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Structural biology often employs a combination of experimental and computational approaches to unravel the structure-function paradigm of biological macromolecules. This thesis aims to approach this combination by the application of Pulsed Electron-Electron Double Resonance (PELDOR/DEER) spectroscopy and structural modelling. In this respect, PELDOR spectroscopy in combination with site-directed spin labelling (SDSL) of proteins is frequently used to gain distance restraints in the range from 1.8 to 8 nm. The inter-spin distance and the flexibility of the spin labelled protein domains are encoded in the oscillation and the dampening of the PELDOR signal. The intrinsic flexibility of the commonly used MTSSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrroline-3-methyl) spin label itself can be an obstacle for structural modelling if the flexibility of the label is large compared to the flexibility of the protein domains. In this thesis the investigation of two multi-domain proteins by the 4-pulse PELDOR sequence is presented. At first, the N-terminal polypeptide transport-associated (POTRA) domains of anaOmp85, a rigid three domain protein, giving well-defined PELDOR distance restraints, is investigated. The experimental restraints are used for structure refinement of the X-ray structure and reveal a strong impact of the intrinsic flexibility of MTSSL on the accuracy of structural refinement. The second example, K48-linked diubiquitin, is a highly flexible multi-domain protein on which the flexibility of MTSSL is of minor impact on structural modelling. In this case, the distance restraints are utilized to determine conformational ensembles. Due to the high intrinsic flexibility already characterizing diubiquitin the recently developed 7-pulse Carr-Purcell (CP) PELDOR sequence was applied to investigate longer ubiquitin chains. This sequence enables to measure dipolar oscillations with an extended time window, allowing a good separation between inter- and intramolecular contributions even for long distance and broad conformational distributions, thereby providing an increased accuracy of the obtained distance distributions.
Die chemischen und physikalischen Eigenschaften eines Festkörpers sind vom inneren Aufbau des Festkörpers abhängig. Die Methode der Wahl zur Bestimmung von Kristallstrukturen sind Beugungsexperimente. Fehlordnungen in den Kristallstrukturen werden mit Beugungsexperimenten häufig nur unzureichend ausgewertet oder ignoriert. In dieser Arbeit wurden die (möglichen) Stapelfehlordnungen der Aminosäuren DL-Norleucin und DL-Methionin, sowie von Chloro (phthalocyaninato)aluminium(III) untersucht. Dazu wurden Gitterenergieminimierungen mit Kraftfeld- und quantenchemischen Methoden an einem Satz geordneter Modellstrukturen durchgeführt.
In den Kristallstrukturen der α- und β-Phasen von DL-Norleucin ordnen sich die Moleküle in Doppelschichten an und bilden jeweils eine Schichtstruktur mit unterschiedlicher Stapelsequenz. Röntgenbeugungsexperimente an Kristallen dieser Verbindung zeigen charakteristische diffuse Streuung. Die durchgeführten Gitterenergieminimierungen reproduzieren die experimentelle Stabilitätenreihenfolge der beiden Polymorphe von DL-Norleucin. Die berechneten Gitterenergien zeigen, dass es für DL-Norleucin bevorzugte Stapelsequenzen gibt. Die Gitterenergien und Molekülstrukturen einer einzelnen Doppelschicht sind dabei von der Anordnung benachbarter Doppelschichten abhängig. Zudem wurden Strukturmodelle mit Stapelsequenzen aufgebaut, die aus kristallographischer Sicht möglich sind, jedoch experimentell nicht beobachtet wurden, und deren Gitterenergie berechnet. Diese Stapelsequenzen liefern im Vergleich zu den energetisch günstigsten Stapelsequenzen einen signifikanten Energieverlust und treten daher selten auf. Ausgehend von den Ergebnissen der Gitterenergieminimierungen mit DFT-D-Methoden wurden Stapelwahrscheinlichkeiten mit Hilfe der Boltzmann-Statistik berechnet. Es wurde ein großes geordnetes Modell mit einer Stapelsequenz gemäß der Stapelwahrscheinlichkeiten aufgebaut. Dieses Modell wurde verwendet, um Beugungsexperimente zu simulieren und mit experimentellen Daten zu vergleichen. Die theoretischen und experimentellen Beugungsdaten waren in guter Übereinstimmung.
Die Moleküle in den Kristallstrukturen der α- und β-Phasen von DL-Methionin bilden Doppelschichten. Die beiden Phasen unterscheiden sich in der Stapelung der Doppelschichten und der Molekülkonformation. Es wurden Gitterenergieminimierungen sowohl mit Kraftfeld-Methoden als auch mit DFT-DMethoden an geordneten Modellen mit unterschiedlichen Stapelsequenzendurchgeführt. Die experimentell bestimmte Stabilitätenreihenfolge der Polymorphe von DL-Methionin bei tiefen Temperaturen wurde durch die Ergebnisse der kraftfeldbasierten Rechnungen reproduziert. Die Modellstrukturen wurden während den Rechnungen moderat verzerrt. Die Bandbreite der relativen Energien aller Modelle ist relativ gering, sodass eine Stapelfehlordnung aus thermodynamischer Sicht nicht ausgeschlossen werden kann. In der Regel liefern Gitterenergieminimierungen mit DFT-D Methoden genauere Ergebnisse. Die Modellstrukturen wurden während den Rechnungen nur leicht verzerrt. Allerdings unterscheidet sich das Energieranking zwischen den Kraftfeld- und DFT-D-Methoden deutlich. Die experimentell bestimmte Stabilitätenreihenfolge der Polymorphe von DL-Methionin wurde mit DFT-D-Methoden nicht reproduziert. Die Energieunterschiede zwischen den beiden Polymorphen (ΔE = 1,60 kJ∙mol−1 (DFT-D2) bzw. ΔE = 0,83 kJ∙mol−1 (DFT-D3)) sind relativ gering und liegen im Fehlerbereich der Methode. Die Bandbreite der relativen Energien aller Strukturmodelle beträgt nur etwa 1,8 kJ∙mol−1. Auf dieser Grundlage ist eine Stapelfehlordnung in den Kristallstrukturen von DL-Methionin möglich, jedoch nicht experimentell beobachtet. Nicht nur die Kraftfeld-,sondern auch die DFT-D-Methoden scheinen für die Berechnung der Gitterenergien für das System DL-Methionin nicht genügend genau zu sein. Die erhaltenen relativen Energien sollten daher mit Vorsicht betrachtet werden.
Chloro(phthalocyaninato)aluminium(III) (AlPcCl) bildet eine Schichtstruktur, in der sich die Moleküle zu Doppelschichten zusammenlagern. Die 1984 durchgeführte Kristallstrukturbestimmung [98] lieferte auf Grund der schlechten Datenqualität nur eine ungenaue Kristallstruktur. Die asymmetrische Einheit enthält zwei Moleküle, von denen das eine Molekül geordnet, das andere fehlgeordnet ist. Die Kristallstruktur von AlPcCl ist fehlgeordnet, weil eine einzelne Doppelschicht von Molekülen eine tetragonale P4/n-Symmetrie aufweist, die vier symmetrieäquivalente Möglichkeiten bietet, eine zweite Doppelschicht auf einer ersten Doppelschicht zu platzieren. Mit Hilfe der OD-Theorie wurde ein Satz geordneter Modelle mit verschiedenen Stapelsequenzen aufgestellt und die Gitterenergie zunächst mit Kraftfeld-Methoden und anschließend mit DFT-DMethoden berechnet. Auf Grund unzureichender Parametrisierung, musste das Kraftfeld an das System AlPcCl angepasst werden. Die Modellstrukturen werden während den Kraftfeld-Rechnungen nur leicht verzerrt. Die berechneten Gitterenergien hängen allerdings stark von der verwendeten Parametrisierung und den Atomladungen ab und sollten daher mit Vorsicht betrachtet werden. Genauere Ergebnisse erzielten Gitterenergieminimierungen mit DFT-D-Methoden. Die verschiedenen Stapelsequenzen haben eine ähnliche Energie, was die Stapelfehlordnung in der Kristallstruktur von AlPcCl erklärt. Die Überlagerung der vier energetisch günstigsten geordneten Stapelsequenzen führt zu einer gemittelten Struktur, die sehr gut die fehlgeordnete experimentelle Kristallstruktur von AlPcCl erklärt.
Gepulste dipolare EPR-Spektroskopie ist eine wertvolle Methode, um Abstände von 1.5 bis 10 nm zwischen zwei Spinmarkern zu messen. Diese Information kann für Strukturbestimmungen hilfreich sein, wo traditionelle Methoden wie Kristallstrukturanalyse und NMR nicht angewendet werden können. Zusätzlich ist es möglich, Änderungen in Konformation und Flexibilität zu verfolgen. Für diese Studien haben sich stabile Nitroxidradikale als Spinmarker etabliert. Diese werden spezifisch durch die site-directed spin labelling Methode (SDSL) kovalent an das zu untersuchende Biomolekül gebunden. In den letzten Jahren wurden weitere Spinmarker für Abstandsbestimmungen mittels EPR-Spektroskopie entwickelt. Besonders interessant sind Triarylmethylradikale (im Folgenden abgekürzt als Trityl) und paramagnetische Metallzentren.
Im Vergleich zu Nitroxidradikalen hat das Tritylradikal einige Vorteile: Eine höhere Stabilität in einer reduzierenden Umgebung wie im Inneren von Zellen, längere Elektronenspin-Relaxationszeiten bei Raumtemperatur und ein schmaleres EPR-Spektrum. Deswegen ist dieses organische Radikal ein alternativer Spinmarker, der besonders gut für die Forschung von Biomolekülen in einer nativen Umgebung unter physiologischen Bedingungen geeignet ist. Auch paramagnetische Metallzentren sind weniger reduktionsempfindlich als Nitroxidradikale. Zusätzlich sind diese Spinmarker interessant in biologischen Fragestellungen. Zum Beispiel besitzen zahlreiche Enzyme paramagnetische Manganzentren als Cofaktoren. Zudem kann Magnesium, ein wesentlicher Cofaktor in Enzymen, Nukleinsäuren und Nukleotid-Bindungsdomänen der G- und Membranproteine, oft durch das paramagnetische Mangan ersetzt werden. Um Abstandsmessungen an Biomolekülen, die nur ein Metallzentrum besitzen, durchzuführen, können zusätzliche Spinmarker in Form eines Nitroxid-, Tritylradikals oder eines anderen paramagnetischen Metallkomplexes mithilfe der SDSL-Methode kovalent gebunden werden.
Nitroxidradikale, Tritylradikale und Metallzentren haben deutlich unterschiedliche EPR-spektroskopische Eigenschaften, welche oft als orthogonale Spinmarker bezeichnet werden. Solche Spinmarker sind nützlich für die Untersuchung von verschiedenen Untereinheiten bei makromolekularen Komplexen. Somit können die intramolekularen Abstände innerhalb einer Untereinheit sowie intermolekularen Abstände zwischen den unterschiedlichen Untereinheiten mit nur einer einzigen Probe bestimmt werden. Zusätzlich können die orthogonalen Marker sehr effektiv genutzt werden, um Metallzentren in Biomolekülen mithilfe der Trilateration-Strategie genau zu lokalisieren.
Die hier vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Nutzung dieser neuen Spinmarker für Abstandsmessungen. Solche Spinmarker sind noch kaum erforscht, obwohl sie für biologische Anwendungen eine große Rolle spielen könnten.
Das erste Ziel dieser Doktorarbeit war eine Studie über Tritylradikale mithilfe der dipolaren EPR-Spektroskopie. Zu diesem Zweck wurden sowohl double quantum coherence (DQC) und single frequency technique for refocussing dipolar couplings (SIFTER) Experimente als auch Hochfrequenz pulsed electron electron double resonance (PELDOR) Experimente mit einem Trityl-Modellsystem durchgeführt. Dabei wurden die Besonderheiten der unterschiedlichen dipolaren Spektroskopiemethoden mit diesem Spinmarker untersucht, um die Empfindlichkeit und Robustheit für die Abstandsmessungen zu optimieren.
Das zweite Ziel war eine Studie über den Einfluss der Hochspin-Multiplizität des Mangans auf die Abstandsbestimmungen. Für diesen Zweck wurde zuerst ein Modellsystem mit einem orthogonalen Mn2+ Ion und Nitroxidradikal mithilfe der PELDOR-Spektroskopie untersucht. Anschließend wurde ein weiteres Modellsystem mit zwei Mn2+-Ionen untersucht, um PELDOR und relaxation-induced dipolar modulation enhancement (RIDME) Experimente bezüglich ihrer Empfindlichkeit und Robustheit sowie Genauigkeit der Datenanalyse zu optimieren.
Das Trityl-Modellsystem wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Sigurdsson synthetisiert. Die EPR Messungen wurden bei zwei verschiedenen Mikrowellenfrequenzen (34 und 180 GHz) durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die Auswahl der optimalen Methode von den EPR-spektroskopischen Eigenschaften des Systems bei den jeweiligen Mikrowellenfrequenzen abhängig ist. Das EPR-Spektrum des Trityls ist bei 34 GHz so schmal, dass das ganze Spektrum von einem üblichen Mikrowellenpuls angeregt werden kann. In diesem Fall sind die DQC und SIFTER Experimente am besten geeignet. Der mit diesen Methoden bestimmte Abstand von 4.9 nm ist in guter Übereinstimmung mit Werten aus der Literatur. Es wurde festgestellt, dass die SIFTER Messung eine höhere Empfindlichkeit als DQC besitzt, da das Signal-zu-Rausch Verhältnis um den Faktor vier größer ist. Außerdem ist die SIFTER-Methode experimentell weniger anspruchsvoll, da ein deutlich kürzerer Phasenzyklus für die Mikrowellenpulse benötigt wird. ...
Die Entwicklung von neuartigen, funktionellen Materialien ist eine komplexe Aufgabe, da die Gesamteffizienz der zu entwickelnden Materialien von einer Vielzahl von Faktoren abhängt. Während die auf einer molekularen Ebene durchgeführte Funktionalisierung via chemischer Reaktionsführung genauso wichtig ist wie die makromolekulare Anordnung, kann die Frage nach einer geeigneten Verbesserung von gegenwärtigen Materialien nicht nur auf einer dieser beiden Ebenen beantwortet werden. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse basieren auf der mirkoskopischen aber auch markoskopischen Betrachtung von neuartigen, funktionellen Nanomaterialien und den daraus gewonnenen Erkenntnissen. Das übergeordnete Ziel ist dabei das Verständnis und die Charakterisierung von Ladungsseparationsprozessen und die daraus resultierende Erzeugung von elektrischen Strömen in organischen photovoltaischen Materialien.
Die relevanten Ladungsseparationsprozesse werden oft im Kontext der Dissoziation von Exzitonen, gebundenen Elektron-Loch Paaren, beschrieben, welche innerhalb der Donordomäne eines beliebigen Donor-Akzeptor-Materials erzeugt werden. Dabei ist der Prozess der Exzitonengenerierung abhängig von der Nanomorphologie des entsprechenden Materials, typischerweise so genannten Bulk-Heterojunctions. Dahingehend ist es notwendig, die Effekte von intermolekularen Wechselwirkungen sowohl mittels quantenmechanischer als auch dynamischer Methoden zu betrachten. Um alle relevanten Zeitskalen und Prozesse zu betrachten ist es weiterhin notwendig, auf sowohl eine deterministische Darstellung im Rahmen von quantendynamischen Methoden als auch statistischen Methoden zurückzugreifen.
Um die oft ultraschnellen und kohärenten Exzitonendissoziationsprozesse zu untersuchen wurde eine Kombination aus high-level ab initio Methoden und zeitabhängiger Dichtefunktionaltheorie (TDDFT) angewandt, um geeignete Modellhamiltonians zu parametrisieren, welche schließlich mittels der Multi-Configurational Time-Dependent Hartree (MCTDH) und der Multilayer (ML-MCTDH) variante propagiert wurden. Die MCTDH Methode hat sich als geeignete Methode erwiesen um eine voll quantendynamische Beschreibung von bis zu 100 Freiheitsgraden durchzuführen; die ML-MCTDH Methode erlaubt gar bis zu 1000 Freiheitsgrade quantendynamisch zu behandeln. Die Parametrisierung der Modellhamiltonians, auf welchen die quantendynamische Behandlung basiert, wurde dabei für kleine, jedoch repräsentative Fragmente durchgeführt. Die geeignete Wahl dieser Fragmente sollte sicherstellen, dass zum einen alle relevanten intermolekularen als auch intramolekularen Wechselwirkungen enthalten sind, jedoch gleichzeitig eine möglichst akkurate Beschreibung mittels high-level elektronenstrukturtheoretischer Methoden in gegebener Zeit möglich ist.
Mit Hilfe dieser Methodenkombination wurden zwei Arten von funktionellen organischen Materialien untersucht. Das erste untersuchte System ist ein neuartiges Donor-Akzeptor System, bestehend aus selbstorganisierenden Oligothiophen-Perylenediimid Dimeren, welche in der Gruppe von S. Haacke und S. Mery der Universität Straßburg synthetisiert und spektroskopisch untersucht wurden. Die quantendynamischen Simulationen an diesem System sollten die Ergebnisse der experimentellen, zeitaufgelösten pump-probe Spektroskopie validieren und die dürftige Effizienz im Hinblick auf eine effektive Ladungstrennung erklären. Dabei konnte gezeigt werden, dass nach der Exzitonendissoziation Elektron und Loch auf räumlich benachbarten Donor- und Akzeptorfragmenten lokalisiert werden, was schließlich zu einem Rekombinationsprozess führen wird. Das zweite untersuchte System ist eine Kombination von Poly(3-Hexylthiophen-2,5-diyl) (P3HT) als Elektronendonor und [6,6]-Phenyl-C61 Butansäure Methyl-Ester (PCBM) als Elektronenakzeptor, welches schon hinreichend stark in diversen theoretischen und experimentellen Studien untersucht wurde. Aufbauend auf einem Gittermodell, welches in unserer Gruppe entwickelt wurde, wurde das Modellsystem um Charge Transfer Exzitonen in der Donordomäne erweitert. Die Bedeutung von solchen Charge Transfer Exzitonen in regioregulären Oligothiophenaggregaten ist ein aktuelles Thema in der Wissenschaft, sowohl in experimentellen aber auch theoretischen Abhandlungen. Neben der theoretischen Beschreibung zur Entstehung solcher Charge Transfer Exzitonen liegt ein besonderes Augenmerk auf dem Einfluss dieser predissoziierten Elektron-Loch Paaren auf die Ladungsseparationsdynamik zwischen Donor und Akzeptor sowie die Generierung von freinen Ladungsträgern. Dieser Aspekt der Ladungsseparation in einem P3HT-PCBM System wurde in dieser Art und Weise in dieser Arbeit zum ersten mal untersucht.
Neben dem zuvor erwähnten Donor-Akzeptor System erster Generation der Universität Straßburg wurde eine zweite Variante dieses Systems entwickelt, welches sich bei bisherigen experimentellen Untersuchungen als wesentlich effizienter erwies. Der interessante Prozess der Ladungsseparation ist dabei allerdings auf einer Zeitskala von mehreren hundert Pikosekunden angesiedelt, sodass kinetische Monte Carlo Methoden verwendet werden mussten um diese Prozesse zu modellieren. Dazu wurde ein Fortran90 Code entwickelt, welcher den First Reaction Method Algorithmus verwendet und explizite Delokalisationsprozesse behandelt, welche in dieser Form in kommerziellen Programmpaketen nicht enthalten ist. In vorangehenden Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Delokalisation von Exzitonen zu einer effektiven Herabsetzung der energetischen Barriere der Ladungsseparation führt und somit die Effizienz zur Stromumwandlung gesteigert werden konnte. Erste Simulationen mit diesem Code an idealisierten und zufällig generierten Donor-Akzeptor Morphologien lieferten realistische Werte für makroskopische Observablen wie Ladungsträgermobilitäten. Weiterhin wurden Simulationen einer coarse-grained Struktur zur zweiten Generation des Donor-Akzeptor Systems durchgeführt, ebenfalls mit Hinblick zur Untersuchung der Ladungsträgermobilität.
Die Entstehung von Leukämien steht meist im Zusammenhang mit chromosomalen Translokationsereignissen, bei denen vor allem das MLL (Mixed Lineage Leukemia)-Gen auf Chromosom 11q23 involviert ist. Die häufigste Translokation, die eine Akute Lymphatische Leukämie (ALL) bei Kleinkindern auslöst, stellt die t(4;11)-Translokation dar. Die Rekombination der Chromosomen 11 und 4 führt hierbei zur Entstehung der beiden Fusionsproteine MLL-AF4 und AF4-MLL. Bisherige Studien, die den Krankheitsmechanismus hinter dieser ALL-Form untersuchten, identifizierten eine charakteristische Überexpression der HOXA-Gene als einen besonderen Treiber dieser Krankheitsentstehung. Durch die Deregulierung des HOX-Clusters durch das chimäre MLL-AF4-Protein wird ein Differenzierungs- und Apoptoseblock induziert und eine stetige Proliferation der Zellen gefördert. Arbeiten von Trentin et al. (2009) klassifizierten eine Subgruppe von t(4;11)-Patienten, die, im Gegensatz zu den bisher charakterisierten ALL-Leukämien, eine Reprimierung ihrer HOXA-Cluster aufwiesen und mit einer schlechteren Prognose assoziiert waren. Das Genexpressionsprofil dieser HOXAlow-Patienten sprach für einen neuen Krankheitsmechanismus. Allen HOXAlow-Patienten war zudem gemein, dass sie eine Überexpression des Transkriptionsfaktors IRX1 aufwiesen. Die Relevanz dieses Transkriptionsfaktors im Kontext einer t(4;11)-Leukämie wurde durch diese Doktorarbeit genauer untersucht. Durch Vorarbeiten mit transient exprimiertem IRX1 in HEK293T-Zellen wurde eine DNA-Microarray-Analyse durchgeführt, durch die ein Genexpressionsprofil (GEP) dieser Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen (mit dem Leervektor transfiziert) erstellt wurde. Dies schuf die Grundlage für die Durchführung weiterer Experimente, die mit Hilfe von RT-PCR-, Chromatin-Immunpräzipitations-, Co-Immunpräzipitations- und Western Blot-Versuchen den Effekt und das Verhalten des IRX1-Proteins im Zusammenhang mit MLL-AF4, bzw. die Funktion von IRX1 alleine, charakterisieren sollten. Es zeigte sich, dass IRX1 eine Reprimierung der HOXA-Gene induziert und dieser Effekt über den aktivierenden Effekt des chimären MLL-AF4-Proteins dominiert. Dies geschah jedoch auf zwei unterschiedliche Wege, da zum einen das IRX1 in der Abwesenheit von MLL-AF4 nicht direkt an die HOXA-Gene binden kann und zum anderen durch MLL-AF4 eine Inkorporation des IRX1 in den Multiproteinkomplex des chimären Onkoproteins stattfindet und IRX1 dadurch direkt an die HOXA-Promotoren gelangt. Zudem wurden weitere direkte und indirekte Zielgene des IRX1 identifiziert. Zu ihnen zählen MEIS1, HOXB4 und EGR1-3. Durch die Erweiterung der Versuche durch Behandlungen mit dem pan-HDAC-Inhibitor Trichostatin A konnte belegt werden, dass MLL-AF4 vom Promotor seiner Zielgene dissoziiert und durch das endogene wt-MLL ersetzt werden kann. Trotz der inhibitorischen Wirkung des IRX1 auf das MLL-AF4 verursacht es eine Stabilisierung des MLL-AF4 an den Promotoren seiner Zielgene, was eine Dissoziation des Komplexes durch TSA verhindert. Die Applikation von TSA führt unabhängig von der vorherigen Konstitution (±IRX1) aber auch zu einer Normalisierung der HOXA-Expression. Die vorgelegten Daten verdeutlichen, dass IRX1 kausal für das GEP der HOXAlow-Patienten verantwortlich ist und durch seine Anwesenheit wichtige Regulatoren der Differenzierung und der Zellzyklusregulierung gestört werden. Zudem wurde der Benefit einer Histondeacetylaseinhibitor (HDACi)-Behandlung bei dieser Patientenkohorte hervorgehoben, da der inhibierende Effekt des IRX1 auf die HOXA-Gene aufgehoben und das wt-MLL in seiner Funktionsfähigkeit nicht beeinträchtigt wurde. Die Relevanz des IRX1 im Kontext einer t(4;11)-Leukämie wurde somit aufgeklärt und ein neuer Krankheits-mechanismus der HOXAlow-Patientenkohorte definiert. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Etablierung eines Transfektionsprotokolls, um eine stabile Integrationen der Sleeping Beauty-Konstrukte in t(4;11)-Suspensionszellen zu ermöglichen. Bisher war es nur über lentivirale Methoden möglich, diese Zellen genetisch zu manipulieren. Durch die hier vorgestellte Methode können nun SEM-Zellen (B-Zell-Vorläuferzellen einer ALL mit t(4;11)) über Elektroporation stabil transfiziert und anschließend über Selektion zu einer homogenen Zellpopulation positiv transfizierter Zellen herangezogen werden. Hierdurch wird eine Übertragung bisheriger Methoden in ein leukämisches Zellsystem möglich, wodurch genetische Manipulationen in einer physiologischen Umgebung getestet werden können, ohne in S2-Laboratorien arbeiten zu müssen.