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Generics and typicality
(2018)
Cimpian et al. (2010) observed that we accept generic statements of the form 'Gs are f' on relatively weak evidence, but that if we are unfamiliar with group G and we learn a generic statement about it, we still interpret it in a much stronger way: (almost) all Gs are f .
This paper makes use of notions like 'representativeness' and 'contingency' from (associative learning) psychology to provide a semantics of generics that explains why people accept generics based on weak evidence. We make use of the Heuristics and Biases approach of Tversky and Kahneman (1974) and the Associative Theory of Probability Judgements to explain pragmatically why people interpret generic statements in a much stronger way. The spirit of the approach has much in common with Leslie's (2008) cognition-based ideas about generics, but the semantics is grounded on Cohen's (1999) relative readings of generic sentences. The basic intuition is that a generic of the form 'Gs are f' is true, not because most Gs are (or tend to have) f , but because f is typical for G, which means that f is valuably associated with G.
Generierung CMV-spezifischer T-Zellen aus mononukleären Zellen von CMV-seronegativen Spendern
(2019)
Die positive Entwicklung der adoptiven Zelltherapie zu einer effektiven und sicheren Therapieform ist enorm wichtig für die Behandlung von Patienten mit einer opportunistischen Infektion, wie bspw. mit CMV oder EBV, nach einer Stammzelltransplantation.
Bei (CMV-)seropositiven Spendern besteht die Möglichkeit der Selektion von VST und somit eine Therapieoption für den CMV-Infizierten Empfänger. Aufgrund der nicht vorhandenen VST bei einem negativen Spender, besteht die Option einer Infusion von selektierten VSTs bei einem CMV-infizierten Empfänger nicht. Dies ist ein besonderes Problem bei seropositiven Patienten, die die Stammzellen eines seronegativen Spenders erhalten haben und bei denen die Gefahr einer Reaktivierung des Virus besonders hoch ist.
Um einen möglichen Lösungsansatz hierfür zu finden, wurde in dieser Arbeit versucht Zellen zu generieren, die eine adoptive Zelltherapie bei dem oben genannten Spender/Empfänger-Konstellation ermöglichen.
Der Forschungsansatz dahinter war, aus naiven T-Zellen des seronegativen Spenders, durch Priming mit einem CMV-spezifischen Antigens, in diesem Fall CMV-pp65, VST zu generieren. Um diese herstellen zu können wurden mehrere Versuchsabläufe getestet. Zunächst inkubierte man unmanipulierte PBMCs mit CMV-pp65-geprimten Monozyten in verschiedenen Koinkubation-Ratios. Dies führte nicht zum gewünschten Erfolg.
In dieser Arbeit erfolgte die Selektion der Monozyten via Adhärenzmethode und mittels Microbeads. Da die Monozytenreinheit nachweislich Microbeads-Methode signifikant höher war, als die Reinheit mittels der Adhärenzmethode verließ man diese und arbeitete nur noch mit Microbeads, um ein besseres Verhältnis der Koinkubation zu erzielen.
Um einen möglichen Erfolg zu erzielen wurden in einem nächsten Schritt die selektierten Monozyten zu dendritischen Zellen (DC) weiterentwickelt und wiederum mit unmanipulierten PBMCs inkubiert.
Leider konnten auch mit dieser Herangehensweise keine VST in der Zellkultur nachgewiesen werden. Weiterführend orientierte man sich in dieser Arbeit an einem Protokoll von Wölfl et al46. Hierbei wurden statt unmanipulierten PBMCs, nur CD45RA+ naive T-Zellen aus den PBMCs verwendet, die mit CMV-pp65-geprimten DCs geprimt wurden.
Orientierend an dem Protokoll von Wölfl et al. entwickelten wir einen Versuchsaufbau bestehend aus DC-Generierung, CD45RA+-Zellselektion und Koinkubation der Zellen. Dieses 13-tägige Protokoll wurde bei 5 seronegativen Spendern durchgeführt und zeigte in der FACS Analyse CMV-spezifische T-Zellen.
Der prozentuelle Anteil der VST betrug zwischen 0,33-5,70%.
Somit konnte gezeigt werden, dass es möglich ist VST aus seronegativem Spenderzellen zu generieren und ermöglicht somit Patienten mit seronegativen Stammzellspendern, die an einer CMV-Reaktivierung/Infektion leiden, die Option der adoptiven Zelltherapie, trotz Nichtvorhandenseins von VST im Spenderblut.
EBV Infektionen nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation sind neben dem Rezidiv eine häufige Komplikation und verbleiben ein häufiger Grund der Morbidität. Langanhaltende Immunsuppression oder die verspätete T-Zell Recovery können EBV Infektionen nach Transplantation begünstigen, welche unter diesen Umständen zu lebensbedrohlichen lymphoproliferativen Erkrankungen (PTLD) führen können. Für die optimale Behandlung der PTLD gibt es keinen Konsens. Adoptive Immuntherapien mit sowohl anti-Tumor Kapazität als auch wiederhergestellter virus-spezifischer zellulärer Immunität könnten, vor allem im Bezug einer PTLD, eine optimale Behandlungs-Option darstellen.
Zytokin-induzierte Killer (CIK)-Zellen repräsentieren einen neuen immuntherapeutischen Ansatz, da sie trotz hoher Mengen an T-Zellen nur ein geringes alloreaktives Potential besitzen und selbst im haploidenten Setting nur ein geringes Risiko zur Induktion einer GvHD besitzen. Der Graft versus Leukämie/Tumor-Effekt nach allogener SZT wird durch die Zellen verstärkt. Durch das dual spezifische zytotoxische Potential der CIK-Zellen über den nicht-MHC restringierten NKG2D Killing-Mechanismus und den MHC restringierten Mechanismus über den T-Zell Rezeptor können sowohl virusinfizierte als auch transformierte Zellen bekämpft werden. In der Literatur gibt es bisher nur eine Arbeit (aus unserer Arbeitsgruppe), in der CIK-Zellen mit spezifischen viralen Antigenen für eine antileukämische und potentielle anti-virale Aktivität stimuliert werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde sowohl in prä-klinischen als auch in einem klinischen Ansatz die Durchführbarkeit, Anwendbarkeit, Effektivität und Sicherheit von EBV-spezifischen CIK-Zellen untersucht. Dazu wurde in einem ersten Schritt untersucht, ob sich durch die Modifizierung des konventionellen Herstellungsprotokolls EBV-spezifische CIK-Zellen generieren lassen.
Im präklinischen in vitro Setting wurde eine Modifizierung im CIK Herstellungsprotokoll vorgenommen um EBV-spezifische CIK-Zellen zu generieren, die sowohl ein anti-leukämisches als auch ein spezifisches anti-virales (EBV) Potential besitzen. Die Generierung erfolgte aus peripheren, mononukleären Zellen EBV-seropositiver Spender. Zusätzlich zu den CIK-Stimulanzien wurden die Zellen zweimal mit dem EBV Consensus Peptid Pool stimuliert, der Peptidsequenzen von verschiedenen latenten und lytischen EBV-Proteinen enthält. Durch die Modifikation konnte eine Ko-Expansion an EBV-spezifischen Zellen innerhalb des CD3+CD8+ Kompartiments der CIK-Zellen von bis zu 8% erreicht werden. In Zytotoxizitätsanalysen wurde das effektorische Potential der generierten Zellen überprüft. Gegenüber EBV peptidbeladenen Zielzellen zeigten die zusätzlich mit EBV-Peptid stimulierten CIK-Zellen in allen E:T Ratios (40:1, 20:1 und 5:1) eine signifikant höhere lytische Aktivität im Vergleich zur Aktivität konventioneller CIK-Zellen. Durch Blocking des NKG2D Rezeptors wurde die TCR-vermittelte lytische Aktivität in Bezug auf ein virales Ziel weiter gezeigt. Das anti-leukämische Killing Potential über den nicht-MHC restringierten NKG2D Rezeptor blieb zeitgleich erhalten, was sich in spezifischen Lysen gegenüber K562 und THP-1 Zellen von bis zu knapp 60% wiederspiegelt. Die durchflusszytometrische immunphänotypische Charakterisierung der EBV-stimulierten CIK-Zellen mittels 10-Farb Panel ergab keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Phänotyp und Rezeptor-Repertoire im Vergleich zu den konventionellen CIK-Zellen. Die Zytokin- und Chemokin Analysen der EBV-spezifischen CIK-Zellen spiegelten ein CD8+ TH1 Profil wieder und reflektierten den zytotoxischen Charakter der Zellen. Mit dem modifizierten Protokoll war es möglich für eine Patientin GMP-konforme CIK-Zellen mit EBV-Spezifität zu generieren, die 9,6 x 103 EBV-spezifische T-Zellen/kg Körpergewicht enthielten. Die Infusion der EBV-spezifischen CIK-Zellen resultierte in einer rapiden Beseitigung der Plasma EBV DNA und langanhaltendem Verschwinden des großen (27 cm3) PTLD-malignen Lymphoms. Während des anschließenden Immun-Monitorings der Patientin konnten CD4+ und CD8+ EBV-spezifische CIK-Zellen mittels der Dextramer Technologie in vivo im Blut der Patientin über einen Zeitraum von 32 Tagen nachgewiesen werden. Weitere FACS Analysen ergaben, dass sich im CD8+ Kompartiment der Patientin neben den CD8bright T-Zellen eine wachsende Population an CD8dim Zellen nachweisen ließ. Diese bestand zu einem bemerkenswerten Prozentsatz von bis zu 95% aus TEMRA Zellen, die auf virusspezifische T-Zellen hinweisen. Die Infusion der Zellen induzierte weder ein CRS noch andere Toxizitäten. Zytokin-Analysen aus dem Serum der Patientin reflektierten ein zytotoxisches und anti-virales Potential der infundierten Zellen. In vitro zeigten die unter GMP generierten Zellen im E:T Verhältnis von 40:1 und 20:1 ein 2-fach höheres zytotoxisches Potential gegenüber peptidbeladenen T2 Zellen im Vergleich gegenüber WT T2 Zellen. Der anti-leukämische Effekt gegen K562 Zellen blieb auch hier erhalten. 2 Jahre nach Behandlung ist die Patientin immer noch in Remission.
Die in dieser Arbeit erzielten prä-klinischen und klinischen Ergebnisse zeigen, dass virusspezifische CIK-Zellen eine neue, potentielle Immuntherapie darstellen, da die Zellen eine wirksame anti-leukämische Immunität mit antiviraler Immunrekonstitution vereinen. EBV-spezifische CIK-Zellen erwiesen sich als ein vielversprechender Ansatz für die Prävention von malignen Erkrankungen sowie in der Behandlung von EBV-Komplikationen nach allogener SZT.
Die Gotik ist eine Kunstepoche des Mittelalters, die eine große Anzahl beeindruckender Bauten hervorgebracht hat. Hierbei sind besonders die monumentalen Sakralbauten dieser Zeit mit ihren eindrucksvollen Fenstern hervorzuheben. Rosetten gehören zu den größten Fenstern in gotischen Kathedralen. Sie sind kreisförmige Fenster, die vor allem durch ihre komplexe Aufbauweise auffallen. Das Grundbauelement der Rosetten ist das sog. Maßwerk - ein Steinwerk das als dekoratives Muster für Fenster und Wände in gotischen Bauten eingesetzt wird. Charakteristisch für diese Muster sind sich wiederholende, verschieden große geometrische Formen, was an die Eigenschaft der Selbstähnlichkeit bei Fraktalen erinnert.
Die manuelle Modellierung gotischer Fenster ist auf Grund deren komplexen Aufbaus sehr aufwendig. Eine prozedurale Generierung hingegen automatisiert den Modellierungsprozess weitgehend und verringert damit den Zeit- und Modellierungsaufwand per Hand.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine prozedurale Methode beschrieben, die die aufwendige manuelle Modellierung der Rosetten bzw. des Maßwerks zum größten Teil ersetzt. Diese Methode basiert auf der Analyse der fraktalen Struktur des Maßwerks und nutzt dabei dessen Selbstähnlichkeit aus, um Rosetten automatisch zu generieren. Mit der in dieser Arbeit entwickelten Implementierung ist es mögliche, eine große Vielfalt gotischer Rosetten zu beschreiben und mit Hilfe der 3D-Grafik-Engine OGRE graphisch darzustellen.
Zur erfolgreichen Behandlung von Tumorerkrankungen sind effiziente Therapien notwendig. Oftmals kommt es nach einer klassischen Tumortherapie zum Auftreten von Rezidiven, die aus residuellen Tumorzellen hervorgehen. Grund hierfür können eine bereits erfolgte Metastasierung oder Resistenzmechanismen der Tumorzellen sein. Auf Grund ihrer Fähigkeit Gewebe aktiv zu infiltrieren bietet der Einsatz zytotoxischer Lymphozyten im Rahmen einer zellulären Immuntherapie den Vorteil, auch bereits metastasierte Tumorzellen zu erreichen. Dadurch können auch Tumorzellen eliminiert werden, die Resistenzmechanismen meist im oberen Teil apoptotischer Signalkaskaden aufweisen. Eine spezifische Ausrichtung zytotoxischer Lymphozyten auf Tumorantigene ist grundsätzlich über chimäre Antigenrezeptoren möglich. Dabei bietet die Generierung von Tumor-spezifischen zytotoxischen Effektorzelllinien den Vorteil, Zellklone mit definierter Aktivität und Spezifität bereitstellen zu können. Im Hinblick auf einen klinischen Einsatz scheint hierfür die Natürliche Killerzelllinie NK-92 besonders geeignet. Die Ergebnisse einer klinischen Studie mit parentalen NK-92 Zellen zeigten eine gute Verträglichkeit ohne Nebenwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden NK-92 Zellen genetisch so modifiziert, dass sie chimäre Antigenrezeptoren mit Spezifität für die Tumorantigene CD20, EpCAM, GD2 und CD138 exprimieren. In der Tumortherapie stellen das mit Tumoren der B-Zell-Reihe assoziierte CD20-Molekül und das auf den meisten Tumorzellen epithelialen Ursprungs exprimierte EpCAM-Protein wichtige Zielantigene monoklonaler Antikörper dar. Studien zeigten, dass auch die auf Tumorzellen des Neuroblastoms bzw. Multiplen Myeloms exprimierten Moleküle GD2 bzw. CD138 geeignete Angriffspunkte für immuntherapeutische Ansätze sein könnten. Die chimären Antigenrezeptoren sind aus einem Antigenspezifischen scFv-Antikörperfragment aufgebaut, das über ein Fragment der CD8alpha-Kette mit der CD3zeta-Kette als Signaltransduktionsdomäne verbunden ist. Nach retroviraler Transduktion zeigte sich eine hohe und homogene Oberflächenexpression dieser Rezeptoren auf modifizierten NK-92 Zellen. Auf das Oberflächenprotein CD20 ausgerichtete NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen wiesen gegen CD20- positive Tumorzelllinien und primäre Tumorzellen eine hohe zytotoxische Aktivität auf. Im Vergleich waren parentale NK-92 Zellen gegen diese Tumorzellen nicht oder deutlich weniger aktiv. Dabei war die zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen mit dem monoklonalen anti-CD20 Antikörper Rituximab kompetitierbar. Mit Hilfe der gegen parentale und modifizierte NK-92 Zellen resistenten Zelllinie NIH3T3 wurde gezeigt, dass allein über die stabile Expression des CD20-Proteins in NIH3T3 Zellen die Resistenz gegen modifizierte NK-92 Zellen überwunden werden kann. NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen waren in der Lage, CD20-positive NIH3T3-CD20 Zellen auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen effizient abzutöten. In Mischkulturen aus NIH3T3 und NIH3T3-CD20 Zellen war zudem eine selektive zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen ausschließlich gegen Antigen-positive Zellen nachweisbar. Über die Analyse von Zellkonjugaten zwischen zytotoxischen Effektorzellen und ihren Zielzellen, deren Bildung grundsätzliche Voraussetzung für eine Eliminierung ist, wurden Hinweise erhalten, dass der chimäre Antigenrezeptor hierzu keinen Beitrag zu leisten scheint, sondern vor allem die anschließende Aktivierung der modifizierten NK-92 Zellen bewirkt. Mit EpCAM-spezifischen NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen war auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen eine effiziente Abtötung von unterschiedlichen Tumorzelllinien epithelialen Ursprungs möglich. Eine erfolgreiche Blockierung dieser zytotoxischen Aktivität mit dem monoklonalen Antikörper MOC31 bestätigte, dass diese spezifisch über den chimären Antigenrezeptor vermittelt wurde. Die untersuchten epithelialen Zelllinien erwiesen sich dagegen als vollkommen resistent gegen parentale bzw. mit demleeren Expressionsvektor modifizierte NK-92-Mock Zellen. Weitere Ergebnisse zeigten, dass die zytotoxische Aktivität von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen tatsächlich über Granzym B vermittelt wird. Eine erhöhte FasL-Oberflächenexpression infolge der Cokultur mit Antigen-positiven Zielzellen war dagegen nicht nachweisbar. Anhand dieser Ergebnisse kann eine signifikante Beteiligung von FasL an der zytotoxischen Aktivität der modifizierten NK-92 Zellen ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden therapeutische Effekte von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen in einem Xenograftmodell in NOD-scid/scid Mäusen mit einer humanen EpCAM-positiven Tumorzelllinie untersucht. Hier wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe durch Behandlung mit EpCAM-spezifischen NK-92 Zellen, unerwarteterweise aber auch mit NK-92-Mock Zellen, ein signifikant längeres Überleben der Tiere beobachtet. Nach der Ableitung CD138-spezifischer NK-92-scFv(B-B4)-Zeta Zellen wurde zwar eine hohe zytotoxische Aktivität gegen CD138-positive Zelllinien erhalten. Es war jedoch keine im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen weiter verstärkte Zytotoxizität nachweisbar. Als Ursache hierfür ist eine mangelnde Funktionalität des scFv-Antikörperfragments im Kontext des chimären Antigenrezeptors denkbar. Da die Bindungseigenschaften von scFv-Fragmenten entscheidend durch die Anordnung ihrer schweren und leichten Antikörperketten zueinander beeinflusst werden können, wurden NK-92 Zellen etabliert, die ein scFv-Fragment mit umgekehrter Orientierung der Antikörperketten in ihrem chimären Antigenrezeptor tragen. Diese werden derzeit im Rahmen einer externen Zusammenarbeit auf ihre Funktionalität hin überprüft. Zur Konstruktion gegen das Disialogangliosid GD2 gerichteter chimärer Antigenrezeptoren wurden parallel zwei scFv-Fragmente des Antikörpers ch14.18 eingesetzt, die sich in der Orientierung der schweren und leichten Antikörperketten zueinander unterscheiden. Mit den Antigenrezeptorkonstrukten modifizierte NK-92 Zellen zeigten eine im Vergleich zu parentalen NK-92 und NK-92-Mock Zellen stark erhöhte Zytotoxizität gegen GD2 exprimierende humane Tumorzelllinien. Dabei wurde weder bei der Expressionsdichte der chimären Antigenrezeptoren noch in der zytotoxischen Aktivität modifizierter NK-92 Zellen mit unterschiedlicher Anordnung der variablen Antikörperdomänen im scFv Antikörperfragment ein signifikanter Unterschied beobachtet. Mit der extrazellulären Domäne von CTLA-4 als Modellprotein wurde der mögliche Einsatz einer zu scFv-Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomäne geprüft. CTLA-4 wird normalerweise auf T-Zellen exprimiert und bindet an CD80 bzw. CD86 auf APCs. CD80- und/oder CD86-positive Zielzellen wurden von NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen spezifisch und mit hoher Effizienz lysiert. In Zytotoxizitätsassays wurde mit Hilfe einer sowohl gegen parentale als auch modifizierte NK-92 Zellen resistenten Tumorzelllinie gezeigt, dass allein die stabile Expression des CD86 Proteins in dieser Zelllinie ausreicht, um die Resistenz gegen NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen aufzuheben. Daraus kann geschlossen werden, dass grundsätzlich auch der Einsatz von zu scFv- Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomänen eine spezifische Ausrichtung und effiziente Aktivierung von NK-92 Zellen gewährleistet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die genetische Modifikation der Natürlichen Killerzelllinie NK-92 zur Ausrichtung auf Tumor-spezifische Zielstrukturen einen grundsätzlich geeigneten Ansatz zur Behandlung maligner Erkrankungen darstellt. Eine Weiterentwicklung Antigen-spezifischer NK-92 Derivate als mögliche Zelltherpeutika erscheint daher sinnvoll und vielversprechend.
Bemerkenswerte Fortschritte in der rekombinanten Antikörpertechnologie und die Entwicklung unterschiedlichster Antikörperformate zur Expression in Bakterien, niederen und höheren Eukaryonten haben Antikörperderivaten vielfältige Anwendungsbereiche eröffnet. Hierzu gehört beispielsweise ihr Einsatz als experimentelle Wirkstoffe in der Tumortherapie, wo einige dieser Ansätze bereits in klinischen Studien evaluiert werden. Daneben könnten rekombinante Antikörperderivate aber auch eine zunehmend wichtige Rolle in der funktionellen Genomik spielen, beispielsweise bei der Aufklärung der Funktion medizinisch relevanter Genprodukte. So stellt der gezielte Einsatz intrazellulär exprimierter single-chain Fv Antikörperfragmente (scFvs) grundsätzlich einen viel versprechenden Ansatz zur selektiven Interferenz mit der Funktion intrazellulärer Proteine dar. Solche scFv Fragmente sind jedoch nach Expression im Zytosol aufgrund des dort vorherrschenden reduzierenden Milieus häufig inaktiv, was auf die nicht erfolgte Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken zurückzuführen ist, die normalerweise in den variablen Domänen von Antikörpern vorliegen. Nur wenige, bisher meist sehr aufwendig durch individuelle Analyse einzelner Moleküle identifizierte scFvs weisen eine ausreichend hohe intramolekulare Stabilität auf, um den Verlust der Disulfidbindungen kompensieren zu können und unter diesen Bedingungen aktiv zu sein. Dies steht bislang einer breiten Anwendung zytoplasmatischer scFvs entgegen. Ziel dieser Arbeit war es, ausgehend von hochdiversen scFv Antikörper-Bibliotheken ("Libraries") direkt solche selten auftretenden scFv Antikörperfragmente zu isolieren, die trotz des reduzierenden Milieus im Zytosol von Säugerzellen aktiv sind und hochspezifisch an die intrazellulären Domänen von ErbB-Rezeptoren wie dem Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) oder dem nahe verwandten ErbB2 Molekül binden. Diese ErbB-Rezeptoren sind in einer Reihe humaner Tumore überexprimiert. Als wichtige signalleitende Moleküle tragen sie zur malignen Transformation von Zellen bei und spielen eine wichtige Rolle in der Tumorentstehung und -progression. Sie stellen daher viel versprechende Zielstrukturen für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe dar. Auf der Grundlage des Yeast Two-Hybrid Systems wurde ein in vivo Assay etabliert, der das Screening von scFv Libraries nach ErbB-spezifischen scFvs unter intrazellulären Bedingungen in Hefezellen erlaubt. Während es nicht möglich war, in einer im Rahmen der vorliegenden Arbeit generierten anti-ErbB2 scFv-Library und einer mit 8 x 10 hoch 5 unabhängigen Klonen wenig diversen anti-EGFR scFv-Library intrazellullär aktive ErbBspezifische scFv Antikörper nachzuweisen, konnte eine zweite anti-EGFR scFv-Library aufgrund ihrer großen Komplexität von 2 x 10 hoch 8 nicht komplett in Hefezellen gescreent werden. Die Library wurde daher zunächst durch wenige Runden Phagen Biopanning präselektioniert, um so die Diversität der Library auf ein Maß zu reduzieren, das eine weitere Selektion in vivo durch Yeast Two-Hybrid Screening zuließ. Mit Hilfe dieser Kombination aus in vitro Präselektion und in vivo Assay gelang es, verschiedene intrazellulär aktive EGFR-spezifische scFv Fragmente aus einer anti-EGFR scFv-Library zu isolieren. Durch GST "pull-down" Experimente und Koimmunpräzipitationsexperimente konnten deren Spezifität und intrazelluläre Aktivität in Säugerzellen in vitro und in vivo verifiziert werden. Wie durch Konfokale Laserscanning Mikroskopie gezeigt wurde, kolokalisieren die isolierten scFv Antikörper mit EGFR an der Zellmembran EGFR-überexprimierender humaner Tumorzellen. Ein direkter Effekt der Expression der EGFR-spezifischen scFvs auf die Autophosphorylierung des Rezeptors und auf die Proliferation von EGFRexprimierenden Mausfibroblasten wurde jedoch nicht beobachtet. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass mit Hilfe des hier entwickelten Konzepts intrazellulär aktive EGFR-spezifische scFv Fragmente aus einer hochdiversen scFv-Library isoliert werden konnten. Prinzipiell sollte diese Strategie auch auf die Gewinnung intrazellulär aktiver scFv Antikörperfragmente anwendbar sein, die spezifisch an andere zytoplasmatische Zielmoleküle binden. Daneben könnten die Spezifität und intrazelluläre Aktivität der bereits isolierten EGFR-spezifischen scFv Fragmente genutzt werden, um z.B. durch Fusion mit Lokalisierungssignalen, Enzymen oder bestimmten Protein-Protein-Interaktionsdomänen die Signalleitung des EGFR gezielt zu beeinflussen. Entsprechende Ansätze werden gegenwärtig in der Arbeitsgruppe weiter verfolgt.
Diese Arbeit behandelt das Thema der Darstellung und der Simulation von Pflanzen mit Lindenmayer-Systemen. Zur Darstellung der aus Lindenmayer- Systemen entwickelten Strukturen wird das Programm Linde 3D entwickelt, welches dem Benutzer das Erstellen und die Simulation von Objekten unter Verwendung von deterministischen, geschachtelten, stochastischen, kontextsensitiven, umgebungssensitiven und offenen Lindenmayer-Systemen ermöglicht.
Neben der Entwicklung des Programms Linde 3D liegt ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Simulation der biologischen Prozesse Vernalisation und Stratifikation. Für die Simulation dieser Prozesse werden Lindenmayer- Systeme entwickelt, welche die Grundfunktionalität der Prozesse simulieren und in Abhängigkeit dieser dreidimensionale Modelle der Pflanze erzeugen.
Das Programm Linde 3D ist so konzipiert, dass es allgemein eingesetzt werden kann. Neben dem Verständnis für die abstrakten Modelle der Lindenmayer-Systeme werden keine speziellen Kenntnisse des Anwenders vorausgesetzt. Die Eingabe der L-Systeme erfolgt entweder über die Auswahl vordefinierter Lindenmayer-Systeme und Umweltdaten oder durch Komposition von Lindenmayer-Systemen und Umweltdaten durch den Anwender. Die graphische Interpretation der Lindenmayer-Systeme erfolgt unter Verwendung des Schildkröten-Modells. Die Ausgabe des Programms Linde 3D besteht zum einen aus einer direkten Darstellung der generierten Szene im Programm und zum anderen aus der Ausgabe der Szene in Form einer oder mehrerer Dateien für den POVRay Raytracer. Die erzeugten Dateien können durch externe Programme aufbereitet und zu einer Animation zusammengefügt werden.
Die vorliegende Arbeit beginnt mit einer kurzen Einführung in das Thema der Fraktale und Lindenmayer-Systeme, sowie den nötigen Grundlagen für das Verständnis der biologischen Hintergründe. Im Anschluss werden dem Leser die notwendigen theoretischen Grundkenntnisse zu Lindenmayer-Systemen und ein Einblick in aktuelle Anwendungen und Entwicklungen vermittelt. Nach einer Beschreibung der Anforderungen, des Aufbaus und der Implementierung des Programms Linde 3D werden die erworbenen Grundkenntnisse im Bereich der Lindenmayer-Systeme und das Programm Linde 3D eingesetzt, um Schritt für Schritt Lindenmayer-Systeme für die Simulation der biologischen Prozesse Vernalisation und Stratifikation zu entwickeln. Nach der Konstruktion der L-Systeme werden die erworbenen theoretischen Grundlagen für den Bereich des Testens von Parser und Schildkröten-Modell auf Funktionalität benötigt. Im Ausblick werden Ideen für Anwendungen und Erweiterungen des Programms Linde 3D beschrieben.
In dieser Arbeit werden Monozyten mit Hilfe der Ficoll-Trennung und Positivanreicherung durch das MACS-Magnetsystem gewonnen und durch die Zytokine GM-CSF und Interleukin 4 stimuliert. Nach zwei Tagen weisen die Zellen eine veränderte Morphologie auf, adhärieren zum Teil an Plastik und zeigen sowohl in der adhärenten als auch der nonadhärenten Fraktion charakteristische Merkmale dendritischer Zellen: In der Mikroskopie längliche, fädige Zytoplasmaausläufer sowie in der Durchflusszytometrie das Erscheinen der Oberflächenmarker CD1a und CD40. Die Zellen sind zu diesem Zeitpunkt zu ca. 90% unreife dendritische Zellen, wie die fehlende Ausprägung des Reifemarkers CD83 zeigt. Als unreife dendritische Zellen sind sie somit geeignet für die Antigenaufnahme; zur weiteren Ausreifung ist die Zugabe anderer Zytokine, z.B TNF α, notwendig. Als Mediengrundlage eignen sich sowohl RPMI+FCS als auch X-Vivo 15 und X-Vivo 20, wobei X-Vivo 15 und X-Vivo 20 aufgrund ihrer immunologischen Vorteile RPMI vorzuziehen sind. Ausblick Insgesamt sind schon vielversprechende Wege aufgezeigt worden, dendritische Zellen für die Immuntherapie zu gewinnen, und zwar sowohl aus CD34+ Stammzellen als auch aus CD14+ Monozyten. Wichtig wäre an dieser Stelle ein genauer Vergleich zwischen aus Monozyten und aus CD34+ Vorläuferzellen generierten Zellen in der Laborpraxis. Zum einen sollte hier untersucht werden, aus welcher Ausgangszelle sich größere Mengen an dendritischen Zellen generieren lassen. Die genaue Ermittlung der Zellzahl an jedem Kulturtag wäre hier von Bedeutung. Zum anderen sollte auch die Funktionalität der jeweiligen Zellen, etwa in der mixed-lymphocte-reaction, analysiert und miteinander verglichen werden, und zwar vor und nach zusätzlicher Gabe von TNF alpha. Die Mediengrundlagen X-Vivo 15 und X-Vivo 20 haben sich als gute Alternativen zu dem herkömmlich verwendeten RPMI 1640 gezeigt. An dieser Stelle wäre noch eine vergleichende Analyse der beiden Medien wichtig, und zwar im Hinblick auf die oben genannte Fragestellung der Zellzahl, Ausprägung der Oberflächenmarker und Funktionalität .
Die Heparininduzierte Thrombozytopenie (HIT) ist eine lebensbedrohliche Komplikation der Heparintherapie. Diese wird verursacht durch die Bildung von Antikörpern gegen einen Komplex aus Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin. Orthopädische und herzchirurgische Patienten weisen deutlich höhere Serokonversionsraten auf (15-75 %) als andere Patientenkohorten, z.B. internistische Patienten (<1 %), ohne dabei in allen Fällen mit den klinischen Zeichen einer HIT, d.h. Thrombozytopenie sowie arteriellen und venösen thromboembolischen Komplikationen, einherzugehen. Der Grund für diese Beobachtung ist unklar. Es ist bekannt, dass Glykosaminoglykane und sulfatierte Polysaccaride ein Epitop auf dem Plättchenfaktor 4 induzieren können, gegen das eine Sensibilisierung erfolgen kann. Es wird vermutet, dass Glykosaminoglykane, d.h. Chondroitinsulfate, die bei großen orthopädischen Eingriffen freigesetzt werden, die hohen Serokonversionsraten bei orthopädischen Patienten erklären könnten.
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Inzidenz von HIT-Antikörpern bei Patienten mit orthopädischen Eingriffen zu untersuchen, bei denen perioperativ keine Heparinexposition erfolgte. Die Antikoagulation zur Thromboseprophylaxe im untersuchten Patientenkollektiv wurde postoperativ mit dem zur orthopädischen Thromboseprophylaxe zugelassenen, direkten oralen Faktor Xa Inhibitor Rivaroxaban und nicht mit niedermolekularem Heparin durchgeführt, welches eine HIT-Antikörperbildung hätte induzieren können.
Material und Methoden: Zur HIT Diagnostik wurde jeweils präoperativ und mindestens 5 Tage postoperativ ein immunologischer Chemilumineszenztest (HemosIL® AcuStar HIT-IgG(PF4-H)) und ein funktioneller Heparin-induzierter Plättchenaktivierungstest (HIPA) durchgeführt, um eine Serokonversion zu detektieren. Ausschlusskriterium war eine Heparinexposition innerhalb der letzten 3 Monate sowie während und nach der Operation.
Ergebnisse: 107 konsekutive Patienten, 65 (60,7 %) weibliche und 42 (39,3 %) männliche Patienten, bei denen eine operative totale Hüftgelenk- (n= 66; 61,6 %) oder Kniegelenkendoprothese (n= 41; 38,3 %) durchgeführt wurde, wurden in die Studie eingeschlossen. Vor und auch nach der Operation konnte weder im durchgeführten Immunoassay noch im funktionellen HIPA eine Serokonversion mit der Bildung von anti-PF-4/Heparin Antikörpern festgestellt werden.
Diskussion: Große orthopädische Operationen allein nicht auszureichen, um die hohen HIT-Antikörper Serokonversionsraten in Abwesenheit von Heparin bei diesen Patienten zu erklären. Heparin scheint für eine Sensibilisierung unerlässlich zu sein. Aber auch andere Risikofaktoren für die Bildung von HIT-Antikörpern gegen den Komplex aus PF4 und Heparin bzw. Polyanionen, wie z.B. bakterielle Infektionen, Ausmaß des Gewebetraumas, Freisetzung von Nukleinsäuren, könnten eine Rolle spielen. Da das antigene Epitop nur bei optimalen stöchiometrischen Ratios von PF4 und Heparin/Glykosaminoglykanen induziert wird, ist es vorstellbar, dass einige der genannten Faktoren zusammenwirken könnten, um die Immunreaktion zu ermöglichen. Auf der Basis unserer Studie kann zwar das Konzept der ‘‘spontanen’’ HIT nicht erklärt werden. Auf Basis der bestehenden Daten kann es aber auch nicht verworfen werden.
Das Hepatitis C Virus (HCV) ist Auslöser einer oftmals chronisch verlaufenden Leberentzündung mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung einer Leberzirrhose und deren Folgen. Die weltweite Prävalenz der Hepatitis C beträgt ca. 3%; allein in Deutschland treten jährlich mehr als 5000 Neuinfektionen auf. Das HCV lässt sich aufgrund phylogenetischer Untersuchungen in mindestens 6 Genotypen und jeweils mehrere Subtypen einteilen, wobei der HCV Subtyp 1b in Europa am häufigsten vorkommt. Die Hepatitis C Forschung wurde lange Zeit durch das Fehlen eines geeigneten Zellkulturmodells erschwert. Mit der Etablierung eines stabil replizierenden Zellkulturmodells in humanen Hepatomazellen 1999 durch Lohmann et al. wurden erstmals molekularbiologische Untersuchungen in grossem Umfang möglich. Die seither existierenden Zellkulturmodelle haben jedoch den Nachteil, dass nicht definiert ist, wie sich das Isolat, aus dem das Replikon geschaffen wurde, klinisch verhält. Unter einer Interferon-basierten Therapie sprechen manche Patienten mit einer dauerhaften Negativierung der HCV RNA Konzentration an (sustained responder, SR), während bei anderen sowohl während als auch nach Therapieende weiterhin HCV RNA im Blut nachweisbar ist (non-responder, NR), obwohl beide Patienten mit demselben Subtyp von HCV infiziert sind und dieselbe Therapie erhalten. Die Ursachen für dieses unterschiedliche Therapieansprechen sind basierend auf Mutationsstudien von HCV Isolaten von Patienten mit unterschiedlichem Therapieansprechen zumindest teilweise genomisch bedingt. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit zwei Konsensusklone zur Einbringung in ein replikatives Zellkulturmodell aus HCV Subtyp 1b Isolaten geschaffen, deren klinisches Verhalten unter Therapie klar charakterisiert ist. Dazu wurde Serum von je einem Patienten herangezogen, der unter definierten Studienbedingungen als SR oder NR bekannt war. Aus den Sera wurde die Virus-RNA extrahiert und mit Hilfe eines eigens dafür entwickelten RT-PCR-Protokolls und anschließender Klonierung in E. coli vervielfältigt. Um zufällige Mutationen und seltene Quasispezies auszuschließen, wurde dann nach vollständiger Sequenzierung von jeweils vier Einzelklonen mittels gezielter Mutagenese und Umklonierung eine Konsensussequenz geschaffen, die einen Durchschnitt der am häufigsten vorkommenden Quasispezies darstellt. Diese Konsensusklone wurden in einen Vektor zur Herstellung von RNA Transkripten eingefügt, so dass die Transkripte direkt zur Einbringung als Replikons in Zellkulturen genutzt werden können. Mit diesen klinisch charakterisierten Isolaten kann nun erstmals nach Unterschieden geforscht werden, die ursächlich für Therapieerfolg oder –misserfolg sein könnten. So können eventuell neue Therapieformen gefunden oder bereits vor Beginn einer Therapie eine Aussage zur Prognose getroffen werden.