Glass App, um vorhandene Grafiken über die Datenbrille durch Sprachbefehle zugänglich zu machen. 40 Medizinstudenten im letzten Drittel des Medizinstudiums wurden in zwei Gruppen randomisiert.
Jeder Proband erhielt die Aufgabe eine PTA der A. femoralis superficialis an einem High-Fidelity-VR-Simulator (ANGIO-Mentor®, 3D Systems) durchzuführen. Während Gruppe A hierfür nötige Informationen über einen zusätzlich installierten Monitor erhielt, verwendete Gruppe B Google Glass®, um jeweilige Informationen durch zuvor definierte Sprachbefehle aufzurufen. Die objektive Bewertung der erbrachten Leistung erfolgte durch standardisierte Bewertungsbögen in dichotomer Nominalskalierung und durch die Messung der für die Aufgaben benötigten Zeit. Am Ende jeder Simulation erfolgte die subjektive Bewertung seitens der Probanden durch standardisierte Fragebögen mit 5-Level-Likert-Skalierung.
Ergebnisse. Eine maximale Punktzahl von 10 Punkten war erreichbar. Der in Gruppe A und Gruppe B gefundene Median lag bei 9 Punkten mit nicht signifikanten Abweichungen (p = 0,91). Die Gesamtdauer des Eingriffs betrug zwischen 12 und 14 Minuten. Gruppe B war unter Verwendung von Google Glass®, aufgrund technischer Schwierigkeiten mit der getesteten App, im Schnitt um 1:07 Minuten signifikant langsamer (p = 0,01). Dennoch konnte nachgewiesen werden, dass Google Glass® bei dem Transfer einfacher Informationen schneller oder zumindest gleichwertig gegenüber dem klassischen Monitoring war.
In diesem Kontext erachteten 92,5% der Probanden die Digitalisierung im klinischen Alltag als sinnvoll. 17 von 20 Teilnehmern (85%) empfanden die Handhabung von Google Glass® als einfach bis sehr einfach. Alle Teilnehmer waren der Ansicht, dass Augmented Reality bei peripheren endovaskulären Eingriffen im Katheterlabor nützlich sein könnte.
Schlussfolgerung. Google Glass® war dem klassischen Monitoring im Katheterlabor hinsichtlich der Gesamtinterventionszeit nur geringfügig unterlegen und behinderte den Arbeitsablauf während einer simulierten PTA der A. femoralis superficialis nicht. Unsere Studie offenbarte hierbei technische Schwierigkeiten bei der Genauigkeit der Spracherkennung und der Bildqualität von Google Glass®. Trotzdem konnten einzelne Aufgaben durch die Nutzung der Google Glass® signifikant schneller durchgeführt werden. Wir erwarten, dass nach Überwindung dieser technischen Probleme der Arbeitsablauf während endovaskulären Eingriffen mit einem optischen Head-Mounted Display verbessert werden kann.
Hintergrund/Zielsetzung: Die Studentische Poliklinik Frankfurt (SP) ist die erste sogenannte Student-run Free Clinic in Deutschland. In ihr versorgen Studenten der Humanmedizin unter ärztlicher Aufsicht nicht-krankenversicherte Patienten. Vor der Tätigkeit in der SP müssen die Studenten ein intensives Vorbereitungsprogramm absolvieren. Dieses Programm ist seit Sommer 2013 als Wahlpflichtfach an der Medizinischen Fakultät der Goethe-Universität Frankfurt curricular verankert. Im Wintersemester 2016/2017 wurde zusätzlich zum bestehenden Peer-assisted Learning Kurs ein web-basierter Virtual Patient Learning Kurs eingeführt.
Ziel dieser Studie war es, die Wirksamkeit von Peer-assisted Learning mit Virtual Patient Learning im Erwerb allgemeinmedizinischer Grundkenntnisse und -fertigkeiten zu vergleichen. Betrachtet wurden hierbei unterschiedliche Ebenen des Kompetenzerwerbs: theoretisches Wissen, praktisches Wissen und Selbstevaluation standen im Fokus der Studie.
Methoden: 51 Studenten des fünften Fachsemesters wurden randomisiert in eine Peer-assisted Learning Gruppe (PAL Gruppe; n = 20), eine Virtual Patient Learning Gruppe (VPL Gruppe; n = 20) und eine Kontrollgruppe (KG, n = 11). Alle Gruppen absolvierten den curricularen Unterricht des ersten klinischen Semesters. Zusätzlich durchlief die PAL Gruppe das Wahlfach der SP im Peer-assisted Learning Format. Die VPL Gruppe durchlief das Wahlfach der SP im web-basierten Format mit sogenannten virtuellen Patienten auf der e-Learning Plattform Lernbar der Goethe Universität Frankfurt.
Die Messung des Wissenserwerbs beinhaltete einen theoretischen Vortest und Nachtest (Langzeit-Test) mit je 24 Single-Choice Fragen und theoretische Kurzzeit-Tests nach jedem der Kasuistikseminare mit je fünf Single-Choice Fragen. Der praktische Kompetenzerwerb wurde durch eine curriculare und eine zum Wahlfach gehörende Objective Structured Clinical Examination (OSCE) nach Abschluss der Intervention gemessen. Außerdem schätzten die Studienteilnehmer ihren Wissens- und Kompetenzerwerb vor und nach Teilnahme am Wahlfach der SP mit Hilfe eines Fragebogens ein. Hierfür beantworteten sie 34 Fragen anhand einer sechsstufigen Likert-Skala (1 = sehr sicher; 6 = überhaupt nicht sicher).
Nach jedem Kasuistikseminar evaluierten die Studenten die jeweilige Kasuistik mit je fünf Fragen anhand einer sechsstufigen Likert-Skala (1 = ich stimme voll zu; 6 = ich stimme überhaupt nicht zu).
Das Signifikanzniveau wurde auf 0.05 festgelegt.
Ergebnisse: Im gesamten theoretischen Nachtest erwarben alle Gruppen (PAL, VPL und KG) einen signifikanten Wissenszuwachs (PAL p < 0.0001; VPL p < 0.0001; KG p = 0.0156) verglichen mit dem theoretischen Vortest. In allen theoretischen Kurzzeit-Tests wies die VPL Gruppe ein signifikant besseres Ergebnis auf als die PAL Gruppe (Mittelwert PAL = 85.75 %; Mittelwert VPL = 90.57 %; p = 0.0047).
Im Wahlfach OSCE zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen der PAL und VPL Gruppe (p = 0.5395). Im curricularen OSCE zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Testgruppen und der KG (p = 0.4263).
In der Selbsteinschätzung nach Intervention schätzte sich die PAL Gruppe in 31 von 34 Items signifikant besser ein als zuvor. Die VPL Gruppe schätzte sich in 25 Items und die KG in 16 der 34 Items signifikant besser ein als zuvor.
Die Kasuistikseminare wurden von der PAL und VPL Gruppe ähnlich bewertet. Die Mediane für die einzelnen Kasuistiken lagen bei 1 oder 2.
Allgemeinmedizinische Grundkenntnisse und Fertigkeiten können mit VPL genauso effektiv vermittelt werden wie mit PAL. Aufgrund der Kosteneffizienz, einer hohen Reproduzierbarkeit und des frei wählbaren Umfangs bezüglich Bearbeitungsort-und Zeit, sollte VPL häufiger in der allgemeinmedizinischen Lehre im Rahmen von Student-run Free Clinics durchgeführt werden. Letztendlich kann dies zu einer verbesserten Behandlungsqualität und Patientenzufriedenheit führen.
Die VPL Seminare sollten dennoch weiterentwickelt werden und besonders im Hinblick auf Feedback an die Studenten moduliert und individualisierter gestaltet werden.
Functional roles of COMP and TSP-4 in articular cartilage and their relevance in osteoarthritis
(2020)
Osteoarthritis (OA) is a slowly progressing disease, resulting in the degradation of cartilage and the loss of joint functionality. The cartilage extracellular matrix (ECM) is degraded and undergoes remodelling in OA progression. Chondrocytes start to express degrading proteases but are also reactivated and synthesise ECM proteins. The spectrum of these newly synthesised proteins and their involvement in OA specific processes and cartilage repair is hardly investigated.
Human articular cartilage obtained from OA patients undergoing knee replacement surgery was evaluated according to the OARSI histopathology grading system. Healthy, non-OA cartilage samples were used as controls. The expression and distribution of thrombospondin-4 (TSP-4) and the closely related COMP were analysed on the gene level by PCR and on the protein level by immunohistology and immunoblot assays. The potential of TSP-4 as a diagnostic marker was evaluated by immunoblot assays, using serum samples from OA patients and healthy individuals. The functional role of both proteins was further investigated in in vitro studies using chondrocytes isolated from femoral condyles of healthy pigs. The effect of COMP and TSP-4 on chondrocyte migration and attachment was investigated via transwell and attachment assays, respectively. Moreover, the potential of COMP and TSP-4 to modulate the chondrocyte phenotype by inducing gene expression, ECM protein synthesis and matrix formation was investigated by immunofluorescence staining and qPCR. The activation of cartilage relevant signalling pathways was investigated by immunoblot assays.
These results showed for the first time the presence of TSP-4 in articular cartilage. Its amount dramatically increased in OA compared to healthy cartilage and correlated positively with OA severity. In healthy cartilage TSP-4 was primarily found in the superficial zone while it was wider distributed in the middle and deeper zones of OA cartilage. The amount of specific TSP-4 fragments was increased in sera of OA patients compared to healthy controls, indicating a potential to serve as an OA biomarker. COMP was ubiquitously expressed in healthy cartilage but degraded in early as well as re-expressed in late-stage OA. The overall protein levels between OA severity grades were comparable. Contrary to TSP-4, COMP was localised primarily in the upper zone of OA cartilage, in particular in areas with severe damage. COMP could attract chondrocytes and facilitated their attachment, while TSP-4 did not affect these processes. COMP and TSP 4 were generally weak inducers of gene expression, although both could induce COL2A1 and TSP-4 additionally COL12A1 and ACAN after 6 h. Correlating data were obtained on the protein level: COMP and TSP-4 promoted the synthesis and matrix formation of collagen II, collagen IX, collagen XII and proteoglycans. In parallel, both proteins suppressed chondrocyte hypertrophy and dedifferentiation by reducing collagen X and collagen I. By analysing the effect of COMP and TSP-4 on intracellular signalling, both proteins induced Erk1/2 phosphorylation and TSP-4 could further promote Smad2/3 signalling induced by TGF-β1. None of the two proteins had a direct or modulatory effect on Smad1/5/9 dependent signalling.
In summary, COMP and TSP-4 contribute to ECM maintenance and repair by inducing the expression of essential ECM proteins and suppressing chondrocyte dedifferentiation. These effects might be mediated by Erk1/2 phosphorylation. The presented data demonstrate an important functional role of COMP and TSP-4 in both healthy and OA cartilage and provide a basis for further studies on their potential in clinical applications for OA diagnosis and treatment.
Mesenchymale Knochenmarksstammzellen (engl. Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells (BMSCs)) sind hochproliferative multipotente Progenitorzellen mit einem hohen Regenerationspotential. Sie können aus dem Knochenmark in geschädigte Knorpelareale migrieren und dort zu Chondrozyten differenzieren. Somit können sie zur Reparatur traumatisch oder osteoarthrotisch bedingter Knorpelschäden beitragen. In verschiedenen Bereichen des Gelenks konnten zudem sympathische Nervenfasern sowie der sympathische Neurotransmitter Noradrenalin (NE) nachgewiesen werden. NE inhibiert die chondrogene Differenzierungskapazität von BMSCs und kann so zur Pathogenese der Osteoarthrose (OA) beitragen. Unbekannt ist zum derzeitigen Zeitpunkt, inwiefern NE die Proliferation von humanen BMSCs beeinflusst. Ziel unserer Studie war, den Einfluss von NE auf die Proliferationskapazität humaner BMSCs zu untersuchen und beteiligte intrazelluläre Signalwege zu identifizieren.
Zu diesem Zweck wurden BMSCs von Patienten nach stattgehabtem Gelenktrauma (Trauma BMSCs) und von Patienten mit diagnostizierter OA (OA BMSCs) untersucht. Zunächst erfolgte eine Analyse des Genexpressionsmusters der verschiedenen Adrenorezeptoren (ARs). Anschließend wurden sowohl Trauma als auch OA BMSCs mit NE in unterschiedlichen Konzentrationen sowie mit NE in Kombination mit verschiedenen AR-Antagonisten (Doxazosin (α1), Yohimbin (α2) oder Propranolol (β2)) behandelt. Die Aktivierung der AR-gekoppelten Signalwege wurde anhand der Phosphorylierung der beiden Hauptsignalwege der extrazellulären signalregulierten Kinasen 1/2 (ERK1/2) und der Proteinkinase A (PKA) via Western Blot untersucht.
Die Genexpression diverser AR-Subtypen konnte in Trauma (α2B-, α2C- und β2-AR) und OA BMSCs (α2A-, α2B- und β2-AR) nachgewiesen werden. Die Behandlung mit NE in hohen Konzentrationen führte zu einer statistisch signifikanten Inhibition der Proliferation von Trauma und OA BMSCs. Die Behandlung mit NE in niedrigen Konzentrationen hatte hingegen keinen Einfluss auf die Proliferation von Trauma und OA BMSCs. Sowohl ERK1/2 als auch PKA wurden in Trauma und OA BMSCs nach Behandlung mit NE aktiviert. Lediglich der β2-Antagonist Propranolol konnte sowohl die Effekte auf die Proliferation als auch auf die Aktivierung von ERK1/2 und PKA aufheben. Doxazosin und Yohimbin hatten hingegen keinen signifikanten Einfluss auf die Proliferation sowie die ERK1/2- und PKA-Phosphorylierung.
Unsere Untersuchungen zeigen, dass NE die Proliferation von Trauma und OA BMSCs konzentrationsabhängig inhibiert. Dieser Effekt wird vornehmlich über eine β2-AR-gekoppelte ERK1/2- und PKA-Aktivierung vermittelt. Über diesen Mechanismus kann NE das regenerative Potential von humanen BMSCs verringern und somit zur Pathogenese der OA beitragen. Über eine zielgerichtete Beeinflussung des β2-Signalweges könnten sich zukünftig neue therapeutische Optionen bei der Behandlung osteoarthrotisch oder traumatisch bedingter Knorpelschäden ergeben.
Ein professioneller Orchestermusiker verbringt die meiste Zeit in körperlich ungünstiger Sitzhaltung beim Spielen. Die Folge ist ein Anstieg des Risikos für die Entwicklung von muskuloskelettalen Beschwerden [44, 127, 128]. Eine Verbesserung der Arbeitsbedingungen lässt sich u.a. durch den Einsatz von ergonomischen Stühlen erzielen, da sie einen Einfluss auf die Körperhaltung des Orchestermusikers besitzen. Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit standen daher sechs unterschiedliche von der Firma Mey für Orchestermusiker konzipierte Stühle. Die Studie beinhaltete eine Untersuchung des Einflusses der Stühle auf die Oberkörperstatik und die Sitzdruckverteilung von Orchestermusikern und den Einfluss auf ihr Instrumentalspiel im Vergleich zur habituellen Sitzhaltung. Das Probandenkollektiv umfasste 24 Berufsmusiker des Polizeiorchesters Mainz (Rheinland-Pfalz, Deutschland) und bestand zum größten Teil aus Blasinstrumentalisten (3 Frauen, 21 Männer). Das Durchschnittsalter betrug 45 Jahre. Die Überprüfung der Oberkörperstatik erfolgte durch einen 3D-Rückenscanner (ABW GmbH, Frickenhausen, Deutschland), eine Evaluation der Druckverhältnisse im Gesäß durch eine Druckmessmatte (GeBioM GmbH, Münster, Deutschland), womit sich bei jedem Stuhl ein bestimmtes Druckmuster kennzeichnen ließ. Die Messung erfolgte pro Stuhl und Messgerät stets im Wechsel zwischen der statischen Position ohne Instrument (oI) und der statischen Position mit Instrument (mI). Bei der statistischen Auswertung kam es zur Verwendung nicht parametrischer Tests (Friedman-, Wilcoxon Matched- Pairs-Test), wobei das Signifikanzniveau bei ≤0,05 lag. Es erfolgte eine Unterteilung in einen Inter- und einen Intrastuhlvergleich.
Die Ergebnisse des Interstuhlvergleichs zeigten bezüglich der Schulterregion keine signifikanten Veränderungen, wohingegen im Hinblick auf die WS-Parameter Signifikanzen zwischen Stuhl 2 und 5 verzeichnet wurden: in der habituellen Position offenbarte die Rumpflänge D die größte Abweichung mit einem Längenunterschied von 14mm (p≤0,001), so auch die Rumpflänge S (16 mm; p≤0,001). Bezüglich dieser Stühle wiesen die restlichen WS-Parameter Abweichungen von max. 4° bzw. 3mm auf. Zwischen Stuhl 2 und 3 ergaben sich m.I. im Hinblick auf den thorakalen (p≤0,01) und lumbalen Biegungswinkel (p≤0,001) max. Diskrepanzen von 2,5°. Die größten Unterschiede in der Beckenregion zeigten sich beim Beckenabstand zwischen Stuhl 3 und 5 o.I. (7mm) und m.I. (4mm), (beide Bedingungen p≤0,001). Im Hinblick auf die Druckparameter fand sich eine Abhängigkeit zwischen belasteter Fläche und Sitzbeinhöckerdruck (SBH): eine kleine Fläche bedeutete eine schlechte Druckverteilung und umgekehrt. Stühle 1 und 4 besaßen den geringsten SBH (p≤0,001). Im Intrastuhlvergleich zeigten die Bereiche der WS, Schultern und Becken jeweils mindestens einen signifikanten Parameter auf, wie z.B. Schulterblattabstand, sagittale Rumpfneigung und Beckenabstand. Korrelationen zwischen den Parametern waren nicht zu erkennen. M.I. kommt es hinsichtlich des SBH auf der linken Hälfte im Schnitt auf allen Stühlen zu einer Druckerhöhung von 8,46%, auf der rechten zu einer von 11,11%. Im Hinblick auf den Oberschenkeldruck (OS) vollzieht sich die größte Veränderung (7,4bar) der rechten Gesäßhälfte auf Stuhl 2 mit p≤0,001. Der Interstuhlvergleich zeigt also, dass die Wahl eines Stuhls keine Auswirkung auf die Körperhaltung hat. Ursache für Diskrepanzen hinsichtlich des SBH ist die unterschiedliche Polsterung und Größe der Sitzfläche, welche eine hohe Relevanz in Bezug auf die Umverteilung des Drucks und den subjektiven Komfort besitzt. Eine gepolsterte und große Oberfläche ist gleichzusetzen mit einer günstigen Druckverteilung und einem angenehmen individuellen Sitzgefühl. Der Intrastuhlvergleich offenbart ebenfalls keine klinisch relevanten Veränderungen im Oberkörper. Ausschließlich in der Druckverteilung ist eine signifikante Variabilität hinsichtlich des OS rechts bei Stuhl 2 vorhanden (p≤0,001). Die Sitzposition der Probanden ist symmetrisch. Die Symmetrie bezieht sich sowohl auf den Schulter-, WS- und Beckenbereich, als auch auf die Druckverhältnisse im Gesäßbereich.
In der vorliegenden Studie konnte belegt werden, dass gepolsterte und breite Sitzoberflächen mit gleichmäßiger Druckverteilung und gleichzeitig hohem Komfort einhergehen. Im Hinblick auf das Musizieren über einen längeren Zeitraum ist das Vorhandensein eines hohen Komforts für den Orchestermusiker von Bedeutung. Diese Erkenntnisse sind bei der Weiterentwicklung von ergonomischen Stühlen zu berücksichtigen. Eine Analyse der Schulter- und Rumpfmuskulatur und Messung des Beckenwinkels ist in weiteren Studien zusätzlich erforderlich, um zu erforschen, inwieweit die Stühle die Fehlfunktionen des Bewegungsapparates beeinflussen.