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Bestimmung der Lösungsstruktur von Rinder-Adrenodoxin durch Auswertung hochaufgelöster NMR-Spektren
(2001)
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Strukturen von RinderAdrenodoxin im oxidierten und im reduzierten Zustand. Die rekombinante Form dieses Elektronentransportproteins aus 128 Aminosäuren und dem [2Fe2S]EisenSchwefel Cluster mit einer Molmasse von 14,4 kDa wurde in E. coli exprimiert. Die hergestellten Proben wurden entweder mit 15 N oder 15 N, 13 Cangereichert, was den Einsatz einer breiten Palette heteronuklearer NMRExperimente ermöglichte. Nach der Zuordnung individueller Werte der chemischen Verschiebung für die NMRaktiven Kerne konnten durch 15 N und 13 Ceditierte dreidimensionale NOESYExperimente 1800 strukturrelevante Interprotonenabstände qualitativ bestimmt werden. Insgesamt konnten 70 Prozent der Resonanzen der NMR aktiven Kerne der jeweiligen Proteinzustände zugeordnet werden. Bedingt durch den paramagnetischen Einfluß des EisenSchwefelClusters waren durch enorme Linienbreiten und sehr schnelle T 1 Relaxationszeiten 30 Prozent der zu erwartenden Signale des Proteins nicht detektierbar. Zusätzlich konnten durch die Anwendung eines ct( 15 N, 1 H)HSQC Experiments weitere 18 Abstandsparameter von Amidprotonen im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster, die aber gerade noch detektiert werden konnten, zu dem jeweiligen näheren Eisenkern gewonnen werden. Für die Strukturrechnung mußte der EisenSchwefelCluster künstlich mit der Aminosäure C46 verbunden werden, da das Programm DYANA keine Eisen Atome erkennt. Anschließend wurde dieser 'künstliche' Aminosäurerest neu benannt (CYSC). Diese neue Aminosäure wurde dann nach Energieminimierung in die DYANA Bausteinbibliothek eingebracht. Es zeigte sich, daß der EisenSchwefelCluster die Struktur wie eine 'Klammer' zusammenhält. Ohne die Einbindung des EisenSchwefelCluster kommt es nach der Strukturrechnung zu keiner Struktur, sondern zu einem ungeordneten 'Knäuel'. Bei der Interpretation der Strukturensembles wurde deutlich, daß Rinder Adrenodoxin ein relativ rigides Protein ist. Scheinbar hohe flexible Bereiche im Protein mußten korreliert werden mit den Bereichen des Proteins, die aufgrund von fehlenden Zuordnungen nicht gut genug definiert werden konnten. Es ist somit nicht definitiv zu bestimmen, woher diese Abweichung in den Strukturen herrührt. Allerdings wurde bei der Betrachtung von Aminosäureresten in der Wechselwirkungsdomäne deutlich, daß an den Positionen der Aminosäurereste D72, E73, D76 und D79 es zu Bewegungen beim Übergang aus dem oxidierten in den reduzierten Zustand kommen muß, da speziell die Aminosäurereste D72 und E73 ihre Position dramatisch verändern. Entsprechende Änderungen der Werte der X1 Diederwinkeleinstellungen wurden beobachtet und lokale Ramachandran Diagramme ergeben sich aus den Rechnungen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß im reduzierten Zustand S112 mit einer T 1 Relaxationszeit von 62,5 ms im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster liegen könnte. Ein Hinweis darauf ist auch die Änderung der Geometrie des C Terminus, da im oxidierten Zustand dieser gerade vom Proteinkörper wegweist, während im reduzierten Zustand das Cterminale Ende sich in Richtung Proteinkörper biegt. Bisher wurde angenommen, daß dem CTerminus keine funktionelle Rolle zukommt. Die Struktur des Adrenodoxins wurde nach der Distanzgeometrierechnung unter Berücksichtigung aller experimenteller Daten erhalten. RinderAdrenodoxin ist klassifiziert als ein (alpha beta)Protein welches 22% betaFaltblatt, 17% alphaHelix und 6% 3 10 Helix besitzt. Für den oxidierten und den reduzierten Zustand konnten jeweils 5 betaFaltblätter und 4 Helices identifiziert werden. Beim oxidierten Zustand erstrecken sich die 5 betaFaltblätter auf die Aminosäurereste 812, 1822, 5759, 8889 und 103106, während beim reduzierten Adrenodoxin sie sich auf die Aminosäurereste 612, 2124, 5758, 8889 und 103106 erstrecken. Die 4 identifizierten Helices erstrecken sich im oxidierten Zustand auf die Reste 2935, 6466, 7229 und 98100. Die 4 Helices für den reduzierten Zustand werden durch die Reste 3336, 6164, 7275 und 98100 charakterisiert. Der EisenSchwefelCluster ist kovalent an die vier CysteinReste 46, 52, 55 und 92 gebunden. Mit einem mittleren globalen RMSDWert der Rückgratatome zur Mittelstruktur für das oxidierte Adrenodoxin von 0,94 Å und für das reduzierte Andrenodoxin von 1,53 Å sind die Anforderungen an relativ gut aufgelöste Strukturen erfüllt. Die hier bestimmten Strukturen entsprechen in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit der Auflösung von 2.0 Å (Programm PROCHECK) für den reduzierten und den oxidierten Zustand von RinderAdrenodoxin und sind somit zufriedenstellend aufgelöst.
Ziel der Arbeit war es, die strukturellen Eigenschaften einer flüssigen Vorstufe einer Mullitkeramik mit Hilfe der NMR-Spektroskopie zu untersuchen. Die fertige Keramik soll später im Triebwerksbau in der Luft- und Raumfahrttechnik eingesetzt werden. Dazu wurden NMR-Messungen an den Kernen 1 H , 13 C, 27 Al und 29 Si durchgeführt. Als Experimente kamen dabei sowohl eindimensionale als auch zweidimensionale Methoden der NMR-Spektroskopie zum Einsatz. Zur Bildung von Strukturhypothesen wurden verschiedene Modellsysteme im Rechner simuliert. Eine besondere Herausforderung bei der Messung und Interpretation der Spektren stellte die hohe Viskosität der verwendeten Proben dar. Diese hohe Viskosität der Proben führte zu einer starken Verbreiterung der Resonanzlinien in den NMR-Spektren und zu den gezeigten Schwierigkeiten bei den Diffusionsmesungen. Die in der Literatur beschriebene strukturelle Vielfalt der Aluminiumalkoholate konnte nicht nur, wie in der Literatur bekannt, mit Hilfe von Aluminiumspektren, sondern auch über Protonen und Kohlenstoffspektren nachgewiesen und beschrieben werden. Insbesondere konnten Struktureinheiten jenseits der bekannten dimeren, trimeren und tertameren Strukturen der Aluminumalkoholate beschrieben werden. Das trimere Aluminiumsekundärbutylat steht mit einer dimeren Form im Gleichgewicht. Durch Temperaturerhöhung wird dieses Gleichgewicht in Richtung der dimeren Form verschoben. Im Falle der Verbindung [Al(OBu) 2n (iP rEtO) n ] konnte die direkte Nachbarschaft der 2-Butanol und iso-Propoxyethanolreste im Komplex über Signale im ROESY-Spektrum aufgezeigt werden. Es konnte eine sehr exakte und reproduzierbare Methode zur Bestimmung von Diffusionskonstanten in viskosen, gelartigen Lösungen mittels NMR-Messungen gefunden und erfolgreich auf die zu beobachtenden Systeme adaptiert und verwendet werden. Nur mit Hilfe dieser Methode war es möglich, den supramolekularen Charakter der Vorstufen einer Mullit-Keramik nachzuweisen. Insbesondere konnte gezeigt werden, daß das vorgestellte System eine hochgeordnete Struktur aufweist, und daß die einzelnen molekularen Einheiten über nicht kovalente Wechselwirkungen miteinander verbunden sind.