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In der vorliegenden Dissertation stand die Aufklärung der Funktion und Regulation von p21 in der Mitose im Mittelpunkt. p21 ist als Cdk-Inhibitor und Schlüsselregulator bekannt, der in viele fundamentale zelluläre Prozesse involviert ist: Zellzyklusregulation, Apoptose, Seneszenz, Zellmigration und Dynamik des Zytoskeletts, Transkription, Differenzierung sowie DNA-Reparatur, aber auch in die Umprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen (Besson et al. 2008; Abbas und Dutta 2009; Jung et al. 2010).
Die unkontrollierte Proliferation von Zellen ist mit der Tumorgenese assoziiert und wird unter anderem durch die Fehlregulation von p21, aber auch durch die wichtigen mitotischen Kinasen Cdk1, im Komplex mit ihrer regulatorischen Untereinheit Cyclin B1, sowie Plk1 bedingt. Zudem ist das Fehlen von p21 oder die Fehllokalisation in das Zytoplasma mit einer schlechteren Prognose für den Patienten und Chemotherapie-Resistenz von Tumoren verbunden (Abukhdeir und Park 2008). Aufgrund der zunehmenden Inzidenz und Mortalität von Krebserkrankungen ist es daher von besonderem klinischem Interesse, die molekularen Ursachen für die Entstehung maligner Tumorerkrankungen aufzuklären. Bislang existieren kaum Studien über welche molekularen Mechanismen die Funktionen von p21, dem wichtigsten Cdk-Inhibitor, der zum Beispiel durch die Anwendung niedermolekularer Inhibitoren wie BI 2536, das sich bereits in klinischen Phase II Studien befindet (Strebhardt 2010), beeinflusst wird, während der Mitose reguliert werden.
In der vorliegenden Dissertation wurde daher die physiologische Rolle des Cdk-Inhibitors bzw. Regulators p21 während der Mitose untersucht und mit der Kinaseaktivität von Cdk1/Cyclin B1, wie auch Plk1 korreliert. Es konnte gezeigt werden, dass p21 während der Mitose stark exprimiert wird und dass mitotisches p21 in verschiedenen Krebszelllinien unabhängig von dem p53-Status in einer phosphorylierten Form vorkommt, welche mit der Aktivität von Cdk1 und weniger mit der von Cdk2 assoziiert ist. Durch Untersuchungen der isogenen HCT116-Zelllinien mit und ohne p21 wurde aufgezeigt, wie wichtig p21 für den ordnungsgemäßen Ablauf der Mitose ist. Ohne p21 sind sowohl die Anaphase wie auch die Zytokinese verlängert, die Zellen ordnen die Chromosomen fehlerhaft in der Metaphaseplatte an (congression Fehler), besitzen weitaus mehr lagging Chromosomen und fast 20 % der Zellen weisen im Versuchsverlauf Polyploidie auf. Durch den Verlust des Cdk-Regulators p21 kommt es zur Fehlregulation von Cdk1 und seiner Substrate (wie MCAK) und es treten die oben beschriebenen Probleme auf.
Weiterhin phosphoryliert Cdk1/Cyclin B1 p21 an Ser-130 in vitro und ex vivo in der frühen Phase der Mitose, der Prophase bzw. Prometaphase. Die nicht phosphorylierbare p21 Form S130A befindet sich hauptsächlich im Zellkern und führt zu vermehrtem Auftreten von congression Fehlern, während die S130D-Mutante, die die Phosphorylierung durch Cdk1 vortäuscht, schneller degradiert wird und zudem den Phänotyp der HCT116 p21-/- Zellen verstärkt. Zellen, die S130D exprimieren, benötigen mehr Zeit für das Durchlaufen der Mitose. Hier ist vor allem die Metaphase stark verlängert, aber auch Anaphase und Zytokinese. Dies führt zu congression Fehlern und zu Polyploidie. Diese Ergebnisse bestätigen, wie wichtig die zeitlich korrekte Phosphorylierung von p21 und die dadurch vermittelte Aktivierung von Cdk1/Cyclin B1 ist.
Darüber hinaus stabilisiert die Suppression von Plk1 das p21 Protein, was darauf hinweist, dass die Degradation von p21 während der Prometaphase von Plk1 kontrolliert wird. Dies wird von der Tatsache unterstützt, dass Ser-114, wie auch Ser116 von Plk1 in vitro phosphoryliert wird. Die Deregulation von p21 durch Plk1, SS114/116AA bzw. SS114/116DD induziert Chromosomenfehler, wodurch die molekularen Mechanismen, warum fehlreguliertes Plk1 die Tumorgenese fördert, hervorgehoben werden.
Nach Abschluss der bisherigen Untersuchungen steht fest, dass man sich von der starren Rolle von p21 als Tumorsuppressor und Akteur während der G1/S-Phase lösen muss. Der Cdk-Inhibitor p21 trägt entscheidend zur mitotischen Progression bei, vor allem bedingt durch die zeitlich ordnungsgemäße Inaktivierung bzw. Aktivierung von Cdk1/Cyclin B1, der Kinase, die wiederum zahlreiche für die Mitose essentielle Proteine reguliert. In Zukunft muss zum besseren Verständnis der Rolle von p21 in der Mitose die genaue Abfolge der Ereignisse unter Einbeziehung der Degradationsmechanismen eingehender untersucht werden.
Parvulustat ist ein kleines Protein (8,2 kDA), das aus dem Bodenbakterium Streptomyces
parvulus sekretiert wird. Es ist ein saures Polypeptid mit einem isoelektrischen Punkt von 4,49
und inhibiert spezifisch α-Amylasen (Ki = 9 x 10-12).
In der vorliegenden Arbeit sollen neben der Isotopenmarkierung des Parvulustats PL-Mutanten
mittels PCR-Mutagenese und DNA Rekombinationstechnick hergestellt werden.
Zur Charakterisierung und Strukturbestimmung der Mutanten werden größere Mengen des
jeweiligen Proteins benötigt, wofür wiederum ein effektives Expressionssystem bereitstehen
muß. Ein Expressionssystem besteht aus einem Wirtsorganismus der seinen Protein-Biosynthese-
Apparat zur Verfügung stellt und einem Vektor (Plasmid) der das Zielgen trägt. Im Falle des
Parvulustats und seiner Mutanten bietet sich der gut charakterisierte Stamm Streptomyces
lividans TK 24 (Hopwood et al, 1985) als Wirtsorganismus an. Der Inhibitor wird in ihm als
Vorläuferprotein mit Signalpeptid als Transportsignal (Leader) gebildet. Da dieses Bakterium
keine äußere Membran besitzt, wird der Inhibitor direkt ins Kulturmedium ausgeschleust. Dabei
wird das Signalpeptid durch die Signalpeptidase abgespalten.
Das Strukturgen wird zuerst im Klonierungsplasmid pSH09 in E. coli vervielfältigt, bevor es mit
den Enzymen EcoRI und SpeI geschnitten wird, um in den Expressionsvektor pSH017 integriert
zu werden. Dieser Shuttlevektor trägt genauso die gewünschten Restriktionsschnittstellen, SpeI
und EcoRI, die die paßgenaue Ligation des rekombinanten Strukturgens mit den funktionellen
Elementen erlauben.
Nach erfolgtem Einbau des Zielgens in das neue Vektorkonstrukt kann dieser Expressionsvektor
leicht in den Wirtsorganismus eingebracht werden und sich dort vermehren. Nach Klonierung der
mutierten Parvulustatsgene in den Expressionsvektor werden die damit transformierten Zellen auf
R2YE-Platten aufgebracht und bei einer Temperatur zwischen 20 und 28°C je nach PL-Mutanten
inkubiert. Zur Selektion wird Thiostrepton verwendet. Nach Transformation und Vermehrung
geeigneter Wirtszellen wird das klonierte Gen transkribiert. Durch anschließende Translation der
gebildeten mRNA in der Wirtszelle entsteht das gewünschte Protein in großen Mengen. Zur
Überprüfung der Aktivität der einzelnen Mutanten steht der qualitative α-Amylase-Plattentest zur
Verfügung, wobei die aktiven Mutanten einen blauen Hemmhof bilden (siehe Abbildung 24). Der
blaue Jod-Stärke-Komplex weist, bei gleichzeitigem Vorhandensein von α-Amylase, auf nicht
abgebaute Stärke und damit indirekt auf die Produktion des α-Amylase-Inhibitors hin.
Da das Parvulustat von den Bakterien ins Medium abgegeben wird, besteht die Abtrennung der
Zellen durch Zentrifugation des Kulturmediums. Es folgen Ammoniumsulfatfällung des
Überstandes, Auftragung auf PAGE und präparative HPLC, nach der reines, einheitliches Protein
isoliert werden konnte.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist eines der Schlüsselenzyme der Leukotrienbiosynthese. Sie katalysiert zunächst die Umsetzung der freigesetzten Arachidonsäure(AA) zu 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HpETE), in einem zweiten Reaktionsschritt wandelt sie diese in Leukotrien A4 (LTA4) um. Leukotriene sind potente Entzündungsmediatoren und spielen eine wichtige Rolle bei entzündlichen und allergischen Reaktionen. Außerdem wird die Beteiligung an verschiedenen Krebsarten kontrovers diskutiert.
Sie besteht aus 673AS, ist 78 kDa schwer und gliedert sich wie alle bisher bekannten Lipoxygenasen in eine N-terminale C2-ähnliche, regulatorische Domäne(AS 1–114) (C2ld), die für die Membran- und Calciumbindung sowie die Interaktion mit dem Coactosin-like Protein (CLP) verantwortlich ist, und in eine C-terminale, katalytische Domäne (AS 121–673), die das Nicht-Häm-gebundene Eisen im aktiven Zentrum trägt. Ein weiteres Strukturmerkmal sind zwei ATP-Bindungsregionen, eine befindet sich in der C2ld (AS 73–83), die andere auf der katalytischen Domäne (AS 193–209), das molare Verhältnis von 5-LO zu ATP konnte dabei auf 1:1 festgelegt werden [167].
Bereits 1982 wurde in einer Veröffentlichung von Parker et al. beschrieben, dass 5-LO aus Rattenzellen in Gegenwart von Calcium auf einer Gelfiltration dimerisieren kann [204], 2008 schließlich wurde von Aleem et al. publiziert, dass humane 12-LO aus Thrombozyten Dimere bilden kann [219]. Somit konnte es möglich sein, dass auch die humane 5-LO zur Dimerisierung fähig ist.
Zunächst wurde aufgereinigtes Enzym mit nativer Gelelektrophorese und anschließender Coomassiefärbung oder Western Blot untersucht, dabei konnten mehrere Banden pro Bahn detektiert werden. Um dieses Phänomen weiter zu untersuchen, wurde im Anschluss eine Gelfiltration etabliert; da die C2ld der 5-LO recht hydrophob ist, war es nötig, 0,5% T20 zum Elutionspuffer PBS/EDTA zuzusetzen, da das Enzym ansonsten unspezifisch mit dem Säulenmaterial interagiert und für seine Größe zu spät eluiert hätte. In Anwesenheit von T20 eluierte 5-LO in zwei getrennten Peaks, die exakt zu den vorher mit Referenzproteinen bestimmten Elutionsvolumina des Monomers und Dimers passten. Weiter wurde getestet, ob niedermolekulare Substanzen einen Einfluss auf das Dimerisierungsverhalten haben, allerdings konnte weder durch Ca2+noch durch ATP eine Verstärkung der Dimerisierung beobachtet werden. Dahingegen konnte, nach Vorinkubation mit GSH und Diamid, das alleinige Monomer auf der Gelfiltration nachgewiesen werden, nach Vorinkubation nur mit Diamid, lag das gesamte Protein ausschließlich als Dimer vor. Durch Gelelektrophorese mit oder ohne Zusatz von ß-Mercaptoethanol und LILBID-MS konnte die Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken bestätigt werden. Ein Bindungsassay mit radioaktivem 35S-GSH konnte die kovalente Bindung des GSH an die 5-LO bestätigen. Quantifizierungsstudien mit Ellmans Reagens zeigten, dass mindestens eins der Oberflächencysteine mit GSH modifiziert wurde. Die von der Gelfiltration erhaltenen Fraktionen wurden auf enzymatische Aktivität getestet und in allen 5-LO-haltigen Fraktionen konnte Aktivität gefunden werden. Leider war es nicht möglich, eine Aussage darüber zu treffen, ob das Mono- oder das Dimer aktiver war. Es liegt offenbar in einem Fließgleichgewicht vor, da erneute Injektion des Monomerpeaks im bekannten Elutionsprofil aus zwei Peaks resultierte. Außerdem führt die Anwesenheit von 0,5% T20 während des Aktivitätstests zu einer Hemmung des Enzyms und weniger detektierbaren 5-LO-Produkten; es fiel vor allem auf, dass so gut wie keinerlei trans- und epitrans-LTB4, die nicht-enzymatischen Zerfallprodukte der 5-HpETE, nachzuweisen waren. Betrachtet man die Struktur der 5-LO, so findet man zehn Cysteine an der Oberfläche; die Cysteine 159, 300, 416 und 418 liegen dabei in einem Interface. Mutiert man diese Cysteine zu Serinen, so verschwindet der Dimer-induzierende Effekt des Diamids, wohingegen die Mutante weiterhin glutathionylierbar bleibt. Interessanterweise zeigt diese Mutante auch eine wesentlich weniger ausgeprägte Hemmung durch T20. Um eine Aussage treffen zu können, ob auch 5-LO aus humanen Zellen Dimere bilden kann, wurde 5-LO-haltiger S100 aus polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) untersucht. Dabei konnte mit Western Blot und einem Aktivitätsnachweis gezeigt werden, dass die 5-LO in einem breiten Bereich von der Gelfiltration eluiert. Das deutet darauf hin, dass sie in PMNL ebenfalls dimerisiert vorliegen kann. In Gegenwart von Ca2+kam es zu einer Verschiebung der 5-LO zu höhermolekularen Gewichten, wobei dieses Phänomen nicht bei S100 aus transformierten E.coli auftrat, was auf einen gerichteten Komplex nach Calciuminduktion in PMNL hindeutet.
Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit der Bindemodus von Sulindac an die 5-LO mittels Crosslinking untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass konzentrationsabhängig der einfache Komplex aus 5-LO und CLP abnimmt, dafür aber ein hochmolekularer Komplex, der beide Enzyme enthält, entsteht. Weder das Prodrug Sulindac noch der weitere Metabolit Sulindacsulfon oder andere Inhibitoren, die ebenfalls an der C2ld angreifen sollen, zeigten diesen Effekt. Leider konnte nicht weiter geklärt werden, was diesen Effekt verursacht, allerdings liegt die Vermutung nahe, dass es zu einer Aggregation kommt. Weitere Untersuchungen könnten wichtige Hinweise auf das Design von neuen Arzneistoffen bringen, um selektivere und damit nebenwirkungsärmere Inhibitoren zu finden.
Das onkogene Fusionsprotein AML1/ETO entsteht durch die chromosomale Translokation t(8;21), die in etwa 12 % aller primären akuten myeloischen Leukämien (AML) auftritt. Die DNA-Bindedomäne des hämatopoetischen Transkriptionsfaktors AML1 wird hierbei mit fast dem gesamten ETO-Protein fusioniert, das als transkriptioneller Repressor wirkt. In den transformierten Zellen kommt es somit zur Blockierung der myeloischen Differenzierung und zur verstärkten Proliferation. Entscheidend für das leukämische Potential von AML1/ETO ist die Fähigkeit zur Oligomerisierung, die durch die Nervy-Homologie-Region-2 (NHR2)-Domäne im ETO-Anteil vermittelt wird.
Durch lentivirale Transduktion konnte bereits gezeigt werden, dass Proteine, welche die NHR2-Domäne enthalten, die Oligomerisierung von AML1/ETO inhibieren und damit den leukämischen Phänotyp AML1/ETO-exprimierender myeloischer Zellen aufheben. In der vorliegenden Arbeit sollten nun alternative Wege zur Einbringung der therapeutischen Proteine in t(8;21)-positive AML-Zellen untersucht werden. Dafür wurde sowohl die Möglichkeit der Proteintransduktion als auch die Verwendung nicht-integrierender viraler Vektoren analysiert.
Im ersten Projekt wurden durch Fusion mit der HIV-1 TAT-Domäne zellpermeable NHR2-Proteine generiert. Zunächst wurde ein Protokoll zur Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine etabliert. Durch eine ausführliche biochemische Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass die aus Bakterien aufgereinigten NHR2-Proteine funktionell und sehr rein waren. Sie wiesen den erwarteten hohen alpha-helikalen Anteil auf und behielten ihre Fähigkeit zur Bildung von Tetrameren in vitro bei. Die TAT-NHR2-Fusionsproteine sind in der Lage, in humane Zellen einzudringen und konnten erfolgreich in den Lysaten nachgewiesen werden. Mikroskopische Studien zeigten, dass der Großteil der internalisierten Proteine in Endosomen-ähnlichen Vesikeln lokalisiert war. Die Zugabe des Endosomeninhibitors Chloroquin oder eines endosomolytischen, zellpermeablen Peptides ermöglichte eine erhöhte intrazelluläre Stabilität der zellpenetrierenden Proteine. Co-Immunpräzipitations-Experimente konnten bestätigen, dass die aufgenommenen NHR2-Proteine spezifisch an das ETO-Protein in transfizierten, adhärenten Zellen binden können. Die Proteintransduktion in die myeloische, AML1/ETO-wachstumsabhängige Zelllinie Kasumi-1 ist unter serumfreien Bedingungen ebenfalls möglich. Die konsekutive Behandlung der AML-Zellen mit den TAT-NHR2-Fusionsproteinen führte zu einer Reduktion der Expression des Stammzellmarkers c-kit (CD117) in 26 % der behandelten Zellen. Die Anwendung zellpermeabler NHR2-Proteine ist demnach prinzipiell möglich, bedarf aber weiterer Optimierung, um die notwendige hohe Bioverfügbarkeit zu erreichen.
In einem zweiten Projekt wurden Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren verwendet, um die NHR2-Proteine in den hämatopoetischen Zellen zu exprimieren. Mit Hilfe mehrerer Methoden konnte gezeigt werden, dass sich mit den generierten Vektoren, die auf dem AAV-Serotyp 2 basierten, erfolgreich eine transiente Genexpression induzieren ließ. Der CMV-Promoter vermittelte jedoch nur eine schwache Expression in den hämatopoetischen Zellen. Unter Verwendung des stärkeren SFFV-Promoters konnte die Expressionsstärke deutlich gesteigert werden. Die von den optimierten AAV-Vektoren vermittelte Expression der NHR2-Proteine führte in den beiden AML1/ETO-positiven Zelllinien Kasumi-1 und SKNO-1 zu den erwarteten, spezifischen Effekten. So wurde das Wachstum verlangsamt und gleichzeitig die Apoptoserate erhöht. AML1/ETO-unabhängige Zellen wurden dagegen von den AAV-NHR2-Vektoren nicht beeinflusst. Obwohl die Proteinexpression in SKNO-1 Zellen stärker war, zeigten die Kasumi-1 Zellen deutlichere Effekte. Die NHR2-Proteine bewirkten in den transduzierten t(8;21)-positiven Zellen außerdem eine Reduktion der Expression der Stammzellmarker CD34 bzw. c-kit. Dies deutet auf eine partielle Differenzierung der beiden AML1/ETO-abhängigen Zelllinien hin. Damit ließen sich durch AAV-vermittelte Transduktion in den AML-Zellen dieselbe Wirkung in Hinblick auf Wachstum, Differenzierbarkeit und Apoptoserate erzielen wie dies mit den lentiviralen Vektoren zuvor beschrieben wurde. In einem abschließenden Vergleich wurde aber deutlich, dass nicht-integrierende Vektorsysteme generell eine schwächere NHR2-Proteinexpression induzieren und demzufolge auch schwächere Effekte als integrierende Vektoren in den AML1/ETO-positiven Zellen auslösen.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Strukturen supramolekularer Komplexe, die aus einem Wirkstoff und einem Modellrezeptor bestehen. Um die spezifische Bindung durch H-Brückenbildung nachzuahmen, wurden Co-Kristallkomponenten ausgesucht, die komplementäre Bindungsstellen besitzen. Die Strukturen der erhaltenen Komplexe sowie einiger (pseudo)polymorpher Formen wurden mit Hilfe der Einkristallstrukturanalyse bestimmt. Ein Vergleich mit Kristallstrukturen ähnlicher Verbindungen ergab Hinweise auf die bevorzugten Konformationen sowie die am häufigsten gebildeten H-Brückenmotive. Theoretische Berechnungen mit den Programmen MOMO und GAUSSIAN wurden bei der Einstufung der Stabilität der Konformere und Tautomere sowie bei der Abschätzung der Komplexbildungsenergien eingesetzt.
Zunächst wurden Co-Kristalle synthetisiert, deren Komponenten ausschließlich fixierte H-Brücken-bindungsstellen besitzen. Die Co-Kristallisationsversuche des Antimalariamittels Pyrimethamin mit Orotsäure führten zur Bildung einer neuen polymorphen Form, zwei Solvaten sowie dem gewünschten Co-Kristall.
In dem ADA/DAD-Komplex zwischen dem Antibiotikum Nitrofurantoin und 2,6-Diacetamidopyridin werden die Co-Kristallkomponenten durch drei H-Brücken verbunden. In den Kristallstrukturen wird die energetisch ungünstigere sp-Konformation von Nitrofurantoin bevorzugt. In dieser Konfomation besitzt das Molekül eine positive und eine negative Seite; dies ermöglicht eine dichtere Kristallpackung.
Aufgrund der Elektronegativitäten der O- und S-Atome sollte das Watson-Crick-Basenpaar zwischen den Nucleosiden 2-Thiouridin und Adenin, das durch eine N-H•••O-Brücke verbunden ist, stabiler sein als das entsprechende Wobble-Basenpaar mit einer N-H•••S-Brücke. Um die Stabilitäten der beiden H-Brücken zu untersuchen, wurden Co-Kristallisationsversuche mit dem Thyreostatikum 6-Propyl-2-thiouracil durchgeführt. Im Co-Kristall mit 2-Aminopyrimidin wird das R_2^2(8)-Heterodimer durch eine N-H•••N- und eine N-H•••S-Brücke verbunden, während N-H•••O-Brücken die 6-Propyl-2-thiouracilmoleküle zu Ketten verknüpfen. Aufgrund der ungünstigen intramolekularen Donor/Akzeptor-Abstände wird im Co-Kristall mit 2,6-Diacetamidopyridin der gewünschte ADA/DAD-Komplex nicht beobachtet. Stattdessen bildet 6-Propyl-2-thiouracil mit Hilfe zweier N-H•••S-Brücken R_2^2(8)-Homodimere, mit denen 2,6-Diacetamidopyridin nur durch eine N-H•••O-Brücke verbunden ist. Die Mitwirkung der N-H•••S-Brücke bei der „Basenpaarung“ kann dadurch erklärt werden, dass bei der Beteiligung der N-H•••O-Brücken an dem R_2^2(8)-Motiv N-H•••S-Brücken für die Kettenbildung zuständig wären; dieses Strukturmotiv wird jedoch in Kristallstrukturen selten beobachtet. Insgesamt zeigen diese Untersuchungen, dass C-O- und C-S-Gruppen konkurrenzfähige H-Brückenakzeptoren sind.
Anschließend wurden mehrere Co-Kristalle des Antimykotikums 5-Fluorcytosin synthetisiert. Im Co-Kristall mit 2-Aminopyrimidin wird das gewünschte AD/DA-Heterodimer beobachtet. Ein ähnliches R_2^2(8)-Heterodimer könnte zwischen 5-Fluorcytosin und N-Acetylkreatinin gebildet werden, jedoch werden die Komponenten lediglich durch eine H-Brücke miteinander verknüpft. Energieberechnungen machen dies plausibel. Trotz der komplementären AAD/DDA-Bindungsstellen wird im Co-Kristall mit 6-Aminouracil das Heterodimer nur durch zwei H-Brücken verbunden. Die dadurch gewonnene Energie reicht offenbar aus, um den Energieunterschied zum AAD/DDA-Heterodimer zu kompensieren. Die Co-Kristalle des 5-Fluorcytosins mit 6-Aminoisocytosin sowie der Co-Kristall mit dem antiviralen Wirkstoff Aciclovir bestätigen die Stabilität des AAD/DDA-H-Brückenmusters, welches dem Watson-Crick-Basenpaar C-G ähnelt.
Es gelang auch, das Konformations- und das Tautomerengleichgewicht durch eine spezifische Bindung zu beeinflussen. In den Co-Kristallen von 5-Fluorcytosin mit den beiden konformationell flexiblen Molekülen Biuret und 6-Acetamidouracil wird nur diejenige Konformation gefunden, die zur Bildung des gewünschten AAD/DDA-Heterodimers führt. Dabei liegt Biuret in der energetisch günstigeren trans-Form, 6-Acetamidouracil jedoch in der ungünstigeren cis-Form vor. Die drei AAD/DDA-Komplexe von 6-Methylisocytosin zeigen, dass durch die Bildung komplementärer H-Brückeninteraktionen Tautomere getrennt kristallisiert werden können: in den Co-Kristallen mit 5-Fluorcytosin findet man ausschließlich die 3H-Form, während in dem Komplex mit 6-Aminoisocytosin lediglich die 1H-Form vorliegt.
In dieser Studie werden somit neue Einblicke in die Anwendung von Co-Kristallen als Modellsysteme für die Untersuchung von Wirkstoff/Rezeptor-Wechselwirkungen gewonnen. Um Wirkstoff/Rezeptor-Komplexe noch besser nachzuahmen, sollten zukünftig Co-Kristallisationsversuche mit größeren und flexibleren Modellrezeptoren vorgenommen werden. Weiterhin wäre die Berücksichtigung schwacher Wechselwirkungen bei der Synthese von Co-Kristallen von Interesse.
Im Zuge dieser Dissertation wurden verschiedene Methoden zur besseren Identifikation von Proteinen aus unspezifischen Proteinverdauen entwickelt und auf ihre Einsatzmöglichkeiten hin untersucht. In diesem Rahmen wurde vorrangig die Protease Thermitase in ihrer Spezifität und ihrem Temperaturverhalten genauer definiert und ihre proteolytische Verwendbarkeit bewertet.
Aufgrund der durchgeführten Untersuchungen konnte mit Thermitase eine weitere, für die massenspektrometrische Analytik verwendbare Protease, erfolgreich etabliert werden. Als wichtigstes Merkmal dieser Protease muss ihr erfolgreicher proteomischer Einsatz, auch in Kombination mit starken organischen Lösungsmittel und Detergenzien, hervorgehoben werden. Außerdem konnten in Anwesenheit von SDS Verdaue massenspektrometrisch erfolgreich untersucht werden. Die Möglichkeiten dieser Methode sind vor allem für die Membran-Proteomik interessant. Mittels Thermitase können Membranproteine direkt in einem hydrophoben Puffer denaturiert, verdaut und ohne vorheriges Ausfällen analysiert werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden mehrere Ansätze für die Verbesserung der Auswertbarkeit von unspezifischen Proteinverdauen verfolgt und teilweise erfolgreich umgesetzt. Mittels der bioinformatischen Auswertung von theoretischen Verdauen ganzer Datenbanken wurden die Unterschiede bei der Identifikation von spezifischen und unspezifischen Verdauen verdeutlicht. Anhand der beobachteten Vergrößerung des Suchraums um den Faktor 10 bis 100 von unspezifischen gegenüber spezifischen Proteolysen konnte nachgewiesen werden, dass bei Verwendung der heute gebräuchlichen Suchalgorithmen erst eine Steigerung der Massengenauigkeit um mindestens den Faktor 20 zu Ergebnissen führt, die mit denen spezifischer Verdaue vergleichbar sind. Einen Schritt in diese Richtung kann durch die Verwendung der MALDI-Orbitrap (Papasotiriou 2010), die eine durchschnittliche Massengenauigkeit von 5 ppm bietet, vollzogen werden. Jedoch wäre nach einer Abschätzung auf der Basis der gewonnenen Ergebnisse eine routinemäßige Massengenauigkeit von unter 1 ppm nötig, um bei der Identifikation mittels PMF für unspezifische und tryptische Verdaue die gleichen Erfolgsquoten zu erhalten. Wird dies erreicht, bieten unspezifische Proteasen, wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, zahlreiche Vorteile gegenüber spezifischen Proteasen.
Ausgehend von der Verwendung aktueller Suchalgorithmen konnte der Einfluss unterschiedlicher Protein- und Peptidkriterien auf die Proteinidentifikation eindeutig gezeigt werden. Zur Verbesserung der Identifikation bei unspezifischen Verdauen wurden mehrere spezifische Kriterien erarbeitet. Eine PMF-Suche unter deren Einbezug führte zu einer 4fach höheren Identifikationsrate gegenüber einer normalen Suche mittels MOWSE. Mit der iterativen sowie der kombinatorischen Suche wurden zwei einfache bioinformatische Methoden entwickelt, die die Suche von unspezifischen Verdauen erleichtern und in Zukunft verbessern werden.
Die Identifikation von Modifikationen mittels der spezifischen Delta-Massen und die Identifikation von unspezifischen Verdauen durch Bewertung der charakteristisch auftretenden Cluster stellen zwei gänzlich neue Ansätze in der Proteinidentifikation dar. Ihr Einsatz ermöglicht neue Verwendungsmöglichkeiten von unspezifischen Verdauen, die über die klassische Proteinidentifikation hinausgehen, und versucht, spezielle Fragen in der Proteinanalytik zu beantworten. Der Einbezug zusätzlicher Informationen, die der Verdau neben der reinen Gewinnung von Peptidmassen bietet, sollte bei unspezifischen Verdauen fokussiert angegangen werden. Durch die mehrfache Überlappung der Peptide liegen diese Informationen, anders als bei tryptischen Verdauen, redundant vor. Sie können sich also bei entsprechender Auswertung in ihrer Bewertung selbst stützen.
Die in dieser Promotionsarbeit vorgestellten Ansätze zur besseren Identifikation von unspezifischen Proteinverdauen zeigen vielversprechende Möglichkeiten auf.
Realistisch betrachtet, stellt jeder dieser Ansätze eine positive Abweichung von der bislang vorherrschenden routinemäßigen Behandlung der Proteinidentifikation dieser Verdaue dar und bieten die Möglichkeiten qualitativ bessere Untersuchungsergebnisse im Bereich der Massenspektrometrie zu erzielen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle retinaler Perizyten nach einer Infektion mit dem Humanen Zytomegalievirus und deren mögliche Beteiligung an einer HCMV-Retinitis untersucht. Zunächst wurde die Isolation, Kultivierung und Vermehrung von humanen retinalen Perizyten (HRP) etabliert. Eine erfolgreiche Isolation der HRP ist abhängig vom Alter des Spenders, welches unter 50 Jahren liegen sollte, als auch vom Zeitpunkt der Entnahme des Auges. Dabei sollten die Retinae spätestens nach 48 h post mortem aus den Augen präpariert werden. Nach Aufschluss mit einem Dispase/Kollagenase-Gemisch und Separation über ein Zellnetz wurden die isolierten Perizyten auf mit Fibronektin oder ECM (extrazelluläre Matrix) beschichtete Kulturflaschen ausgebracht. Aufgrund der Optimierung des Mediums war es zum ersten Mal möglich, humane retinale Perizyten über 12-15 Passagen zu kultivieren. Somit standen genügend Zellen zur Analyse der Infizierbarkeit mit HCMV und für die Reportergenanalyse zu Verfügung.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Zellen mit HCMV infizierbar sind, jedoch keine lytische Infektion stattfindet und nur wenige Zellen einen zytopathischen Effekt zeigen. Mithilfe von Titerbestimmungen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen infizierter Perizyten konnte die Virusreplikation und die Bildung reifer bzw. funktioneller Viruspartikel nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die Expression der viralen IE- und late-Proteine in HCMV-infizierten Perizyten mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und quantitativer RealTime-PCR nachgewiesen. Während einer HCMV-Infektion werden unterschiedliche inflammatorische Prozesse induziert. Dazu gehört z. B. die Aktivierung zellulärer Transkriptionsfaktoren, welche durch ihre Bindung an Promotorregionen die Transkription verschiedener Gene die für Zytokine und Adhäsionsmoleküle kodieren, und andere Transkriptionsfaktoren beeinflussen (Pahl, 1999). Der Transkriptionsfaktor NF-κB wird als Hauptregulator für die HCMV-Replikation beschrieben, in retinalen Perizyten wird NF-κB jedoch nicht aktiviert. Mittels Immunfluoreszenzfärbung und Genexpressionsstudien konnte ein weiterer proinflammatorischer Prozess, die Überexpression von ICAM-1, in infizierten Perizyten nachgewiesen werden. ICAM-1 bewirkt die Infiltration und Anhaftung von Leukozyten an infizierten Zellen. Durch Adhäsionsstudien wurde eine 4,6-fach gesteigerte Anhaftung an HCMV-infizierten Perizyten nachgewiesen, welche durch blockierende Antikörper wieder aufgehoben werden konnte. Durch Expressionanalysen von Chemokin- und Interleukingenen mittels qRT-PCR und ELISA-Analysen konnten erhöhte Sekretionen von CCL2, CCL5, CXCL10 und IL-8 in HCMV-infizierten HRP nachgewiesen werden. Die Resultate einer Infektion mit Vollvirus wurden durch die Transfektion mit Expressionsplasmiden für die viralen Proteine IE1/2 bestätigt. Eine gesteigerte Expression der Zytokine wurde vor allem durch die Überexpression von IE2 und synergistisch durch IE1/2 nachgewiesen. Eine durch IE1 induzierte Expression wurde nur für CCL2 detektiert. Die viralen IE-Proteine sind potentielle Transaktivatoren viraler und zellulärer Promotoren. Ziel war es, den Einfluss auf die Promotoren der Zytokingene (von -3000bp bis 100 bp) durch Koexpression der viralen IE1/IE2-Proteine mittels Luciferase-Reportergenassays in HRP zu untersuchen. Nur der CCL2-Promotor (-1355/+55) zeigte eine erhöhte basale Promotor-aktivität. Um den Einfluss der IE-Proteine auf die Promotoren zu untersuchen, wurden Kotransfektionen mit den Expressionsplasmiden für IE1/2 und den Reportergen-konstrukten der Zytokingene durchgeführt. Dabei zeigten die Analysen mit den Minimalpromotoren (TATA-Box/NF-κB Bindungsstellen) keine erhöhten Luciferaseaktivitäten. NF-κB wurde durch eine HCMV-Infektion nicht aktiviert, somit ist die Transaktivierung der Promotoren von CCL2, CCL5, CXCL10, IL-8 und ICAM-1 in infizierten Perizyten vermutlich NF-κB unabhängig. Die Transaktivierung dieser Promotoren könnte durch AP-1 vermittelt sein, da die höchsten Luciferaseaktivitäten durch die Kotransfektion mit strangabwärts gelegenen Promotorbereichen erhalten wurden, in diesen Bereichen befinden sich potentielle Bindungsstellen für AP-1, SP-1 und anderer Transkriptionsfaktoren. Mittels Western Blot-Analyse wurde eine Induktion der Expression von AP-1 durch HCMV nachgewiesen, somit wird die HCMV-Replikation in HRP vermutlich über AP-1 vermittelt.
In der vorliegenden Arbeit wurden primäre humane Perizyten isoliert und erstmals mit HCMV infiziert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Zellen als Modellsystem zur Untersuchung einer HCMV-Retinitis von großer Bedeutung sind. Aufgrund ihres hohen Anteils in der Retina, ihrer schützenden Funktion für die Blut-Retina Schranke sowie ihrer Beteiligung an der HCMV-Retinitis spielen diese bisher nur wenig untersuchten Zellen, offensichtlich eine große Rolle im immunpriviligiertem Auge. Für die Etablierung neuer Therapieansätze für eine HCMV-Retinitis könnten detailliertere Untersuchungen retinaler Perizyten Aufschluss über den Replikationsmechanismus von HCMV und die damit verbundenen inflammatorischen Prozesse während einer HCMV-Retinits bieten.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Regiospezifität und Spaltungsausbeute von 5’-modifizierten Trisbenzimidazolkonjugaten wie 53 unter Verwendung von Helfer-Sequenzen verbessert werden (S.74 ff). Mit dieser Technik gelang es, Turnover zu erzielen und so eine echte katalytische Aktivität der DNA-Konjugate nachzuweisen. Die verwendeten Helfer-DNA-Sequenzen sind günstig zu erwerben oder mit einem DNA-Synthesizer leicht selbst herzustellen und können so der jeweiligen Aufgabe perfekt angepasst werden.
Weiterhin wurden verschiedene Versuche unternommen, ein 5’-modifiziertes Konjugat maßzuschneidern, so dass es durch interne bulge-Bildung mit seinem Substrat ebenfalls Turnover erreichen könnte und so katalytische Aktivität zeigte (S.59 ff). Diese Projekte wurden in Anlehnung an Arbeiten von Häner [91] durchgeführt, der damit Turnover erzielte, da das Konjugat nach Spaltung des bulges wieder in den katalytischen Zyklus eingegliedert werden konnte. Leider waren diese Versuche nicht von Erfolg gekrönt, obwohl man sich bei der Konzipierung der Substrat-Konjugat-Hybriden an die Sequenzen von Häner et.al. hielt. Statt dessen beobachtete man im Falle von Konjugat 51 bei der Hybridisierung die Ausbildung einer Helix; ein bulge konnte nicht erhalten werden (S. 61). Dieser Unterschied könnte auf die große, planare Spaltereinheit mit Europium(III) von Häner et. al. zurück zu führen sein, die im Falle der von uns untersuchten Konjugat-Substrat-Hybride fehlte, denn die 2-Aminobenzimidazol-Einheiten von Trisbenzimidazol 15 waren im Vergleich als klein anzusehen.
Diese Vermutung führte schließlich zu zwei unterschiedlichen Ansätzen. Einer davon war es, eine größere intercalationsfähige Teilstruktur in das Konjugat einzuführen. Man versuchte deshalb ein Konjugat zu synthetisieren, welches zwischen der katalytischen Einheit und dem sequenzerkennenden Teil die Pyrenaminosäure 56 von Dr. M. Suhartono trug (S. 69 ff).
Dieses sollte den großen, Häner’schen Rest imitieren und so einen bulge erzeugen. Leider gelang die Synthese dieses Konjugates nicht. Wie sich heraus stellte, war das kommerziell erworbene DNA-Material nicht geeignet für die angewendete Synthese. Eine Basen-Schutzgruppe bzw. das Anhydrid derselben, welches bei der Festphasensynthese als Capping-Reagenz verwendet wurde, führte zu einer irreversiblen Reaktion mit der 5'-NH2-Funktion an der DNA und machten das Material daher für eine Kupplung unbrauchbar.
Eine andere Herangehensweise war es, die Faltung des Konjugat-Substrat-Hybrides voraus zu berechnen und so ein Hybrid zu erhalten, welches einen bulge ausbildete (S. 65 ff). Konjugat 55 und Substrat 54 wurden nach dieser Strukturvorhersage synthetisiert bzw. erworben und entsprachen genau den Erwartungen, ein interner bulge wurde ausgebildet. Dennoch konnte man auch mit diesem System keinen Turnover erreichen.
Ein weiteres großes Teilgebiet dieser Arbeit war die Untersuchung kleiner Moleküle als unspezifische RNA-Spalter. Im Rahmen dieser Arbeit wurden speziell Guanidiniumanaloga auf ihre RNA-Spaltungsfähigkeit untersucht. In der Vergangenheit hatte man als Gütekriterium dieser Verbindungen das Augenmerk auf ihre pKa-Werte gerichtet. Sofern sich diese annähernd im physiologischen Bereich befanden, konnten häufig gute bis sehr gute RNA-Spaltungsausbeuten erzielt werden.
Erstmals kam das Konzept der Energiedifferenz zwischen den tautomeren Formen eines guanidiniumtragenden Moleküls als Werkzeug zur Vorhersage der Güte eines RNA-Spalters zum Einsatz (S.113 ff). Sofern die beiden Strukturen (Amino- und Iminotautomer) sehr geringe Energieunterschiede aufwiesen, sollten sie sich besser als „Protonen-Shuttle“ eignen und so die Phosphosäuretransesterifikation katalytisch besser unterstützen. Zusammen mit dem pKa-Wert der Verbindungen wurde untersucht, ob dieses Konzept als Vorhersagemethode tragfähig ist.
Unter den mit diesen Methoden gefundenen sowie kommerziell erhältlichen Molekülen konnte 2-Aminoperimidin 67 als sehr guter Spalter identifiziert werden. Verglichen mit Trisbenzimidazol 15 erreichte es ebenso gute Spaltungsraten wie letzteres, wobei 67 nur über eine einzige Guanidiniumeinheit verfügt. Dieser so identifizierte neue Kandidat für den Einbau in DNA-Konjugate enttäuschte auch nach Untersuchungen seines N-Methyl-Aminoderivates 80 nicht: Das Derivat zeigte eine ausreichend hohe Spaltungsaktivität, um es in Zukunft als Baustein für antisense-Konjugate in Frage kommen zu lassen.
Es gab allerdings auch Schwierigkeiten bei der Untersuchung der kleinen Moleküle. Problematisch gestaltete sich ihre Löslichkeit in hohen Konzentrationen. Man ging deshalb dazu über, Co-Solventien wie Methanol oder DMSO zu verwenden, um auch während des Experimentes eine ausreichende Löslichkeit der Verbindungen zu gewährleisten. Ein Volumenanteil von 20% Co-Solvens stellte sich als ideal heraus, das Experiment wurde dadurch nicht negativ beeinflusst.
Außerdem kam es zu Präzipitation einiger Substanzen (u.a. 2-Aminoperimidin 67) beim Auftragen auf das Sequenzierergel, welche die Auswertbarkeit dieser Experimente einschränkte. Die Verwendung eines neuen Harnstoffladepuffers beim Auftragen der Proben auf das Gel und das Senken der Substanzkonzentration (von mM auf μM) im Experiment verbesserten diese Situation deutlich. Häufig beobachtete Präzipitationseffekte waren danach größtenteils verschwunden, was die Auswertung der Spaltungsexperimente mit kleinen Molekülen erleichterte (S. 129 ff). Einige Verbindungen konnten mit der Kombination von ΔHf-Wertbestimmung und pKa-Wert-Bestimmung als schlechte RNA-Spalter korrekt vorhergesagt werden (z.B. 2-Aminopyridin 69, 2- Aminopyrimidin 68).
Nicht ganz klar ist das mittelmäßige Abschneiden von Imidazoimidazol 71 als RNA-Spalter (S.136 ff). Durch seine Symmetrie liegt sein ΔHf-Wert bei 0 und auch sein pKa-Wert liegt mit 7.4 perfekt im physiologischen Bereich. Dennoch konnte es nur Spaltungsausbeuten von unter 10% bei Konzentrationen im höheren mM-Bereich erreichen. Es ist aber auch die einzige untersuchte Verbindung, die signifikant RNA schneidet, ohne diese gleichzeitig zu aggregieren oder zu denaturieren.
Untersuchungen des Aggregationsverhaltens der kleinen Moleküle mittels FCS-Messungen (S. 139 ff) zeigten, dass fast alle bei hohen Konzentrationen – etwa im mM- oder hohem μMBereich – Aggregate bilden, und das auch bei Verwendung von Co-Solventien, wie es im Rahmen dieser Arbeit etabliert wurde. Man kann also bei den kleinen Katalysatoren nicht davon ausgehen, dass isolierte Moleküle für die beobachteten Effekte verantwortlich sind. Vielmehr agieren diese Moleküle bei solchen Konzentrationen als große oder kleine Aggregate, die durch die Vielzahl ihrer katalytischen Einheiten an der Oberfläche ihr Potential vervielfachen. Erst bei niedrigen Konzentrationen lösen sich die Aggregate auf, man kann hier wieder von einem Ein-Molekül-ein-Substrat-Mechanismus ausgehen (s. Schema 3 S. 110).
Dies wird allerdings nicht als Ausschlusskriterium gesehen, diese Moleküle auch weiterhin als potentielle Kandidaten für antisense-Konjugatbausteine zu betrachten. In Konjugaten verhalten sie sich wie Einzelmoleküle, bei denen man streng mechanistische Betrachtungen anstellen kann und darf.
In dieser Arbeit geht es um Kristallstrukturbestimmung und -modellierung ausgewählter organischer Pigmente sowie metallorganischer Polymere. Der feste – und insbesondere kristalline – Zustand der Materie ist von (im wahrsten Sinne des Wortes) tragender und weitreichender Bedeutung für die moderne Wissenschaft, Technologie, den Alltag überhaupt.
Die Kenntnis über den inneren (mikroskopischen)Aufbau des Festkörpers ermöglicht es zunächst, seine (makroskopischen) Eigenschaften zu verstehen. Genannt seien z. B. nicht-lineare optische Eigenschaften, die in der typischen anisotropen Struktur des kristallinen Festkörpers begründet liegen, mechanische Stabilität von Werkstoffen wie Metallen oder Legierungen, aber auch die Eigenschaften von Pigmenten: Was macht eine Substanz zu einem Pigment? Wann ist ein Pigment ein gutes, wann ein weniger gutes Pigment? Die Antworten auf diese Fragen finden sich u. a. in der Kristallstruktur: Packungsdichte, (Schwer-)löslichkeit, etc.
Die Eigenschaften von Substanzen mit sichtbaren Low-Spin–High-Spin-Übergängen lassen sich auch nur verstehen, wenn der innere Aufbau, die Kristallstruktur, bekannt ist. Was geht im Inneren vor, wenn solche Substanzen einem äußeren Einfluss wie beispielsweise Temperaturänderung ausgesetzt werden? Ist es nicht so, dass z. B. ein High-Spin-Fe2+-Ion einen größeren effektiven Radius als ein Low-Spin-Fe2+-Ion hat? Dehnt sich die Kristallstruktur aus, „atmet“ sie?
Die Kenntnis der Kristallstruktur ermöglicht es nicht nur, die Eigenschaften zu verstehen. Umgekehrt ist es auch möglich, diese Eigenschaften gezielt zu manipulieren: Verbesserung der Pigmenteigenschaften durch Herabsetzen der Löslichkeit, Veränderung der elektronischen und magnetischen Kopplungen in niedrig-dimensionalen Polymerketten, um nur zwei zu nennen.
Zum Leidwesen des Chemikers, des Physikers und des Kristallographen besteht in den Eigenschaften, die z. B. Pigmente als „gut“ auszeichnen, das größte Problem: die mangelnde Löslichkeit der Verbindung. Es ist genau diese Eigenschaft, die dafür sorgt, meist keine Einkristalle züchten zu können, massive Schwierigkeiten beim Umkristallisieren zu haben und letztendlich – wenn keine Einkristalle vorliegen – bei der Strukturbestimmung aus Pulverdaten breite, überlappende Reflexe separieren zu müssen.
Dennoch gibt es nützliche und bewährte Methoden, auch aus (sogar nur mäßigen) Pulverdaten eine Kristallstruktur zu lösen. Genannt seien hier quantenchemische Rechnungen, die unter Umständen sehr rechen- und zeitintensiv sein können, oder Kraftfeld-Methoden, die zwar nicht sehr exakte, aber immerhin doch brauchbare Ergebnisse mit vertretbarem Zeit- und Rechenaufwand liefern. Diese Methoden sind insbesondere dann zur Vorhersage von Kristallstrukturen geeignet, wenn das Pulverdiagramm nicht indizierbar ist.
Wenn die Struktur erst gelöst ist, ist die bewährte Methode der Strukturverfeinerung die Rietveld-Methode. Obwohl oder gerade weil die Methode mittlerweile zu einer „Black- Box“-Methode geworden ist, ist die genaue Analyse und Interpretation der Ergebnisse unabdingbar.
Es gibt genügend Beispiele, in denen vermeintlich gute Ergebnisse (struktur-)chemisch sinnlos sind.
Themenstellung
Pigmente spielen in der Industrie eine wesentliche Rolle. Im Gegensatz zu Farbstoffen sind Pigmente im Anwendungsmedium unlöslich, sie werden feinkristallin dispergiert, um z. B. in Autolacken oder Kunststoffen eingesetzt zu werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Kristallstrukturen von 13 Pigmenten bestimmt.
Zu den genannten Kristallstrukturbestimmungen kommt ein Kapitel mit einer grundsätzlichen Fragestellung: Wo sind die Grenzen der Strukturbestimmung aus Pulverdaten? Wann ist eine Kristallstruktur „richtig“ oder „falsch“?
Ein letztes Pigment verknüpft die beiden vorangehenden Punkte.
Das letzte Kapitel behandelt die Erstellung von 5 Modellstrukturen aus zwei Substanzklassen für niedrig-dimensionale metall-organische Festkörper.
Beide Substanzklassen wurden im Rahmen der Forschergruppe 412 („Spin- und Ladungsträgerkorrelationen in niedrigdimensionalenmetallorganischen Festkörpern“)der DFG hinsichtlich elektronischer und magnetischer Eigenschaften untersucht.
Übergeordnetes Ziel der Arbeit war die Synthese von Molekülen, die zur gezielten Funktionalisierung von Oberflächen dienen sollten. Dazu mussten jeweils Synthesewege inklusive geeigneter Schutzgruppenchemie sowie Reinigungsstrategien entwickelt werden. Im Rahmen dieser Zielsetzung wurde zunächst eine Anlage zur Gradientensublimation aufgebaut, mit der sich die Substanzen in sehr hoher Reinheit erhalten ließen.