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Die somatische Gentherapie ist eine neuartige Therapieform, bei der Gensequenzen in Zielzellen eingebracht werden, um die verschiedensten Defekte auf molekularer Ebene zu beheben. Für die Entwicklung von Vehikeln, mit denen dieser Gentransfer effizient durchzuführen ist, werden in vielen Studien modifizierte Retroviren verwendet. Mit Hilfe des Transport- und Integrationsmechanismus der Retroviren ist es möglich das genetische Material stabil in das Genom der Zielzellen zu integrieren. Im Hinblick auf eine lebenslange Heilung bestimmter Erbkrankheiten können die retroviralen Vehikel auch zum Gentransfer in Stammzellen verwendet werden. Eine wichtige Rolle spielt die stabile Genexpression der eingeschleusten Sequenzen, um einen Therapieerfolg auf lange Sicht zu erreichen. In vielen Studien erfolgte jedoch eine Erniedrigung der Genexpression nach mehreren Wochen und auch das Ausbleiben der Transkription oder Translation des therapeutischen Gens konnte beobachtet werden. Das Abschalten therapeutischer Gene wird meist durch zelluläre Mechanismen hervorgerufen, hierzu gehören Methylierungen bestimmter Chromosomenabschnitte oder die Bindung von Repressormolekülen an Promotorregionen. Die Sequenzumgebung mit der das therapeutische Genmaterial in das Genom der Zielzellen integriert, ist somit besonders wichtig. Die viralen Sequenzen, die zum Einschleusen und für die Integration des therapeutischen Gens notwendig sind, tragen oft erheblich zur Expressionshemmung bei. Ein retroviraler Vektor, der nach Integration der proviralen DNA alle nicht benötigten viralen Sequenzen selbständig deletiert, würde störende Einflüsse durch umgebende Sequenzen vermindern. Das therapeutische Gen verbliebe mit wenigen viralen Sequenzen in der Zelle. Ein System, das nach Integration des therapeutischen Gens alle nicht erwünschten viralen Sequenzen selbständig und gezielt entfernt, stellt das entwickelte Cre/loxPVektorsystem dar. Dieser retrovirale Vektor enthält ein spezifisches Rekombinationssystem, das nach Integration der proviralen DNA in das Genom einer Zelle alle nicht benötigten viralen Sequenzen selbständig deletiert. Das therapeutische Gen verbleibt mit wenigen Sequenzen im Zielzellgenom. Störende Einflüsse durch transkriptionelles Silencing oder Translationshemmung durch umgebende Sequenzen werden damit vermindert. Die Anordnung der Gene und Sequenzen zur Entwicklung eines selbstdeletierenden Cre/loxP-Vektors wurde für die stabile Expression eines Markergenproduktes untersucht. Das modifizierte Gen des Nervenwachstumsfaktors LNGFR (LNGFR, engl. – Low Affinity Nerve Growth Factor Receptor) diente anstelle eines therapeutischen Gens als Modell für eine Proteinexpression in verschiedenen Zielzellen. In dieser Studie wurde ein konventionelles retrovirales Vektorsystem mit den entwickelten Cre/loxP-Vektoren verglichen. Beide Vektorsysteme integrierten das LNGFRD-Gen zusammen mit den nötigen viralen Sequenzen in das Genom der Zielzellen. Nach Integration des konventionellen Vektors blieb die Sequenzumgebung des LNGFRD-Gens erhalten. Durch das Cre/loxPVektorsystem konnten die störenden viralen Sequenzen durch den spezifischen Rekombinationsmechanismus entfernt werden und nur die LNGFRD-Expressionskassette verblieb mit wenigen Elementen im Genom der Zielzellen. Mit beiden Vektorsystemen konnte eine Expression des LNGFD-Rezeptors erreicht werden, wobei die zu erreichende Expressionshöhe des Rezeptor mit dem Cre/loxP-Vektorsystem zum Teil erhöht war, im Vergleich zum Kontrollsystem. Der Anteil an Zellen, die nach Gentransfer den LNGF-Rezeptor exprimierten, war nach einigen Modifikationen ebenfalls vergleichbar mit dem System des konventionellen Gentransfervektors. Die Verwendungsmöglichkeiten des entwickelten Cre/loxPVektorsystems sind auf vielen Gebieten denkbar. Retrovirale Vektoren werden zum einem zur Behandlung von monogenen Erbkrankheiten verwendet, bei denen das therapeutische Gen den Defekt des fehlerhaften Gens ausgleicht. Ein retroviraler Cre/loxP-Vektor könnte hierbei zu einer lebenslangen Expression des Genprodukts genutzt werden. Außerdem könnten Gene transferiert werden, die nur temporär exprimiert werden sollen. Hierzu könnte ein induzierbarer Cre/loxP-Vektor verwendet werden. Zur Bekämpfung von Krebs oder HIV werden Untersuchungen mit Apoptose-Genen und Suizid-Genen durchgeführt, die bei einer unerwünschten Immunreaktion mit Hilfe des Cre/loxPSystems eliminiert werden könnten. Für die Zell- und Gentherapie werden zur Zeit Studien zur kontrollierten Expansion von Stammzellen und Endothelzellen durchgeführt, wobei Genen verwendet werden, die diesen Zellen einen Proliferationsvorteil verschaffen. Die vollständige Abschaltung dieser Gene nach der Zellexpansion ist wünschenswert. Mit dem Cre/loxP-Vektorsystem könnte eine reversible Immortalisierung erzielt werden, was die Sicherheit einer späteren Transplantation erhöhen würde. Die Deletion weiterer viraler Sequenzen erhöht außerdem die Sicherheit des Gentransfers für eine erstrebenswerte lebenslange Integration von Gensequenzen. Die Möglichkeiten zur Mobilisierung eingeführter retroviraler Sequenzen durch Mutationen oder Rekombinationen mit endogenen Viren wird stark vermindert, da Elemente, wie das virale Verpackungssignal oder virale Genkassetten entfernt werden können. Der entwickelte Cre/loxP-Vektor ist außerdem ein selbstdeletierender Vektor, der nicht nur die spezifischen Bindestellen der loxP-Elemente enthält, sondern auch das CreGen zur Rekombination. Die spezielle Anordnung der Elemente zur Rekombination erlaubt nicht nur eine spezifische Rekombination, sondern auch die Deletion des Gens der CreRekombinase. Das Cre/loxPSystem deletiert sich somit selbständig, was einen weiteren Sicherheitsaspekt darstellt.
The conditionally-lethal pso4-1 mutant allele of the spliceosomal-associated PRP19 gene allowed us to study this gene’s influence on pre-mRNA processing, DNA repair and sporulation. Phenotypes related to intron-containing genes were correlated to temperature. Splicing reporter systems and RT–PCR showed splicing efficiency in pso4-1 to be inversely correlated to growth temperature. A single amino acid substitution, replacing leucine with serine, was identified within the N-terminal region of the pso4-1 allele and was shown to affect the interacting properties of Pso4-1p. Amongst 24 interacting clones isolated in a two-hybrid screening, seven could be identified as parts of the RAD2, RLF2 and DBR1 genes. RAD2 encodes an endonuclease indispensable for nucleotide excision repair (NER), RLF2 encodes the major subunit of the chromatin assembly factor I, whose deletion results in sensitivity to UVC radiation, while DBR1 encodes the lariat RNA splicing debranching enzyme, which degrades intron lariat structures during splicing. Characterization of mutagen-sensitive phenotypes of rad2{Delta}, rlf2{Delta} and pso4-1 single and double mutant strains showed enhanced sensitivity for the rad2{Delta} pso4-1 and rlf2{Delta} pso4-1 double mutants, suggesting a functional interference of these proteins in DNA repair processes in Saccharomyces cerevisiae.
Septine bilden eine neue Klasse filamentbildender kleiner GTPasen, die ursprünglich in der Hefe Saccharomyces cerevisiae aufgrund ihrer Funktion in der Cytokinese entdeckt wurden. Mittlerweile wurde gezeigt, dass Septine nicht nur in Pilzen, sondern auch im gesamten Tierreich vorkommen. In Säugern sind bisher zehn Isoformen, die z. T. in mehreren Spleißvarianten auftreten, beschrieben worden. Die Tatsache, dass Septine auch in postmitotischen Geweben wie dem Hirn exprimiert werden, weist darauf hin, dass Septine zumindest in Säugetieren nicht nur in der Zellteilung eine Rolle spielen. Die nachgewiesene Interaktion eines Säugerseseptins mit dem für die Fusion sekretorischer Vesikel essentiellen Membranprotein Syntaxin-1 (Beites et al., 1999) und die Koimmunopräzipitation eines Septinkomplexes mit Antikörpern gegen den Sec6/8-Komplex (Hsu et al., 1998), der beim zielgerichteten Transport sekretorischer Vesikel eine Rolle spielt, deuten darauf hin, dass Säugerseptine ein Funktion bei Transportprozessen spielen könnten. Um weitere Hinweise über die Wirkungsweisen von Septinen zu erhalten, wurden in dieser Arbeit zwei Screening-Systeme angewendet, um Interaktionspartner von Septinen zu identifizieren. Bei einem Suppressor-Screen mit einer Hefe-Septinmutante (cdc1-11) wurden zwei andere Hefeseptine als Suppressoren identifiziert (Cdc3p und Cdc12p), was auf eine Redundanz in der Funktion dieser Septine hinweist. Außerdem wurden Hefe-Zwei-Hybrid-Screens durchgeführt, bei denen eine cDNA-Bank aus adultem Rattenhirn nach potentiellen Interaktionspartnern des N-Terminus und des C-Terminus des Säuger-Septins rSLPa durchsucht wurde, das wegen der oben genannten Koimmunpräzipitation mit Komponenten des Sec6/8-Komplexes möglicherweise eine Rolle in Transportprozessen spielt. Als möglicher Interaktionspartner des N-Terminus von rSLPa wurde die lange Isoform der Kalzium-unabhängigen Phospholipase A2 identifiziert. Die Interaktion konnte in vitro mittels GST-Fusionsproteinen in Kopräzipitations-Experimenten zwar nicht eindeutig verifiziert werden. Jedoch wurde in Koexpressionsexperimenten eine Kolokalisation von rSLPa mit iPLA2 beobachtet, was zumindest auf eine mögliche Interaktion beider Proteine in vitro hindeutet. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die gefundene Interaktion eindeutig zu verifizieren. Als Interaktionspartner des C-Terminus von rSLPa wurden drei verschiedene Septine identifiziert: KIAA0202, Pntl2 und ein Klon mit hoher Homologie zu Septinen (DKFZp566C224). Die Interaktion von rSLPa und KIAA0202 wurde durch Kolokalisationsstudien in COS-7 Zellen bestätigt. Bei der weiteren Untersuchung verschiedener Säugerseptine und deren Interaktionen wurde die filamentbildende Eigenschaft der Septine näher charakterisiert. Mithilfe von Mutanten, die die Fähigkeit, GTP zu binden, verloren hatten, konnte nachgewiesen werden, dass die GTP-Bindung eine wichtige Funktion in der Filamentbildung hat. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der N-Terminus von rSLPa dessen Lokalisation an Aktinstressfasern vermittelt. Mit spezifischen Antiseren, die gegen rSLPa und Septin6 hergestellt wurden, wurde die Expression dieser Septine in verschiedenen Rattengeweben untersucht. Außerdem wurde gezeigt, dass beide Septine während der Entwicklung in etwa gleich bleibenden Mengen in verschiedenen Regionen des Gehirns exprimiert werden, was die Annahme unterstützt, dass diese Septine nicht ausschließlich eine Rolle in der Zellteilung spielen. Die Lokalisation von endogenem sowie überexprimiertem rSLPa wurde in hippocampalen Neuronen untersucht. rSLPa ist nicht synaptisch, sondern in Anreicherungen direkt neben synaptischen Kontakten, bzw. unterhalb von dendritischen Dornfortsätzen lokalisiert. Diese Lokalisation von rSLPa weist neben einer Funktion des Septins in Transportprozessen auch auf eine Rolle in der Kompartimentalisierung der Plasmamembran von Neuronen hin.
MDMA oder Ecstasy, wie diese Droge, die 1913 erstmalig zufällig synthetisiert wurde, auch heißt, ist inzwischen fester Bestandteil der Jugendkultur in Amerika und Europa. Eine Literaturrecherche zu diesem Thema kann sich natürlich nicht nur auf Wirkungsweise, Struktur, Synthese und neurotoxische Gefahren beschränken, auch wenn das der Schwerpunkt der Recherche und auch der Ausführungen ist. Dennoch werden in dieser Arbeit auch die Probleme mit dem Umgang dieser Droge, der historische Werdegang und die wichtigen Hinweise zum Umgang mit MDMA beleuchtet, um so einen insgesamt ansatzweise vollständigen Überblick über ein sehr komplexes und umfassendes Thema zu geben. Der rechtliche Aspekt von MDMA wird nur sehr knapp behandelt. Nicht näher wird auf soziologische und gesellschaftliche Überlegungen im Zusammenhang mit der Benutzung von Ecstasy eingegangen, da dieses den Rahmen der Ausführungen sprengen würde und thematisch auch sehr fern ist. Stellvertretend sei hier auf eine Arbeit von Jens Rottmann (Drogenkonsum und Sucht bei Jugendlichen – Ursachen – Verbreitung – Handlungsalternativen ) [1] verwiesen, die diese Aspekte sehr eingehend behandelt. Die Ausführungen konzentrieren sich selbstredend auf die chemischen Grundlagen und biochemischen Abläufe im Zusammenhang mit MDMA. Im dritten Kapitel werden ausführlich biochemische Grundsätze zur Informationsweitergabe in unserem Körper erörtert, da die Ausführungen der Arbeit auf diesen Kenntnissen beruhen.
Der Malaria verursachende Organismus Plasmodium falciparum (P. falciparum) besitzt in seinem Kerngenom für die Mitochondrien bestimmte Proteine, die als Transportsignal ein mitochondriales Transitpeptid enthalten. Durch die kürzlich erfolgte Sequenzierung des Genoms von P. falciparum ist es wünschenswert, Vohersagealgorithmen für verschiedene Proteinlokalisationen zur Verfügung zu haben. Für andere Organismen etablierte Programme zur Vorhersage von mitochondrialen Transitpeptiden, MitoProtII und TargetP, lieferten bei Anwendung auf Sequenzen aus P. falciparum nur unbefriedigende Ergebnisse. MitoProtII erzielte in einer 20-fachen Kreuzvalidierung einen Mathews-Koeffizienten von cc = 0,49, TargetP erzielte in diesem Fall einen Mathews-Koeffizienten von cc = 0,60. TargetP erzielte für die Sequenzen aus P. falciparum nur eine Selektivität von 47%, MitoProtII nur eine Sensitivität von 35%. Dieser Ergebnisse haben die Entwicklung eines speziell auf P. falciparum trainierten Vorhersagemodells wünschenswert gemacht. Kerncodierte mitochondriale Precursorproteine aus P. falciparum wurden mit statistischen Methoden, Hauptkomponentenanalyse, selbstorganisierenden Karten und überwachten neuronalen Netzen analysiert und mit solchen aus anderen Organismen verglichen. Zwei Repräsentationen der Datensätze wurden gewählt, Aminosäurehäufigkeiten und 19 physikochemische Eigenschaften. Ein grundsätzlich unterschiedlicher Aminosäuregebrauch konnte festgestellt werden. Glycin, Alanin, Prolin und Arginin werden in P. falciparum mit weniger als 60% der Häufigkeit in der Swiss-Prot-Datenbank, Version 36, verwendet. Isoleucin, Tyrosin, Asparagin und Lysin werden hingegen mit mehr als 150% der Häufigkeit in der Referenzdatenbank verwendet. Diese Häufigkeitsmuster wurden, mit Variationen, auch in allen Targetingsequenzen beobachtet. In der Datenanalyse mittels Hauptkomponentenanalyse und selbstorganisierenden Karten ließen sich cytoplasmatische Proteine in beiden Repräsentationen klar von der Gruppe mitochondrialer, extrazellulärer und apicoplastischer Proteine trennen. Die Trennung innerhalb der zweiten Gruppe war weniger deutlich. Ein neuronales Netz (PlasMit) zur Vorhersage mitochondrialer Transitpeptide in P. falciparum wurde entwickelt. Basierend auf der relativen Aminosäurehäufigkeitsverteilung innerhalb der ersten 24 N-terminalen Aminosäuren lieferte es einen Mathews- Korrelationskoeffizienten von 0,74 (86% korrekt vorhergesagte Sequenzen) in einer 20fachen Kreuzvalidierung. Dieses Netz sagte 2449 (24%) der 10276 vorhergesagten Open Reading Frames aus dem Genom von P. falciparum als mögliche mitochondrial lokalisierte Proteine voraus. Ein Netz mit identischer Topologie wurde auf eine geringere Anzahl falsch-positiver Vorhersagen trainiert und erzielte einen Mathews-Koeffizienten von 0,51 (84% korrekte Vorhersagen) in einer 10fachen Kreuzvalidierung. Dieses Netz sagte 903 (8,8%) potentielle mitochondriale Precursorproteine unter den 10276 vorhergesagten Open Reading Frames voraus. Sämtliche Trainingsdatensätze, die Open Reading Frames des Genoms von P. falciparum, sowie das Netz, das den höchsten Mathews-Koeffizienten erzielt hat, sind per Web unter http://www.modlab.de, Menüpunkt PlasMit, erreichbar.
Die Messung von heteronuklearen 15N-Relaxationszeiten (Longitudinale, transversale sowie heteronukleare NOE) bei verschiedenen Magnetfeldstärken (500, 600 und 800 MHz 1H Larmorfrequenz) ergeben Informationen über interne dynamische Prozesse in Biomolekülen. Diese verschiedenen Relaxationsraten sind voneinander abhängig und über die spektrale Leistungsdichtefunktion miteinander gekoppelt. Die mikrodynamischen Parameter des NH-Peptidrückgratvektors (der Ordnungsparameter S2 und die effektive interne Korrelationszeit te) sowie der Beitrag des konformationellen Austausches zur transversalen Relaxationsrate der Austauschparameter Rex wurden für einige Proteine errechnet und angepaßt. Das Human ILBP gehört zur Familie der intrazellulären Lipidbindungsproteine (LBP), die in der Lage sind, Fett- und Gallensäuren spezifisch zu binden und in Cytosol zu transportieren. Viele verschiedene Typen von LBPs sind bis heute identifiziert worden. Diese Proteine enthalten 127 - 135 Aminosäurereste und werden nach dem Gewebe benannt, aus dem sie isoliert wurden. Human-ILBP enthält 127 Aminosäurereste und besteht haupsächlich aus 10 antiparallelen beta-Faltblattsträngen, die eine beta-Fassstruktur mit einer großen Bindungstasche bilden, und zwei alpha-Helices. ILBP hat die Tendenz, Gallensäuren oder Fettsäuren zu binden. Diese geringe Tendenz zur liganden Spezifität ist entweder in der Struktur oder in seiner Dynamik begründet. Aus diesem Grund kann die Untersuchung der Dynamik des Human ILBP (apo- und holo-Form) in zwei Zeitfenstern zum besseren Verständnis der Funktion führen. Für die nicht-terminalen Peptidrückgratgruppen wurde ein S2-Parameter> 0,8 mit einen Durchschnitt von 0,88 beobachtet, was auf eine niedrige Mobilität im ganzen Protein in einem Nano- zu Picosekunden-Zeitfenster deutet, wobei eine Korrelationszeit von tc = 6.25 ns für ILBP (apo-form) und tc = 6.10 ns für ILBP (holo-Form) beobachtet wurde. Apo- und holo-Form (mit Taurocholat als Ligand) zeigen eine ähnliche Dynamik in diesem Zeitfenster. Überdurchschnittliche S2-Werte der alpha-Helix I deuten eine geringe Flexibilität des Peptidrückgrats an, während alpha-Helix II als Teil der Portalregion eine höhere Beweglichkeit zeigt. Austauschparameter Rex wurden hauptsächlich in den Regionen der Ligandenbindung nachgewiesen. Die hier beschriebenen Eigenschaften unterscheiden sich von denen des H-FABP und des E-FABP. Offensichtlich unterscheiden sich verschiedene Mitglieder der LBP-Familie wie ILBP (Human oder Schwein), H-FABP und E-FABP in der Funktion und Dynamik des Peptidrückgrats. In der vorliegenden Arbeit wurden die transversalen 15N CSA/DD-kreuzkorrelierten Kreuzrelaxationsraten bestimmt. Für die Bestimmung der Anisotropie des chemischen Verschiebungstensors wurde des Verhältnis zwischen den Auto- und Kreuzrelaxationsraten in Abhängigkeit von der magnetischen Feldstärke genutzt, wobei es möglich war, die Orientierung und Größe des CSA-Tensors einzelner Aminosäurereste zu bestimmen. Bei dieser Methode (wie auch in vielen anderen Studien gezeigt) wurde keine Korrelation zwischen der Sekundärstruktur des Proteins und den 15N CSA-Werten festgestellt. Zum Vergleich der CSA-Konstanten der ILBP-Spezies wurden die entsprechenden Parameter der RNaseT1 gemessen. Alle Daten wurden im Hinblick auf strukturelle Details kritisch diskutiert.
Die Lösung unbekannter Strukturen aus Pulverbeugungsdaten ist keineswegs eine Routineanwendung, und es steht noch einiges an Arbeit an, um die vorhandenen Methoden so weit zu automatisieren, daß sie von Nichtspezialisten, auch solchen mit kristallographischen Kenntnissen, direkt verwendet werden können. In dieser Arbeit konnte überzeugend dargelegt werden, daß die Anwendung des älteren Verfahrens der Fragmentsuche eine sehr gute Möglichkeit bietet, den Schwierigkeiten der Strukturlösung aus Pulverdaten erfolgreich zu begegnen. Durch graduelle Steigerung des Schwierigkeitsgrads bzw. der Komplexität der Strukturlösung von der anfänglichen Verwendung simulierter Pulverbeugungsdaten bekannter Strukturen über die Messung von Pulverbeugungsdiagrammen bekannter Strukturen bis hin zur Lösung unbekannter Strukturen konnte die sinnvolle Anwendbarkeit des Fragmentsuchprogramms PATSEE zweifelsfrei belegt werden. Die in den einzelnen Stadien der Untersuchungen diskutierten Einflüsse, wie die benötigte minimale Fragmentgröße oder die Fragmentqualität, lieferten entscheidende Hinweise für das Aufstellen einer einfachen Strategie zur Strukturlösung aus Pulverdaten mit PATSEE. So konnte gezeigt werden, daß für einen sinnvollen Strukturlösungsversuch in der Regel mehr als 50% des relativen Streubeitrags aller Atome in der asymmetrischen Einheit benötigt werden und daß sich diese Grenze nur durch die Verwendung qualitativ hochwertiger Pulverbeugungsdaten, wie sie an modernen Synchrotronringen erhalten werden können, durchbrechen läßt. Auch die Variation eines Torsionsfreiheitsgrads im Zuge der Rotationssuche kann entscheidende Vorteile verschaffen, wenn zwei für sich genommen zu kleine starre Bereiche miteinander kombiniert werden. Außerdem konnte die prinzipielle Verwendbarkeit sowohl mittels Kraftfeldmethoden berechneter als auch experimentell bestimmter Fragmente, wie sie in der CSD in großer Zahl bereitstehen, bestätigt werden. Die in PATSEE verwendete Vielzahl an Gütekriterien zur Beurteilung einer Lösung konnte auch im Falle von Pulverdaten im wesentlichen überzeugen. Zwar ist die Diskriminierung zwischen richtigen und falschen Lösungen bei weitem nicht so eindeutig in bezug auf alle Gütekriterien, aber zumindest wird eine sehr gute Bewertung hinsichtlich von CFOM - dem Gütekriterium, nach dem die Lösungen sortiert werden - und den beiden R-Werten RE(1) und RE(2) erreicht. Als etwas problematisch hat sich die Rotationssuche erwiesen, die nur auf der Beurteilung eines einzigen Gütekriteriums beruht. Da aber gerade der Rotationssuche als erstem Schritt der Fragmentsuche eine wichtige Bedeutung zukommt, ist der Anwender zu großer Sorgfalt bei deren Durchführung verpflichtet. Eine Grenze für Strukturlösungsversuche mit PATSEE stellen derzeit Strukturen mit mehreren Molekülen in der asymmetrischen Einheit dar. Da im einfachsten Fall (Z'= 2) bereits ein komplettes Molekül als Suchfragment einen relativen Streubeitrag von unter 50% aufweist, wird eine erfolgreiche Orientierung und Positionierung mit PATSEE nur noch für hervorragende Datensätze möglich sein. Für noch schwierigere Fälle (Z'> 2) oder für Verbindungen, bei denen nicht das gesamte Molekülgerüst als Suchfragment verwendet werden kann, bestehen dann praktisch keine Aussichten mehr auf eine erfolgreiche Strukturlösung mit PATSEE. Basierend auf diesen Ergebnissen, konnten PATSEE-Parameter empfohlen werden, die sowohl für große Fragmente als auch für den Grenzbereich der minimal benötigten Fragmentgröße gute Erfolgsaussichten für die Strukturlösung gewährleisteten. Dabei wichen die empfohlenen Parameter nur in geringem Maße von den für Einkristalldaten optimierten Werten ab. Anhand zweier unbekannter Strukturen konnte die empfohlene Strategie verifiziert werden. Zusätzlich wurde für eine der beiden Strukturen eine Einkristallstrukturbestimmung vorgenommen, welche die aus Pulverdaten gelöste Struktur bestätigte. Auch wenn einerseits die prinzipielle Anwendbarkeit der Fragmentsuche mit PATSEE auf Pulverbeugungsdaten bewiesen werden konnte und andererseits eine allgemeine Strategie zur Vorgehensweise geliefert wurde, sind doch noch nicht alle interessanten Fragestellungen geklärt. Hier sind zum einen die unbefriedigenden Möglichkeiten bei Strukturen mit mehreren Molekülen in der asymmetrischen Einheit zu nennen. Eine sinnvolle Erweiterung der Zahl simultan suchbarer Fragmente in PATSEE könnte diesen Schwachpunkt beheben. Zugleich könnte mit dieser Erweiterung die Anwendbarkeit auf flexiblere Molekülgeometrien ausgedehnt werden, so daß im Endeffekt eine Steigerung der einsetzbaren Fragmentgröße erreicht wird. Diese Erweiterung sollte bei der enormen Rechenleistung moderner Computersysteme kein unüberwindliches Hindernis darstellen, so daß die benötigte Zeit für einen PATSEE-Lauf mit mehreren zu suchenden Fragmenten auf maximal einige wenige Stunden ansteigen würde. Alternativ wäre zu überlegen, ob nicht das Aufheben der strikten Trennung von Rotationssuche und Translationssuche, also eine 6-dimensionale Fragmentsuche, die bisweilen zu beobachtenden Probleme der Rotationssuche beheben würde. Auch bei dieser Änderung der Vorgehensweise in PATSEE könnten moderne Computer sinnvoll eingesetzt werden. Vorteilhaft für die Strukturlösung wäre hier die Kombination der sehr erfolgreichen Diskriminierung der Gütekriterien bei der Translationssuche mit der bisher kritischen Bestimmung der Orientierung. Eine zweite Fragestellung, die im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden konnte, betrifft die Anwendbarkeit auf makromolekulare Verbindungen, die über eine große interne Regelmäßigkeit verfügen, wie beispielsweise kleinere Peptide mit alpha-helikaler Struktur oder einer beta-Faltblattstruktur. Verschiedene Testreihen an derartigen Verbindungen belegen die prinzipielle Machbarkeit, und außerdem konnte bereits in mindestens einem ähnlich gelagerten Fall [17] gezeigt werden, daß derartige Strukturlösungsversuche bei sehr großen Verbindungen durchführbar sind. Insbesondere wegen der erheblichen Schwierigkeiten bei der Kristallisation derartiger Verbindungen und dem großen wissenschaftlichen Interesse an ihrer Struktur könnten erfolgversprechende Ansätze zur Strukturlösung aus Pulverdaten einen wichtigen Beitrag in der Pharmazie, der Pharmakologie, der Biologie und nicht zuletzt in der Medizin leisten.
An der chemischen Synapse des Nervensystems führt ein präsynaptisches Aktionspotential zur Freisetzung eines Neurotransmitters, der über den synaptischen Spalt diffundiert und an die Rezeptoren der postsynaptischen Membran bindet. Die ionotropen Rezeptoren sind an dieser Membran zu Clustern aggregiert. Entstehung und Dynamik dieser Rezeptoraggregate sind für Funktion und Plastizität der Synapse essentiell. Für die Aggregation der inhibitorischen Glyzin- und der meisten Subtypen der GABAA-Rezeptoren ist das periphere Membranprotein Gephyrin notwendig. Es ist ein Schlüsselfaktor für die Genese und Aufrechterhaltung der glyzinergen postsynaptischen Membran. Dabei bindet es direkt an den GlyR und verbindet diesen über die Bindung von Mikrotubulie an das Zytoskelett. Auch andere Bindungspartner wurden nachgewiesen. Gephyrin ist in einer zweiten Funktion in die Synthese des Molybdän-Cofaktors involviert und weist Sequnezhomologien zu Proteinen anderer Spezies auf, die in diesen Syntheseweg eingebunden sind. Gephyrin ist ubiquitär exprimiert und wird alternativ gespleißt. Möglicherweise existieren verschiedene Varianten mit unterschiedlichen Funktionen. Die Untersuchung der Domänen und Bindungseigenschaften Gephyrins ist daher für das weitere Verständnis über Aufbau und Funktion der Synapse unerlässlich. In dieser Arbeit wurde ein Testsystem etabliert, mit dem sowohl heterolog exprimiertes als auch natives Gephyrin über die hoch-affine Bindung an den GlyR aufgereinigt werden konnte. Mit diesem System konnten erstmals unterschiedliche Varianten Gephyrins nachgewiesen werden. In verschiedenen Organen der adulten Ratte wurden dabei Gephyrinmoleküle mit Molekulargewichten zwischen 52 und den bekannten 93 kDA identifiziert. Auch Bestandteile des GlyR-Komplexes lassen sich mit dieser Methode anreichern. So wurde gezeigt, daß Gephyrin und Collybistin in einem trimeren Komplex mit dem GlyR vorliegen können. Hiermit ist es künftig möglich, in einem proteomischen Ansatz weitere aus dem GlyR-Konmplex anzureichern und zu identifizieren. Mit dem gleichen System wurde auch die Bindungsregion Gephyrins für den GlyR gefunden. Diese diskontinuierliche Bindungsstelle wird aus einer a-Helix der Aminosäuren 164 bis 184, sowie aus hydrophoben Resten gebildet, die von Aminosäure 15 bis 163 unregelmäßig über den gesamten N-Terminus Gephyrins verteilt sind. Zur Bindung an den GlyR werden beide Elemente benötigt. Das kleinste GlyR-bindende Gephyrinfragment erstreckt sich somit über die Aminosäuren 1-184. Mit einem Kosedimentationsassay wurde die Bindung Gephyrins an Mikrotubuli untersucht. Es stellte sich heraus, daß die vermutete Bindungsstelle nicht zur Bindung an Mikrotubuli benötigt wird. Vielmehr ist der C-terminale Abschnitt Gephyrins hierzu ausreichend. Um Regionen Gephyrins zu finden, die die Autoaggregation vermitteln, wurden Bindungsstudien mit dem Zwei-Hybrid-System und ein heterologes Expressionssystem in Zellkulturen durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß sowohl die N- als auch der C-terminal gelegene Bereich in der Lage sind, mit Gephyrin zu aggregieren. Im C-Terminus wurde die Domäne auf 62 Aminosäuren eingegrenzt. Zur Erfüllung der verschiedenen Funktionen Gephyrins sind die hierfür notwendigen Domänen offensichtlich in modularer Art organisiert. So lässt sich durch alternatives Spleißen eine Variante exprimieren, die den speziellen Erfordernissen der Zelle gerecht wird. In dieser Arbeit wurden mehrere Domänen und Regionen Gephyrins eingegrenzt, deren Aufgaben von der GlyR-Bindung über die Autoaggregation zur Bildung glyzinerger Proteinkomplexe und der Verknüpfung mit dem Zytoskelett reichen. Somit konnte ein Beitrag zum weiteren Verständnis über die glyzinerge Synapse geleistet werden.
Der Ein-Elektron Transporter Adrenodoxin spielt in der Steroidhormonbiosynthese eine entscheidende Rolle. Bislang konnte der Elektronentransportmechanismus zwischen der Adrenodoxin-Reduktase und dem Cytochrom P450 mittels Adrenodoxin nicht eindeutig nachgewiesen werden. Um die molekularen Wechselwirkungen besser verstehen zu können wurden in der vorliegenden Arbeit strukturelle Untersuchungen am Rinderadrenodoxin durchgeführt. Nachdem es bereits 1998 gelang die Struktur des oxidierten Zustands des Adrenodoxins aufzuklären [Müller et al. 1998], sollte die Struktur des reduzierten Zustands Aufschluss über mögliche redoxbedingte konformationelle Änderungen geben. Die Strukturaufklärung mittels NMR erfordert hohe Expressionsausbeuten und effektive Aufreinigungsstrategien des rekombinant hergestellten Proteins. Deshalb wurde zunächst eine Steigerung der Expression von löslichem Adrenodoxin in E.coli angestrebt. In Minimalmedium lieferte die Expression unter Zusatz von 2,5g Glycerin und 1g Glucose optimale Ergebnisse. So konnte nach Optimierung der Aufreinigungsabfolge aus einem Liter M9-Medium bis zu 50 mg homogenes Protein isoliert werden. Nach Optimierung der Expressionsbedingungen und der Aufreinigungsstrategie konnte das Adrenodoxin mit den NMR aktiven Isotopen 15N sowie 13C angereichert werden. Die Reduktion des Adrenodoxins erfolgte durch Zusatz von Natriumdithionit unter strikt anaeroben Bedingungen. Die strukturelle Untersuchung mittels NMR setzt eine Zuordnung der Proteinresonanzen voraus. Diese erfolgte unter Verwendung verschiedener Tripleresonanzexperimente. Eine Zuordnung war aufgrund des stark ausgeprägten Paramagnetismus nur für solche Reste möglich, die sich mindestens 8 Å vom [2Fe-2S]-Cluster des Adrenodoxins entfernt befinden. Trotzdem konnten wichtige Regionen, die sich außerhalb des Einflussbereichs des [2Fe-2S]- Clusters befinden, zugeordnet und mit dem oxidierten Zustand verglichen werden. Aus den 15N-NOESY-HSQC und 13C-NOESY-HSQC-Spektren wurden für den reduzierten Zustand unter Zuhilfenahme des Programms NMR2st 1300 effektiv abstandsbeschränkende NOESignale eindeutig zugeordnet. Nach Minimierung der Zielfunktion wurden im letzten Schritt 50 Strukturen mit dem Strukturkalkulationsprogramm DYANA berechnet. Die 20 Strukturen mit den besten Targetfunkionen wurden als Strukturensemble dargestellt. Für das Proteinrückrat beträgt der RMSD 2,34 Å. Anhand der chemischen Verschiebungsänderungen konnten erste Unterschiede zwischen oxidierten und reduzierten Zustand des Adrenodoxins festgestellt werden. Besonders markant sind diese Veränderungen im Bereich des C-Terminus und des Loops 80-86. Änderungen konnten auch im "Chemical Shift Index" und beim Vergleich der NOE-Konnektivitäten beider Redoxzustände beobachtet werden. Gerade für die Aminosäurereste Asp76 und Asp79, die für die Wechselwirkung zu den Redoxpartnern essentiell sind, konnten Veränderungen im Aufspaltungsmuster der "NOE-Pattern" nachgewiesen werden, was auf konformationelle Änderungen im Bereich der Wechselwirkungsdomäne hindeutet. Der Vergleich der beiden Tertiärstrukturen lieferte weitere Indizien dafür, dass der C-Terminus redoxbedingte konformationelle Änderungen erfährt. Während des Erstellens dieser Arbeit konnte eine US-amerikanische Gruppe durch Zufall die Existenz eines Adrenodoxin (oxidiert) Dimers bei physiologisch relevanten Konzentrationen nachweisen [Pikuleva et al. 2000]. Bei der Dimerisierung spielt der C-Terminus eine entscheidende Rolle. Zwei intermolekulare Wasserstoffbrücken bilden sich zwischen CTerminus und Protein des jeweils anderen Partners aus. Redoxbedingte konformationelle Änderungen im Bereich des C-Terminus sollten die Auflösung des Dimers begünstigen. Um diese Vermutung zu bestätigen wurden Cross-Linking Experimente mit dem reduzierten und oxidierten Zustand des Adrenodoxins durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten die Annahme, dass sich das Adrenodoxin Dimer nach Reduktion auflöst. Außerdem konnte anhand der voll funktionsfähigen C-terminal verkürzten Mutante Adx(4-108) die tragende Rolle des CTerminus bei der Dimerbildung bewiesen werden. Aus den experimentell erhaltenen Daten wurde ein neuer Elektronentransportmechanismus postuliert, der sowohl Adrenodoxin Dimere als auch Adrenodoxin Monomere als Elektronentransporter annimmt [Beilke et al. 2002]. Die streng kontrollierte Steroidhormonbiosynthese wird durch den Einsatz von Adrenodoxin Dimeren beschleunigt und durch die redoxbedingte Auflösung der Dimere optimert. Die redoxbedingte Auflösung eines Dimers ist in der Biochemie einzigartig und kann zum Verständnis molekularer Wechselwirkungen beitragen. Für die gesamte Gruppe der vertebraten Ferredoxine sind aufgrund der Struktur- und Sequenzhomologie ähnliche Ergebnisse zu erwarten. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Ferredoxin-NADP -Reduktase (FNR) für strukturelle Untersuchungen mittels NMR zugänglich gemacht werden. Durch Verwendung von bakteriellen Expressionssystemen, insbesondere dem pQE30-Expressionssystem, konnte der Anteil an löslichem Protein im Vergleich zum Ursprungssystem um den Faktor 12 erhöht werden. Dabei führten möglichst niedrige Expressionstemperaturen und IPTG Konzentrationen zu den höchsten Proteinausbeuten. Ein verbessertes Isolationsverfahren wurde etabliert und ermöglicht die Darstellung von bis zu 90 mg FNR aus einem Liter LB-Medium. Eine Verlängerung der Expressionsdauer, hervorgerufen durch das Wachstum in M9-Medium und in D2O, verringerte den Anteil an vollständig intaktem Protein, weshalb auf eine kostspielige Proteinpräparation in dreifach angereicherten Minimalmedium verzichtet wurde.