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Bei jeder chemischen Reaktion werden Bindungen gebrochen und andere neu geknüpft. Dabei ändert sich die Anordnung und eventuell Anzahl der Atome im Molekül. Voraussetzung hierfür sind Bewegungen der beteiligten Atome und Moleküle. Um chemische Umwandlungen in "Echtzeit" zu studieren, müssen Untersuchungen im Zeitbereich der Schwingungs- und Rotationsdynamik durchgeführt werden. Dazu nutzen Wissenschaftler des Instituts für Physikalische und Theoretische Chemie die Möglichkeiten der modernen Ultrakurzzeit-Lasertechnik.
Tumorspezifische T-Zellen stellen den im Prinzip wirkungsvollsten Mechanismus zur Abstoßung von Tumoren dar. Voraussetzung für die Aktivierung tumorspezifischer zytotoxischer CD8+ T-Zellen (Tc oder CTLs) ist die Präsentation von Tumorantigenen auf MHC-Klasse I Molekülen durch professionelle Antigen-präsentierende Zellen (APCs). Wegen ihrer Schlüsselrolle bei der Aktivierung von T-Zellen werden APCs in der aktiven Krebs-Immuntherapie eingesetzt. Unabhängig von CTLs können auch CD4+ Helfer T-Zellen (Th) eine Reihe effektiver Anti-Tumor Mechanismen einleiten. Die Aktivierung von CD4+ erfordert die Präsentation des Antigens via MHC-Klasse II Molekülen. Bis jetzt konnten jedoch nur einige wenige tumor-spezifische Th-Epitope identifiziert werden, welche auf MHC-Klasse II Molekülen präsentiert werden. Aus diesem Grund benutzen die meisten derzeitigen Vakzinierungsstrategien definierte Tc-Epitope, die in der Lage sind, spezifische Immunantworten gegen das Tumorantigen auszulösen. Diese Vakzine basieren auf tumorspezifischen Peptiden, Proteinen oder Proteinfragmenten, aber auch auf DNA-Konstrukten, welche für ein bestimmtes Tumorantigen kodieren. Um allerdings eine ausreichend starke Immunreaktion auszulösen, ist es notwendig diese normalerweise nur schwach immunogenen Substanzen zusammen mit Adjuvanzien zu verabreichen. Dendritische Zellen (DCs) sind hoch-effiziente APCs. Weil sie in der Lage sind, die primäre Immunantwort einzuleiten werden sie auch als „natürliches Adjuvanz“ bezeichnet. Nicht zuletzt deswegen werden bei der Entwicklung von Vakzinen immer mehr die einzigartigen Eigenschaften von DCs ausgenutzt. Gegenwärtige Studien untersuchen daher die Beladung von DCs mit synthetischen, tumorspezifischen Peptiden oder Tumor-Lysaten, um eine Aufnahme des Tumorantigens sowie dessen anschließende Präsentation auf MHCKlasse I Molekülen zu erreichen. Obgleich einige dieser Vakzinierungs-Ansätze zu vielversprechenden Ergebnissen führten, sind solche Strategien mit der aufwendigen und kostenintensiven ex vivo Aufbereitung primärer Dendritischer Zellen verbunden. Zudem muss gewährleistet sein, dass die ausgewählten T-Zell Epitope auch vom jeweiligen MHC-Haplotyp des Patienten präsentiert werden. Um einige dieser Nachteile auszugleichen, wären „Konstrukte“ wünschenswert, welche in vivo einen zielgerichteten Transport eines oder besser, mehrerer T-Zell Epitope zu den Dendritischen Zellen ermöglicht. Mit der Entwicklung und Optimierung von Systemen, die Tumorantigene gezielt zu und in APCs transportieren, könnte die Effizienz herkömmlicher Vakzinierungen gesteigert und deren Dosierung verringert werden. In dieser Arbeit wird die Herstellung sowie die funktionelle Charakterisierung zweier neuartiger Vakzine beschrieben. Diese Vakzine wurden für die in vivo Vakzinierung gegen das tumorassoziierte Antigen ErbB2 (HER2/neu) entwickelt. ErbB2 wird in einer Reihe von Tumoren wie Brust- und Ovarialkarzinomen oder Adenokarzinomen der Lunge überexprimiert. Andere Tumorenentitäten wie Kolon-, Nieren-, Blasen-, Speicheldrüsen-, Prostata- und Pankreaskarzinome zeigen ebenfalls eine variable Überexpression von ErbB2. Ziel des ersten der beiden Vakzinierungsansätze war eine verbesserte Aufnahme und Präsentation von Tumorantigenen durch APCs zu erreichen. Als Teil eines Fusionsproteins sollte hier die zielgerichtete Bindung einer antigenen Determinante an APC-spezifische Oberflächenmoleküle und deren anschließende Aufnahme und Prozessierung innerhalb von APCs ermöglicht werden. Als mögliche APC-Bindedomäne wurde ein Fragment gewählt, welches sich vom extrazellulären Anteil des B7-Rezeptors CTLA-4 (CTLA-4125) ableitet. B7 ist ein Oberflächenprotein, das speziell auf APCs exprimiert wird. Nach der bakteriellen Expression und Reinigung wurde durch FACS-Analyse gezeigt, dass lösliches humanes CTLA-4125 spezifisch sowohl an murine als auch humane B7 Moleküle bindet und daher als effektive APC-Bindungsdomäne für den zielgerichteten Transport von Tumorantigenen zu APCs verwendet werden kann. Als chimäre Proteinvakzine zur spezifischen Bindung an APCs wurden zwei mit C-ErbB2(N) bzw. C-E-ErbB2(N) bezeichnete Fusionsproteine konstruiert. Diese setzen sich aus CTLA-4125 am N-Terminus für die Bindung an APCs und einem Fragment des extrazellulären Teils des humanen tumorassoziierten ErbB2 Antigens (ErbB2(N), Aminosäuren 1-222) am C-Terminus zusammen. Beim C-E-ErbB2(N) Protein wurde zusätzlich die Translokationsdomäne von Pseudomonas exotoxin A (ETA II) zwischen der APC-Bindungsdomäne und der antigenen Determinante eingefügt. Diese Domäne könnte nach Rezeptor-vermittelter Aufnahme des Fusionsproteins die Freisetzung des Tumorantigens aus dem Endosom ins Zytoplasma verbessern und so die Prozessierung und Präsentation des Antigens via MHC-Klasse I verstärken. Beide chimären CTLA-4-ErbB2 Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert und mittels Metallchelat-Chromatographie aus den bakteriellen Lysaten gereinigt. Die spezifische Bindung der rekombinanten Fusionsproteine an B7 Moleküle auf der Zelloberfläche sowie deren Aufnahme durch B7-exprimierende humane Raji Zellen wurde mittels FACS Analyse und konfokaler Mikroskopie nachgewiesen. In Balb/c Mäusen wurde untersucht, inwieweit die Fusionsproteine eine Immunantwort gegen das Tumorantigen auslösen können. Die Vakzinierung von Balb/c Mäusen mit den CTLA-4 Fusionsproteinen bewirkte die Abstoßung anschließend subkutan injizierter syngener ErbB2-positiver Nierenkarzinomzellen (Renca-lacZ/ErbB2) nach subkutaner Injektion. Dies deutet auf die Erzeugung protektiver Immunität hin. Obgleich beide Fusionsproteine effektiv waren, zeigte das Fusionsprotein C-ErbB2(N), dem die bakterielle Translokationsdomäne fehlt, in mehreren unabhängigen Experimenten eine höhere Wirksamkeit als C-E-ErbB2(N). Vakzinierung mit den CTLA-4 Fusionsproteinen erzeugte keinen Schutz gegen ErbB2-negative Kontroll-Tumorzellen. Dies Experimente zeigt die Antigen-Spezifität der induzierten Immunantwort nach Vakzinierung mit CTLA-4 Fusionsproteinen. T-Zell Depletionsexperimente ergaben, dass die protektiven Effekte eindeutig von CD8+ CTLs abhängig waren. Eine erneute, diesmal intravenöse Applikation von ErbB2+ Tumorzellen in vakzinierte, tumorfreie Mäuse zwei Monate nach der ersten, subkutanen Injektion („Re-challenge“) führte nicht zur Ausbildung von Lungenmetastasen. Dies deutet darauf hin, dass durch die Vakzinierung eine langanhaltende Immunreaktion induziert wurde. In therapeutischen Vakzinierungsexperimenten, die wohl am ehesten eine klinische Situation in Tumorpatienten widerspiegeln, wurden die CTLA-4 Fusionsproteine in die Umgebung bereits etablierter subkutaner Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren injiziert. In zwei unabhängigen Experimenten konnte gezeigt werden, dass durch die therapeutische Vakzinierung mit CErbB2(N) 7 von 8 Mäusen geheilt werden konnten, wohingegen die Wirkung von C-EErbB2(N) – von 8 Mäusen wurden 6 geheilt – auch im therapeutischen Einsatz etwas schwächer zu sein schien. Nach einem intravenösen „Re-challenge“ mit Renca-lacZ/ErbB2 Zellen waren bereits geheilte Tiere auch vor der Ausbildung von Lungenmetastasen geschützt. Dies bestätigt eine durch die Vakzinierung hervorgerufene lang-anhaltende Anti-Tumor Immunität. Alternativ zur Produktion rekombinanter Proteinvakzine in Bakterien wurde auch die direkte Injektion von DNA-Konstrukten zur in vivo Expression und Sekretion der CTLA-4 Fusionsproteine getestet (DNA-Vakzinierung). Basierend auf dem Plasmid pSecTag2 wurden Säugerzell-Expressionsvektoren hergestellt, welche unter der Kontrolle eines CMVPromotors die beiden Fusionsproteine C-ErbB2(N) bzw. C-E-ErbB2(N) kodieren. Ein Igk “leader” Signalpeptid ermöglicht hierbei die Sekretion der produzierten Proteine. Nach Transfektion der Plasmide in COS-7 Zellen konnte Sekretion der CTLA-4-Fusionsproteine in den Zellkulturüberstand sowie deren Zellbindungsspezifität für B7, mit Hilfe von Western-Blot und FACS-Analysen nachgewiesen werden. Protektionsexperimente ergaben, dass alle Balb/c Mäuse, die vorher durch intramuskuläre Injektion der CTLA-4-ErbB2 DNA-Vakzine vakziniert wurden, vor dem Anwachsen subkutan injizierter Renca-lacZ/ErbB2 Tumorzellen geschützt waren. Mäuse, die als Kontrolle mit dem leeren pSecTag2 Vektor vakziniert wurden, entwickelten dagegen schnell wachsende Tumoren. In diesem ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass chimäre Proteinvakzine, die in einer einzigen Polypeptidkette eine Zellerkennungsdomäne zur spezifischen Bindung an APCs und ein antigenes Proteinfragment aus dem humanen ErbB2 enthalten, in vivo eine äußerst wirkungsvolle ErbB2-spezifische T-Zell vermittelte Anti-Tumor Immunantwort auslösen. Hierbei konnte sowohl durch die Injektion von rekombinanten, in Bakterien hergestellten Proteinen, wie auch durch DNA-Vakzinierung zur in vivo Produktion dieser chimären Proteinvakzine erreicht werden, dass syngene, ErbB2 exprimierende Tumoren abgestoßen wurden. Die oben beschriebenen chimären Proteinvakzine enthalten ein großes Proteinfragment, abgeleitet aus einem humanen Tumorantigen, welches zu APCs befördert und von ihnen aufgenommen wird. Dieser Ansatz ist nicht unbedingt abhängig von einem bestimmten MHCTyp und möglicherweise besonders dann wirkungsvoll, wenn Immunantworten gegen Antigene erzeugt werden sollen, für die noch keine von MHC-Molekülen präsentierten Peptide identifiziert sind. Für Tumorantigene, aus welchen bereits einzelne Peptide als potentielle Tumorabstoßungs-Antigene definiert sind, wurden in einzelnen Fällen synthetische Derivate solcher Peptide erfolgreich eingesetzt, um hochspezifische T-Zell Antworten zu erzeugen. Aber auch in diesem Fall könnte die Verknüpfung des Antigens mit einem geeigneten „Antigen-Carrier“ eine verbesserte Aufnahme und Präsentation durch APCs und eine Verstärkung der Immunantwort gegen das Antigen zur Folge haben. Aus diesem Grund wurde in einem alternativen Ansatz zur Induktion einer ErbB2-spezifische Anti-Tumor Immunität die in vivo Anwendung von synthetischen Vakzin-Komplexen untersucht, welchen ein liposomaler Träger als Vektor für Peptid-Antigene zugrunde liegt. Diese Peptide sind über einen immunstimulatorischen Lipopeptid-Anker (Pam3CysSerSer) mit der Oberfläche solcher Liposomen verknüpft. Dieser Teil der Arbeit wurde in enger Kollaboration mit Audrey Roth, Dr. Benoit Frisch und Dr. Francis Schuber, Laboratoire de Chimie Bioorganique, Faculté de Pharmacie, Université Louis Pasteur (ULP), Strasbourg ausgearbeitet, die alle in dieser Arbeit verwendeten liposomalen Vakzine konstruierten und für in vivo Untersuchungen bereitstellten. Zwei liposomale Substanzen wurden synthetisiert. Ein Mono-Epitop Konstrukt, als „Tc-ErbB2-liposomes“ bezeichnet, trägt ein Tc-Epitop (TYLPTNASL), welches sich von der Aminosäuresequenz des humanen ErbB2 Moleküls ableitet. Es war bereits vorher gezeigt worden, dass dieses Peptid mit hoher Affinität an das murine H-2Kd MHC-Klasse I Molekül bindet und eine Peptid-spezifische CTL Immunantwort in Balb/c Mäusen auslösen kann. Die zweite liposomale Substanz, als „Tc-ErbB2/Th-liposomes“ bezeichnet, enthält zusätzlich zum ErbB2-Peptid noch ein universelles Th-Epitop, das sich vom Influenza Virus Hämagglutinin (HA 307-319) ableitet und ebenfalls über den adjuvanten Anker mit dem Liposom verbunden ist. Durch das Hinzufügen des Th-Epitops wurde beabsichtigt, zusätzlich CD4+ Helfer TZellen zu rekrutieren und damit die CTL Antwort gegen das Tc-Epitop zu verstärken. Durch ex vivo Restimulation von Milzzellen aus zuvor mit den liposomalen Konstrukten vakzinierten Tieren mit dem ErbB2-Peptid konnte die in vivo Aktivierung Tc-spezifischer CTLs nachgewiesen werden. In dem gleichen immunkompetenten Balb/c Maus-Modell, das auch zur Charakterisierung der CTLA-4-ErbB2 Proteinvakzine verwendet worden war, wurde auch die anti-tumorale Aktivität der liposomalen Komplexe untersucht. Die Vakzinierung von Balb/c Mäusen mit beiden Konstrukten, Tc-ErbB2-liposomes und Tc-ErbB2/Th-liposomes, führte zur Abstoßung anschließend subkutan injizierter ErbB2 exprimierender RencalacZ/ErbB2 Zellen. Eine therapeutische Vakzinierung von Mäusen, die bereits etablierte ErbB2+ Tumoren trugen, führte zu einem verlangsamten Wachstum in einigen und zur kompletten Abstoßung in den übrigen Tieren. In Kontrolltieren, die lediglich mit dem liposomalen Träger vakziniert waren, konnten keinerlei Tumorregression beobachtet werden. Während beide liposomalen Substanzen sowohl bei der protektiven als auch bei der therapeutischen Vakzinierung Anti-Tumor Effekte zeigten, verstärkte das Hinzufügen des Th-Epitops zu den „Tc-ErbB2 liposomes“ sowohl die ErbB2-spezifische Immunantwort als auch die Anti-Tumor Immunität. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung einer synergistischen CD4+ T-Zell Aktivierung als Teil von Anti-Tumor Immunantworten. Unabhängig von ihrer unterschiedlichen Wirkungsweise und chemischen Zusammensetzung stellen beide in dieser Arbeit untersuchten Vakzinkomplexe effektive Tumorvakzine dar, die nach ihrer Anwendung in vivo ErbB2-spezifische, T-Zell vermittelte Anti-Tumor Immunantworten auslösen können. Die chimären Fusionsprotein-Vakzine enthalten ein großes antigenes Proteinfragment. Durch ihre spezifische Zellbindungsdomäne wird der zielgerichtete Transport zu und die Aufnahme des Antigens in APCs, gefolgt von in vivo Prozessierung des Proteins in kleine antigene Peptide, MHC-Präsentation und schließlich Aktivierung tumorspezifischer T-Zellen gewährleist. Dieser Ansatz könnte insbesondere dann nützlich sein, wenn für das jeweilige Tumorantigen noch keine passenden T-Zell Epitope charakterisiert sind. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Konstrukte ist, dass in einem einzigen Vakzin mehrere unterschiedliche antigene Determinanten bereitgestellt werden können. Für eine Reihe von Tumorantigenen sind bereits einzelne Peptide als potentielle Tumorabstoßungs-Antigene charakterisiert worden. Die in dieser Arbeit beschriebenen neuartigen liposomalen Träger, welche zusätzlich zum Tc-Epitop einen immunstimulatorischen Anker und ein starkes Th-Epitop tragen, könnten dazu beitragen, die Immunogenität und die anti-tumorale Aktivität synthetischer Peptid-Vakzine zu erhöhen.
Heute gewinnen pflanzliche Arzneimittel im Zeichen einer verstärkten Hinwendung zu natürlichen, relativ nebenwirkungsarmen Medikamenten zunehmend an Bedeutung, so auch die über Jahrtausende hinweg traditionell angewandte Ginsengwurzel (Panax ginseng) und der Indische Weihrauch (Boswellia serrata). Neben der Struktur- und Extraktanalytik konzentriert sich die Forschung in zunehmenden Maße darauf, die zahlreichen pharmakologisch untersuchten und klinisch beobachteten Wirkungen dieser beiden Arzneipflanzen einzelnen Inhaltsstoffen zuzuordnen. Bei der Ginsengwurzel gestaltet sich dies jedoch besonders schwierig. Dies ist begründet durch die große Anzahl strukturell ähnlicher Ginsenoside sowie durch deren unterschiedlicher Metabolismus. Zwar ist aus In-vitro-Experimenten bekannt, daß die Degradation über die stufenweise Deglukosylierung stattfindet, allerdings ist bislang nicht geklärt, ob intakte Ginsenoside überhaupt resorbiert werden und welche der vielen in vitro ermittelten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Anders als bei Ginseng, kann die therapeutische Wirkung des Indischen Weihrauches wohl definierten Inhaltsstoffen, AKBA und KBA, zugeschrieben werden. Dennoch mangelt es hier an verlässlichen pharmakokinetischen Daten, da bislang keine validierte bioanalytische Methode zur Verfügung stand. Im Rahmen der Bioanalytik von Ginsenosiden und Boswellliasäuren kamen in der vorliegenden Arbeit die Nano-ESI-MS(n)-Technik sowie die HPLC-Analytik zur Anwendung. Bereits bei der Strukturanalyse von Ginsenosiden erwies sich die Kombination der Nano-ESI-Technik mit MS(n)-Experimenten in einer Quadrupol-Ionenfalle als besonders vorteilhaft. Im Vergleich zu konventionellem ESI bietet Nano-ESI nicht nur den Vorzug, mit kleinsten Substanzmengen lange Messungen durchführen zu können, sondern auch den Vorteil einer effektiveren, weniger diskreminierenden Ionisation. Sowohl die hohe Sensitivität der Nano-Elektrosprayionisierung bei der Analyse von glykosidischen Verbindungen als auch die umfangreichen Strukturinformationen infolge mehrerer aufeinanderfolgender stoßinduzierter Fragmentierungen machen diese Technik zu einer attraktiven und effizienten Methode zur Analyse von Ginsenosiden. In MS(n)-Experimenten äußert sich das charakteristische Fragmentierungsverhalten der Ginsenoside in der sequentiellen Abspaltung der Zuckereinheiten in sukkzessiven Fragmentierungsschritten. Mit dieser Methode konnten die Zuckerketten an verschiedenen Positionen des Protopanaxadiol- bzw. Protopanaxatriolaglykons der Ginsenoside identifiziert, die glykosidischen Verknüpfungen innerhalb der einzelnen Zuckereinheiten durch spezifische Ringfragmente bestimmt und die genaue(n) Verknüpfungsposition(en) enzymatisch eingeführter Galaktose(n) lokalisiert werden. Bisher wurden allerdings Nano-ESI-MS/MS bzw. MS(n)-Untersuchungen primär an wässrigen oder organischen Lösungen von isolierten / aufgereinigten Stoffen oder Stoffgemischen durchgeführt. In dieser Arbeit wurde erstmals diese Technik in der Bioanalytik zur Identifizierung von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und -urin angewandt. Obwohl die optimale Analytkonzentration für die Nano-Elektrosprayionisierung im allgemeinen bei 10-5M liegt, ist es gelungen, die Ginsenoside anhand ihrer spezifischen Fragmentionen im MS/MS Modus bis zu einer Konzentration von 2 ng/mL (10-8M) in biologischen Matrices nachzuweisen. Auch wenn die Molekülionenpeaks bei diesen geringen Konzentrationen im Rauschen untergehen, können die Ginsenoside durch selektive Isolierung der gewünschten Vorläuferionen und deren anschließende Fragmentierung in der Quadrupol-Ionenfalle auf der Basis der Detektion spezifischer Fragmente identifiziert werden. Da bei der Fragmentierung der gleichen Vorläuferionenmasse in Leerplasma bzw. Urin keine charakteristischen Fragmentionen gebildet werden, handelt es sich somit um einen spezifischen Nachweis der Ginsenoside in biologischen Matrices. Vor dem Hintergrund dieser vielversprechenden Vorversuche wurde eine Pilotstudie zum qualitativen Screening von Ginsenosiden und deren Metaboliten in Humanplasma und –urin durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß Protopanaxatriol-Ginsenoside sowohl im Magen hydrolysiert als auch intestinal degradiert werden. Schon in den ersten Stunden nach der einmaligen oralen Einnahme von Ginsana G115 Kapseln wurden die Hydrolyseprodukte G-Rh1 und hydratisiertes G-Rh1 in Humanplasma detektiert. Die schnelle Resorption dieser beiden Verbindungen aus dem oberen Gastrointestinaltrakt deutet auf die Hydrolyse des Ginsenosides Rg1 im Magen hin. Das spätere Auftreten eines weiteren monoglukosylierten Protopanaxatriols, des Degradationsproduktes G-F1, liefert den ersten In-Vivo-Hinweis auf einen intestinalen Metabolismus von Protopanaxatriol-Ginsenoside. Im Gegensatz zu den Protopanaxatriolginsenosiden passieren die Protopanaxadiol-Ginsenoside den Magen unverändert, wie aus der Abwesenheit jeglicher Protopanaxadiol-Degradationsprodukte im Plasma und Urin in den ersten Stunden nach der Applikation geschlossen werden kann. Erst im unteren Gastrointestinaltrakt werden Protopanaxadiol-Ginsenoside durch intestinale Bakterien zu „Compound-K“ abgebaut und anschließend resorbiert. Der Nachweis von Ginsenosid Rb1 im Plasma, sowie weiterer Ginsenoside im Urin eines Probanden zeigt, daß auch Ginsenoside in ihrer intakten Form resorbiert werden können. Dennoch sind weitere Studien hierzu notwendig, um zu klären, ob die Resorption intakter Ginsenoside die Regel oder eher eine Ausnahme darstellt. Mit der Identifizierung des Hydrolyseproduktes G-Rh1, der Degradationsprodukte G-F1 sowie „Compound-K“ in Humanplasma und -urin konnte schließlich die Frage geklärt werden, welche der zahlreichen in vitro bestimmten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Damit ist die Basis für eine spätere Quantifizierung dieser Verbindungen nach ihrer Isolierung bzw. Herstellung und Charakterisierung als Referenzsubstanzen geschaffen. Außerdem können diese neuen Erkenntnisse helfen, pharmakologische Ergebnisse aus In-vitro-Versuchen mit In-vivo-Daten besser zu korrelieren, da sie erste Hinweise geben, welche der in vitro getesteten Substanzen für die in vivo beobachteten Effekte verantwortlich sein könnten. Bisher wurde Nano-ESI-MS(n) in der Bioanalytik pflanzlicher Arzneistoffe nicht eingesetzt. In dieser Arbeit wurde diese Technik erstmals zum Screening von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und –urin benutzt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Nano-ESI-MS(n) auch eine empfindliche und sensitive Methode zur Identifizierung und zum Nachweis anderer medizinisch relevanter glykosidischer Verbindungen in biologischen Matrices darstellt, woraus sich neue Perspektiven für den Einsatz dieser Technik in der Metabolitenforschung sowie in der Bioanalytik pflanzlicher Xenobiotika ergeben. In den letzten Jahren rückte auch der Indische Weihrauch immer mehr in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen sowie therapeutischen Interesses. Aufgrund der selektiven Hemmung der 5-Lipoxygenase gewinnen AKBA und KBA, als neue entzündungshemmende Verbindungen, zunehmend an Bedeutung. Während die quantitative Analytik der Boswelliasäuren in Extrakten und in verschiedenen Fertigarzneimitteln erhebliche Fortschritte erzielen konnte, fehlten auf dem Gebiet der Bioanalytik bislang validierte analytische Methoden zur Durchführung pharmakokinetischer Studien. Vor diesem Hintergrund wurde eine HPLC-Methode zur Bestimmung von KBA in Humanplasma entwickelt und validiert. Die Methode ist durch eine einfache Probenvorbereitung gekennzeichnet, die sich auf eine Festphasenextraktion der KBA aus der komplex zusammengesetzten biologischen Matrix beschränkt. Im Anschluß an die chromatographische Trennung auf einer RP-C18 Säule erfolgt die Quantifizierung der KBA mittels UV-Detektion bei 250 nm. Um eine adäquate Bestimmung der KBA in Humanplasma zu gewährleisten, wurde eine umfassende Validierung durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter, wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte HPLC-Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Mit der Erstellung einer Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve im Rahmen einer ersten Pilotstudie konnte diese Methode zudem ihre praktische Anwendbarkeit unter Beweis stellen. Somit steht für zukünftige pharmakokinetische Studien eine validierte HPLC-Analytik zur Bestimmung von KBA, einer der Hauptwirkstoffe des Indischen Weihrauches, zur Verfügung, die sich durch hohe Spezifität, Reproduzierbarkeit und Präzision auszeichnet. Verlässliche Daten zur Pharmakokinetik am Menschen sind heute von besonderer Bedeutung, da sie helfen, die Dosierung zu optimieren, die biopharmazeutischen Eigenschaften von Präparaten zu verbessern und die Sicherheit bei der Anwendung zu erhöhen. Insbesondere im Hinblick auf bereits festgestellte Interaktionen von pflanzlichen Arzneimitteln mit Medikamenten reicht es nicht mehr aus, wenn sich pflanzliche Arzneimittel, wie beispielsweise Ginseng und Indischer Weihrauch, nur auf ihre langjährigen tradierten Anwendungserfahrungen berufen. So wird auch bei Phytopharmaka in verstärktem Maße eine wissenschaftliche Absicherung durch bioanalytische Forschung erwartet. Mit der Identifizierung der Ginsenoside und deren Degradationsprodukte im Menschen, der erstmaligen Anwendung von Nano-ESI-MS(n) in der Metabolitenforschung und der Entwicklung einer validierten bioanalytischen Methode zur Bestimmung der 11-Keto-Beta-Boswelliasäure in Humanplasma wurde diesen Erfordernissen Rechnung getragen.
Der bc1-Komplex ist eine Komponente der Atmungskette und damit essentiell für den Energiestoffwechsel vieler Organismen, die zum aeroben Wachstum befähigt sind. Im Vergleich zu mitochondrialen bc1-Komplexen, die bis zu elf unterschiedliche Untereinheiten besitzen, ist das Enzym aus Paracoccus denitrificans mit nur drei Untereinheiten einfach aufgebaut. Vergleicht man die Sequenz des P. denitrificans Cytochrom c1 Genproduktes mit denen anderer prokaryotischer und mitochondrialer Cytochrom c1 Untereinheiten, so fällt auf, dass dieses prokaryotische Protein eine für Paracoccus charakteristische zusätzliche N-terminale Domäne von ca. 150 Aminosäuren trägt, die zudem eine sehr auffällige Zusammensetzung besitzt (40% saure Reste, 40% Alanine, keine einzige positiv geladene Aminosäure). Diese saure Domäne wird in anderen Organismen durch zusätzliche Untereinheiten innerhalb des bc1-Komplexes dargestellt, die in direkter Assoziation mit dem Cytochrom c1 vorliegen. Bis dato konnte für Paracoccus jedoch noch kein eindeutiger Beweis für eine Beteiligung dieser sauren Domäne an der Wechselwirkung zwischen bc1 und den Substraten des Komplexes geführt werden. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu konstruieren und in E. coli heterolog zu exprimieren. Durch zielgerichtete Mutagenese am Cytochrom c1 und anschließende kinetische Charakterisierung der Produkte sollte die funktionelle Bedeutung einzelner Aminosäurereste dargestellt werden. Es ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu exprimieren. Für das saure Fragment (SF) wurde lediglich der Membrananker deletiert, während das Kernfragment (KF) durch die zusätzliche Deletion der sauren Domäne als eine Art minimalisiertes Cytochrom c1 anzusehen ist. Beide Fragmente konnten nach erfolgreicher Aufreinigung durch pre-steady-state-Kinetiken in ihrer Wechselwirkung mit dem homologen Reaktionspartner Cytochrom c552 sowie mit drei weiteren c-Typ Cytochromen funktionell charakterisiert werden. Des weiteren wurden zahlreiche Mutanten von KF hergestellt und ebenfalls hinsichtlich ihrer Wechselwirkung mit Cytochrom c552 getestet. Die Untersuchungen zur Ionenstärkeabhängigkeit des Cytochrom c1 zeigten, dass das saure Fragment unter den gewählten Versuchsbedingungen im Vergleich zu KF keine erhöhte Spezifität gegenüber Cytochrom c552 besitzt. Es konnte jedoch eindeutig gezeigt werden, dass die Interaktion der beiden untersuchten Elektronentransportpartner von der Wechselwirkung geladener Aminosäureseitenketten auf beiden Proteinen abhängt und somit elektrostatischer Natur ist. Dieser Sachverhalt wird zusätzlich durch die Ergebnisse bestätigt, die mit der Negativkontrolle (Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa) erzielt wurden. Dieses negativ geladene Protein zeigte nur eine schwach affine Wechselwirkung mit dem ebenfalls stark negativ geladenen Cytochrom c1 aus P. denitrificans. Zusätzliche kinetische Untersuchungen mit weiteren Cytochromen im Bereich mittlerer Ionenstärke zeigten, dass die beiden löslichen Fragmente SF und KF keine erhöhte Spezifität gegenüber homologen Elektronenakzeptoren (Cyt c552 und Cyt c550 aus P. denitrificans) im Vergleich zu dem nicht-homologen Reaktionspartner (Pferdeherz Cyt c) besitzen. Bei diesen drei Cytochromen handelt es sich um Proteine, die eine basische Interaktionsfläche aufweisen. In Hinblick auf die Ergebnisse zur Wechselwirkung von KF und SF mit dem löslichen Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa wird jedoch deutlich, dass die Spezifität des Cytochrom c1 gegenüber möglicher Substrate alleinig durch das Kriterium des Oberflächenpotentials bedingt ist. Keine der eingeführten Punktmutationen führte zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des Proteins. Vielmehr zeigten die meisten Mutanten eine im Vergleich zum Wildtyp leicht herabgesetzte Geschwindigkeitskonstante der Elektronentransport-Reaktion. Der deutlichste Effekt wurde für die Mutanten E243K (36 % der WT-Aktivität) und E243Q (78 % der WT-Aktivität) bestimmt. Dieser Rest ist am oberen, dem Periplasma zugewandten Rand der Hämspalte positioniert, wodurch eine direkte Interaktion mit dem Cytochrom c552 während der Elektronentransport-Reaktion sehr gut möglich ist. Die im Rahmen dieser Arbeit bestimmten Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion zwischen Cytochrom c1 und Cytochrom c552 lassen eindeutig auf einen diffusionskontrollierten Prozess schließen. Ein solches Verhalten schließt eine spezifische Oberflächen-Wechselwirkung der beiden Proteine nicht aus Die Ergebnisse der Mutagenesestudie verdeutlichen jedoch, dass die Substratspezifität nicht primär durch definierte gegensätzliche Ladungspaare auf der Oberfläche von Cytochrom c1 und Cytochrom c552 definiert wird.
Das Rauchen von Kokain („Crack“) hat sich in den letzten Jahren weltweit verbreitet und Crack hat eine wichtige Stellung in der Gruppe der harten Drogen eingenommen. Der inhalative Konsum unterscheidet sich von den anderen Formen der Kokain-Aufnahme durch seine schnelle und intensive Wirkung sowie durch einen sehr starken, unkontrollierten Drang zum erneuten Konsum. Schwere gesundheitliche Schäden sind die Folge sowie auch soziale Isolierung und zwischenmenschliche Konflikte. Da zur Finanzierung der Crack-Sucht häufig Straftaten begangen werden, sind diese Fälle forensisch von besonderem Interesse. Im Gegensatz zum nasalen oder intravenösen Konsum entsteht ausschließlich beim Rauchen das Pyrolyseprodukt Anhydroecgoninmethylester (AEME), welches deshalb als Marker für einen Crack-Konsum angesehen wird. Die toxikologischen Aspekte dieser Substanz sind nicht ausreichend untersucht, um dessen toxikologisches Potential abschätzen zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten analytische Methoden entwickelt und der Metabolismus von AEME untersucht werden, um Daten an authentischen Proben von Kokainkonsumenten erheben zu können.
Sequenz-spezifische DNA-Rekombination (SSR) bewirkende Systeme aus niederen Organismen, wie z.B. das Cre/loxP-System aus dem P1-Phagen oder das Flp/FRT-System aus Hefe, sind in den letzten Jahren als wichtige und weitverbreitete Werkzeuge zur Modifikation des Säugergenoms etabliert worden. Dies hängt unter anderem mit der Vielfalt an Reaktionen zusammen, welche diese Systeme in der Lage sind durchzuführen. Dazu zählen Exzisions/Deletions-, Integrations-, Inversions- und Translokationsreaktionen. Die hier vorgestellte Arbeit fokussiert auf die Integrationsreaktion, welche aus thermodynamischen Gründen bisher keine breite Anwendung finden konnte, und ihren Einsatz bei der Etablierung allelischer Serien in embryonalen Stammzellen (ES Zellen) oder frühen Embryonen der Maus. Eine solche Methodik wäre ideal für Fragestellungen zu Funktionen von Genen in vivo (Functional Genomics) geeignet. Zur Anwendung kam ein als „Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch“ (recombinase-mediated cassette exchange, RMCE) bezeichnetes Verfahren. RMCE ist ein Zwei-Schritt-Verfahren: Zuerst wird der interessierende Genort durch homologe Rekombination derart verändert, daß 5’ und 3’ des Genlocus SSR-Erkennungsstellen eingeführt werden. Durch das Einbringen eines die gleichen Erkennungsstellen tragenden Austauschplasmides und die Bereitstellung der entsprechenden Rekombinase kann die im Genom residierende gegen die eingebrachte Kassette (von Erkennungsstellen flankiertes DNA-Segment) ausgetauscht werden. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Ansätze für RMCE vorgestellt: Der erste Ansatz basiert auf der Verwendung heterospezifischer lox-Sequenzen, welche sich in einer Base unterscheiden (lox511/loxP). Diese Mutation sollte eine effektive Integration durch Verhinderung der Exzision gewährleisten. Es konnte hier gezeigt werden, daß RMCE unter Verwendung einer solchen Methodologie in ES Zellen und frühen Mausembryonen effizient möglich ist, daß das Produkt der Integration jedoch instabil ist und nachfolgender Exzision unterliegt. Diese Deletionsreaktionen sind durch promiskuitive Rekombination der verwendeten lox511 und loxP bedingt. Aus diesen Erkenntnissen wurde ein zweiter Ansatz entwickelt, welcher auf dem simultanen Einsatz des Cre/lox- und des Flp/FRT-Systems basiert. Diese Methodik umgeht die Nachteile promiskuitiver Erkennungssequenzen und ihre Anwendbarkeit, Funktionsfähigkeit und Effizienz in ES Zellen konnten demonstriert werden. Ein solches Verfahren, welches sowohl in Zellkultur als auch in frühen Mausembryonen zum Einsatz kommen könnte, bietet insbesondere im Hinblick auf zukünftige Bedürfnisse in der Functional Genomics viele Optionen.
The volume changes of cesium under pressure are discussed with respect to the packing density of the atoms and valence. The element is univalent in densely packed Cs I and Cs II. Valence increases in Cs III (packing density q = 0.973), in Cs IV (q = 0.943), in Cs V (q ~ 0.99), and in close packed Cs VI. The diminuition of volume beyond ~ 15 GPa is caused by this increase only which implies that electrons of the fifth shell act as valence electrons.