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The transporter associated with antigen processing (TAP) plays a pivotal role in the adaptive immune response against virus-infected or malignantly transformed cells. As member of the ABC transporter family, TAP hydrolyzes ATP to energize the transport of antigenic peptides from the cytosol into the lumen of the endoplasmic reticulum. TAP forms a heterodimeric complex composed of TAP1 and TAP2 (ABCB2/3). Both subunits contain a hydrophobic transmembrane domain and a hydrophilic nucleotide-binding domain. The aim of this work was to study the ATP hydrolysis event of the TAP complex and gain further insights into the mechanism of peptide transport process. To analyze ATP hydrolysis of each subunit I developed a method of trapping 8- azido-nucleotides to TAP in the presence of phosphate transition state analogs followed by photocross-linking, immunoprecipitation, and high-resolution SDS-PAGE. Strikingly, trapping of both TAP subunits by beryllium fluoride is peptide-specific. The peptide concentration required for half-maximal trapping is identical for TAP1 and TAP2 and directly correlates with the peptide-binding affinity. Only background levels of trapping were observed for low affinity peptides or in the presence of the herpes simplex viral protein ICP47, which specifically blocks peptide binding to TAP. Importantly, the peptideinduced trapped state is reached after ATP hydrolysis and not in a backward reaction of ADP binding and trapping. In the trapped state, TAP can neither bind nor exchange nucleotides, whereas peptide binding is not affected. In summary, these data support the model that peptide binding induces a conformation that triggers ATP hydrolysis in both subunits of the TAP complex within the catalytic cycle. The role of the ABC signature motif (C-loop) on the functional non-equivalence of the NBDs was investigated. The C-loops of TAP transporter contain a canonical C-loop (LSGGQ) for TAP1 and a degenerated ABC signature motif (LAAGQ) for TAP2. Mutation of the leucine or glycine (LSGGQ) in TAP1 fully abolished peptide transport. TAP complexes with equivalent mutations in TAP2 showed however still residual peptide transport activity. To elucidate the origin of the asymmetry of the NBDs of TAP, we further examined TAP complexes with exchanged C-loops. Strikingly, the chimera with two canonical C-loops showed the highest transport rate whereas the chimera with two degenerated C-loops had the lowest transport rate, demonstrating that the ABC signature motifs control the peptide transport efficiency. All single-site mutants and chimeras showed similar activities in peptide or ATP binding, implying that these mutations affect the ATPase activity of TAP. In addition, these results prove that the serine of the C-loop is not essential for TAP function, but rather coordinates, together with other residues of the C-loop, the ATP hydrolysis in both nucleotide-binding sites. To study the coupling between the ATP binding/hydrolysis and the peptide binding, the putative catalytic bases of the TAP complex were mutated to generate the so-called EQ mutants. The mutations did not influence the peptide-binding ability. Dimerization of the NBDs of EQ mutants upon ATP binding does not alter the peptide binding property. At 27°C, both ATP and ADP could induce the loss of peptide-binding ability (Bmax) only in the variants bearing a mutated TAP2. Further studies are required to deduce at which stage in the catalytic cycle the peptide-binding site is affected. In addition, mutation of the putative catalytic base of both subunits showed a magnesium-dependent peptide transport activity, demonstrating these mutants did not abolish the ATP hydrolysis. Thus, the function of this acidic residue as the catalytic base is not likely to be universe for all ABC transporters.
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der beta-Herpesviridae. Bis zu 80% menschlichen Bevölkerung sind weltweit mit dem Virus infiziert. Nach einer meist asymptotischen Erstinfektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirtsorganismus. Im Laufe der Evolution wurden von einigen Herpesviren verschiedene Strategien entwickelt, um der Antigenprozessierung und damit der zellulären Immunantwort zu entgehen. Das HCMV-Protein US6 blockiert die Antigenpräsentation via MHC I. US6 ist ein ER-ständiges Typ I Transmembranglykoprotein bestehend aus einer Signalsequenz, einer ER-luminalen Domäne, einer Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus. US6 inhibiert den TAP-abhängigen Peptidtransport aus dem Zytoplasma in das ER-Lumen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ER-luminale Domäne von US6 bestehend aus der Primärsequenz 20-146 heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies rückgefaltet. Das rückgefaltete Protein erwies sich als Monomer (15,6 kDa). Die in der ER-luminalen Domäne befindlichen acht Cysteine bilden ein intramolekulares Netzwerk aus vier Disulfidbrücken. Zur Aufklärung des molekularen Inhibitionsmechanismus von US6(20-146) wurden verschiedene in vitro TAP-Funktions-Assays angewendet. Die Bindung von US6 an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung in den zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid- und ADP-Bindung von TAP ist nicht beeinflusst, durch die Inhibition der ATP-Bindung wird jedoch die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse unterbunden. Für die Inhibitionsreaktion konnte ein halbmaximaler Inhibitionskoeffizient (IC50) von 1 µM ermittelt werden. Für die inhibitorische Aktivität von US6 sind die C-terminalen Aminosäuren 126-139 der ER-luminalen Domäne von US6 verantwortlich. Die innerhalb dieser Region befindlichen Aminosäuren Cys127, Cys129, D130, W134 und R138 wurden gegen Serin bzw. Alanin ersetzt. Dies hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von US6(20-146). Auch ist der N-Terminus von US6 nicht essentiell für die Aktivität.
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass bei Krebspatienten Tumorspezifische Gedächtnis T-Zellen im Verlauf einer Tumorerkrankung generiert und erhalten werden. Dies konnte sowohl für einen soliden Tumor, das Mammakarzinom, als auch für eine hämatologische Neoplasie, das Multiple Myelom, verifiziert werden. Dabei konnte zum ersten Mal belegt werden, dass im Verlauf einer MM-Erkrankung MUC-1 als autologes Tumor-assoziiertes Antigen immunologisch erkannt wird und zur Generierung von Gedächtnis T-Zellen mit einer Anreicherung im Knochenmark der Patienten führt. Weiterhin konnte eine Anreicherung TAA-spezifischer Gedächtnis T-Zellen innerhalb der EM Zellpopulation bei Mammakarzinom-Patientinnen demonstriert werden. Die Analyse der Funktionalität und Langlebigkeit von EM und CM T-Zellen im Hinblick auf ihre klinische Relevanz zeigte wesentliche Unterschiede zwischen beiden Gedächtniszell- Populationen. So war eine IFN-gamma Induktion und Proliferation in CM T-Zellen in stärkerem Ausmaß von einer zusätzlichen Costimulation abhängig verglichen zu EM T-Zellen. Außerdem fiel eine Apoptose-Induktion in CM stärker aus als in EM T-Zellen. Unterschiede in Funktion und Viabilität von CM und EM T-Zellen korrelierten dabei mit der Expression des Chemokinrezeptors CCR7. ELISpot-Analysen der Polarisierung induzierter TH-Antworten beim Mammakarzinom ergaben eine große Heterogenität zwischen den Patienten. So exhibierte ein Teil der Patienten dominante TH1-Antworten, während bei einem anderen Teil lediglich TH2- oder toleranzinduzierende IL-10-Antworten induziert werden konnten. Darüber hinaus traten auch gemischt-polarisierte TH-Antworten auf. Eine Analyse ausgewählter Zytokine resultierte in der Detektion immunsuppressiver und immunstimulatorischer Zytokine im Tumorgewebe, wobei die Zytokinprofile interindividuell stark schwankten und kein einheitliches Muster erkennen ließen. Interessanterweise bestand jedoch eine inverse Korrelation zwischen der Induktion einer TH1-Antwort im ELISpot und dem erhöhten Vorkommen immunsuppressiver Zytokine im autologen Tumorgewebe von Mammakarzinom-Patienten. Eine derartige Korrelation impliziert, dass das vorherrschende Milieu der Tumorumgebung bei einer tumorspezifischen Aktivierung einen Einfluss auf infiltrierende Dendritische Zellen und ihre nachfolgende Polarisierung von T-Zellantworten hat. Folglich könnte die Untersuchung eines breiten Spektrums an Zytokinen in der Tumor-Mikroumgebung zu relevanten Zeitpunkten einer Tumorentwicklung, einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von Tumor-Immun Interaktionen liefern.
Ligands of Iron-Sulphur Cluster N2: In this work the ubiquinone reducing catalytic core of NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from Y. lipolytica was studied by a series of point mutations replacing conserved histidines or arginines in the 49-kDa subunit. Although the missing 4th ligand of cluster N2 could not be found in the 49-kDa subunit of complex I, it was clearly demonstrated that iron-sulphur cluster N2 resides directly on the interface between the PSST and 49-kDa subunits. The results presented in this work show that residues in the 49-kDa subunit have strong influence on this redox centre and also on catalytic activity. The strong influence of Arg-141 and His-226 residues in 49-kDa subunit on this cluster can be deducted from complete loss of N2 signals in EPR spectra such as in case of mutants H226A and R141A. In the case of mutant H226M the EPR signal from cluster N2 was shifted and cluster N2 even lost the pH dependence of its redox midpoint potential and became more similar to the other so called 'isopotential' clusters. Specifically in the case of mutants R141M and R141K the characteristic signature of cluster N2 became undetectable in EPR spectra. However, specific dNADH:DBQ oxidoreductase activity that could be inhibited with the specific complex I inhibitors DQA and rotenone was not absolutely abolished but rather reduced. These reductions in complex I activity did not correspond to similar reductions in the specific EPR signal of cluster N2 as it was observed in the His-226 mutant series. No indications could be found that these mutations had modified the magnetic properties of cluster N2, resulting in different EPR spectra. From these observations it could be concluded that both mutants R141K and R141M virtually or entirely lack iron-sulphur cluster N2. The rates in complex I activity could be reconciled with electron transfer theory: After removal of a single redox centre in a chain, electron transfer rates are predicted to be still much faster than steady-state turnover of complex I. These results from mutants R141K, R141M and also the result from mutant H226M that protons are being pumped even if the redox midpoint potential of cluster N2 is not pH dependent questions the prominent role in the catalytic mechanism of complex I that has been ascribed to cluster N2. Histidine 91 and 95 were found to be absolutely essential for activity of complex I since in both mutants complex I was fully assembled and artificial NADH:HAR activity was parental whereas complex I specific dNADH:DBQ activity was abolished. The signal from cluster N2 in EPR spectra was parental for all His-91 and -95 mutants. Mutations at the C-terminal arginine 466 affected ubiquinone affinity and inhibitor sensitivity but also destabilised complex I. All these results provide further support for a high degree of structural conservation between the 49-kDa subunit of complex I and the large subunit of water soluble [NiFe] hydrogenases. Remodelling of Human Pathogenic 49-kDa Mutations in Y. lipolytica: Y. lipolytica has been proven a good system for studying complex I properties and thus also for studying defects that occur in humans. In this work pathogenic mutations in the 49-kDa subunit of complex I were recreated and studied. The P232Q mutant showed non-assembly of complex I and this is probably the cause why this mutation was lethal in patients. The mutants R231Q and S416P were parental for the content, artificial and also specific complex I activity, Km for DBQ and IC50 for DQA. From these results we can conclude that these two residues Arg-228 and Ser-413 in mammalian cells have specific structural importance for the 49-kDa subunit even if they are not directly involved in catalytic process.
Das Ziel dieser Arbeit war die Evaluierung der Einsatzmöglichkeiten eines mikrostrukturierten Reaktorsystems in der heterogenen Katalyse. Hierzu wurde eine Reaktion herangezogen, welche typische Problemstellungen der heterogenen Katalyse abbildet. Zu diesen Problemen gehören Temperaturkontrolle, sichere Handhabung von explosiven Gasgemischen und das Erzielen von zufriedenstellenden Selektivitäten. Die Reaktion sollte außerdem bereits gut untersucht worden und die Prozessparameter aus der Literatur bekannt sein. Aus diesem Grund wurde die Partialoxidation von Ethen zu Ethenoxid an Silberkatalysatoren gewählt. Es konnte gezeigt werden, dass die Reaktion in einem Mikrostrukturreaktorsystem sicher durchführbar ist. Vor allem wurde an einer ganzen Reihe von Beispielen veranschaulicht, dass eine herausragende Eigenschaft des Mikrostrukturreaktors seine inhärente Explosionssicherheit ist. Gasgemische, welche sich mitten im explosiven Gemischbereich befanden, konnten bei Drücken von 2 bis 20 bar und Temperaturen von 230 bis 310 °C sicher gehandhabt werden. So konnte gezeigt werden, dass der Mikrostrukturreaktor sich dazu eignet Reaktionen mit explosiven Gasgemischen durchzuführen. Die Verwendung von Mikrostrukturreaktoren in der heterogenen Katalyse befindet sich noch im Anfangsstadium. Um Probleme bei der Übertragung von Katalysatorsystemen auf ein System mit Mikrostruktur zu vermeiden, erfolgte zunächst der Einsatz von Vollsilberkatalysatoren. Die Mikrostruktur wurde deshalb aus dem katalytisch aktiven Material selbst hergestellt. Die Herstellung wurde auf drei unterschiedliche Weisen (LIGA-, Ätz- und Sägeverfahren) durchgeführt. So konnte gezeigt werden, dass eine Kostenreduzierung bei der Darstellung von Mikrostrukturen möglich ist. Der Nachteil der Nutzung von Vollsilber war, dass sich deutlich schlechtere Selektivitäten bei der Partialoxidation von Ethen ergaben. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass mit dem Mikrostrukturreaktor die Selektivitäten für Vollsilber im Schnitt 10 % über denen für Rohrreaktorexperimenten bei gleichen Umsätzen lagen. Die effektive Wärmeabführung und die homogene Verteilung der Wärme über den Mikrostrukturreaktor scheinen eine Verbesserung der Selektivität zu erbringen. Kinetische Untersuchungen zeigten, dass sowohl durch Anheben des Partialdrucks von Ethen als auch von Sauerstoff eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit erzielt werden kann. Dabei wurde für Ethen eine formale Reaktionsordnung bei der Bildung von Ethenoxid von 0,53 gefunden, während sie für Sauerstoff 0,78 betrug. Mit diesen Untersuchungen wurde verdeutlicht, dass ein Erhöhen des Sauerstoffpartialdrucks einen positiven Einfluss auf die Selektivität hat. So konnte durch Anheben der Sauerstoffkonzentration von 5 %, wie es in industriellen Prozessen aus Sicherheitsgründen notwendig ist, auf bis zu 95 % eine Verbesserung der Selektivität von bis zu 15 % erzielt werden. Über diesen Sachverhalt wurde zwar bereits in der Literatur (16) berichtet, jedoch erfolgten die Untersuchungen hierfür unter Hochvakuumbedingungen. Der Mikrostrukturreaktor ermöglichte einen Nachweis dieses Phänomens auch unter Hochdruckbedingungen, wie sie für industrielle Reaktoren üblich sind. Damit konnte ein in der heterogenen Katalyse bekanntes Problem, nämlich die Übertragung von Erkenntnissen aus Ultrahochvakuumexperimenten auf Hochdruckbedingungen (pressure-gap), untersucht werden. Eine wissenschaftliche Prüfung, ob dem Ergebnis die gleichen Ursachen sowohl im Ultrahochvakuum als auch bei Hochdruckbedingungen zugrunde liegen, muss noch erfolgen. Es zeigte sich aber auch, dass durch eine Verweilzeiterhöhung keine weitere Verbesserung der Raum-Zeit-Ausbeute möglich ist. Vielmehr wurde klar, dass Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität mit längeren Verweilzeiten abnehmen. Als Grund hierfür konnte die Bildung von elementarem Kohlenstoff an der Silberoberfläche festgestellt werden. Aufgrund der Limitierung bei der Verweilzeit wurden maximale Umsätze von 24 % erzielt. Der Einsatz von 1,2-Dichlorethan als Oxidationsinhibitor für Vollsilber wurde ebenfalls untersucht. Dabei konnte die Selektivität auf bis zu 69 % gesteigert werden. Es erfolgte jedoch eine Einbuße an Aktivität von etwa 42 %. Es ist bekannt, dass die Oberflächenmorphologie von Silberkatalysatoren unter Reaktionsbedingungen starke Veränderungen erfährt. (68) Es wurde aufgezeigt, dass dies für die Oberfläche von mikrostrukturierten Silberfolien ebenfalls festzustellen ist. Dabei wurde gleichzeitig festgestellt, dass die Katalysatoren trotz unterschiedlicher Herstellungsmethoden und den daraus resultierenden unterschiedlichen Oberflächenmorphologien vergleichbare Aktivitäten aufweisen. Industriell verwendete Katalysatoren basieren auf alpha-Aluminiumoxid als Trägermaterial. Dabei wurde bereits seit vielen Jahren an Optimierungen des Katalysators gearbeitet. Durch das Einstellen der spezifischen Oberfläche und Partikelgröße des Silbers und den Einsatz von Alkali- und Erdalkalimetallen als Promotoren werden so Katalysatoren hergestellt, welche eine Selektivität von 80 % besitzen. Die Übertragung dieser Erkenntnisse auf ein Mikrostrukturreaktorsystem kann nicht ohne weiteres vorgenommen werden. Es wurden verschiedene Darstellungsmöglichkeiten für eine alpha-Aluminiumoxidschicht in einem Mikrostrukturreaktor untersucht. Dabei zeigte sich, dass nur die direkte Darstellung von alpha- Aluminiumoxid ohne Phasenumwandlung aus anderen Modifikationen erfolgversprechend ist. Eine Darstellung der Aluminiumoxidschicht durch Sol-Gel- oder CVD-Prozesse war nicht erfolgreich, da die für die Phasenumwandlung von gamma-Aluminiumoxid nach alpha-Aluminiumoxid notwendige Temperatur von 1100 °C die Ausbildung einer Eisenoxidschicht an der Oberfläche der mikrostrukturierten Edelstahlfolien zur Folge hatte. Diese eignete sich nicht als Träger. Alternativ wurde erfolgreich der Einsatz von aluminiumhaltigen Edelstählen untersucht. Diese bilden beim Ausheizen bei 1100 °C eine alpha-Aluminiumoxidschicht an der Oberfläche aus, welche mittels Sputtern mit Silber geträgert wurde. Katalytische Untersuchungen zeigten, dass mit dem Einsatz von alpha-Aluminiumoxidträgern eine Verbesserung der Selektivität im Vergleich zu Vollsilber von 17 % erreicht werden kann. Gleichzeitig konnte anhand eines Gegenüberstellens von katalytischen Daten mit TEM-Aufnahmen der Sputterschichten festgestellt werden, dass eine geschlossene Silberschicht an der Oberfläche notwendig ist, um eine zufriedenstellende Aktivität und Selektivität zu erzielen. Während bei Schichtdicken von 1 nm noch einzelne Silberinseln an der Oberfläche zu finden sind, liegt bei einer Schichtdicke von 5 nm eine fast geschlossene Silberschicht vor. Ein Anheben der Schichtdicke ergab keine weitere Verbesserung der Aktivität oder Selektivität. Dagegen ergab der Einsatz von 1,2-Dichlorethan eine weitere Steigerung der Selektivität auf 77 %. Industriell eingesetzte Rohrbündelreaktoren erreichen im Sauerstoffverfahren eine Selektivität von 80 %. Die hier erzielten 77 % Selektivität bei vergleichbaren Umsätzen zeigt, dass der Einsatz eines Mikrostrukturreaktors für die Synthese von Ethenoxid möglich ist, vor allem unter dem Gesichtspunkt, dass Potenzial für die Optimierung von Reaktoren und die Katalysatorpräparation besteht. Die Nutzung von Reaktionsbedingungen, wie Ethen in reinem Sauerstoff, und der daraus resultierenden Verbesserung für Aktivität und Selektivität, ermöglichen Raum-Zeit-Ausbeuten, die über denen von Industriereaktoren liegen. Ob Mikrostrukturreaktoren in industriellen Prozessen jemals eingesetzt werden, hängt allein von ökonomischen Faktoren ab. Dazu müsste die Selektivität über die bestehenden 80 % angehoben werden. Zur Zeit entfallen 80 % der Produktionskosten von Ethenoxid auf den Rohstoff Ethen, so dass jeder Prozentpunkt, um den die Selektivität angehoben werden könnte, eine deutliche Kosteneinsparung mit sich brächte und darüber entschiede, ob ein neuer Prozess eingeführt wird. Hierzu wäre es auch notwendig, die Kosten für die Produktion der Mikrostrukturreaktoren pro Volumeneinheit um mehrere Größenordnungen zu reduzieren. Außerdem müssten Lösungen entwickelt werden, welche die Peripherie des Reaktors betreffen, vor allem die Heizung und die Gasversorgung. Im Rahmen dieser Arbeit sollte überprüft werden, welche Leistungsfähigkeit ein Mikrostrukturreaktorprozess im Vergleich zu einem bestehenden Prozess besitzt. Es konnte dargestellt werden, dass Raum-Zeit-Ausbeuten über denen eines Industriereaktors erzielt werden können bei vergleichbareren Selektivitäten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Mikrostrukturreaktor ein geeignetes Werkzeug ist, welches helfen kann, Reaktionen unter bisher nicht einfach zugänglichen Bedingungen durchzuführen.
Die Übergangsmetalle Vanadium und Niob wurden in einer neuartigen Thermowaage bzw. mit dem Rapid Thermal Processing (RTP) unter Verwendung von Ammoniak und Stickstoff als Prozessgas nitridiert. In der Thermowaage, die die in situ Aufzeichnung von Massenänderungen während der Reaktion möglich macht, wurde die Nitridierung hauptsächlich an pulverförmigen Proben durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass sowohl Temperatur- und Druckerhöhung, als auch eine Verlängerung der Temperzeit zu größeren Massenzunahmen führten. Die Bildung der unterschiedlichen Nitridphasen war aber allein von der Temperatur während des Versuches und dem verwendeten Prozessgas abhängig. Die detektierten Massenzunahmen bei der Erhöhung von Temperzeit und Druck wurden nur von der vermehrten Einlagerung von Stickstoff bzw. Sauerstoff in das Metall verursacht, die keine neue Phasenbildung zur Folge hatte. Sauerstoff wurde in allen getemperten Proben gefunden, was die Untersuchung von dünnen Schichten in der Thermowaage verhinderte, da aufgrund des erhöhten Sauerstoffgehaltes die Schichten vollständig oxidierten. Der Sauerstoff wurde hauptsächlich von dem Glasreaktor geliefert. Ein dort abgelagerter Belag, der sich durch Korrosion der Edelstahlgasleitung gebildet hatte, wirkte vermutlich katalytisch. Aus diesem Grund war die Thermowaage in dieser Konfiguration nicht für Nitridierungsversuche geeignet und konnte ihren eigentlichen Zweck, die genaue Untersuchung des Reaktionsmechanismus mit Hilfe der Massenänderung und der anschließenden massenspektrometrischen Untersuchung des Prozessgases nach der Reaktion, nicht erfüllen. 200 nm und 500 nm Vanadium- und Niob-Schichten wurden im RTP nitridiert. Auch hier konnte man eine Bildung von Oxiden bzw. Oxynitriden beobachten, diese bildeten sich aber durch die Ausdiffusion von Sauerstoff aus dem Substrat in die Metallschicht, was anhand von SNMS- und TEM/EFTEM/EELS-Untersuchungen eindeutig belegt werden konnte. Um dieses Phänomen zu untersuchen wurden Schichten auch auf Saphir-Substrat, welches gegenüber der Ausdiffusion von Sauerstoff inert sein sollte, aufgebracht. Für die beiden verwendeten Metalle wurden unterschiedliche Ergebnisse gefunden. Während bei den Vanadium-Schichten nur aus dem SiO2-Substrat Sauerstoff ausdiffundierte, wurde dies bei den Niob-Schichten bei beiden Substraten festgestellt. Die Temperatur während der Versuche (V: 600 und 700°C; Nb: 800°C) scheint also auch einen Einfluss auf die Ausdiffusion von Sauerstoff zu haben. Dabei zeigt Saphir eine etwas größere Temperatur-Stabilität als SiO2. Ein Einfluss des Prozessgases auf die Reaktion an der Grenzfläche Metall/Substrat konnte nicht nachgewiesen werden. Zwar kam es bei der Verwendung von Wasserstoff zur Bildung von mehr und sauerstoffreicheren Phasen, was dafür spricht, dass die Substrate stärker angegriffen werden, aber auch beim Einsatz von Inert-Gas (N2) wurde eine Ausdiffusion von Sauerstoff aus den Substraten beobachtet. Allerdings wirkte sich die Schichtdicke der Probe auf die Ausdiffusion von Sauerstoff und die Bildung der Oxid-Phase aus. Da von der Oberfläche der Schicht eindiffundierender Stickstoff die Diffusion von Sauerstoff behindert, kann Sauerstoff mit zunehmender Schichtdicke weiter in das Metall vordringen. Bei dünneren Schichten wird er eher aufgestaut und es bilden sich Oxide mit höherem Sauerstoffgehalt. Ein Einfluss der unterschiedlichen Herstellungsverfahren (Elektronenstrahlverdampfung / Magnetronsputtern) für die Ausgangsschichten auf die Ausdiffusion von Sauerstoff aus dem Substrat konnte, trotz der größeren Kristallinität der gesputterten Proben, nicht nachgewiesen werden.
Für bestimmte Gentherapiestrategien bieten sich retrovirale Vektoren auf Grund der stabilen Integration der von ihnen übertragenen genetische Information an. Mit bisher vorhandenen retro- und lentiviralen Vektorsystemen kann jedoch kein effizienter Gentransfer in ruhende primäre Zellen wie unstimulierte PBMC oder undifferenzierte Monozyten erreicht werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, retrovirale Vektorsysteme zu etablieren, die naive primäre Zellen effizient transduzieren können. Zunächst wurden HIV-1-Vektoren mit den Hüllproteinen (Env) des amphotropen MLV, des MLV-Klons 10A1, des felinen endogenen Retrovirus RD114 und des VSV sowie einem modifizierten GaLV-Env pseudotypisiert, um ihre Eignung für die Transduktion von primären T-Lymphozyten zu untersuchen. Mit diesen Vektoren konnten primäre stimulierte humane T-Lymphozyten mit ähnlichen Transduktionsraten von ca. 20% transduziert werden. Im Gegensatz dazu wurden mit MLV-Vektoren, die mit den gleichen Hüllproteinen pseudotypisiert waren, bei gleichem Transduktionsprotokoll untereinander deutlich unterschiedliche Transduktionsraten zwischen 1 - 45% erreicht. Dieser unerwartete Unterschied ist möglicherweise auf eine längere, dabei untereinander ähnliche Halbwertszeit der HIV- 1-abgeleiteten Vektoren zurückzuführen. Unstimulierte PBMC konnten allerdings unabhängig vom verwendeten Hüllprotein weder von den MLV- noch von den HIV-1-abgeleiteten Vektoren transduziert werden. Demgegenüber hatte sich in meiner vorangegangenen Diplomarbeit die Transduzierbarkeit ruhender humaner Zellen durch Vektoren angedeutet, die von dem akut pathogenen simianen Immundefizienzvirus SIVsmmPBj1.9 abgeleitet waren. In der hier vorgestellten Arbeit zeigten die PBj-Vektoren, die nur im env-Gen eine Deletion aufwiesen, dass sie auch in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte GHOST-Indikatorzellen oder diploide Fibroblasten effizient und unabhängig von dem zur Pseudotypisierung verwendeten Hüllprotein transduzieren können. Die korrespondierenden HIV-1-Vektoren waren dazu nicht in der Lage. Auch PBj- und HIV-1-Vektoren, die egfp als Markergen transferieren, zeigten das gleiche Transduktionsverhalten. Die egfp-transferierenden SIVsmmPBj-Vektoren konnten schließlich im Unterschied zu den entsprechenden HIV-1-Vektoren auch frisch isolierte primäre humane Monozyten sehr effizient transduzieren. Mit Nef-deletierten Mutanten wurde schließlich gezeigt, dass die beschriebenen Fähigkeiten PBj-abgeleiteter Vektoren nicht vom viralen Nef-Protein abhängen, obwohl dieses regulatorische Gen die pathogenen Eigenschaften und die Replikationsfähigkeit von SIVsmmPBj-Viren bestimmt. Für alle mit SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektoren transduzierten Zellen konnte in der vorliegenden Arbeit ferner die chromosomale Integration des Transfervektors gezeigt werden. Schließlich gelang die Konstruktion eines ersten 3-Plasmid-Vektorsystems, mit dem transduktionsfähige Vektorpartikel generiert werden können. Mit SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektoren steht somit ein neues retrovirales Vektorsystem zur Verfügung, mit dem auch ruhende primäre Zellen stabil genetisch modifiziert werden können. Durch die Erschließung dieser wichtigen Zielzellen werden die Perspektiven einer dauerhaften Gentherapie in vitro und in vivo beträchtlich erweitert.
An den Folgen der HIV-Infektion sind bisher mehr als 15 Millionen Menschen gestorben und die Zahl der Neuinfektionen wächst ständig. Nach Einführung der hochaktiven antiretroviralen Kombinationstherapie (HAART) 1995 konnte die HIV-Replikation im Patienten unterdrückt und der Verlauf der Krankheit verzögert werden. Aber die Bildung resistenter HIV-Stämme während der Therapie und die hohe Toxizität der Medikamente limitieren diese Erfolge. Einen neuen Therapieansatz bietet die genetische Modifikation von T-Lymphozyten zur "intrazellulären Immunisierung" der Zielzellen von HIV. Dabei werden die Zellen mit einem retroviralen Vektor transduziert und exprimieren ein antivirales Gen, das sie vor der HIV-Infektion schützt. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Laer wurde der retrovirale Vektor M87- Ineo entwickelt, der die Expression des membranverankerten Fusionsinhibitors C36/T20 auf der Zelloberfläche ermöglicht. Durch das Peptid sind die Zielzellen effizient vor der Infektion mit HIV geschützt (Hildinger et al., 2001). Das therapeutische Gen von M87-Ineo besteht aus dem Signalpeptid von LNGFR für die Translokation in das ER, dem inhibitorischen Peptid C36/T20, das von HIV-1 gp41 abgleitet ist, einem flexiblen Linker sowie aus der Transmembrandomäne von LNGFR für die Verankerung in der Plasmamembran. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser retrovirale Vektor erfolgreich für die klinische Applikation zur Gentherapie der HIV-Infektion optimiert. Ziel war es, die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu minimieren, die Expression zu erhöhen sowie der Resistenzbildung entgegenzuwirken. Der Linker im Basiskonstrukt M87-Ineo ist abgeleitet aus dem Gelenk des murinen Antikörpers von IgG2 und verleiht dem Hemmpeptid Flexibilität. Um die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu reduzieren, wurde der Linker des murinen Antikörpers IgG2 durch Gelenke ("Hinge") von humanen Antikörpern der IgG-Klasse ersetzt. Das Konstrukt mit der humanen "Hinge" von IgG2 exprimierte genauso hoch wie das Basiskonstrukt und hemmte mindestens so effizient die HIV-Replikation. Durch die N-terminale Verlängerung des C-Peptids um 10 Aminosäuren konnte das Risiko der Resistenzbildung minimiert werden. Das verlängerte C-Peptid war in der Lage, HIV-Hüllproteine zu hemmen, die gegen das C36/T20-Peptid resistent sind. Das optimierte Peptid von M87o bestand somit aus dem Membrananker von trunkiertem CD34, dem Linker von humanem IgG2 sowie aus dem verlängerten C-Peptid (C46). Weiterhin wurde ohne Verlust der Expression oder Hemmwirkung des membranverankerten C-Peptids ein RNAElement (RRE decoy) erfolgreich als weiteres Hemmprinzip in den Vektor eingefügt, um die Bildung resistenter HIV-Stämme zu unterbinden. Durch Einsatz eines optimierten Leaderelementes im retroviralen Vektor konnte die Expression des inhibitorischen Peptides mehr als verzehnfacht werden. Damit konnte das Peptid und dessen Hemmung erstmals auch in primären Zellen nachgewiesen werden. Der Vergleich zwischen dem Basiskonstrukt M87-Ineo und dem optimierten Konstrukt M87o-RRE-Ineo zeigte, dass die erhöhte Expression auch mit einer wesentlich verbesserten Hemmwirkung einherging. In Zell-Zellfusionsassays wurde außerdem nachgewiesen, dass die Wirkung des C-Peptids auf der Hemmung des Viruseintritts von HIV in die Zelle beruht. Für die klinische Applikation wurde der Vektor M87o-RRE konstruiert, der die optimalen Vektorelemente und Peptidmodule enthielt, aber aus dem das Neomycin-Resistenzgen entfernt wurde. Dies führte zu einer nochmals höheren Expression des C-Peptids sowie zur weiteren Verminderung der Immunogenität des retroviralen Vektors. Das Markergen wurde ohnehin nicht mehr benötigt, da die genetisch modifizierten Zellen aufgrund der hohen Transgenexpression einfach detektiert werden konnten. Der optimierte Vektor M87o-RRE hemmte die HIV-Replikation so effizient, dass bisher keine resistenten Stämme isoliert werden konnten. Bei Toxizitätsstudien in Maus und Rhesusmacaquen konnten keine Nebenwirkungen oder Immunogenität beobachtet werden. Durch die erfolgreiche Optimierung steht nun für die klinische Studie der Phase I der bestmögliche retrovirale Vektor zur Verfügung.