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Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Generierung virtueller Organismen respektive mit der dreidimensionalen Nachbildung anatomischer Strukturen von Pflanzen, Tieren, Menschen und imaginärer Wesen per Computer. Berücksichtigt werden dabei sowohl die verschiedenen Aspekte der Visualisierung, der Modellierung, der Animation sowie der Wachstums-, Deformations- und Bewegungssimulation. Dazu wird zuerst eine umfassende State-of-the-Art-Analyse konventioneller Methoden zur Organismengenerierung durchgeführt. Im Laufe dieser Analyse werden die Defizite herkömmlicher Verfahren aufgezeigt und damit eine gezielte Anforderungsanalyse für neue Verfahren erstellt. Mit Hilfe dieser Anforderungsanalyse wurde nach neuen Lösungsansätzen gesucht. Besonders hilfreich hat sich in diesem Zusammenhang die Frankfurter Organismus- und Evolutionstheorie erwiesen. Gemäß dieser Theorie stellen Organismen aus biomechanischer Sicht komplexe hydropneumatische Konstruktionen dar. Ihre Körperformen und Bewegungen werden weitgehend durch stabilisierende, kräfteerzeugende und kräfteübertragende Strukturen generiert, die den Gesetzen der klassischen Hydropneumatik folgen. So entstand die Idee, Organismen auf der anatomischen Ebene als eine komplexe Hierarchie unterschiedlicher hydropneumatischer Einheiten anzusehen, welche mechanisch miteinander interagieren. Diese Sichtweise liefert die Grundlage für ein neues biologisches Simulationsmodell. Es erlaubt der Computergraphik, sowohl die Form eines Organismus zu beschreiben als auch sein Verhalten bezüglich seiner Bewegungsabläufe, seiner evolutionären Formveränderungen, seiner Wachstumsprozesse und seiner Reaktion auf externe mechanische Krafteinwirkungen numerisch zu simulieren. Aufbauend auf diesem biologischen Simulationsmodell wurde ein neues Verfahren (Quaoaring) entwickelt und implementiert, das es erlaubt, beliebige organische Einheiten interaktiv in Echtzeit zu modellieren. Gleichzeitig ermöglicht dieses Verfahren die Animation von Bewegungen, Wachstumsprozessen und sogar evolutionären Entwicklungen. Die Animation verhält sich dabei im Wesentlichen biologisch stringent, z.B. wird das interne Volumen während komplexer Bewegungsabläufe konstant gehalten. Die größte Stärke der neuen Modellierungs- und Animationstechnik ist die holistische Verschmelzung des biologischen Simulationsmodells mit einem computergraphischen Geometriemodell. Dieses erlaubt dem Modellierer, biologische Konzepte für die Beschreibung der Form und anderer Attribute einer organischen Einheit zu verwenden. Darüber hinaus ermöglicht es die Animation des geometrischen Modells durch einfache Parameterspezifikation auf einer hohen Abstraktionsebene. Dazu wird ein utorenprozess beschrieben, wie Quaoaring für Modellierungs- und Animationszwecke verwendet werden kann. Es werden Aspekte der prototypischen Implementierung der Quaoaringtechnologie behandelt und über die Ergebnisse berichtet, die bei der Implementierung und der Anwendung dieses Softwareframeworks gewonnen wurden. Schließlich wird die Quaoaringtechnologie in ihrem technologischen Kontext beleuchtet, um ihr Zukunftspotential einzuschätzen.
Während sich das deutsche Erziehungs-, Bildungs- und Sozialsystem durch Achtung und Expansion „institutioneller Vielfalt“ auszeichnet, wird in Spanien spätestens seit 1990 mit unterschiedlicher Intensität, je nach Regierung, ausgehend von der LOGSE Reform an einer „Schule für alle“ gearbeitet. Es werden vergleichsweise wenige Kinder in Sondereinrichtungen beschult. Die Strategien und die dahinter liegenden Vorstellungen, wie Partizipation zu realisieren sei, waren Ende letzten Jahrhunderts in beiden Ländern deutlich verschieden. Die in der Dissertation vorgestellten Daten zeigen jedoch, dass zu wenige Kinder die Kompetenzen für eine gegenwärtige und zukünftige persönlich und wirtschaftlich erfolgreiche Lebensführung erwerben. Zentral für die Arbeit ist die von Urie Bronfenbrenner entwickelte systemökologische Theorie der menschlichen Entwicklung. Im Kern geht es bei dieser Theorie immer um die Suche, das Finden und Gestalten optimaler Bedingungen für menschliche Entwicklung. Die Fragestellung der Arbeit ist, wie in Deutschland und Spanien, aber auch wie Professionelle, interdisziplinär die Aufgabe der Integration und Partizipation im Rahmen ihrer Vorgaben bewältigen. Die Arbeit ist in zwei große Teile unterteilt. Die ersten Kapitel sind eine Sammlung von Daten, Theorien, Praxen, Diskussionen und geschichtlichen Entwicklungen, die die schulische Integration von Kindern mit Behinderungen bzw. mit schwierigen Lebenslagen, darstellt. Ab Kapitel sieben wird dann mit Methoden der qualitativen Sozialforschung nach Ressourcen und Kompetenzen, die in Spanien wie in Deutschland vorliegen bzw. entwickelt werden müssen gesucht, um auch Kindern mit Schwierigkeiten eine für sie persönlich erfolgreiche Bildung zur ermöglichen. Nach einem Einführungskapitel werden im zweiten Kapitel Theorien und Modelle der Integrationspädagogik und der an ihr beteiligten Disziplinen diskutiert. Das folgende Kapitel stellt ausgewählte Studien vor, die sich mit Lern- und Lebenslagen von Kindern befassen, denn der gesellschaftliche wie der wissenschaftliche Blick auf die Kindheit hat sich gewandelt. Ein integratives bzw. inklusives Erziehungs- und Bildungssystem wäre eine passende Antwort auf den Wandel. Das vierte Kapitel gibt einen Einblick in das bundesdeutsche Bildungssystem und stellt statistische Daten zur integrativen Beschulung in den Bundesländern vor. Das fünfte Kapitel befasst sich mit dem spanischen Bildungssystem. Das starke Engagement der Katholischen Kirche im 19. und auch noch im 20. Jahrhundert, die Francozeit und die Transición sind die Basis, auf der in den 90 ziger Jahren des letzten Jahrhunderts die, auf 10 Jahre angelegte LOGSE Reform geplant und teilweise umgesetzt wurde. Diese als top-down zu bezeichnende systemische Reform, wird mit ihren Elementen der integrativen und der kompensatorischen Erziehung dargestellt. Die Beschreibung der spanischen Reformentwicklungen endet im Jahr 2004. Der empirische Teil der Arbeit beginnt im Kapitel sechs mit Gedanken zur Qualitativen Sozialforschung. Im Kaptitel sieben wird die Gegenstandsnahe Theoriebildung vorgestellt. Das achte Kapitel befasst sich mit dem Zirkulären Dekonstruieren. Im neunten Kapitel werden die deutschen und die spanischen Interviewpartner in ihrer professionellen Expertenrolle als Grundschullehrerin, Sozialarbeiterin, Erziehungswissenschaftler, Psychologe, Unterstützungslehrerin, Physiotherapeut und Förderschullehrerin vorgestellt. Sechs Interviews fanden Ende 1999, also zu einer Zeit in der die LOGSE Reform bereits fast abgeschlossen sein sollte, statt. Das siebte Interview mit der Förderschullehrerin wurde 2001 geführt. Verständigung und Bewertung konnten aus den Kategorien der Interviews als wichtige Ressourcen für integrative schulische Arbeit erkannt werden. Im Kaptitel zehn wird der ökosystemische Ansatz vertieft dargestellt. Im elften Kapitel werden dann systematisch die Definitionen der Ökosystemischen Theorie auf die Lebensbereiche, die ein Kind betreffen, bzw. die herausgearbeiteten Kategorien angewendet. In diesen Lebensbereichen werden interdisziplinär und über die Ländergrenzen hinweg, die Kategorien diskutiert, um zu Aussagen über gute Entwicklungsbedingungen zu kommen. Die Kapitel zwölf bis vierzehn verbinden die Ergebnisse der Auswertung mit den zusammengetragenen Daten und Fakten zur Situation in Deutschland und Spanien. Als förderlich für die Integration, die auf allen Systemebenen angelegt sein sollte, werden beispielhaft folgende Kriterien beschrieben: eine integrative Grundhaltung, ein moderat konstruktivistischer Unterricht, die Anerkennung und Förderung aller Kompetenzen der Kinder, die Arbeit mit dem entwicklungsfördernden Potential, Kontinuität in den Beziehungen, Strukturen und Räumen, Bestreben nach müheloser Kommunikation. Seitenzahl: 400 Abbildungen: 55 Tabellen: 52
Im Rahmen der Arbeit wurden eine Reihe C2-symmetrischer chiraler Amidiniumsalze hergestellt und ihre katalytische Wirkung in einer Diels-Alder-Reaktion (Schlüsselschritt der Quinkert-Dane-Estronsynthese) untersucht. Für die Synthese der Amidiniumsalze war es erforderlich, einen synthetischen Zugang zu verschiedenen chiralen 1,2-Diaminen zu schaffen und diese herzustellen. Zur Herstellung von chiralen 1,2-Diaminen wurden zwei Synthesekonzepte verfolgt. Zum einen wurden kommerziell zugängliche Aldehyde in einer McMurry-Reaktion in die entsprechenden (E)-Olefine überführt und durch nachfolgende Sharpless-Dihydroxylierung enantioselektiv zu den (R,R)- bzw. (S,S)-Diolen umgesetzt. Diese wurden nach Überführung der Hydroxylgruppen in Mesylat zu den entsprechenden Diaziden umgesetzt. Die Hydrierung der Diazide lieferte schließlich die chiralen 1,2-Diamine. Eine andere Synthesestrategie ging von kommerziell zugänglicher chiraler Weinsäure aus. Die Hydroxylgruppen wurden zunächst durch Überführen in das Acetonid geschützt. Nach Reduktion der Carboxylgruppen zu den primären Alkoholen und nach Kupplung dieser mit Benzylchlorid zu dem entsprechenden Bisbenzyloxymethylderivat konnten die Hydroxylgruppen durch Öffnen des Acetonids entschützt werden. Die freien Hydroxylgruppen wurden in Mesylat überführt. Nach Umsetzung zum Diazid und Abspaltung der Benzylethergruppen konnten die Diazide zu den chiralen 1,2-Diaminen hydriert werden. Ein weiteres chirales 1,2-Diamin wurde durch Nichtabspaltung der Benzyletherschutzgruppen erhalten. Zur Herstellung der C2-symmetrischen chiralen Amidiniumsalze Durch Kupplung verschiedener chiraler 1,2-Diamine mit aus 5-tert-Butyl-isophthalsäure hergestelltem 5-tert-Butyl-isophthalodiimidsäurediethylester-hydrochlorid konnten eine Reihe C2-symmetrischer chiraler Amidiniumsalze mit aromatischen und „aliphatischen“ Resten hergestellt werden. Es wurden mit verschiedenen Katalysatoren Enantiomerenüberschüsse von bis zu 31 % bei 5 °C und bis zu 47 % bei -78 °C erzielt. Es wurden Katalysexperimente in verschiedenen Lösungsmitteln durchgeführt, um deren Einfluß auf Enantioselektivität und Ausbeute zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, daß CH2Cl2 in Bezug auf Enantiomerenüberschüsse und Ausbeuten die besten Werte lieferte.
One possible approach to study systematically the influence of the deformation regime on the geometry of geological structures like folds and boudins is analogue modelling. For a complete understanding of the resulting structures, consideration of the third dimension is required. This PhD study deals with scaled analogue modelling under constriction and plane-strain conditions to improve our knowledge of folding and boudinage of lower crustal rocks in space and time. Plasticine is an appropriate analogue material for rocks in the lower crust. Therefore, this material was used for the experiments. The macroscopic behaviour of most types of plasticine is quite similar to rocks undergoing strain-rate softening and strain hardening regardless of the different microscopic aspects of deformation. Therefore, if one is aware that the stress exponent and viscosity increase with increasing strain, the original plasticine types used with stress exponents ranging from 5.8 to 8.0 are adequate for modelling geologic structures. The same holds for plasticine/oil mixtures. Thus, plasticine and plasticine/oil mixtures can be used to model the viscous flow of different rock types in the lower crust. If climb-accommodated dislocation creep and associated steady-state flow is assumed for the natural rocks, the plasticine/oil mixtures should be used, which flow under steady-state conditions. Three different experimental studies of plane-strain coaxial deformation of stiff layers, with viscosity η2 and stress exponent n2, embedded in a weak matrix, with viscosity η1 and stress exponent n1, have been carried out. The undeformed samples (matrix plus layer) were cubes with an edge length of 12 cm. All experimental runs have been carried out at T = 25 ± 1°C and varying strain rates ė, ranging from 7.9 x 10 high -6 s high -1 to 1.7 x 10 high -2 s high -1, until a finite longitudinal strain of 30% – 40% was achieved. The first experimental study improved the understanding about the evolution of folds and boudins when the layer is oriented perpendicular to the Y-axis of the finite strain ellipsoid. The rock analogues used were Beck’s green plasticine (matrix) and Beck’s black plasticine (competent layer), both of which are strain-rate softening modelling materials with stress exponent n = ca. 8. The effective viscosity η of the matrix plasticine was changed by adding different amounts of oil to the original plasticine. At a strain rate ė of 10 high -3 s high -1 and a finite strain e of 10%, the effective viscosity of the matrix ranges from 1.2 x 10 high 6 to 7.2 x 10 high 6 Pa s. The effective viscosity of the competent layer has been determined as 4.2 x 10 high 7 Pa s. If the viscosity ratio is large (> ca. 20) and the initial thickness of the competent layer is small, both folds and boudins develop simultaneously. Although the growth rate of the folds seems to be higher than the growth rate of the boudins, the wavelength of both structures is approximately the same as is suggested by analytical solutions. A further unexpected, but characteristic, aspect of the deformed competent layer is a significant increase in thickness, which can be used to distinguish plane-strain folds and boudins from constrictional folds and boudins. In the second experimental study, the impact of varying strain rates on growing folds and boudins under plane strain have been investigated. The strain rates used range from 7.9 x 10 high -6 s high -1 to 1.7 x 10 high -2 s high -1. The stiff layer and matrix consist of non-linear viscous Kolb grey and Beck’s green plasticine, respectively, both of which are strain-rate softening modelling materials with power law exponents (n) and apparent viscosities (η) ranging from 6.5 to 7.9 and 8.5 x 10 high 6 to 7.2 x 10 high 6 Pa s, respectively. The effective viscosity (η) of the matrix plasticine was partly modified by adding oil to the original plasticine. At the strain rates used in the experiments the viscosity ratio between layer and matrix ranges between 3 and 10. Different runs have been carried out where the layer was oriented perpendicular to the principal strain axes (X>Y>Z). The results suggest a considerable influence of the strain rate on the geometry of the deformed stiff layer including its thickness. This holds for every type of layer orientation (S ┴ X, S ┴ Y, S ┴ Z). If the stiff layer is oriented perpendicular to the short axis Z of the finite strain ellipsoid, the number of the resulting boudins and the thickness of the stiff layer increase, whereas the length of boudins decreases with increasing strain rate. If the stiff layer is oriented perpendicular to the long axis, X, of the finite strain ellipsoid, enlargement of the strain rate results in increasing wavelength of folds, whereas the number of folds and the degree of thickening of the stiff layer decreased. If the stiff layer is oriented perpendicular to the intermediate Y-axis of the finite strain ellipsoid enlargement of the strain rate results in a decreasing number of boudins and folds associated with increasing wavelengths of both structures. The wavelength of folds is approximately half of the boudins wavelength. This is true for the case where folds and boudins develop simultaneously (S ┴ Y) and for cases where both structures develop independently (folds at S ┴ X and boudins at S ┴ Z). In the third experimental study, scaled analogue experiments have been carried out to demonstrate the growth of plane-strain folds and boudins through space and time. Previous 3D-studies are based only on finite deformation structures. Their results can therefore not be used to prove if both structures grew simultaneously or in sequence. Plane strain acted on a single stiff layer that was embedded in a weak matrix, with the layer oriented perpendicular to the intermediate Y-axis of the finite strain ellipsoid. Two different experimental runs have been carried out using computer tomography (CT) to analyse the results. The first run was carried out without interruption. During the second run, the deformation was stopped in each case at longitudinal strain increments of 10%. Every experiment was carried out at a temperature T of 25°C and a strain rate, ė, of ca. 4 x 10 high -3 s high -1 until a finite longitudinal strain of 40% was achieved with a viscosity contrast m of 18.6 between the non-linear viscous layer (Kolb brown plasticine) and the matrix (Beck’s green plasticine with 150 ml oil kg high -1). The apparent viscosity, η, and the stress exponent, n, for the layer at a strain rate ė = ca. 10 high -3 s high -1 and a finite strain e = 10% are 2.23 x 10 high 7 Pa s and n = 5.8 and for the matrix 1.2 x 10 high 6 Pa s and 10.5. These new data that result from incremental analogue modelling corroborate previous suggestions that folds and boudins are coeval structures in cases of plane-strain coaxial deformation with the stiff layer oriented perpendicular to the intermediate Y-axis of the finite strain ellipsoid. They will be of interest for all workers who are dealing with plane-strain boudins and folds, where the fold axes are parallel to the major axis (X) of the finite strain ellipsoid. As has been demonstrated by the first experimental study, coeval folding and boudinage under plane strain, with S ┴ Y, are associated with a significant increase in the thickness of the competent layer. The latter phenomenon does not occur in other cases of simultaneous folding and boudinage, such as bulk pure constriction. To study the impact of layer thickness on the geometry of folds and boudins under pure constriction, we carried out additional experiments using different types of plasticine for a stiff layer and a weaker matrix to model folding and boudinaging under pure constriction, with the initially planar layer oriented parallel to the Xaxis of the finite strain ellipsoid. The stiff layer and matrix consist of non-linear viscous Kolb brown and Beck’s green plasticine, respectively, both of which are strain-rate softening modelling materials. Six runs have been carried out using thicknesses of the stiff layer of 1, 2, 4, 6, 8 and 10 ± 0.2 mm. All experimental runs were carried out at a temperature T of 30 ± 2°C and a strain rate, ė, of ca. 1.1 x 10 high -4 s high -1 until a finite longitudinal strain of 40% was achieved with a viscosity contrast m of 3.1 between the stiff layer (Kolb brown plasticine) and the matrix (Beck’s green plasticine). The apparent viscosity, η, and the stress exponent, n, for the layer at a strain rate ė = ca. 10 high -3 s high -1 and a finite strain e = 10% are 2.23 x 10 high 7 Pa s and n = 5.8 and for the matrix 7.2 x 10 high 6 Pa s and 7.9. Our results suggest a considerable influence of the initial thickness of the stiff layer on the geometry of the deformed stiff layer. There is no evidence for folding in XY=XZ-sections if the initial thickness of the competent layer is larger than ca. 8 mm. If the initial thickness of the competent layer is set at ca. 10 ± 0.2 mm, both folds and boudins develop simultaneously. However, the growth rate of the boudins seems to be higher than the growth rate of the folds. A further expected, but characteristic, aspect of the deformed competent layer is no change in thickness of the competent layer, which can be used to distinguish plane-strain folds and boudins from constrictional folds and boudins. The model results are important for the analysis and interpretation of deformation structures in rheologically stratified rocks undergoing dislocation creep under bulk constriction. Tectonic settings where constrictional folds and boudins may develop simultaneously are stems of salt diapirs, subduction zones or thermal plumes. To make (paleo) viscosimetric statements possible, the rheological data of the different plasticine types were related to the geometrical data. When comparing the normalized dominant wavelength Wd obtained from the deformed layer of the models with the theoretical dominant wavelength (Ld) calculated using the Smith equation (1977, 1979), the latter probably also holds when folding and boudinage develop simultaneously (S ┴ Y) and when boudins develop independently (S ┴ Z), but can obviously not be applied at very low viscosity ratios as is indicated by the low-strain-rate experiments.
Heterologe Expression des humanen ß-2-adrenergen Rezeptors in Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem
(2005)
Der humane ß2-adrenerge Rezeptor besitzt sieben Transmembrandomänen und gehört zur Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Der Rezeptor ist an der Zelloberfläche lokalisiert und kann nach Bindung extrazellulärer Signalstoffe intrazelluläre Antworten auslösen. Als physiologische Liganden des ß2-adrenergen Rezeptors dienen hauptsächlich die Katecholamine wie Noradrenalin. Nach der Bindung des Liganden kann der Rezeptor an ein stimulatorisches G-Protein (Gs) koppeln und durch Aktivierung der Adenylatzyklase die intrazelluläre cAMP-Konzentration regulieren. Aufgrund der großen pharmakologischen Bedeutung von GPCRs ist es wichtig, die dreidimensionale Struktur dieser Rezeptoren aufzuklären. Da die GPCRs im nativen Gewebe nur in geringen Mengen vorkommen, müssen sie heterolog überproduziert und zur Strukturaufklärung gereinigt werden. In dieser Arbeit wurde das Semliki Forest Virus (SFV)-Expressionssystem zur Produktion des ß2-adrenergen Rezeptors etabliert und optimiert. Die Optimierung des SFV-Expressionssystems erfolgte zunächst bei der Produktion von rekombinanten Viren. Die in vitro Transkriptionsreaktion wurde zur Verbesserung der RNA-Ausbeute untersucht. Anschließend wurde eine optimale Bedingung für die Elektroporation gefunden. Dabei konnte einen Virustiter von 7,5 × 108 infektiöse Partikel pro ml erreicht werden. Zur Produktion des Rezeptors in Säugerzellen wurden sieben rekombinante Viren hergestellt. Verschiedene N- und C-terminale Fusionen wurden im Hinblick auf einen möglichen Einfluss auf die Rezeptorproduktion untersucht. Für das Gen des Kapsid-Proteins (CAP) des Semliki-Forest-Virusgenoms konnte eine deutliche Steigerung der Rezeptorproduktion gefunden werden. Auch die Kozak-Sequenz und das Hämagglutinin (HA)-Signal-Peptid zeigten einen positiven Einfluss auf die Rezeptorproduktion. Die heterologe Proteinexpression wurde in verschiedenen Zelllinien durchgeführt. Es zeigte sich, daß die BHK-21-Zellen für die Produktion in großen Mengen am besten geeignet sind. Die Expressionsrate des Rezeptors in BHK-21-Zellen stieg mit zunehmender Infektionsmultiplizität (MOI). Durch Zugabe von Liganden Alprenolol ins Kulturmedium konnte eine weitere signifikante Steigerung von Rezeptorproduktion erzielt werden. So konnte in adhärenten BHK-21-Zellen 20 Stunden nach der Infektion bei einer MOI von 150 und 2 µM Alprenolol im Medium eine Produktionsrate von 49,6 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. In Suspensionskultur konnte eine Produktionsrate von 36,0 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. Damit konnten 0,2 mg Rezeptoren aus 1 Liter Suspensionskultur produziert werden. Die Rezeptorproduktion in Suspensionskultur könnte jedoch weiter verbessert werden. Mit Immunogoldmarkierung konnte eine überwiegende Lokalisation des Rezeptors im endoplasmatischen Retikulum festgestellt werden. Ein N-Glykosylierung des Rezeptors konnte nachgewiesen werden. Die Glykosylierung gehört zum mannosereichen Typ. Für den Rezeptor wurde eine Dissoziationskonstante von 2,7 nM konnte für Liganden [3H]-CGP-12177 bestimmt. Durch Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurde die vollständige Funktionalität des rekombinanten Rezeptors nachgewiesen. Für die Membranpräparation wurde ein Protokoll erarbeitet, womit ca. 120 mg Membranprotein aus 1 Liter Zellkultur gewonnen werden konnten. Bei der anschließenden Solubilisierung des Rezeptors mit 1,5 % n-Dodecyl-ß-D-maltosid bei pH 7,4 und 100 mM NaCl konnte eine Ausbeute von ca. 100% erreicht werden. In dieser Arbeit konnte nach verschiedenen Versuchen gezeigt werden, daß eine Reinigung über Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) in einem einzigen Schritt nicht möglich war.
Acute myeloid leukemia (AML) is characterized by the accumulation of a large number of abnormal, immature blast cells. Recently, histone deacetylase inhibitors (HDIs) received considerable interest on the ground of their ability to overcome the differentiation block in these leukemic blasts regardless of the primary genetic alteration, an effect achieved either alone or in combination with differentiating agents, such as all-trans retinoic acid (t-RA). Valproic acid (VPA), a potent HDI, is now under clinical evaluation owing to its potent differentiation effect on transformed hematopoietic progenitor cells and leukemic blasts from AML patients. Conversely, in a clinical study by Bug et al., the favorable effects of the combination treatment with t-RA/VPA in advanced acute myeloid leukemia patients were reported to be most likely due to an enhancement of nonleukemic myelopoiesis and the suppression of malignant hematopoiesis rather than enforced differentiation of the leukemic cells. Based on the hypothesis that VPA influences normal hematopoiesis, the effect of chromatin modeling through VPA on HSCs was investigated with respect to differentiation, proliferation as well as self-renewal in the present study. It has been shown that valproic acid increases both proliferation and self-renewal of HSC. It accelerates cell cycle progression of HSC accompanied by a down-regulation of p21cip-1/waf-1. Furthermore, valproic acid inhibits GSK3B by phosphorylation on Ser9 accompanied by an activation of the Wnt signaling pathway as well as by an up-regulation of HoxB4, a target gene of Wnt signaling. Both are known to directly stimulate the proliferation of HSC and to expand the HSC pool. To sum up, valproic acid, a potent histone deacetylase inhibitor known to induce differentiation and/or apoptosis in leukemic blasts, stimulates the proliferation and self-renewal of hematopoietic stem cells. Therefore, the data reported in this study suggest to reconsider the role of histone deacetylase inhibitors from a differentiation inducer to a coadjuvant factor for increasing the response to conventional therapy in acute myeloid leukemia.
Haematopoietic stem cells (HSCs) are regarded as the prime target for gene therapy of inherited and acquired disorders of the blood system, e.g. X-linked chronic granulomatous disease (X-CGD). The major reason for this is that HSCs posses the ability to self renew as well as the potential to differentiate into all lineage-specific cell types. However, the need to reach and to maintain sufficient therapeutic levels of genetically modified stem cells and their progeny after gene delivery still presents major challenges for current HSC gene therapy approaches. In particular, one of the main limitations for most genetic defects is the lack of a selective growth advantage of gene-modified cells after engraftment. In vitro and in vivo methods have been developed that focus on either positive or negative selection of HSCs. An artificial selection advantage can be conferred to transduced HSCs by incorporating a selection marker in addition to the therapeutic transgene. In the present study, two novel strategies for positive selection of murine gp91phox gene-modified haematopoietic stem cells were developed and tested, bearing in mind that with selective growth advantage, the possibility of uncontrolled proliferation arises. The first strategy to be investigated was based on the homeobox transcription factor HOXB4, which plays an important role in the control of haematopoietic stem cell proliferation and differentiation. Overexpression of a retroviral bicistronic construct containing the therapeutic gene gp91phox and HOXB4 in murine primary bone marrow cells led to a significant 3–4-fold expansion of transduced cells ex vivo. The numbers of transgene-expressing cells increased 2–3-fold after 2 weeks cultivation under cytokine stimulation. Furthermore, the clonogenic progenitor cell assay (CFU assay) demonstrated that the number of colony-forming cells had increased to levels 2-fold higher than those of mock-transduced cells after 1 week of culture, thereby augmenting the presence of a significant number of stem/progenitor cells in the selected cell population. However, in our experiments, HOXB4-overexpressing murine HSCs did not show any repopulating advantage in transplanted recipient mice over control construct-transduced HSCs. These results indicate that selective expansion of gp91phox gene-modified HSCs can be induced by the HOXB4 transcription factor ex vivo but not in vivo. This is possibly dependent on HOXB4 expression levels, which are too low in vivo to achieve selection. The second strategy made use of a chemically inducible dimerizer system consisting of the therapeutic gene gp91phox and a fusion protein, containing sequences from a growth factor receptor signalling domain (epidermal growth factor receptor, EGFR, or prolactin receptor, PrlR) and the drug binding protein FKBP12, as the selection cassette. This strategy aimed to allow inducible selection that could be easily switched off. The activity of these fusion proteins is controlled through the small molecular dimerizer AP20187. Transduction of BaF/3 cells with lentiviral vectors expressing the EGFR construct induced proliferation and led to complete selection within 18 days (99%). However, removing AP20187 could not turn off proliferation. This construct is, therefore, not suitable as a selection cassette for the expansion of gene-modified HSCs due to its oncogenic potential. Transduction of the construct containing the intracellular domain of PrlR caused significant selective expansion of AP20187-treated BaF/3 cells. Following expression in cells, the fusion protein, which lacks membrane-anchoring sequences, mainly localized to the cytoplasm. Evidence was found to indicate that activated STAT5 might be responsible for this effect. Upon expression of the prolactin construct, phosphorylation of STAT5 and its DNA-binding activity to a ß-casein promoter sequence was strongly increased. Importantly, the induced proliferation was reversible after removal of AP20187. Transduced Sca1+ bone marrow cells obtained from C57BL/6-CD45.1 mice could be expanded about 20–100-fold ex vivo in the presence of AP20187 and mSCF without losing progenitor cell features and the capability to contribute to all lineages of the haematopoietic system. To exclude oncogenic outgrowth of one single clone, the polyclonality of selected cells was proven by ligation-mediated PCR (LM-PCR) analysis. In mouse transplantation experiments, ex vivo-expanded cells repopulated the bone marrow of lethally irradiated mice suggesting that the ex vivo expansion took place at the level of haematopoietic stem and/or progenitor cells. Genomic gp91phox sequences were detected in the bone marrow, spleen and peripheral blood cells of transplanted animals, indicating that gp91phox-containing cells most likely contributed to the reconstitution of haematopoiesis in these mice.
Identifikation eines neuen Brustkrebsantigens NW-BR-3 mittels serologischem Screening (SEREX)
(2005)
Die Tumortherapie hat in den letzten Jahren, vor allem durch die Etablierung neuer molekularbiologischer Techniken, die den Tumor mittels spezifischer immunologischer Methoden angreifen, enorme Fortschritte erzielt. Nach wie vor ist das Mammakarzinom eine der häufigsten Krebsarten der Frau und immer noch eine der häufigsten Todesursachen. Die bisherigen nicht chirurgischen Therapiestrategien richten sich in erster Linie gegen die allgemeine Zellteilung (Strahlen- oder Chemotherapie) oder sind Antagonisten gegen einen Hormonrezeptor. Die Hinwendung zu speziellen molekularbiologischen Zielen mittels Antigenen scheint hier neue Möglichkeiten der Therapie zu eröffnen. So konnten Boon et al. Ziele von zytotoxischen T-Zellen bei Melanomen isolieren. Die hiermit gefundenen Antigene weisen ein gemeinsames charakteristisches Merkmal auf: ihre Expression in Normalgeweben ist auf Keimzellen in Testis und Ovar beschränkt. Folgerichtig wurde diese Klasse von Antigenen als cancer-testis Antigene beschrieben. Diese Technik stößt jedoch an ihre Grenzen, sobald die Etablierung von stabilen T-Zellinien in bestimmten Tumore nicht gelingt. Pfreundschuh et al. entwickelten daher die SEREX (Serological Analysis of cDNA Expression libraries) genannte Klonierungstechnik, die Antigene basierend auf einer spontanen humoralen Immunantwort des Patienten identifiziert, und somit auf die Etablierung von Zellinien verzichtet. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Identifizierung neuer Tumorantigene als potentielle Zielantigene für Immuntherapiestrategien beim Mammakarzinom. In einem Mammakarzinomscreening identifizierten wir die bereits zuvor beschriebenen Tumorantigene NY-BR-1 und SCR1, sowie ein weiteres, bisher unbekanntes Antigen NW-BR-3, welches ein Cancer-Testis ähnliches Expressionsmuster zeigt. Die Expression dieser Antigene und Implikationen für Immuntherapieansätze wird diskutiert.