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Identifizierung und Charakterisierung neuer Inhibitoren der C2-ähnlichen Domäne der 5-Lipoxygenase
(2011)
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) katalysiert die ersten beiden Schritte der Leukotrien (LT)-Biosynthese (Samuelsson et al., 1987). Das Substrat Arachidonsäure (AA) wird im ersten Schritt zu einem Fettsäurehydroperoxid, der 5(S)-Hydroperoxy-6-trans-8,11,14-cis-Eikosatetraensäure (5-HpETE) oxidiert. Durch Dehydrierung entsteht im zweiten Reaktionsschritt das instabile Epoxid LTA4. Weiter wandeln zwei Synthasen das LTA4 zum einen in LTB4 oder zum anderen in die Cysteinyl-LTs C4, D4 und E4 um (Samuelsson et al., 1987). Die 5-LO wird in Zellen myeloiden Ursprungs exprimiert und kommt vor allem in reifen Leukozyten vor.
LTs spielen eine wichtige Rolle bei der angeborenen Immunantwort und vermitteln vor allem entzündliche und allergische Reaktionen (Funk 2001; Peters-Golden & Henderson, 2007). Asthma bronchiale, kardiovaskuläre Erkrankungen wie Atherosklerose, Osteoporose oder verschiedene Krebsarten werden im Zusammenhang mit der 5-LO untersucht (Werz & Steinhilber, 2006). Die Inhibition der LT-Biosynthese oder die Senkung der LT-Spiegel stellt eine Möglichkeit dar, den entzündungsfördernden Eigenschaften entgegenzuwirken. Inhibitoren der LT-Biosynthese lassen sich in indirekte und direkte 5-LO-Inhibitoren gliedern. Zu den indirekten 5-LO-Inhibitoren zählen FLAP-Antagonisten (Young, 1991; Evans et al., 2008) sowie CysLT1-Rezeptorantagonisten (Darzen, 1998). Von den vier Gruppen der direkten 5-LO-Inhibitoren (redoxaktive, Eisenligand-, nichtredox- sowie diverse Inhibitoren (Pergola & Werz, 2010)) ist bisher nur Zileuton (Carter et al., 1991), ein Eisenligand-Inhibitor, als Wirkstoff zur Behandlung von Asthma bronchiale in den USA zugelassen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die neuartige Klasse der Imidazo[1,2-a]pyridine hinsichtlich ihrer 5-LO-Inhibition, ihrer Löslichkeit sowie ihrer Effekte auf die Zellviabilität zu evaluieren und zu optimieren. Dabei stand das Verständnis der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung im Fokus. Ausgehend von Substanz A14, der potentesten Substanz eines virtuellen Screenings nach dualen COX/5-LO-Inhibitoren (Hofmann et al., 2008), wurden 78 Substanzen in ionophor-stimulierten intakten polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) sowie im zellfreien System, dem Überstand nach 100.000 × g Zentrifugation (S100) von homogenisierten PMNL, bezüglich ihrer inhibitorischen Aktivität untersucht. Die Effekte auf die Zellviabilität nach Inkubation mit den Substanzen für 48 h auf die humane leukämische Monozytenvorläufer Zelllinie U937 wurden mit Hilfe eines WST-Assays, der die mitochondriale Aktivität misst, sowie eines LDH-Assays, zur Bestimmung der Freisetzung von LDH als Folge von Nekrose, evaluiert.
Innerhalb der Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) der 78 Derivate konnte kein eindeutiges Substitutionsmuster, das sowohl in intakten PMNL als auch in zellfreiem S100 zu den gleichen Schlüssen führt, festgestellt werden. Ausgehend von Substanz A14 konnte die inhibitorische Aktivität verbessert werden, wobei Substanzen mit nanomolaren IC50-Werten in beiden Assaysystemen resultierten. Die Substanzen lassen sich in drei strukturelle Teile gliedern: Einen oberen Teil am sekundären Amin, ein bizyklisches N-fusioniertes Imidazopyridin (Teil A) sowie einen Teil B am aromatischen Kern. Nur für den oberen Teil ließ sich ein allgemein-gültiges Substitutionsmuster feststellen. Am sekundären Amin führen in intakten PMNL größere Substituenten zu einer Verbesserung der inhibitorischen Aktivität, wobei dies bis zu einer Cyclohexylgruppe gilt und eine Adamantyl-Substitution eine Ausnahme bildet. Allgemein lässt sich feststellen, dass bei einer Cyclohexylgruppe am sekundären Amin und einer Methylgruppe an Position 6 in Teil A, die Substituenten in Teil B stark variieren können, ohne an inhibitorischer Aktivität zu verlieren. Werden innerhalb des oberen Teils oder in Teil A die Substituenten polarer, sind in Teil B weniger Variationen möglich. Es werden insbesondere lipophile Reste toleriert. Beim Versuch, die Löslichkeit zu verbessern, zeigte sich, dass ein Gleichgewicht zwischen polaren und unpolaren Substituenten vorliegen muss. Auch die Einflüsse der Substituenten auf die Zellviabilität konnten nicht einem allgemein-gültigen Muster unterworfen werden. Mit Substanz 15 konnte ein Derivat identifiziert werden, das verglichen mit der Ausgangssubstanz A14 eine verbesserte inhibitorische Aktivität aufweist (IC50-Werte von 0,16 µM (PMNL) und 0,1 µM (S100)), löslicher ist (clogP-Wert von 4,6) und keine Nekrose auslöst. Weiter zeigten auch die Substanzen 31 und 50 eine Verbesserung der inhibitorischen Aktivität (IC50-Werte von 0,26 µM bzw. 0,58 µM (PMNL) und 0,8 µM bzw. 0,16 µM (S100)) ohne Nekrose auszulösen, wobei Substanz 50 zusätzlich eine verringerte Lipophilie (clogP-Wert von 4,2) aufweist. Substanz 76 ist mit einem IC50-Wert von 6 nM die im zellfreien System aktivste Substanz unter den 78 getesteten Derivaten.
Ein vielversprechender Vertreter dieser neuartigen Klasse der Imidazo[1,2-a]pyridine, Substanz 15 (EP6), wurde in verschiedenen Assaysystemen charakterisiert. EP6 ist ein hochwirksamer Inhibitor der 5-LO mit einem IC50-Wert von 0,16 µM in intakten PMNL und weist im zellfreien S100 von PMNL einen IC50-Wert von 0,1 µM, am partiell gereinigten Enzym einen IC50-Wert von 0,05 µM auf. Die vergleichbare inhibitorische Aktivität in intakten Zellen sowie im zellfreien System lässt auf eine direkte Inhibition der 5-LO schließen. Die Zugabe der allosterischen Faktoren ATP oder Calcium hat keinen Einfluss auf die Potenz von EP6. Auch ist die Inhibition nicht vom Redoxzustand der Zelle abhängig, wie im Falle bekannter nichtredox-Inhibitoren (Werz et al., 1998). Die Zugabe von steigenden Mengen an exogenem Substrat AA zu S100 von PMNL führt zu keiner Beeinträchtigung der Potenz von EP6, was im Vergleich zu den nichtredox-Inhibitoren einen Vorteil bei entzündlichen Prozessen mit erhöhten Lipidhydroperoxid-Spiegeln darstellt. Bei ionophor-stimulierten PMNL ohne die Zugabe von exogenem Substrat resultiert ein sechsfach höherer IC50-Wert von 1,2 µM, der auf eine allosterische Inhibition durch EP6 hinweist, bei der Substrat in ausreichenden Mengen vorliegen muss, damit EP6 mit dem 5-LO-AA-Komplex interagieren kann. Darüber hinaus inhibiert EP6 die LT-Bildung unabhängig von der Art der 5-LO-Stimulation bei einer Zugabe von 20 µM exogener AA. Der physiologische Stimulus in PMNL über N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) führt zu einem höheren IC50-Wert von 0,76 µM mit Zugabe von 20 µM AA und bestätigt die Ergebnisse von ionophor-stimulierten PMNL ohne Zugabe von exogenem Substrat. Für EP6 konnte weiterhin eine allosterische Bindestelle an der C2-ähnlichen Domäne der 5-LO postuliert werden. Die Zugabe von Phosphatidylcholin führte zu einer verminderten inhibitorischen Aktivität. Durch Experimente mit einer Mutante der 5-LO, bei der die Tryptophane, welche die Membranbindung vermitteln, ausgetauscht sind (3W-Mutante), konnte die Interaktion dieser Aminosäuren mit EP6 gezeigt werden. Über einen Kompetitionsassay mit der C2-ähnlichen Domäne, Mutations- und Docking-Studien, wurden die Aminosäuren Y81, Y100 und Y383 des Interfaces der beiden Domänen der 5-LO als essentiell für die Bindung identifiziert. Somit zählt EP6 als Vertreter der Klasse der Imidazo[1,2-a]pyridine neben Hyperforin und AKBA zu den einzigen mit der C2-ähnlichen Domäne interagierenden 5-LO-Inhibitoren.
EP6 ist ein selektiver Inhibitor der 5-LO, der die 15-LO1, 15-LO2 und 12-LO nicht inhibiert. Weiterhin werden drei weitere Enzyme der AA-Kaskade, die Cyclooxygenase-1 und -2 sowie die mikrosomale Prostaglandin E2 Synthase-1 nicht durch EP6 beeinflusst. Neben der humanen 5-LO wird auch die murine 5-LO, in intakten RAW 264.7 Zellen und deren S100 getestet, mit niedrig mikromolarem bzw. nanomolarem IC50-Wert inhibiert, was die erste Voraussetzung für potentielle in vivo Studien darstellt.
Die Inhibition der 5-LO-Produktbildung in humanem Vollblut konnte jedoch bis zu einer Konzentration von 30 µM EP6 nicht gehemmt werden. EP6 ist lipophil (clogP-Wert von 4,6) und weist eine hohe Plasmaproteinbindung (Bindung an humanes Serumalbumin von 97,5 ± 0,7% bei 10 µg/ml EP6) auf, was die Unwirksamkeit in humanem Vollblut erklären könnte.
Abschließend wurden die Effekte von EP6 auf die Zellviabilität untersucht. Die Experimente wurden zunächst in U937 bei einer Inkubationszeit von 48 h mit einer maximalen Konzentration von 30 µM EP6 durchgeführt. EP6 führt zu keinen unmittelbaren zytotoxischen Effekten innerhalb der Inkubationszeit der in dieser Arbeit durchgeführten Aktivitätsassays (gezeigt in PMNL). Weiter wurde jedoch gezeigt, dass die mitochondriale Aktivität nach Inkubation für 48 h mit einem EC50-Wert von 14 µM beeinträchtigt wird (WST-Assay). Dieser Effekt ist jedoch nicht auf Nekrose zurückzuführen, da die gemessene Konzentration an freigesetztem LDH gering bleibt. Über ein Langzeitexperiment wurde die Abnahme der Lebendzellzahl nach Inkubation mit 30 µM EP6 nach 24 h festgestellt. Über Detektion von PARP-Spaltung, einem Marker für späte Apoptose, stellte sich heraus, dass EP6 in U937 Apoptose induziert. Zusätzlich zu den Untersuchungen der leukämischen Zelllinie wurden humane nicht-tumor Zellen (RPE) im Langzeitexperiment sowie im BrdU-Assay untersucht. EP6 beeinträchtigt die Lebendzellzahl der nicht-tumor Zelllinie RPE nicht und führt nur zu geringen antiproliferativen Effekten.
Der gezielte, effiziente Aufbau komplexer Struktureinheiten, die mehrere Stereozentren besitzen, ist bis heute eine der größten Herausforderungen in der organischen Synthese. Gerade hinsichtlich der Wirkstoffentwicklung ist es von großer Bedeutung alle möglichen Stereoisomere einer Verbindung zugänglich zu machen. Die 1,3-Diamin-Struktureinheit ist Bestandteil interessanter Naturstoffe, biologisch aktiver Substanzen oder chiraler Liganden. Zusammenfassend konnte erfolgreich eine neue hoch modulare, stereokonvergente, Enamid/Acylimin-basierte Methode zur Synthese von 1,3-Diaminen mit drei fortlaufenden Stereozentren entwickelt werden. Diese Route bietet Zugang zur kompletten Tetrade möglicher Diastereomere, ausgehend von einfach zugänglichen Startmaterialien. Die Konfiguration der beiden zuerst gebildeten Stereozentren kann durch die Enamid-Geometrie kontrolliert werden ((E) -> 1,2 anti, (Z) -> 1,2-syn-Konfiguration). Die 2,3 Konfiguration kann hingegen über die geschickte Wahl der Reagenzien und den damit assoziierten Reaktionsbedingungen gesteuert werden. Weiterhin konnte eine Bi(OTf)3-katalysierte Ein-Topf-Sequenz zur diastereoselektiven Synthese von 1,2-anti-2,3-anti-1,3-Diaminen 6 etabliert werden. Darüber hinaus konnte die Synthese der N,O-Acetale, als auch die der Enamide optimiert und bzgl. der Synthesen im Multigrammmaßstab verbessert werden. Die N,O-Acetale konnten erfolgreich aus Amiden, Aldehyden und Alkoholen dargestellt werden. Die Enamide wurden unter Zuhilfenahme luftunempfindlicher Ni-Katalystoren aus Allylamiden mittels Isomerisierung zugänglich gemacht.
Der 2‘-Desoxyguanosin-Riboschalter gehört zur unter Bakterien weit verbreiteten Klasse der Purin-Riboschalter. Allerdings wurden 2‘-Desoxyguanosin-bindende Riboschalter bisher ausschließlich in M. florum gefunden, damit stellt diese RNA eine Ausnahme unter den ansonsten verbreiteten Purin-Riboschaltern dar. In der vorliegenden Arbeit wurde ein NMR-Strukturmodell des IA-Aptamer-2‘-Desoxyguanosinkomplexes erstellt und anhand der mittels NMRSpektroskopie zugänglichen strukturellen Informationen sowohl Struktur und Dynamik des freien RNA-Aptamers als auch des 2‘-Desoxyguanosinkomplexes charakterisiert. Dabei wurde insbesondere der Einfluss von Mg2+ auf Struktur und Dynamik der jeweiligen Zustände sowie auf den durch 2‘-Desoxyguanosin induzierten Faltungsprozess untersucht.
Mg2+-Ionen modulieren die Faltungstrajektorien von sensorischen RNA-Domänen. Die Übertragbarkeit von Mg2+-abhängigen Charakteristika der RNA-Faltung innerhalb verschiedener Messmethoden ist durch die schlechte Vergleichbarkeit der relativen Konzentrationsverhältnisse eingeschränkt. Die NMR-spektroskopisch beobachtbaren Mg2+-Einflüsse sollten also unter besonderer Berücksichtigung der für NMR benötigten vergleichsweise sehr hohen RNAKonzentrationen mit Ergebnissen aus kalorimetrischen oder fluoreszenzspektroskopischen Messungen interpretiert werden. Die in der NMR-Spektroskopie üblichen hohen Probenkonzentrationen befinden sich in dem Regime, in dem auch der physikalische Effekt des verdrängten Volumens eine Rolle zu spielen beginnt. Demnach ist es für die RNA-Moleküle im NMR-Probenröhrchen bei Konzentrationen von 5-10 mg/ml auch ohne Zugabe von Mg2+ entropisch günstiger, kompakte Konformationen einzunehmen. Die Relevanz des Effekts des verdrängten Volumens für die RNA-Faltung unter NMR-Bedingungen und unter zellulären Bedingungen ist Gegenstand der aktuellen Forschung und wird in dieser Arbeit am Beispiel des IA-Aptamers diskutiert.
Der oft einzigartige Bindungsmodus ubiquitärer Metaboliten durch bakterielle Riboschalter (Montange and Batey, 2006) ermöglicht prinzipiell den Einsatz von RNA-Aptameren in vivo, ohne mit zellulären Proteinsystemen zu interferieren (Mulhbacher et al., 2010). Therapeutische Ziele sind beispielsweise die Anwendung von Riboschaltern gegen bakterielle Pathogene beziehungsweise gegen pathogene Bakterien selbst. Eine weitere Rolle wird RiboschalterElementen zukünftig als Bausteine in der synthetischen Biologie zukommen (Dixon et al., 2010; Knight, 2003; Topp and Gallivan, 2008). Hierfür ist es von grundlegender Bedeutung, Charakterisierung von Struktur als Basis für das Verständnis von Funktion unter zellulären Bedingungen zu etablieren. Im Rahmen einer Zusammenarbeit mit Robert Hänsel aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Volker Doetsch wurde am Beispiel des IA-Aptamers und einer nichtnatürlichen Sequenzvariante gezeigt, dass eine strukturelle Charakterisierung von Riboschaltern mittels in cell NMR-Spektroskopie möglich ist. In Zusammenarbeit mit Karl von Laer aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Beatrix Suess wurden beide RNA-Aptamer hinsichtlich ihrer Funktion in einem biologischen Assay getestet. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten eine deutliche Korrelation von Struktur und Funktion in vivo, während Diskrepanzen zwischen Struktur in vitro und Funktion in vivo demonstriert werden.
Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass eine gewisse strukturelle Flexibilität der Bindungstaschen regulatorischer RNA-Motive für Selektion und Adaption während Evolution nötig ist. Beispielsweise wurde für den Guanin-Riboschalter gezeigt, dass der nicht-native Ligand 2‘-Desoxyguanosin zur Komplexbildung des Aptamers führt. Demnach könnte die Bindung von 2‘-Desoxyguanosin im Guanin-Riboschalter bereits evolutionär angelegt sein und die Entstehung des IA-Aptamers nach Genomreduktion der Mesoplasmen begünstigt haben. Das IA-Aptamer dagegen bindet Guanin nicht, stattdessen besitzt M. florum auf Guanin spezialisierte Sequenzvarianten dieses Riboschalters (Kim et al., 2007). Strukturell hochauflösende Einblicke in unterschiedliche Zustände der Bindungstasche im G-Aptamer-Thioguaninkomplex, die durch die Lösung der Kristallstruktur des GLoop-Aptamers ermöglicht wurden, unterstützen die Hypothese einer anpassungsfähigen Bindungstasche im G-Aptamer. Für B. subtilis wäre es interessant, die physiologische Bedeutung der Komplexbildung des G-Aptamers mit 2‘-Desoxyguanosin zu untersuchen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, MALDI-Massenspektrometrie als robuste Analysenmethode für die quantitative Analyse niedermolekularer Verbindungen aus komplexen biologischen Matrizes zu etablieren. Zu Beginn der Arbeit wurden drei typische Fragestellungen im Bereich der Lebensmittelanalytik, der medizinischen Forschung und der klinischen Chemie ausgewählt, um die Methodik anhand dieser Modellsysteme zielgerichtet zu entwickeln und zu bewerten. Für jede dieser Fragestellungen wird routinemäßig ein hoher Probendurchsatz verlangt und damit werden hohe Anforderungen an die Probenvorbereitung gestellt, da diese einfach, schnell, reproduzierbar, Matrix-tolerant und automatisierbar sein muss um die Weiterentwicklung zur Hochdurchsatzanalytik zu erlauben.
Der quantitative Nachweis von Melamin und seinen Derivaten wurde aufgrund des Aufkommens von Milchprodukten, die mit diesen Verbindungen kontaminiert waren, ein wichtiger Bestandteil der Analytik dieser Lebensmittel. Insbesondere an diesem Beispiel zeigte sich der Vorteil des Einsatzes von MALDI-Massenspektrometrie zur Analyse kleiner Moleküle. Aufgrund der höheren Toleranz gegenüber Puffern und Salzen konnte die Probenvorbereitungszeit der für die FDA entwickelten Methode zur Quantifizierung von Melamin in Milchpulver mittels LC-ESI von ca. 140 min auf 90 min reduziert werden, da auf die zeitaufwendige Flüssigchromatographie verzichtet werden konnte. So wurde Melamin mit einem LLOQ von 0,5 ppm quantifiziert, was unterhalb der Vorgaben der WHO (2,5 ppm in Milichpulver und 1 ppm in Babynahrung) lag. Cyanursäure, ein Derivat von Melamin welches für die Bildung schwerlöslicher Komplexe in der Niere mitverantwortlich gemacht wird, konnte ebenfalls mit der entwickelten MALDI-MS Methode quantifiziert werden. Allerdings war die ermittelte Bestimmungsgrenze mit 15 ppm um den Faktor 30 schlechter als bei Melamin. Die Nachweisgrenze bei MALDI-MS ist stark von der MALDI-Matrix abhängig und die Verwendung von Sinapinsäure war eine gute Kompromisslösung, um die Analyten in einem Spot im positiven und negativen Reflektormodus zu analysieren. Allerdings wurde diese Matrix zur Analyse von Analyten im positiven Reflektormodus entwickelt. Bislang wurden nur wenige Matrizes für MALDI-MS im negativen Reflektormodus beschrieben, um z.B. Säuren besser nachweisen zu können. Forschung in diesem Bereich wird neue Möglichkeiten zur Detektion negativ geladener kleiner Moleküle ergeben.
Des Weiteren wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Lösungen für klinische Fragestellungen wie etwa den Nachweis von Methylphenidat im Plasma und Gehirn von Ratten oder der Dried Blood Spot Analytik entwickelt. Bei beiden Methoden wurde jeweils nur eine einfache Flüssig-Flüssig-Extraktion zur Probenvorbereitung angewendet und sie ließen sich sehr gut auf Realproben übertragen.
Methylphenidat konnte im Plasma im Konzentrationsbereich von 0,1-40 ng/mL und im Hirnhomogenat im Konzentrationsbereich von 0,4-40 ng/mL quantifiziert werden, was gut im Konzentrationsbereich der Realproben von mit Methylphenidat gefütterten Ratten lag. Dazu standen das Plasma und die Gehirne von fünf Ratten zur Verfügung. Es wurde eine lineare Korrelation zwischen der MPH-Konzentration im Gehirnhomogenat und im Plasma gefunden, was basierend auf den bis dato bekannten Literaturergebnissen ein zu erwartendes Ergebnis war, aber zukünftig mit einer größeren Anzahl von Versuchstieren verifiziert werden sollte. Während der Methodenentwicklung war auch bei diesem Projekt die Auswahl der MALDI-Matrix ausschlaggebend für den Erfolg der Messungen. Im MALDI-Massenspektrum interferierte das Signal des Natriumaddukts von CHCA mit dem Signal von MPH. Für dieses Problem kamen zwei mögliche Lösungen in Betracht. Erstens die Quantifizierung mit ClCCA als MALDI-Matrix, da hier keine Interferenzen auftraten. In ersten Vorversuchen konnte MPH so in einem Konzentrationsbereich von 1-48 ng/mL mit einer exzellenten Linearität von R2=0,9992 quantifiziert werden. Eine zweite mögliche Problemlösung war die Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie. Hierzu wurden Fragmentionen-Massenspektren der überlagerten Signale aufgenommen. MPH und der verwendete interne Standard MPH-d9 zeigten dabei spezifische Fragmentionensignale, über die quantifiziert wurde. Da die Sensitivität um den Faktor 100 im Vergleich zu MS-Spektren von CHCA und ClCCA gesteigert werden konnte, wurde die weitere Methodenentwicklung basierend auf der Tandem-Massenspektrometrie mit der MALDI-Matrix CHCA durchgeführt. Überdies sind MS/MS-Versuche unter Verwendung von ClCCA als MALDI-Matrix für kleine Moleküle sehr erfolgsversprechend und sollten in weiteren Forschungsarbeiten durchgeführt werden.
Die Dried Blood Spot Technik als alternative Probenvorbereitung bietet eine Reihe von Vorteilen, wie etwa den einer einfacheren Lagerung und eines einfacheren Transports einer großen Menge von Proben. Darüber hinaus werden nur wenige Mikroliter Blut verwendet, was vorteilhaft ist bei z B. klinischen Studien oder dem Therapeutic Drug Monitoring. Diese Art der Probennahme ist somit eine perfekte Ergänzung für weitere quantitative Analysen von Methylphenidat in Rattenblut. Den Ratten würden nur wenige Mikroliter Blut entnommen werden, was ihr Überleben sichert und der Transport der Proben auf dem Postweg wäre wesentlich einfacher. Um eine allgemein verwendbare DBS-MALDI-MS-Methode zu entwickeln, wurden neben Methylphenidat auch bekannte Analyten aus dem Bereich des Dopings sowie Lamotrigin, Coffein und Theophyllin als Beispiele für das Therapeutic Drug Monitoring verwendet. Es wurden verschiedene Lösungsmittel zur Extraktion eingesetzt, wobei sich eine Kombination aus Methyl-tert-Butylether und Ethanol, sowie Aceton als am besten geeignet erwies. Einige Analyten wie Coffein, Theophyllin und Lamotrigin wurden bis zu einer Konzentration von 0,5 μg/mL quantifiziert. Diese Bestimmungsgrenze ist bei Analyten aus dem Bereich des Dopings wie z.B. Salbutamol, Methylphenidat oder Clenbuterol, deren therapeutisch wirksame Plasmakonzentration im Bereich von wenigen Nanogramm pro Milliliter Blut liegt, um den Faktor 15-500 zu hoch. Diese Analyten waren bis zu einer Konzentration von 5 μg/mL im Blut mittels MALDI-MS problemlos nachweisbar. Um die Sensitivität zu erhöhen, ist es allerdings sinnvoll, die Extraktion zukünftig für die einzelnen Analyten zu optimieren, sie mittels Festphasenextraktion oder LC anzureichern und MS/MS-Spektren aufzunehmen. Für die Analyten Coffein, Theophyllin und Lamotrigin, deren therapeutisch wirksame Plasmakonzentration im ein- bis zweistelligen Mikrogramm-pro-Milliliter Bereich liegt, eignete sich die entwickelte Methode sehr gut. Es wurde eine Methodenvalidierung durchgeführt, wobei die validierten Parameter den Vorgaben der FDA entsprachen.
Da die Auswahl der MALDI-Matrix bei den verschiedenen Methodenentwicklungen jeweils ein kritischer Faktor war, wurden abschließend eine Auswahl von Analyten mit einer Molekülmasse bis ca. 600 Da mit verschiedenen MALDI-Matrizes präpariert. Ein Großteil der Analyten wurde am sensitivsten mit ClCCA nachgewiesen. Im Rahmen dieser Versuche wurde auch erstmals ein Strukturanalogon von ClCCA, und zwar ClCCA-Tetrazol, als alternative MALDI-Matrix eingesetzt, bei welchem die Carboxylgruppe durch einen Tetrazolring ausgetauscht wurde. Diese zeigte eine sehr homogene Kristallisation und für einige Analyten eine bis zu Faktor 3 höhere Signalintensität im Vergleich zu ClCCA. Außerdem war auffällig, dass einige Analyten unter bestimmten Präparationsbedingungen wie z B. der Graphite Supported Preparation sensitiver mittels MALDI-MS nachweisbar waren. Bei anderen Analyten verschlechterten sich die Analysenergebnisse. Graphit verändert stark die Kristallisation der MALDI-Matrix und es wird vermutet, dass sich dies auf den Einbau der Analyten in die Matrixkristalle auswirkt. Es konnte bislang aber noch nicht abschließend geklärt werden, wie genau die Präparation der Proben Einfluss auf den Einbau der Analyten in die Matrix nimmt. Eine Untersuchung dieser Phänomene sollte daher Gegenstand weiterer Forschungsprojekte sein.
Zusammenfassend stellt die MALDI-Massenspektrometrie eine schnelle und robuste Methode zur Quantifizierung einer Vielzahl kleiner Moleküle in komplexen biologischen Matrizes dar.
Die Modulation molekularer Systeme mit Licht ist ein in den letzten Jahren immer stärker untersuchtes Forschungsgebiet. Es existiert bereits eine große Anzahl an Publikationen, die mittels statischer Spektroskopie und anderer statischer Methoden Einblicke in die ablaufenden Prozesse gewähren konnten. Untersuchungen im Ultrakurzzeitbereich sind jedoch eher selten, liefern aber detaillierte Informationen zu den ablaufenden Prozessen. Den Wissensstand diesbezüglich zu erweitern, war Ziel dieser Dissertation.
Untersucht wurden neun photoschaltbare, molekulare Dyaden hinsichtlich ihrer Dynamik nach Photoanregung. Die Dyaden setzten sich aus einem Fluorophor (Bordipyrromethen, BODIPY), einem Photoschalter (Dithienylethen, DTE; offen oder geschlossen) und gegebenenfalls einer COOH-Ankergruppe zusammen.
Die Unterschiede in den Molekülstrukturen bestanden in der Verknüpfung der einzelnen Bauteile (kurze oder lange, beziehungsweise gerade oder gewinkelte Brücke) und der Art des Fluorophors und des Photoschalters (jeweils zwei verschiedene Strukturen).
Durch Belichtung mit UV- oder sichtbarem Licht konnten photostationäre Zustände generiert werden, die 40 – 98 % geschlossenes Isomer (je nach Molekül) beziehungsweise 100 % offenes Isomer enthielten.
Unter Verwendung von Licht verschiedener Wellenlängen konnten beide Teile der Dyade (BODIPY beziehungsweise DTE) separat angeregt und hinsichtlich der ablaufenden Photodynamik untersucht werden, wobei der Fokus der Arbeit auf transienten Absorptionsmessungen mit Anregung des BODIPY lag. Bei einem Großteil der untersuchten Moleküle kam es in diesem Fall, je nach Zustand des Photoschalters, zu einem intramolekularen Energietransfer nach der Theorie von Theodor Förster. Durch diese Energietransferprozesse kommt es zu einer drastischen Verkürzung der Lebenszeit des angeregten Zustands des BODIPY. Ausgehend von Lebenszeiten im Bereich von Nanosekunden im Falle der offenen Dyaden (entspricht der Fluoreszenzlebensdauer) reduziert sich die Lebenszeit auf wenige Pikosekunden, beziehungsweise je nach Aufbau des Moleküls sogar noch weiter. Die unterschiedlich schnellen Transferprozesse sind im Sinne der Förster-Theorie durch die unterschiedlichen Entfernungen und relativen Orientierungen der beiden beteiligten Übergangsdipolmomente (von DTE und BODIPY) erklärbar.
Neben Experimenten mit Anregung des BODIPY-Teils der Dyaden wurden weitere Experimente durchgeführt, in denen der geschlossene Photoschalter direkt angeregt wurde. Aus diesen Messungen konnten Erkenntnisse über die Relaxation des DTE erlangt werden. Auf diese Weise war es möglich, bei einigen der Moleküle die Ringöffnungsreaktion zu beobachten und zu charakterisieren. Im Fall von Dyade 4 konnten zusätzlich kohärente Schwingungen des Moleküls nach Photoanregung detektiert werden, die sich anhand einer Frequenzmodulation der Absorptionsbande des BODIPY-Teils über einen Zeitbereich von 2 ps beobachten ließen.
Der Name Histamin hat seinen Ursprung aus dem griechischen Wort "histos" (Gewebe) und spielt auf sein breites Spektrum an Aktivitäten, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen an. Histamin ist eines der Moleküle mit welchem man sich im letzten Jahrhundert am intensivsten beschäftigt hat.
Im Jahr 1907 wurde das Histamin erstmals synthetisiert. Drei Jahre später gelang es, dieses Monoamin erstmals aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea zu isolieren. Weitere 17 Jahre vergingen, ehe Best et al. Histamin aus der humanen Leber und der humanen Lunge isolieren konnten. Best konnte somit beweisen, dass dieses biogene Amin einen natürlichen Bestandteil des menschlichen Körpers darstellt. Nach der Entdeckung wurden dem Histamin mehrere Effekte zugeschrieben. Dale et al. beobachteten, dass Histamin einen stimulierenden Effekt auf die glatte Muskulatur des Darms und des Respirationstraktes hat, stimulierend auf die Herzkontraktion wirkt, Vasodepression und ein schockähnliches Syndrom verursacht.
Popielski demonstrierte, dass Histamin dosisabhängig einen stimulierenden Effekt auf die Magensäuresekretion von Hunden hat. Lewis wiederum beschrieb erstmals, dass Histamin einen Effekt auf der Haut hervorruft. Dies zeigte sich durch verschiedene Merkmale, wie geröteter Bereich aufgrund der Vasodilatation und Quaddeln aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität. Des Weiteren wurde Histamin eine mediatorische Eigenschaft bei anaphylaktischen und allergischen Reaktionen zugeschrieben. Zusätzlich spielt das biogene Amin eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem beim Lernen, bei der Erinnerung, beim Appetit und beim Schlaf-Wach-Rhythmus. Von den zahlreichen physiologischen Effekten des Histamins ist seine Rolle bei Entzündungsprozessen, der Magensäuresekretion und als Neurotransmitter am besten verstanden.
In dieser Arbeit wurde das Protein OR1 ausführlich charakterisiert und die Grundlage für weitere Studien an diesem Protein gelegt. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand primär in der biophysikalischen Analyse eines eukaryotischen Proteorhodopsins, da bislang keine Daten zu diesen vorlagen. Dieser Ansatz ist vergleichbar mit der Studie am BR ähnlichen Rhodopsin aus dem Pilz Leptosphaeria maculans (Waschuk et al. 2005). Auch wenn man aus den Eigenschaften von OR1 keine Signatur für eukaryotische PRs herausfiltern kann, so weist OR1 eine Reihe von Charakteristika auf, die es wert sind weiterbearbeitet zu werden. Zu den hervorzuhebenden Ergebnissen dieser Arbeit zählen:
(1) OR1 zeigte in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris ein hohes Expressionsniveau weit über der gewohnten Ausbeute bei Membranproteinen.
(2) OR1 offenbarte sich als Proteorhodopsin mit BR ähnlichen Eigenschaften wie dem niedrigen pKs-Wert des Protonenakzeptors und damit guten Protonenpumpeigenschaften über einen großen pH-Bereich. Auch bindet OR1 keinen zweiten Chromophor, was die nahen Verwandten GR und XR hingegen tun.
(3) OR1 demonstriert, dass die Konfiguration des komplexen Gegenions von Proteorhodopsinen stark variiert und sich anscheinend flexibel den physiologischen Erfordernissen des jeweiligen Organismus anpasst. In diesem Zusammenhang spielt auch das konservierte Histidin eine Rolle, da es den primären Protonenakzeptor beeinflusst. Bei OR1 stellte sich heraus, dass das Histidin den pKs Wert der D100 Position nicht signifikant beeinflusst.
(4) OR1 wurde mit 13C und 15N Atomen erfolgreich markiert und das entwickelte Protokoll für die Rekonstitution bewährte sich. Die Proteoliposomen des Wildtyps gaben sehr gut aufgelöste Festkörper-NMR Spektren. In Zukunft sind somit ausführliche NMR Studien an OR1 möglich.
Die Paarverteilungsfunktion (PDF) beschreibt die Wahrscheinlichkeit, zwei Atome eines Materials in einem Abstand r voneinander zu finden. Diese Methode bewährt sich seit längerer Zeit zur Untersuchung von Gläsern, Flüssigkeiten, amorphen, stark fehlgeordneten und nanokristallinen anorganischen Substanzen. Die Anwendung für organische Substanzen ist jedoch relativ neu, mit etwa 20 Veröffentlichungen und Patenten insgesamt.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei Methoden zur Strukturverfeinerung und Strukturlösung organischer Substanzen anhand von PDF-Daten erfolgreich entwickelt und an diversen Beispielen validiert. Als erster Schritt hierzu wurde eine Methodenverbesserung vorgenommen. Hierbei handelte es sich um eine Verbesserung der Simulation der PDF-Kurven organischer Verbindungen anhand eines gegebenen Strukturmodells. Mit Hilfe der bisherigen Methoden können die PDF-Kurven anorganischer Substanzen erfolgreich simuliert werden. Für organische Substanzen werden bei Anwendung der bisherigen Methode die Signalbreiten der intramolekularen und intermolekularen Beiträge zu der PDF-Kurve falsch wiedergegeben, dies führt zu einer schlechten Anpassung der simulierten PDF-Daten and die experimentellen PDF-Daten. Deshalb wurde ein neuer Ansatz entwickelt, in welchem für die Berechnung der intramolekularen Beiträge zum PDF-Signal ein anderer isotroper Auslenkungsparameter verwendet wurde, als bei der Berechnung der intermolekularen Beiträge zum PDF-Signal. Mit diesem Ansatz konnte eine sehr gute Simulation der PDF-Kurve für alle Testbeispiele erzielt werden. Zur Strukturverfeinerung organischer Substanzen anhand von PDF-Daten wurden zwei Ansätze entwickelt: der Rigid-Body-Ansatz zur Behandlung starrer organischer Moleküle und der Restraint-Ansatz zur Behandlung flexibler organischer Moleküle.
Neben methodischen Entwicklungen wurden in dieser Arbeit zwei weitere Untersuchungen organischer Verbindungen mittels PDF-Analyse durchgeführt.
Es wurden drei, auf unterschiedliche Weise hergestellte, amorphe Proben des Wirkstoffes Telmisartan untersucht. Des Weiteren wurde mittels PDF-Analyse eine pharmazeutische Nanosuspension untersucht.
Die einzelnen Forschungsprojek
te sollen den breit aufgestellten Anwendungsbereich der Röntgenpulverdiffraktometrie im Bereich der Klärung von wissenschaftlichen Problemstellungen mit weiteren Beispielen komplementieren. Weiter soll die Nutzung der Synergie aus der kombinierten Anwendung von diversen strukturaufklärenden Methoden an polykristallinen Festkörpern aufgezeigt werden. Verwendet werden dazu Testsubstanzen aus verschiedenen, breit gefächerten Stoffklassen. Zum Einen wird die erfolgreiche Kristallstrukturbestimmung aus Röntgenpulverbeugungsdaten an einem diradikalischen Azobenzol-Derivates 1 (4-4'-Diazendiylbis[(1,4-phenyl)-bis-(carbonyloxy)]bis(2,2,6,6-tetramethylpiperidinyloxidanyl) gezeigt. Die Substanzklasse der diradikalischen Verbindungen ist für die Bestimmung von Radikal-Radikal-Abständen per EPR-Methoden (electron paramagnetic resonance) sehr wichtig. Zur Validierung der ermittelten Abstände aus den EPR-Messungen musste der Radikal-Radikal-Abstand vorab bekannt sein. Der intramolekulare Radikal-Radikal-Abstand von 23,658(6) Å. welcher im gewünschten Radikal-Radikal-Abstandsbereich für EPR-Messungen liegt, somit konnte 1 als Testsubstanz für Abstandsbestimmungen mittels EPR validiert werden. Die vorliegende
Kristallstruktur wurde in der Raumgruppe P21/c (Z = 2, Z’ = 0,5) mit a = 19,3355(5) Å, b = 5,9277(2) Å, c = 14,5264(4) Å, β = 109,22(1)° und einem Volumen V = 1572,12(8) ų ermittelt. Der Molekülmittelpunkt von 1 liegt auf einem kristallographischen Inversionszentrum und das aromatische Fragment von Estergruppe zu Estergruppe bildet annähernd eine Ebene. Anhand der Kristallstrukturbestimmung aus Röntgenpulverbeugungsdaten soll die
Lokalisierung eines Wasserstoffatoms in direkter Nachbarschaft zu Molekülfragmenten mit einer hohen Anzahl an Chlorsubstituenten untersucht werden. Am Beispiel der Bestimmung des tautomeren Zustands des achtfach chlorierten Color Index Pigment Yellow 138 (P.Y. 138) kann die Synergie aus quantenchemischen Rechnungen, Festkörper-NMR-Messungen und der Kristallstrukturbestimmung aus Röntgenpulverbeugungsdaten gezeigt werden. Hierbei wurden unter anderen unterschiedliche Kristallstrukturverfeinerungsstrategien zur Ermittlung des tautomeren Zustands entwickelt und angewendet. P.Y. 138 liegt in der monoklinen Raumgruppe P21/c (Z = 4, Z’ = 1) mit a = 19,3750(5) Å, b = 7,8516(1) Å, c = 16,9704(4) Å, β = 105,649(2)° und V = 2485,9(1) ų als NH-Tautomer vor. Es bilden sich Molekülschichten parallel zur (100)-Ebene aus. Innerhalb der Schichten wirken Van-der-Waals-Kräfte; zwischen den Schichten dominieren Typ I Cl⋯Cl-Wechselwirkungen. An dem pharmazeutisch aktiven Wirkstoffes Flupirtinmaleat wird die immer noch hohe Relevanz der Röntgenpulverdiffraktometrie bei einer Polymorphiesuche gezeigt. Flupirtinmaleat ist aufgrund seiner analgetischen Wirkung, ohne typische weitere Eigenschaften von Schmerzmittel wie beispielsweise opiode oder herzrhythmusbeeinflussende aufzuweisen, eine höchst interessante Substanz. Neue Polymorphe können bessere Eigenschaften als die Ausgangsphase aufweisen oder auch den wirtschaftlichen Nutzen erhöhen, da diese patentierbar oder kostengünstiger und ressourcenschonender in der Herstellung sein können. Für das Flupirtinmaleat-Projekt wurden Aufnahme und Auswertung von Röntgenpulverdiffraktogrammen als standardisierte analytische Methoden zur Bestimmung von neuen kristallinen Phasen bei einer sehr großen Probenanzahl von über 500 Einzelversuchen, welche bei Polymorphiesuchen aufkommt, genutzt. Von der pharmazeutisch aktiven Substanz Flupirtinmaleat ist es gelungen, die neuen Festkörperphasen C, F, G und H zu entdecken. Ebenfalls konnte durch Vermahlungsexperimente Flupirtinbromid erzeugt werden. Des Weiteren wurden die Einkristallstrukturen von Flupirtinmaleat Form A und Flupirtin Phase B bestimmt. Das letzte Projektkapitel zeigt den Beginn einer methodischen Entwicklung zur Konfigurationsbestimmung von chiralen Molekülen aus Röntgenpulverbeugungsdaten. Ziel
der Methode ist es, ein schnelles Verfahren zur Ermittlung der absoluten Konfiguration und Strukturaufklärung von neu entwickelten Substanzen beispielsweise für pharmazeutische Wirkstoffe zu haben. Bei der Einkristallstrukturanalyse kann aus dem Reflexbild anhand von Intensitätsunterschieden spezieller Reflexpaare die Konfiguration einer Verbindung direkt bestimmt werden. Da dies bei Röntgenpulverdiffraktogrammen nicht der Fall ist, kann diese
Methode nicht angewendet werden. Zur Umsetzung des Leitgedankens sollen daher chirale Salze aus der Zielsubstanz mit unbekannter Konfiguration und einem Salzbildner bekannter Chiralität erzeugt werden. Der Drehsinn des bekannten Salzbildners soll sozusagen als
Ankerpunkt für die Bestimmung der absoluten Konfiguration dienen. Da ein Anwendungsschwerpunkt die pharmazeutische Forschung sein könnte, wurden als Grundlage der Methodenentwicklung chirale Testsysteme bestehend aus pharmazeutischen Wirkstoffen und Salzbildnern jeweils mit bekannter Konfiguration. Acht neue Entitäten von verschiedenen Wirkstoff-Salzbildner-Paaren konnten erzeugt und mittels Röntgenpulverbeugungsdaten bestätigt werden. Dies zeigt, dass durch Kristallisation wahrscheinlich durch Salzbildung, neue Entitäten mit einem Ankerpunkten zur späteren Konfigurationsbestimmung erzeugbar sind. Ebenfalls konnten aus Einkristallbeugungsdaten die Kristallstruktur von R-Flurbiprofen und Kristallstrukturen der Salze aus R-Flurbiprofen mit R-Phenylpropylamin und R-Aminoglutethimid mit R-Camphersulfonsäure bestimmt werden. Diese Kristallstrukturen, ganz speziell die der Salze, können im weiteren Verlauf zum Vergleich und/oder zur Validierung mit den Kristallstrukturen aus Röntgenpulverbeugungsdaten dienen. Hervorzuheben sind die Kristallisationsprodukte aus S-Flurbiprofen bzw. R-Flurbiprofen mit R-Phenylpropylamin, da diese voneinander unterscheidbare Röntgenpulverdiffraktogramme aufweisen die enantiomeren Ausgangsstoffe S- und R-Flurbiprofen jedoch nicht. Dies legt nahe, dass es grundsätzlich möglich sein sollte eine Konfigurationsbestimmung aus Röntgenpulverbeugungsdaten durchzuführen.