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1. Die Deletionsderivate der Kompetenzproteine PilN und PilQ wurden als Fusionsproteine mit dem Maltosebindeprotein überproduziert, über eine Amylosesäule aufgereinigt und in nativer Form für die Generierung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern eingesetzt. 2. Unter Einsatz der spezifischen alpha-PilN- und alpha-PilQ-Antikörpern konnte das PilN-und PilQ-Kompetenzprotein im Rohextrakt von T. thermophilus HB27 detektiert werden. 3. Die Überprüfung bereits vorliegender Antikörper gegen die Kompetenzproteine PilM, PilW und PilA4 ergaben, dass es sich hier ebenfalls um spezifische Antikörper handelt. 4. Mittels Western-Blot-Analysen unterschiedlicher Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertion in den Genen pilM, pilN, pilO und pilW zu keinem polaren Effekt der jeweils stromabwärts gelegenen Gene führt. 5. Analysen der subzellulären Lokalisation der Kompetenzproteine ergaben, dass PilM und PilN ausschließlich in der inneren Membran lokalisiert sind, während PilW, PilQ und PilA4 sowohl in der inneren als auch äußeren Membran detektiert wurden. Die größte Menge an PilQ wurde allerdings in der äußeren Membran gefunden. 6. Mutantenstudien ergaben, dass eine pilQ-Mutantion zur Abwesenheit von PilW und PilA4 in der äußeren Membran führte. Ebenso führte eine pilW-Mutantion zu Abwesenheit von PilQ und PilA4 in der äußeren Membran. Diese Ergebnisse indizieren Interaktionen zwischen PilW, PilQ und PilA4. 7. In der pilD-Mutante wurde kein PilA4 mehr in der äußeren Membran detektiert. Dieser Befund untermauert den Schluss, dass es sich bei PilD um eine PilA4 prozessierende Präpilin-Peptidase handelt. 8. Western-Blot-Analysen der gereinigten Pili führen zu dem Schluss, dass das Kompetenzprotein PilA4 die strukturelle Untereinheit der Pilus-Struktur repräsentiert. Das Sekretin-ähnliche Kompetenzprotein PilQ wurde ebenfalls in der gereinigten Pilus-Fraktion detektiert und könnte Teil der globulären Struktur an den Pilusenden sein. 9. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten durch T. thermophilus HB27 Zellen ließen den ungewöhnlichen Aufbau der Zellperipherie erkennen. Zwischen der inneren Membran (8 nm dick) und der äußeren Membran (8 nm dick) befand sich neben dem dünnen Peptidoglykan (8 nm dick) eine 40 nm dicke kontrastarme Schicht, die radial von Fäden durchzogen schien. 10. Die Dünnschnitte wurden für Immunogoldmarkierungen mit alpha-PilQ-Antikörpern eingesetzt, um PilQ zu detektieren. Allerdings konnte in den elektronenmikroskopischen Analysen keine spezifische Goldmarkierung nachgewiesen werden. Ursache hierfür könnte die Unzugänglichkeit des nativen PilQ in den Dünnschnitten sein. 11. Die Immunogoldmarkierung des Gefrierbruchs von ganzen Thermus-Zellen mit alpha-PilQ-Antikörpern führte zur Detektion von PilQ-haltigen Ring-ähnlichen Strukturen in der äußeren Membran. Der Durchmesser des PilQ-Komplexes mit 17 - 18 nm ist mit denen der aus Sekretinen bestehenden Ringsystemen anderer Organismen vergleichbar. 12. In den T. thermophilus HB27 Membransolubilisaten wurde ein >669 kDa PilW-PilQ-Komplex identifiziert. Dieser Komplex ließ sich optimal mit n-Dodecyl-beta-D-maltosid (1 mg Detergenz pro mg Membranprotein) aus der Membranfraktion solubilisieren. Stabilitätsuntersuchungen ergaben, dass dieser Komplex bei 4 °C einige Tage, bei Raumtemperatur und bei Anwesenheit von 1 M NaCl einige Stunden stabil ist. 13. Mittels einer DEAE-Austausch-Chromatographie konnte der PilW-PilQ-Komplex angereichert werden. Die Western-Blot-Analysen ergaben, dass das Kompetenzprotein PilM mit dem PilW-PilQ-Komplex koeluiert. 14. In der MALDI-TOF-Massenspektrometrie konnte das Kompetenzprotein PilQ und Untereinheiten der DNA-gerichteten RNA-Polymerase, ein Membran-Lipoprotein sowie Energie-Stoffwechsel-Proteine in der angereicherten PilW-PilQ-haltigen Fraktion nachgewiesen werden. Diese Proteine müssen auf die Beteiligung an der Transformation untersucht werden. 15. Immunelektronenmikroskopische Analysen des angereicherten PilW-PilQ-Komplexes führten zur Identifizierung von Ringstrukturen mit einem Durchmesser von 17 nm. Dieser Durchmesser entspricht den Sekretin-Komplexen von P. aeruginosa (18,3 ± 1,2 nm) bzw. N. gonorrhoeae (15,5 - 16,5 nm) und dem Durchmesser der über Immunogoldmarkierung detektierten PilQ-haltigen Strukturen in T. thermophilus HB27.
Seit der Einführung der antiretroviralen Therapie (HAART) ist die Mortalität von HIV-Infizierten in der westlichen Welt zwar deutlich zurückgegangen, die HIV-Infektion ist jedoch bis heute nicht heilbar. Die derzeitige Therapie unterdrückt zwar sehr effektiv die Virusreplikation, kann aber nicht das Virus vollständig eliminieren und somit die Infizierten nicht heilen. Die daher notwendige Langzeitbehandlung wird wiederum durch die relativ hohe Toxizität der Medikamente und durch das Auftreten resistenter Virusvarianten limitiert. Die Suche nach neuen Therapienansätzen und Wirkstoffklassen ist daher immer noch von größter Wichtigkeit. Die HIV-Gentherapie stellt neben der konventionellen antiretroviralen Therapie eine mögliche zusätzliche Behandlungsform dar. Die Arbeitsgruppe von Laer hat am Georg-Speyer-Haus retrovirale Vektoren entwickelt, die membrangebundene (ma) HIV-Eintrittsinhibitoren, sog. C Pepitde, kodieren. Das durch den Prototyp-Vektor M87 kodierte maC36-Peptid zeigte eine moderate Inhibition des Viruseintritts. In einem Optimierungsprozess wurde der Vektor M87o generiert. M87o kodiert im Vergleich zu M87 ein wirksameres maC-Peptid (maC46) und weist auch eine wesentlich höhere Expressionsstärke und dadurch eine stärkere inhibitorische Wirkung als der Prototypvektor auf. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, HIV Varianten, die resistent gegenüber dem M87o–Genprodukt maC46 sind, in vitro zu generieren und anschließend den Resistenzmechanismus aufzuklären. In einer Kollaboration mit der Gruppe um M. Dittmar aus Heidelberg war durch Passage des HIV 1 Wildtyp (wt) Ba L-Isolats auf M87-transduzierten Zellen bereits das maC36-resistente Virusisolat Ba L_sel_MD generiert worden. Ba L_sel_MD wies zwei Resistenzmutationen in der gp41-Untereinheit des Hüllproteins auf: I556V (heptad repeat 1 Region) und N634K (heptad repeat 2 Region). Für die Mutation 634K war dabei gezeigt worden, dass sie auch zu einer leichten Reduktion der maC46-Sensibilität führt. In der vorliegenden Arbeit diente Ba L_sel_MD als Ausgang für die Selektion einer Virusvariante mit deutlich verminderter Sensibilität gegenüber maC46. Hierfür wurde Ba L_sel_MD über 149 Tage lang auf Zellen mit steigender maC46 Expressionshöhe passagiert und so das Isolat Ba L_FH1 generiert. Das Hüllprotein des selektierten Isolats war ausreichend, um einen maC46-resesistenten Phänotyp hervorzurufen. Das selektierte Hüllprotein war im Vergleich zu dem Ausgangsisolat ca. fünf- bis zehnfach weniger empfindlich gegenüber maC46. Die Sequenzierung des Ba L_FH1 Hüllproteingens zeigte, dass die Aminosäureausprägung an Position 634 des Ausgangsisolats (BaLsel_MD) konserviert worden war, während die Position 556 zur Wildtypsequenz revertiert war. Darüber hinaus wurden drei Mutationen in der gp120-Untereinheit des Hüllproteins (V2-Region (I187T), V3-Region (N305Y), C3-Region (E352K)), sowie eine Mutation in der heptad repeat 1 Region (A579T) der gp41-Untereinheit identifiziert. Für die reduzierte maC46-Empfindlichkeit waren in erster Linie die Mutation N305Y in der V3 Region und die Rückmutation 556I in Zusammenwirkung mit der bereits vorhandenen Mutation 634K verantwortlich. Die verbleibenden Mutationen hatten allenfalls modulierende Wirkung auf die maC46-Sensibilität. Die Resistenz ist vermutlich auf die beobachtete erhöhte Fusionsgeschwindigkeit des Hüllproteins von Ba L_FH1 im Vergleich zum Ausgangsisolat zurückzuführen, die interessanterweise mit einer reduzierten Corezeptoraffinität verknüpft war. Die erhöhte Fusionsgeschwindigkeit verkürzt das zeitliche Fenster, in welchem maC46 an seine Zielstruktur innerhalb des gp41 binden kann. Es scheinen zwei unterschiedliche Phasen des Eintrittprozesses durch die Mutationen verändert worden zu sein. Die Mutation in der V3-Region (N305Y) der gp120-Untereinheit beschleunigt wohl eine frühe Phase. Vermutlich ermöglicht diese Mutation, dass bestimmte Übergangszustände nach der Corezeptorbindung schneller durchlaufen werden können, indem die gp120/Corezeptorbindung destabilisiert wird. Die Rückmutation 556I beschleunigt wahrscheinlich in Zusammenspiel mit der bereits vorhandenen Mutation 634K die Ausbildung des 6 Helixbündels. Diese beiden Mutationen wirken somit auf eine späte Phase der Fusion. Obwohl bekannt ist, dass natürliche Variationen in gp120 die Sensibilität des HIV-Hüllproteins gegenüber C-Peptiden beeinflussen, konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass solche Mutationen auch in vitro selektiert werden, um eine C-Peptidresistenz herbeizuführen.
Der menschliche Körper ist permanent mechanischen Reizen in Form von Dehnung oder Druck ausgesetzt. Diese Stimuli können vielfältige zelluläre Prozesse induzieren. Dehnungsreize erhöhen die Zellproliferation in allen bisher untersuchten Zellspezies, inklusive Endothel- und Epithelzellen. Im Gegensatz dazu scheinen mechanische Druckbelastungen zu zellulärer Differenzierung zu führen. Die Relevanz dieser mechanischen Reize für die Physiologie und Pathophysiologie ist für viele Organe nachgewiesen worden. Jedoch gibt es bislang keine hinreichenden Untersuchungen, die belegen, dass mechanische Reize ebenso eine Rolle bei der Tumorproliferation spielen könnten. Im Fokus dieser Promotionsarbeit steht die Fragestellung, inwieweit die mechanischen Verhältnisse in Tumoren in einem funktionellen Zusammenhang mit der Tumorgenese stehen. Zur Klärung dieser Fragestellung ist ein Xenograft-Tumormodell etabliert worden, das es erlaubt in vivo-Untersuchungen an humanen epithelialen Tumoren durchzuführen. Um Erfahrungen aus vorherigen in vitro-Versuchen nutzen zu können, wurden humane epitheliale A431-Vulvakarzinom- und humane epitheliale A549-Lungenkarzinomzellen für das Tumormodell verwendet. Mit diesem Modell konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass solide humane Tumore einer permanenten mechanischen Dehnung ausgesetzt sind, die direkten Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen hat. Als zentraler Auslöser für die mechanische Dehnung der Tumorzellen konnte der erhöhte tumorinterstitielle Flüssigkeitsdruck (TIFP) identifiziert werden. Der Einfluss der mechanischen Dehnung auf die Proliferation der Tumorzellen wurde anhand der Phosphorylierung der extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) bzw. der Ki-67 Expression gezeigt. Durch die Punktion bzw. Drainage von Tumoren konnte der TIFP experimentell abgesenkt werden und in Folge dessen kam es zu einer reduzierten mechanischen Dehnung der Tumorzellen. In allen Versuchen war die Abnahme der mechanischen Dehnung von einer verringerten Phosphorylierung der ERK1/2 bzw. reduzierten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 begleitet. Der TIFP induziert aber nicht nur mechanische Dehnungsreize, sondern er stellt darüber hinaus eine physikalische Barriere für den effizienten Transport von Therapeutika in den Tumor dar. Der gegenüber dem umliegenden Gewebe erhöhte TIFP behindert den interstitiellen Transport und die Aufnahme von Molekülen aus dem Gefäßsystem in die Tumorzellen. Die Etablierung einer neuen experimentellen Technik zur Senkung des TIFP, durch i.v. Injektion von konzentriertem humanem Serumalbumin, führte zu einer signifikanten Verbesserung der Aufnahme und einer Verlängerung der Verweildauer von Makromolekülen/Therapeutika innerhalb von Tumoren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen gegen lymphspezifische Marker in Gewebeproben von A431 und A549 Tumoren keinen direkten Zusammenhang zwischen Lympharchitektur und TIFP zeigen. Dies bedeutet, dass in den untersuchten Tumoren die Ausbildung des hohen TIFP eher auf eine erhöhte Rigidität der extrazellulären Matrix bzw. die hohe Permeabilität des tumorversorgenden vaskulären Gefäßsystems zurückzuführen ist. Parallel zu den in vivo-Untersuchungen durchgeführte in vitro-Versuche konnten Proteine identifizieren, die an der druckinduzierten p38 Signaltransduktionskaskade beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern die bisherigen in vitro-Daten bzgl. der differentiellen Reaktionen von Zellen auf mechanische Druckreize. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in vivo-Versuche die Bedeutung und die klinische Relevanz des biophysikalischen Parameters TIFP hervorgehoben haben. Die Zukunft der Krebstherapie liegt nicht alleine in der Entwicklung neuer hochspezifischer Wirkstoffe, sondern auch in der Lösung des Transports der Wirkstoffe an den Zielort. Die vorgestellten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit weisen eine beträchtliche klinische Relevanz auf, denn sie zeigen, dass die experimentelle Absenkung des TIFP zu einer verbesserten Aufnahme von Therapeutika beiträgt. Gleichzeitig wird die Proliferationsrate von Tumorzellen durch die reduzierte mechanische Dehnung signifikant verringert. Dieser Doppeleffekt könnte zu einer effizienteren Krebstherapie führen in Folge derer es zu einer verlängerten Überlebensrate sowie einer Verbesserung der Lebensqualität von Krebspatienten kommen könnte.
Many environmental chemicals are suspected of disturbing the human and animal endocrine system. These so-called endocrine disruptors can operate in many ways. The interaction of endocrine disruptive effects that eventually endanger human health is still unclear. However, one of the basic mecha-nisms of endocrine disruption is the inhibition of key enzymes in the hormone metabolism. In this study, we focused on the inhibitory potency of suspected endocrine disrupting compounds on aromatase (P450arom) and 5alpha-reductase (5alpha-Re) activities in human tissue and human cancer cells. Both enzymes are essential for the human sex steroid hormone metabolism. We were able to demonstrate that the organotin compounds tributyltin (TBT) and triphenyltin (TPT) are potent unspecific inhibitors of P450arom and 5alpha-Re activity. Prochloraz and fenarimol inhibited P450arom activity at low concentrations (IC50<2 µM), while 5alpha-Re activity was only impaired at higher concentrations (IC50>10 µM). While the human tissue assay proved to be more practical and sensitive as a screening tool for putative endocrine disruptors, the cell assay reflected partly the situation in vivo. In another experimental series, we investigated the inhibitory effect of TPT on P450arom, 5alpha-Re, 3beta-HSD type 2, 17beta-HSD type 1 and type 3 alone and in combination with the strong antioxidant dithioerythrithol (DTE). TPT inhibited unspecifically all enzymes that were tested. The experiments also showed that DTE is able to compensate the adverse effects of TPT, and that the effectiveness of the compensatory activity of DTE differs among the enzymes investigated. The suppressed 5alpha-Re activity could not be reactivated with DTE. Conceivably, cysteine residues that are responsible for the tertiary and quarternary structure of the enzyme are critical targets for TPT. A human sampling study was undertaken with the COMPRENDO partner in Gdansk. 60 Polish and 15 German blood samples were investigated for chemical residues and sex hormone concentrations. In addition, 15 placenta samples from Poland and Germany, respectively, were tested for chemical residues, P450arom activities and CYP19 mRNA contents. The chemical analysis was performed by the COMPRENDO partners in Milan (p,p´DDE), Orleans (TBT and TPT) and Ioannina (diuron, fenarimol, linuron und vinclozolin). The results showed that individual sex hormone concentrations in blood were not correlated with chemical body burden. The detected differences in sex hormone concentrations, specific aromatase activity and relative CYP19 mRNA content of Polish and German donors were presumably the result of other factors than the ones determined in this study. Another task of the EU-project was the investigation of the effects of chemical exposure of the aquatic model organisms Pimephales promelas, Rutilus rutilus and Xenopus laevis. We investigated the specific P450arom and 5alpha-Re activities in brain and gonads of the animals. During the qualitative investigation of the androgen metabolism in Xenopus laevis brain, 5alpha-reductase activity was discovered for the first time. In contrast to the inhibitory potency of TPT discovered in our enzyme assays, TPT exposure of aquatic model organisms had no observed effect on enzyme activity in the organs investigated, except for P450arom activities in female gonads of Pimephales promelas at 320 ng TPT/L. In this group, mean P450arom activities were elevated, possibly as a result of an overshooting upregulation due to the inhibition of P450arom by TPT. The exposure of Rutilus rutilus and Xenopus laevis to the effector substances methyltestosterone and letrozole resulted in slightly different mean enzyme activities compared to the control group. In conclusion, many of the tested pesticides are able to inhibit P450arom and 5alpha-Re, and thus might be of clinical relevance. However, results are not always coherent, and possible risks for human and wildlife health are therefore difficult to predict. Risk assessment will require large studies with an additional number of short and long term in vitro and in vivo assays. Any extrapolation to humans should be very meticulously performed.
The following thesis is concerned with the elucidation of structural changes of RNA molecules during the time course of dynamic processes that are commonly denoted as folding reactions. In contrast to the field of protein folding, the concept of RNA folding comprises not only folding reactions itself but also refolding- or conformational switching- and assembly processes (see chapter III). The method in this thesis to monitor these diverse processes is high resolution liquid-state NMR spectroscopy. To understand the reactions is of considerable interest, because most biological active RNA molecules function by changing their conformation. This can be either an intrinsic property of their respective sequence or may happen in response to a cellular signal such as small molecular ligand binding (like in the aptamer and riboswitch case), protein or metal binding. The first part of the thesis (chapters II & III) provides a general overview over the field of RNA structure and RNA folding. The two chapters aim at introducing the reader into the current status of research in the field. Chapters II is structured such that primary structure is first described then secondary and tertiary structure elements of RNA structure. A special emphasis is given to bistable RNA systems that are functionally important and represent models to understand fundamental questions of RNA conformational switching. RNA folding in vitro as well as in vivo situations is discussed in Chapter III. The following chapters IV and V also belong to the introduction part and review critically the NMR methods that were used to understand the nature and the dynamics of the conformational/structural transitions in RNA. A general overview of NMR methods quantifying dynamics of biomolecules is provided in chapter IV. A detailed discussion of solvent exchange rates and time-resolved NMR, as the two major techniques used, follows. In the final chapter V of the first part the NMR parameters used in structure calculation and structure calculation itself are conferred. The second part of the thesis, which is the cumulative part, encompasses the conducted original work. Chapter VI reviews the general NMR techniques applied and explains their applicability in the field of RNA structural and biochemical studies in several model cases. Chapter VII describes the achievement of a complete resonance assignment of an RNA model molecule (14mer cUUCGg tetral-loop RNA) and introduces a new technique to assign quaternary carbon resonances of the nucleobases. Furthermore, it reports on a conformational analysis of the sugar backbone in this RNA hairpin molecule in conjunction with a parameterization of 1J scalar couplings. Achievements: • Establishment of two new NMR pulse-sequences facilitating the assignment of quaternary carbons in RNA nucleobases • First complete (99.5%) NMR resonance assignment of an RNA molecule (14mer) including 1H, 13C, 15N, 31P resonances • Description of RNA backbone conformation by a complete set of NMR parameters • Description of the backbone conformational dependence in RNA of new NMR parameters (1J scalar couplings) Chapters VII & VIII summarize the real-NMR studies that were conducted to elucidate the conformational switching events of several RNA systems. Chapter VIII gives an overview on the experiments that were accomplished on three different bistable RNAs. These molecules where chosen to be good model systems for RNA refolding reactions and so consequently served as reporters of conformational switching events of RNA secondary structure elements. Achievements: • First kinetic studies of RNA refolding reactions with atomic resolution by NMR • Application of [new] RT-NMR techniques either regarding the photolytic initiation of the reaction or regarding the readout of the reaction • Discovery of different RNA refolding mechanisms for different RNA molecules Deciphering of a general rule for RNA refolding methodology to conformational switching processes of RNA tertiary structure elements. The models for these processes were a) the guanine-dependent riboswitch RNA and b) the minimal hammerhead ribozyme. Achievements: • NMR spectroscopic assignment of imino-resonances of the hypoxanthine bound guanine-dependent riboswitch RNA • Application of RT-NMR techniques to monitor the ligand induced conformational switch of the aptamer domain of the guanine-dependent riboswitch RNA at atomic resolution • Translation of kinetic information into structural information • Deciphering a folding mechanism for the guanine riboswitch aptamer domain • Application of RT-NMR techniques to monitor the reaction of the catalytically active mHHR RNA at atomic resolution In the appendices the new NMR pulse-sequences and the experimental parameters are described, which are not explicitly treated in the respective manuscripts.
All living organisms exhibit daily fluctuations in biochemical, physiological and behavioural parameters driven by endogenous oscillators, residing in the organism itself. In mammals, the core circadian oscillator is located in the paired suprachiasmatic nuclei (SCN) of the hypothalamus. Circadian rhythm generation in the SCN depends upon the expression of clock genes interacting in positive and negative transcriptional/translational feedback loops. The SCN governs the timing of peripheral circadian oscillators by neuronal pathways and by neuroendocrine mechanisms. An important neuroendocrine hand of the core circadian oscillator is melatonin, which is produced in and secreted from the pineal gland night by night. The adenohypophysis represents a peripheral circadian oscillator and the secretion of one of its hormones, prolactin, is known to be regulated by melatonin. The aim of the present study was to analyze a putative influence of melatonin on the activity state and diurnal variations of identified cell types in the hypophysis. Particular attention was paid to lactotroph, gonadotroph and pars intermedia cells. Experiments were performed with young male mice of different strains: melatonin-proficient C3H, melatonin-deficient C57BL, melatonin-proficient C3H with targeted deletions of the Mel1a receptor (MelaaBB), Mel1b receptor (MelAAbb) or both receptors (Melaabb). Cells producing prolactin (PRL), follicle stimulating hormone (FSH) were immunocytochemically identified and the presence of phosphorylated CREB protein (pCREB) and clock gene protein PER1 was demonstrated by double immunolabeling at different time points during the light/dark cycle in melatonin deficient, melatonin proficient and melatonin receptor knockout mice. Melatonin influence on Prl mRNA levels was investigated by means of in situ hybridization. At night the percentage of lactotroph cells showing a positive nuclear pCREB- and PER1-immunoreaction is significantly smaller in C57BL than in C3H mice. In both mouse strains, the percentage of pCREB –immunoreactive cells is minimal in the early morning and gradually increases to reach a maximum in the late night. PER1 levels show a parallel temporal variation in C3H, but in C57BL, they are drastically reduced in the early afternoon. The percentage of FSH-immunoreactive cells showing pCREB immunoreaction was significantly lower in the melatonin-deficient C57Bl mice than in the melatonin-proficient C3H mice during the second part of the day and during the night. In each strain, the percentage of FSH-immunoreactive cells was lowest at the early morning and gradually increases until the maximum at late night. In wild type (MelAABB) and MelAAbb mice the percentage of lactotroph cells with nuclear pCREB immunoreactions varied significantly over 24 h period, whereas in MelaaBB and Melaabb mice no significant differences were found between the five time points analyzed. The number of Prl mRNA expressing cells was significantly higher in MelaaBB and MelAAbb than in their wild type (MelAABB) littermates. pCREB levels in the pars intermedia did not show rhythmic variation in wild type or Melaabb animals, but wild type mice had higher pCREB levels than Melaabb. The observation that, during darkness, the percentage of lactotroph cells with nuclear pCREB immunoreaction is significantly higher in C3H than in C57BL mice suggests the existence of a distinct cell population that is under the control of melatonin-dependent intrapituitary signaling. Results with melatonin receptor knockout mice indicate that Mel1a and Mel1b melatonin receptors are involved in the control of the activity state of lactotroph cells, but to a differing degree. Analysis of cells expressing Prl mRNA showed that inhibitory action on the Prl expression is mostly mediated through the Mel1a receptor. The significant difference between pCREB immunoreaction in gonadotroph cells of C3H and C57BL mice might suggest that, like lactotrophes, FSH cells represent a heterogeneous population and only a subpopulation is under control of melatonin signaling. The present study is first to show that melatonin signaling also affects pCREB levels in pars intermedia of mice.
To determine the effects of inhaled IL-10 at different doses and different time points on the pulmonary and systemic inflammatory response during endotoxemia, 48 ventilated, anaesthetized rats (mean body weight ± standard deviation, 500 ± 33g) were randomly assigned to six groups (n = 8, each). Interleukin-10 was nebulised either prior to or following the intravenous injection of LPS (5mg/kg) at two doses (5.0 mycro-g or 0.5 mycro-g) in our groups. Eight rats received the same insult with no further treatment (LPS-only group). Another eight rats served as controls without endotoxemia but with aerosolized phosphate-buffered saline, the solvent of IL-10 (Sham group). Concentrations of TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, and IFN-gamma were analyzed in plasma and bronchoalveolar lavage fluid (BALF). In addition, the nitrite release from ex-vivo cultured alveolar macrophages was determined. As compared to the LPS-only group, the concentrations of the proinflammatory cytokines TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, and IFN-gamma in plasma were significantly reduced in the group, which inhaled 5 mycro-g IL-10 before LPS injection (p< 0.0125). Spontaneous nitrite release from exvivo cultured alveolar macrophages was suppressed in this group (p< 0.0125). Inhalation of 0.5 mycro-g IL-10 before LPS injection and both dosages of IL-10 inhalation (5 mycro-g or 0.5 mycro-g) after LPS injection did not significantly influence either inflammatory cytokine concentrations in BALF, in plasma or the nitrite release from ex-vivo cultured alveolar macrophages. In this study, inhaled IL-10 only demonstrated anti-inflammatory effects when it was administered at 5 mycro-g prior to the induction of experimental endotoxemia. Interleukin-10 aerosol had no effect when it was given either following induction of endotoxemia or given at a lower dosage (which here was 0.5 mycro-g) either before or following injection of lipopolysaccharide.
In several academic fields (most notably: physics, mathematics, economics, astronomy, and computer science), most current research papers are freely accessible on the Internet in both pre- and post-publication formats. For these disciplines, open-access dissemination of publications and data has created a robust and useful information environment that is highly valued by researchers. While the acceptance of open-access dissemination has been disruptive to traditional scholarly publishing, the status and economic value of the elite journals has remained largely intact. Indeed, publication in the most prestigious journals (e.g., Science, Nature, Cell, BMJ, etc.) may have more influence than ever in determining the advancement of academic careers. Traditional publishing and open access will continue to coexist uncomfortably for years to come, but the next wave of digital publishing systems (empowered social networking applications) will establish open access repositories as indispensable infrastructure for the sciences and social sciences.
University 2.0
(2007)
The major challenge facing universities in the next decade is to reinvent themselves as information organizations. Universities are, at their core, organizations that cultivate knowledge, seeking both to create new knowledge and to preserve and convey existing knowledge, but they are remarkably inefficient and therefore ineffective in the way that they leverage their own information resources to advance that core activity. This talk will explore ways that the university could learn from what is now widely called "Web 2.0" -- a term that is meant to identify a shift in emphasis from the computer as platform to the network as platform, from hardware to data, from the wisdom of the expert to the wisdom of crowds, and from fixity to remixability.
Thema der vorliegenden Arbeit ist die systematische Darstellung und methodische Bewertung von wissenschaftlichen Publikationen zu psychosozialen Aspekten von Herzrhythmusstörungen. Thematisch ergaben sich zwei Hauptrichtungen: 1. Das Befinden und die Lebensqualität von Patienten mit Herzrhythmusstörungen. 2. Das Problem der psychischen Beteiligung an der Auslösung von ventrikulären Arrhythmien und dem plötzlichen Herztod. Mit der Eignungsbewertung nach Hermann-Lingen und Buss (2002), mit der der Hauptteil der Studien bewertet wurde, konnten die Studien meist gut eingeteilt werden. Die Klassifizierung erfolgte anhand zweier Aspekte: der Fallzahl und der methodischen Qualität (entsprechend der Fragestellung der vorliegenden Arbeit). Die Gesamt-Eignung einer Studie errechnet sich aus dem Produkt von Fallzahl und dem Mittelwert der methodischen Qualität. Eine Ausnahme von der o.g. Bewertung stellen Studien dar, die Fragen zur Lebensqualität nur als ein weiteres Kriterium zusätzlich zu kardiologischen Parametern untersuchen, welche das größere Gewicht haben. Die Eignung ergibt sich hier als die Summe aus Fallzahl und Nutzung eines validierten Messinstrumentes. Da sie trotzdem meist als „weniger geeignet“ bewertet wurden, haben sie in dieser Arbeit kaum Gewicht. In der vorliegenden Arbeit wurden die gesichteten Originalarbeiten entsprechend ihrem Design in 3 Subgruppen unterteilt und bewertet: Querschnitts-, Verlaufs- und Prädiktorstudien. Die Verlaufsstudien befassen sich hauptsächlich mit Fragen der Lebensqualität und dem Befinden, die Prädiktorstudien ausschließlich mit dem Problem der psychischen Beteiligung an der Auslösung von ventrikulären Arrhythmien und dem plötzlichen Herztod, die Querschnittstudien bearbeiten beide Schwerpunkte. Die methodische Qualität der Studien war bei den o.g. Hauptthemen sehr unterschiedlich. Dabei ist das Niveau der Studien zur eher jungen Forschungsrichtung Lebensqualität bei den Verlaufsstudien mit 10 von 17 oder 59% Studien mit guter Bewertung eher mäßig, bei den Querschnittstudien mit 6 von 7 oder 86% gut. Bei den Studien die eher andere, einzelne Parameter zum Befinden von Patienten abfragen wie Distress, Angst, Depression, Schmerz, Anpassung an die Krankheit, Sorge um die Krankheit oder Unsicherheit wegen der Krankheit und sie mit der Lebensqualität in Beziehung setzen, ist das Niveau schlechter mit formal 11 von 11 als „weniger geeignet“ bewerteten Studien bei den Querschnittstudien und 4 von 4 bei den Verlaufsstudien, was hauptsächlich an kleinen Fallzahlen lag. Beim schon älteren Thema der psychischen Beteiligung an der Auslösung von ventrikulären Arrhythmien und dem plötzlichen Herztod ist das Niveau wesentlich besser. Das Niveau der 13 Prädiktorstudien ist hier formal hoch mit 9 von 12 also 75% als „gut“ oder „besonders gut“ geeignet bewerteten Studien. 7 Querschnittstudien befassen sich ebenfalls mit dem Thema. Davon sind 6, also 86% als „gut“ oder „besonders gut geeignet“ bewertet worden. Probleme ergaben sich durch die Änderung der Forschungsmeinung im Laufe der Zeit, was eine relevante Arrhythmie darstellt und was behandelt wird. So maß man noch 1990 Herzrhythmusstörungen ab Lown Klasse III so viel Bedeutung zu, dass man bei Symptomen eine Behandlungsindikation sah. Insbesondere die CAST-Studie von 1987 bis 1991 führte zu Veränderungen in der Sicht von Arrhythmien. Ab 1993 wird der Wandel dann auch in Lehrbüchern ersichtlich. 2004 werden unter ventrikulären Herzrhythmusstörungen nur noch Tachykardien mit einer Herzfrequenz von > 120/min. mit breitem QRS-Komplex angesehen. Vereinzelten VES wird keine Bedeutung mehr zugemessen. Als Risikofaktor für den plötzlichen Herztod wird heutzutage hauptsächlich eine eingeschränkte linksventrikuläre Ejektionsfraktion (EF) angesehen. Man geht heute davon aus, dass komplexe VES eher eine linksventrikuläre Dysfunktion anzeigen und nur für die Prognose von Patienten mit struktureller Herzerkrankung bedeutsam sind. Es wird in der vorliegenden Arbeit die neuere Definition von 2004 gewählt und bei Betrachtung von vereinzelten VES ein relevanter arrhythmischer Endpunkt (z.B. anhaltende Tachykardien, lebensbedrohliche Rhythmusstörungen) gefordert. Zum ersten Schwerpunkt zeigte sich bei den Studien zur Lebensqualität, dass Patienten mit ventrikulären und supraventrikulären Herzrhythmusstörungen eine eingeschränkte Lebensqualität aufweisen. Eine „kurative“ Therapie mit Ablation, die ohne weitere Medikamentengabe auskommt, führt dabei zu einer starken, stabilen Verbesserung der Lebensqualität, der Symptome, des psychologischen Distress und die Lebensqualität nach Ablation gleicht der von Gesunden. Bei Betrachtung der Studien zu nicht-kurativen Therapien von supraventrikulären Herzrhythmusstörungen drängt sich der Verdacht auf, dass sich eine vom Patienten empfundene Verbesserung des Befindens aus verschiedenen Komponenten zusammensetzt. Die Symptomkontrolle ist wichtig, und korrelierte gut mit Verbesserungen im sozialen Bereich und körperlichen Wohlbefinden, aber darüber hinaus scheinen auch psychische Mechanismen beteiligt zu sein. Hier könnte sich die weitere Forschung stärker und mit höheren Fallzahlen mit den psychischen Komponenten beschäftigen und versuchen, sie von den kardiologischen abzutrennen. Die objektiven, kardiologischen Parameter korrelierten nur schlecht mit den erhobenen Parametern der Lebensqualität und der Aktivität des täglichen Lebens bei supraventrikulären Arrhythmien. Die Studien zu ventrikulären Arrhythmien beschränken sich thematisch meist auf den Vergleich der Lebensqualität bei Therapie mit ICD oder Antiarrhythmika. Allgemein gaben jüngere Patienten mit ventrikulären Arrhythmien eine schlechtere Lebensqualität an als ältere. Eine größere Gesundheitsstörung und stärkerer Distress hatten eine geringere Lebensqualität zur Folge, und stärkere Medikamentennebenwirkungen hatten stärkeren Distress zur Folge. Die Sorgen wg. der Krankheit waren bei Baseline für Arrhythmiepatienten erhöht und führten zu einer schlechteren Lebensqualität. Problematisch bei den Originalarbeiten zu ventrikulären Arrhythmien war, dass meist gemischte Kollektive von Patienten nach Reanimation und ohne Reanimation untersucht wurden. Bei Bearbeitung der Originalarbeiten gewann man den Eindruck, dass diese beiden Untergruppen sich zu stark voneinander unterscheiden, als dass eine gemeinsame Betrachtung sinnvoll erscheint. Dies müssten geeignete Studien überprüfen. Zum zweiten Schwerpunkt unterscheidet man akute von chronischen psychischen Auslösern von ventrikulären Arrhythmien und dem plötzlichen Herztod. Von den akuten psychischen Zuständen scheinen 15 min. vor einer Herzrhythmusstörung bei einem hohen Prozentsatz der Patienten Ärger zu bestehen. Oft gingen vielfältige psychische Ausnahmezustände bis 24 Stunden einer ventrikulären Herzrhythmusstörung voraus. Dabei war Wut der Hauptaffekt, andere waren Depression, Angst, ängstliche Erwartung und Trauer. An chronischen Zuständen wurden folgende Konstrukte untersucht: psychischer Distress, Depression, Angst, Typ A/B-Verhalten, unterdrückter Ärger, soziale Unterstützung, der Wunsch nach Kontrolle und vitale Erschöpfung. Dabei ist die Depression am besten untersucht. Nach der Datenlage scheint es eine Korrelation mit arrhythmischen Ereignissen zu geben. Der psychische Distress, ein aus verschiedenen Variablen zusammengesetzter Parameter, ist nach Datenlage ebenfalls von Bedeutung. Für die Konstrukte Angst, unterdrückter Ärger, soziale Unterstützung, Wunsch nach Kontrolle und vitale Erschöpfung kann keine definitive Aussage gemacht werden, da sie zum Teil nur von einer Studie untersucht werden. Sie zeigen jedoch alle eine positive Korrelation zur Auslösung von Herzrhythmusstörungen. Von einer Relevanz des Typ A-Verhaltens kann man eher nicht ausgehen. Bei den Randthemen ist das Verhältnis von funktionellen Herzrhythmusstörungen zu relevanten Herzrhythmusstörungen erwähnenswert. So gibt es Hinweise, dass Patienten mit funktionellen Herzbeschwerden ängstlicher sind und sie erschienen hysterischer und stärker entfremdet im gesellschaftlichen Bereich. Jedoch werden bei Patienten mit relevanten Herzrhythmusstörungen ebenfalls oft die Beschwerden als psychisch abgetan. Als Forschungsdefizit fiel auf, dass die meisten guten Arbeiten zur Lebensqualität das Ziel haben, die Lebensqualität unter bestimmten Therapien zu bewerten. Originalarbeiten, die psychische Aspekte untersuchen, die bei Arrhythmiepatienten Einfluss nehmen auf die Lebensqualität oder das Befinden, gibt es nur wenige und es wird nur mit sehr kleinen Fallzahlen untersucht. Insgesamt fehlen größere, aussagekräftigere Studien dazu. Außerdem entsteht der Eindruck, dass viele Studien zur Lebensqualität Placebo-Effekte, z.B. der stärkeren Hinwendung zum Patienten bei bestimmten Therapien, nicht kontrollieren und schon gar nicht thematisieren. Es fehlen Untersuchungen, wo ausdrücklich geforscht wird, welche Komponenten bei hochsymptomatischen sowie auch mäßig symptomatischen Patienten mit supraventrikulären Rhythmusstörungen zur Besserung der Lebensqualität beitragen. Speziell zu den Arbeiten zu ventrikulären Arrhythmien wäre eine Untersuchung wünschenswert, inwieweit sich Patienten mit lebensbedrohlichen Herzrhythmusstörungen nach Reanimation von Patienten mit lebensbedrohlichen Herzrhythmusstörungen ohne Reanimation im Befinden, im kognitiven Erleben und in der Lebensqualität voneinander unterscheiden. Es müsste geklärt werden, ob die Reanimation ein so stark dominierender Faktor ist, dass er die kleineren Unterschiede zwischen Gesunden und Arrhythmiepatienten überlagert und verdeckt, wie es bei der vorliegenden Arbeit den Anschein hatte. Die Unterschiede von Frauen und Männern wurden von nur einer hochwertigen Arbeit zum Vorhofflimmern bearbeitet. Hier besteht noch Forschungsbedarf, da in anderen Feldern der Kardiologie durchaus Unterschiede im Erleben der Krankheit festgestellt wurden.