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Screening und Charakterisierung von Peptidliganden für den BCR-ABL mRNA Translokationsbereich
(2005)
Die reziproke Translokation t(9;22) ist in 95% der chronischen myeloischen Leukämie vorhanden. Bei der Translokation entsteht ein Fusionsprotein BCR-ABL, welches ausreichend für die Entstehung von Leukämien ist. 30% aller akuten lymphatischen Leukämien sind ebenfalls positiv für diese Translokation. Durch die Translokation entsteht am Translokationsbruchpunkt eine einzigartige RNA-Sequenz, welche als Ziel für eine RNA-Liganden Suche dienen kann. Ziel dieser Arbeit war es, Peptidliganden zu finden, welche die BCR-ABL mRNA binden können. Zunächst wurde die bcr-abl mRNA nach Sekundärstruktur-Elementen durchsucht, welche als Interaktionspartner mit Peptiden in Fragen kommen. Hierzu wurde die BCR-ABL mRNA durch das MFold-Programm von Zuker analysiert. Durch die Auswertung der errechneten Diagramme für die thermodynamische Stabilität und die kinetische Prävelanz der Basenpaarinteraktion, wurden zehn verschiedene BCR-ABL mRNA-Bereiche ausgewählt, welche die Möglichkeit besitzen, sich in stabile Sekundärstruktur-Elemente zu falten. Um diese strukturellen Gegebenheiten am BCR-ABL Translokationsbruchpunkt b2a2 im Experiment zu überprüfen, wurden in Kooperation mit Prof. Göbel und Dr. Scheffer RNase-Mapping und Mapping mit einer künstlichen Nuklease durchgeführt. Es konnte im Experiment das Vorhandensein einer Sekundärstruktur nachgewiesen werden. Diese Struktur wird aus einem Stamm mit einer Fehlpaarung, einem asymmetrischen internen Loop, einem weiteren Stamm und durch einen Loop definiert. Gegen diese b2a2-Struktur und gegen neun weitere mRNA-Bereiche wurde eine Phage-Display-Selektion durchgeführt, welche zum Ziel hat, Peptide zu gewinnen, welche die entsprechende RNA-Struktur spezifisch binden können. Nach der Sequenzierung der Phagen, konnten insgesamt 14 verschiedene Peptid-Sequenzen für die zehn unterschiedlichen RNA-Bereiche gefunden werden, welche die Möglichkeit besitzen, mit der jeweiligen Ziel-RNA zu interagieren. Die Phagen-RNA Interaktion wurde durch Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie ermittelt. Bei dieser Meßmethode werden Diffusionszeiten von markierten Molekülen in Lösung bestimmt. Zwei von den 14 Phagen-Präsentierten-Peptiden zeigen eine Interaktion mit der Ziel RNA. Die gefundenen Peptide besitzen die folgenden AS-Sequenz: das Peptid 12, KHLHLHK und das Peptid 14, NPEKVKMLYVEF. Die Interaktion mit der RNA wurde in nicht kompetitiven und in kompetitiven FCS Experimenten gezeigt. Kompetiert wurde die Phagen-RNA Interaktion mit kompetitor RNA und in einem weiteren Experiment mit den synthetisierten Peptiden. Beide Peptide zeigten im FCS eine Interaktion mit dem b2a2 BCR-ABL Translokationsbruchpunkt. Die kD-Werte der Peptid-RNA Interaktion wurde durch CDTitration ermittelt. Peptid 12 bindet die b2a2-RNA mit einem kD-Wert von 42 μM und Peptid 14 bindet diese RNA mit einem kD-Wert von 52 μM. Durch die CD-Titration wurde auch der Interaktionsort der beiden Peptide mit der b2a2-RNA ermittelt. Ausgehend von unserem b2a2-Strukturmodell, wurden RNA-Mutanten generiert und in Gegenwart von den Peptiden CD-Spektrometrisch untersucht. Die Interaktion von Peptid 12 mit der RNA findet am Loop und am oberen Stamm statt. Das längere Peptid 14 benötigt alle b2a2-RNA Strukturmerkmale, außer dem unteren Stamm, zur Interaktion. Der Einfluß der Peptide auf die Translation wurde durch ein In-vitro-Translationssystem ermittelt. Demnach bindet Peptid 14 an die b2a2-RNA-Struktur und verringert auf diese Weise die Translation. Peptid 12 bindet zwar ebenfalls an die b2a2-RNA, jedoch konnte eine Verringerung der Translation bei diesem Peptid nicht beobachtet werden.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde eine wirksame synthetische und spektroskopische Methode entwickelt, um Abstände in DNA- und RNA-Duplexen mittels Elektronen-Paramagnetische-Resonanz (EPR) zu messen und um in Zukunft die dreidimensionale Struktur biologisch relevanter RNAs bestimmen zu können. Die Synthese von iodierten Nukleotid-Bausteinen für die Oligonukleotidsynthese, an denen mit Hilfe der Palladium katalysierten Sonogashira-Kreuzkupplung sich EPR-aktive Nitroxid-Acetylene einführen lassen, wurde erfolgreich durchgeführt. Diese Phosphoramidite sollten die folgenden Kriterien erfüllen: Alle vier Basen (A, C, G und U) sollten modifiziert werden und das eingeführte Spinlabel 2,2,5,5- Tetramethyl-3-ethinyl-pyrrolin-N-oxyl (TPA) sollte entweder in die minor oder die major groove hineinragen. Im Falle der Pyrimidine (U und C) war nur die Orientierung in die major groove möglich, da das Iodid nur am C5 eingeführt werden kann. Obwohl 5-Iodo-desoxyuridin- und 5-Iodo-uridin-phosphoramidit käuflich sind, wurden diese Bausteine selber hergestellt, wobei die iodierten Bausteine mit hohen Ausbeuten erhalten wurden. Die Synthese von 5-Iodo-cytidin erfolgte aus Cytidin, insbesondere durch die Iodierung mit Iod, Iodsäure in Essigsäure und Tetrachlorkohlenstoff. Die einzige Möglichkeit, dass das Nitroxid eine Orientierung innerhalb der minor groove annimmt, war die Derivatisierung am C2 der Purine. Der Austausch von Iodo gegen eine Aminofunktion für Guanosin war wegen des Verschwindens einer potentiellen Wasserstoffbrücke ungünstig, im Gegensatz zu Adenosin. Die Synthese von 2-Iodo-adenosin-phosphoramidit wurde durchgeführt, wobei die Amino-Gruppe am C2 eines modifizierten Guanosins durch Iod mittels einer radikalischen Reaktion mit Iod, Iodmethan und Kupferiodid substituiert wurde. Die Synthese von 7-Deaza-adenosin (7-Iodo-tubercidin) und von 7-Deaza-guanosin wurde durch eine Lewissäure katalysierte Vorbrüggen-Glykosylierung zwischen der geschützen Nukleobase und der acetylierten Ribofuranose erzielt. Die Iodierung erfolgte für das geschützte Tubercidin mit N-Iodsuccinimid, während sie für Guanosin trotz zahlreicher Versuche leider scheiterte. Da natürlich vorkommende DNA und RNA nicht paramagnetisch sind, müssen sie durch die Einführung eines Spinlabels EPR-fähig gemacht werden. Dafür wurde das Spinlabel TPA ausgewählt, da es sich mit einer hohen Stabilität und Starrheit auszeichnet. Dafür wurde zuerst die Palladium(II) katalysierte Sonogashira-Kupplung in DNA-Strängen wärend der Oligonukleotidsynthese für 5-Iodo-desoxy-uridin optimiert: Sehr reine Proben mit einem oder zwei Spinlabels in einem Strang konnten hergestellt werden. Diese Methode wurde anschließend erfolgreich auf RNA mit geringfügigen Änderungen für U, C und A übertragen, um die Ausbeute der Kupplung zu verbessern. Die benutzte Chemie hat sich als entscheidend erwiesen, da es zu berücksichtigen gilt, wie sich die Reagenzien, die bei der RNA-Festphasensynthese eingesetzt werden, auf das Spinlabel auswirken. Es wurde festgestellt, dass die Oxidationsstufe des klassischen TBDMS-Festphasenzyklus mit Iod, Pyridin und Wasser für die Reduktion eines beträchtlichen Teils des Nitroxids verantwortlich ist, insbesondere im Falle von 2-Iodo-adenosin. Deshalb wurde beschlossen, die patentierte ACE-Chemie zu verwenden, in der das Phosphor-Atom während des Festphasenzyklus mit tert-Butylperoxid in Toluol oxidiert wird. Die Synthese der geeigneten Bausteine wurde hierfür durchgeführt, 5-Iodo-uridin-phosphoramidit ist bei Dharmacon kommerziell erhältlich. Leider scheiterte die Synthese von 7-Iodo-tubercidin-phosphoramidit auf der Stufe der Einführung des Orthoesters. Auf diese Weise wurden sehr reine doppelgelabelte DNA und RNA Duplexe erhalten, deren Stabilität durch UV-Spektroskopie überprüft wurde. Der Unterschied in den Tm-Werten überstieg nicht 3,2°C für DNA und 5,1°C für RNA im Vergleich zu den unmodifizierten Duplexen. CD-Spektren wurden ebenso aufgenommen und zeigten, dass die B- bzw. A-Form erhalten blieb. In Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Prisner wurden die Abstände zwischen den zwei Nitroxiden in den synthetisierten fünf DNA- und sechs RNA-Duplexen mit Puls-Elektron-Doppel-Resonanz (PELDOR) gemessen. Diese experimentellen Werte wurden mit den theoretischen Werten verglichen, die mit Molecular Dynamics Simulationen erhalten wurden (Arbeitskreis Stock). Die mit beiden Methoden erhaltenen Ergebnisse stimmen überein. Erfolgreich wurde auch die Synthese von reinen spingelabelten biologisch relevanten RNAs wie TAR-RNA, der vier-Wege Kreuzung IIIa,b,c des Hepatitis C Virus und dem U4-U6 Komplex des Spleißosoms im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt. Die größte synthetisierte RNA betrug 65 Nukleobasen. Leider konnten wegen zu hoher Flexibilität oder nicht richtiger Faltung der RNA keine definierten Abstände gefunden werden.
Summary and Outlook The aim of this work was the investigation of the Mn2+ binding sites in hammerhead and the Diels-Alder ribozymes. This project consists of three main topics. In the first part quantification and structural characterization of Mn2+ binding sites in the m- and the tsHHRz using Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy are described. The second part summarizes the newest results obtained for the cleavage activity of both mand tsHHRzs in the presence of different Mg2+ and Mn2+ and Na+ ion concentrations using the new method with fluorescent-labeled RNAs. Here the influence of neomycin B on the structure of Mn2+ binding pockets and on the catalytic activity of both HHRzs is discussed. In addition, a possible role of Mn2+ ions is suggested from correlation of the EPR data with the kinetic results. The last chapter is devoted to quantification and differentiation of Mn2+ binding sites of the Diels-Alder ribozyme using continuous wave (cw) EPR experiments in solution. In this work EPR spectroscopy was used to study the binding of Mn2+ ions to the cis tsHHRz and to compare it with the binding to the trans mHHRz and to the Diels-Alder ribozyme. Cw EPR measurements showed that the tsHHRz possesses a single highaffinity Mn2+ binding site with a KD of < 10 nM at a NaCl concentration of 0.1 M. This dissociation constant is three orders of magnitude smaller than the KD determined for the single high-affinity Mn2+ site in the mHHRz (KD = 4.4 μM). The measurements of catalytic activity have been performed using fluorescent-labeled RNAs. Compared to the mHHRz, the cis tsHHRz cleaves up to 20-fold faster in the presence of Mg2+/Mn2+ ions with no saturation of the cleavage rates at high metal(II) ion concentrations. This is in good agreement with the last investigations on the trans tsHHRz (Nelson et al. 2005). Thus, the much stronger Mn2+ binding and higher cleavage activity were attributed to the interaction between the two external loops of the tsHHRz which reduces the RNA dynamics and traps the Mn2+ in the tightly folded conformation. Intriguingly, according to the EPR studies the binding constants for Mn2+ ions are several orders higher than the concentration of Mn2+ ions required for the catalytic activity (mHHRz: KD = 4.4 ± 0.5 μM and the Mn2+ concentration required to achieve half of the maximum cleavage rate [Mn2+]1/2 = 4.1 ± 0.6 mM respectively). Therefore, strongly bound Mn2+ ions seem to be needed for the folding of the HHRz, whereas weakly bound metal(II) ions are required to achieve full catalytic activity, and may be directly involved in catalysis. A comparison between the Electron Spin Echo Envelope Modulation (ESEEM) and Hyperfine Sublevel Correlation (HYSCORE) spectra of m- and tsHHRz demonstrates that both binding sites in HHRzs are structurally very similar. This suggests that the Mn2+ is located in both ribozymes between the bases A9 and G10.1 of the sheared G•A tandem basepair, as shown previously and in detail for the mHHRz (Vogt and DeRose 1998, Schiemann et al. 2003). However, the hyperfine spectra of the tsHHRz with 15N labeled G10.1 revealed no difference in comparison with the ones with 14N. This leads to an interpretation that the Mn2+ binding sites in both ribozymes are not identical. In addition, aminoglycoside antibiotic neomycin B inhibits the cleavage activity of both despite of the fact that it displaces the high-affinity Mn2+ ion only from the mHHRz. Hence, binding of neomycin B to the m- and the tsHHRzs probably occurs at different sites and neomycin B displaces only loosely bound Me2+ ions from the tsHHRs, whereas in the mHHRz both the high-affinity ion and the weakly bound ions are replaced. Therefore, it cannot be excluded that weakly bound Mg2+/Mn2+ ions, together with looploop interactions, induce a structural rearrangement which brings the high-affinity ion closer to the cleavage site. In the case of the Diels-Alder ribozyme it possesses five Mn2+ binding sites with KD = 0.6 ± 0.2 μM in solution under conditions where it is catalytically active. The competition experiment with Cd2+ allows to distinguish three different types of Mn2+ binding sites in the Diels-Alder ribozyme including inner-sphere monomeric Mn2+, monomeric Mn2+ bound through water-mediated contacts and electronically coupled dimeric Mn2+. Three Mn2+ ions are more strongly bound to the ribozyme via inner-sphere contacts, whereas two other Mn2+ ions form water-mediated outer-sphere contacts with the nucleotides of the ribozyme. The inner-sphere Mn2+ with the highest affinity and the fourth Mn2+ ions added to the ribozyme form a dimer with a Mn2+-Mn2+ distance of ~6 Å (as arises from simulations). Moreover, an addition of the product analog inhibitor (AMDA) to the [Diels-Alder ribozymes/ Mn2+] complex shows no conformational changes in the Mn2+ binding pockets. This is in good agreement with the recent studies which suggest that the Diels-Alder ribozyme is preorganized (Keiper et al. 2004). Some considerations on the evolution of the project (Outlook) There may be several venues of continuation of this project, which exploit on unique combination of EPR experiments and biochemical studies on RNA. This combination may allow us to significantly contribute to understanding of metal role in HHRz catalysis. Since the tsHHRz possesses the high affinity Mn2+ binding site (Kd < 10 nM) it creates a possibility to find conditions where the structural site is occupied by Mn2+, while catalytic sites are occupied by Mg2+ ions. If these conditions will be established by EPR titration, a set of standard biochemical experiments may be designed to look at the kinetic of cleavage and differentiate the “structural” and catalytic effects. The other experiment would be to look at the Mn2+ binding site in the tsHHRz in comparison with P1 and P1/P2 complexes and compare the results with the ones for the mHHRz. No matter the answer, P1 can be used as a simpler model to study the effect of tertiary structure on Mn2+ binding. A set of the tsHHRz mutants can be created to observe the mutations affect on Mn2+ binding sites, Mn2+ affinity and correlate the data with the kinetic analysis. FRET-based kinetic assay with fluorophore pairs on P1 and P2 can be designed for the kinetic experiments. Having this system one will be able to perform kinetic measurements 100-fold faster comparing to standard gel procedures (everything will be done in 96-wells). By manipulating the lengths and the sequence of P2 we most likely will be able to use FRET assay for the chemical step analysis (provided Kd > k2), and measure it using stop-flow system with time resolution of microseconds. And finally, one will be able to quantitatively measure the effect of neomycin B on the tsHHRz. Another interesting possibility would be to look at the state of metal(II) in the tsHHRz – enzyme alone (dissociated product) and in the enzyme-product complex and compare with the full-length tsHHRz. It will provide the information about the local rearrangements upon catalysis and the role of metal(II) ions. Furthermore, additional pulse-EPR experiments using 15N labeling have to be performed in order to reveal the location of the high-affinity Mn2+ binding site in the tsHHRz. Additionally, paramagnetic Mn2+ ions can be localized within the global fold of HHRzs using PELDOR and site-directed spin labeling. Further characterization of the high-affinity binding site in the tsHHRz can be performed using high-field ENDOR measurements in order to obtain the 14N and 31P tensors.
An den Folgen von AIDS sind bisher fast 20 Millionen Menschen gestorben. Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte erstmals die Viruslast bei gleichzeitiger Erhöhung der CD4-Lymphozytenzahl effizient erniedrigt werden. Dadurch konnte zwar eine Kontrolle der Virusreplikation und damit verbunden eine längere Überlebenszeit erreicht werden, jedoch ist eine vollständige Eradikation des Virus bisher nicht möglich. Hohe Behandlungskosten, Nebenwirkungen der antiviralen Substanzen, ihre unzureichende Wirkung in manchen Körperkompartimenten und die rasche Verbreitung resistenter Viren schränken die Effektivität von HAART ein. Alternative Therapieformen zielen in den letzten Jahren verstärkt auf die HIV-Eintrittshemmung durch Inhibition der Membranfusion von Virus und Wirtszelle („Fusionsinhibitoren“). Peptide, die sich aus der „heptad repeat“ Region 2, HR2, des gp41 ableiten (C-Peptide), sind äußerst wirksame antivirale Substanzen. 2003 wurde T-20, ein 36 Aminosäure langes C-Peptid, als erster Fusionsinhibitor zugelassen. Sein breiter Einsatz ist jedoch aufgrund rascher Resistenzbildung, mangelnder oraler Verfügbarkeit, einer äußerst kurzen Serumhalbwertszeit sowie daraus resultierender hoher Therapiekosten limitiert. Aufgrund dessen sollte in der vorliegenden Arbeit mit der Entwicklung von RNA-Aptameren als HIV-Fusionsinhibitoren ein neuer therapeutischer Ansatz etabliert werden. Zur Isolierung dieser RNA-Aptamere wurden zwei hoch komplexe RNA-Bibliotheken in manuellen sowie automatisierten Selektionen gegen verschiedene Zielstrukturen auf dem HIV-1 gp41 mit Hilfe der SELEX-Technologie selektiert. Der Wirkmechanismus der isolierten RNA-Aptamere sollte analog zu den gp41 HR-abgeleiteten Peptiden auf der Hemmung der Ausbildung des Sechs-Helix-Bündels als fusionaktive Struktur beruhen. So sollten die RNA-Aptamere die Ausbildung der zentralen N coiled-coil Struktur verhindern (Selektion gegen HR1-Peptide) oder die Anlagerung der HR-2 Domänen an die konservierten hydrophoben Furchen des zentralen N coiled-coils inhibieren (Selektion gegen HR2-Peptide). Die gewählten Zielstrukturen wurden entweder als freie synthetische Peptide oder membrangebunden auf der Oberfläche von humanen T-Zellen präsentiert. Um die Selektion von serumstabilen Aptameren zu gewährleisten, wurden die RNA-Aptamere unter Einsatz von 2’-F- oder 2’-NH2-modifizierten Pyrimidinen transkribiert. Nach initialen Selektionsrunden wurden die isolierten Aptamerfraktionen in einer „single-round infection“ unter Einsatz von HIV-Pseudotypvektoren auf spezifische Inhibition des Eintritts von HIV in die Zielzellen analysiert. Die isolierten RNA-Aptamere waren in der Lage, den HIV-Eintritt zu inhibieren, ihre Wirksamkeit war allerdings im Vergelich zu der naiven Bibliothek gering. Nach Durchführung von verschiedenen Reifungsstrategien, um die Affinität der vorselektieren RNA-Fraktionen zum jeweiligen Zielepitop zu erhöhen, konnte die inhibitorische Wirkung der gereiften RNA-Fraktionen auf das 10Fache im Vergleich zu der Urspungsbibliothek verbessert werden. Die wirksamste RNA-Fraktion, 435UU, wurde aus einer Selektion einer aminomodifizierten N30 RNA-Bibliothek gegen das membranverankerte Fusionsprotein M435, bestehend aus gp41 C46 und dem membranproximalen HIV-Linker, und anschließender Kompetiton mit dem 2F5 Antikörper gewonnen. Die 435UU RNA-Fraktion konnte den Eintritt von HIV mit einer IC50 ≈ 200 nM spezifisch hemmen. Weiterhin konnte die spezifische Fusionsinhibition der 435UU Aptamerfraktion in einem Zell-Zellfusionsassay unter Einsatz von HIV env exprimierenden Zellen und einer humanen T-Zelllinie demonstriert werden. Die Affinität der 435UU-Fraktion wurde in einem Gelmobilitätsversuch bestimmt. Die moderate HIV-Eintrittshemmung beruhte auf einer schwachen Bindung (Kd ≈ 750 nM) an das Zielepitop auf dem gp41. Die Analyse von Einzelaptameren aus der 435UU RNA-Population ergab keine signifikanten Unterschiede in ihrem HIV-Neutralisationspotential. Des Weiteren konnten nur wenig gemeinsame Primärstrukturmotive bestimmt werden. Der Gehalt an inkorporierten Pyrimidinen in den 435UU-Einzelaptameren war allerdings mit ca. 70% vergleichsweise hoch. Unter Einsatz von randomisierten RNA-Transkripte mit definiertem Pyrimidingehalt konnte festgestellt werden, dass tendenziell ein höherer Gehalt an NH2-Pyrimidinen die HIV-Neutralisation fördert. Allerdings konnte keine eindeutige Korrelation zwischen der Bindung an das C46-HIVLinker Fusionskonstrukt und dem Pyrimidingehalt der Transkripte ermittelt werden. Die Sekundärstukturvorhersage ergab keine strukturelle Verwandtschaft unter den 435UU-Einzelaptameren noch konnten klar definierte Sekundärstrukturmotive gefunden werden. Die Selektion der 435UU-Aptamerfraktion erfolgte deshalb nich allein aufgrund ihres hohen Pyrimidingehaltes. Ein direkter Vergleich der 435UU Aptamerfraktion mit dem bisher einzigen RNA-Eintrittsinhibitor, einem anti-gp120 RNA-Aptamer, ergab zwar eine geringfügig schwächere HIV-Inhibition, jedoch ein wesentlich breiteres Wirkspektrum der isolierten anti-gp41 RNA-Aptamere wahrscheinlich durch ihren hoch konservierten Wirkmechanismus. Schlussendlich könnte die Wahl der Präsentation der Zielstrukturen sowie der Selektionsdurchführung die Gewinnung von RNA-Aptameren mit moderater Affinität fördern und gleichzeitig zum Verlust von hoch affinen RNA-Strukturen führen. In nachfolgenden Selektionen sollte deshalb die Selektionsstringenz erhöht sowie gegen membrangebundene Zielstrukturen selektiert werden, die die tatsächliche native gp41 Konformation darstellen.
Ribozyme und siRNAs sind in der Lage, durch sequenzspezifische Spaltung der viralen RNA, die HIV-Replikation in vitro zu inhibieren. Es konnten bis jetzt allerdings nur wenige Antisense-basierte Therapeutika entwickelt werden, die eine ausreichend effiziente antivirale Wirkung in klinischen Studien zeigen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Untersuchungen zur Wirksamkeit von therapeutischen RNA-Effektor-Molekülen durchgeführt. Die Effizienz von exogen in Zellen transfizierter therapeutischer siRNAs wird von vielen Faktoren beeinflusst. Neben der Bindung der Effektor-RNA an ihre Ziel-RNA und der Stabilität der Effektor-RNA sind weitere wichtige Faktoren die Lokalisation innerhalb der Zelle sowie die Effizienz der Transfektion. Zur Beurteilung der Knockdown-Effizienz einer exogen zugeführten Effektor-RNA bedarf es somit einer Meßmethode, die diese unterschiedlichen Parameter berücksichtigt. Wesentlich ist dabei insbesondere die Transfektionseffizienz, in den meisten in vitro Studien finden jedoch Unterschiede in der Transfektionseffizienz wenig Beachtung. Da die Wirksamkeit der Effektor-RNA in einer Zelle nur dann hinreichend beurteilt werden kann, wenn bekannt ist wie viel RNA in die jeweilige Zelle transfiziert wurde, wurde ein Assay-System etabliert, mit welchem die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung der Effektor-Moleküle ermittelt werden kann. Mit Hilfe dieses Assay-Systems wurde in dieser Arbeit der Einfluss verschiedener Nukleotidanaloga auf die Wirksamkeit von siRNAOligonukleotiden untersucht. Bei dem einen Nukleotidanaloga handelt es sich um das 2,4,6-Trifluorbenzene, eine universelle Base, welche den RNA-Duplex partiell destabilisiert. Es konnte bereits gezeigt werden, dass für die Effektivität von siRNAs ein thermodynamisch destabilisiertes 5’-Ende des antisense-Stranges von Vorteil ist. Eine siRNA mit zwei 2,4,6-Trifluorbenzenen am 5’-Ende des sense-Stranges zeigte eine erhöhte Effektivität gegenüber den Kontrollen. Das zweite Nukleotidanaloga war das 4,6-Difluorbenzimidazol. Dabei handelt es sich ebenfalls um eine universelle Base, die nicht zwischen den einzelnen Basen diskriminiert. Die Verwendung dieser Base soll die Toleranz einer verwendeten siRNA gegenüber Punktmutationen erhöhen. Im Einsatz gegen HIV könnte diese Strategie die Bildung von Escape-Mutanten verhindern. Diese Base wurde an den Positionen 7 und 10 im antisense-Strang eingebaut. Als Kontrollen wurden an diesen Positionen mismatch-Basenpaarungen eingesetzt. An diesen Positionen werden mismatch-Basenpaarungen allerdings gut toleriert, so dass durch den Einsatz des 4,6-Difluorbenzimidazol keine Effektivitätssteigerung erreicht werden konnte. Durch gezielte Punktmutagenese konnten Nukleotidpositionen innerhalb des siRNA Moleküls identifiziert werden, bei denen mismatch-Basenpaarungen zu einem hohen Aktivitätsverlust führen und an denen der Einbau des 4,6-Difluorbenzimidazol sinnvoll erscheint. Ein zweiter Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit anti-HIV Ribozymen. In unserer Arbeitsgruppe wurden mehrere neue anti-HIV Ribozyme entwickelt und charakterisiert. Das Hammerhead Ribozym gegen das 13. GUC Triplett im Pol Gen erwies sich als äußerst effizienter Inhibitor der HIV-Replikation in vitro. In dieser Arbeit konnte die antivirale Wirksamkeit durch Bestimmung der kinetischen Parameter bestätigt werden. Der Wert für Kcat von 3,9 min-1 entspricht der Spaltungsrate von Hammerhead Ribozymen von <5 min-1. Der ermittelte Wert ist verglichen mit anderen anti-HIV Ribozymen sehr hoch. Es handelt sich um ein Ribozym mit einer sehr hohen molaren katalytischen Aktivität. Die antivirale Wirkung dieses anti-HIV Ribozyms sollte durch die Kolokalisation an seine Target-RNA zusätzlich verbessert werden. Ribozyme binden sequenzspezifisch an ihre Target RNA, das Zusammentreffen von Ribozym und Ziel-RNA ist jedoch ein zufälliges Ereignis. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Kolokalisation von Ribozymen zu einer Effektivitätssteigerung führt. Es war geplant das Ribozym über RNA-Aptamere an die HIV-1 Proteine Tat und Rev zu kolokalisieren, da beide Proteine spezifisch über ihre RNA Bindedomäne an die HIV mRNAStrukturen TAR (Tat Activated Region) bzw. RRE (Rev Responsive Element) binden. In dieser Arbeit konnten Expressionssysteme und die Reinigung für beide viralen Proteine etabliert werden, allerdings ließ sich das Affinitätstag nicht durch Proteaseverdau entfernen. Aus diesem Grund wurde die Selektion der Aptamere mit Peptiden durchgeführt. In dieser Arbeit konnten jedoch keine RNAs identifiziert werden, die eine Affinität zu den Peptiden aufwiesen. RNA Interferenz wird zunehmend als das effektivste Verfahren zum spezifischen Knockdown einer mRNA angesehen. Zum Vergleich von siRNA mit anti-HIV Ribozymen wurden überlappende Zielsequenzen im HIV-1 Pol Gen für beide Effektor-Moleküle identifiziert und ihre antivirale Wirkung verglichen. Beide Ribozyme und shRNAs wurden retroviral in T-Zellen exprimiert, um die antivirale Wirkung der beiden Effektor-Moleküle vergleichen zu können. Die antivirale Aktivität der siRNAs wurde nach HIV-1 Exposition mit der unseres Referenzribozyms HHPol 13 verglichen. Die siRNA gegen eine Sequenz im Bereich des 7. GUC Tripletts im HIV-1 Pol Gen war in der Lage die HIV Replikation effektiv zu hemmen. In gleicher Weise konnte dies auch das Referenzribozym gegen das 13. GUC Triplett im Pol Gen. Die siRNA, die gegen die gleiche Sequenz wie das effektive Ribozym gerichtet war, zeigte hingegen keinerlei antivirale Aktivität. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein Ribozym ebenso effektiv wie eine siRNA die HIV Replikation hemmen kann. Die siRNA, die gegen die gleiche Sequenz wie das effektive Ribozym gerichtet ist, hatte keine antivirale Aktivität. Neben der Zugänglichkeit der Ziel-RNA beeinflussen scheinbar noch andere Faktoren die Effizienz von siRNA-Molekülen. In diesen Experimenten wurden erstmals systematisch siRNAs und Ribozyme gegen identische Zielsequenzen miteinander vergleichen. Der antivirale Effekt der siRNA Pol7 wurde näher untersucht. Um die Effizienz der siRNA leichter zu bestimmen und vergleichen zu können, wurden die weiteren Versuche mit synthetischen Oligonukleotiden und der Zelllinie Hela-P4 CCR5 durchgeführt. Dabei zeigte die siRNA eine sehr gute Inhibition der viralen Replikation.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei Knockout-Mutanten für die Cyclophiline CypA1 und CypA2 hergestellt. Für die Konstruktion wurde nicht nur das eigentlich Gen verwendet, sondern auch umliegende Bereiche. Im Endeffekt standen der homologen Rekombination an beiden Seiten des Knockout-Konstrukts ca. 1000 bp zur Verfügung. Zunächst wurden die DNA-Abschnitte der Cyclophiline aus der genomischen DNA von Streptomyces lividans mittels PCR isoliert. Aufgrund des hohen GC-Gehalts wurde die Amplifikation in Fragmenten durchgeführt. Es wurden verschiedene PCR-Bedingungen getestet und für jedes Fragment optimale Bedingungen ermittelt. Nach Aufreinigung und A-Tailing folgte eine Ligation mit pGemT-Easy. Die erhaltenen Fragmente wurden sequenziert und anschließend über mehrere Klonierungsschritte in E. coli wieder zusammengefügt. Dabei wurde eine Apramycinresistenz-Kassette so in das Gen eingebaut, dass die eigentliche Information für das Cylophilin-Gen zerstört wurde. Das daraus resultierende Knockout-Konstrukt wurde in den temperatursensitiven pGM160, einem E.coli-Streptomyces-Shuttle Vektor, kloniert und in Streptomyces lividans transformiert. Nach einem Temperaturshift integrierte der temperatursensitive Vektor über homologe Rekombination in das Genom. Die DNA der potenziellen Mutanten wurde auf den zielgerichteten Einbau des Knockout-Konstrukts im gewünschten Cypclophilin-Gen untersucht. Mittels PCR konnten entsprechende Amplifikate hergestellt werden, die den Nachweis für die erfolgreiche homologe Rekombination lieferten. Der physiologische Zustand des Zellstoffwechsels kann durch extreme Umweltbedingungen wie Nährstoffdefizienz oder Hitzeschock in radikaler Weise verändert werden. Bei diesen Prozessen können Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen beteiligt sein, indem sie durch Isomerisation der Prolyl-Bindung ein Enzym modulieren oder bei der Expression von neuen Proteinen im Rahmen der Proteinfaltung mitwirken. Experimente unter veränderten Wachstumsbedingungen wie z.B. Nährstoffdefizienz oder Hitzeschock können Aufschluss darüber geben, ob in diesem Fall Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen an der Modulation von Enzymen beteiligt sind.
Die Replikation und Pathogenese von HIV ist in hohem Maße von zellulären Faktoren abhängig. Das Virus muss einerseits die protektiven und antiviralen Abwehrmechanismen der Wirtszelle umgehen können und gleichzeitig ist seine Replikation an die Nutzung zellulärer Faktoren adaptiert. Neben der Interaktion mit konstitutionell exprimierten zellulären Proteinen bewirkt das HI-Virus auch eine transkriptionelle Regulation zellulärer Gene, um sich einen für seine Replikation vorteilhaften Funktionszustand der Wirtszelle zu schaffen. Durch eine HIV-Infektion differentiell exprimierte Gene stellen daher potentielle Kandidatengene zur Identifizierung essentieller Wirtsfaktoren oder zellulärer Restriktionsfaktoren der HIV-Replikation dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die durch HIV-Infektion differentiell regulierten Gene LEREPO4, GLiPR, SCC-112 und Moesin auf eine mögliche Funktion bei der HIV-Replikation analysiert. Dabei wurden diese durch RNA Interferenz (RNAi) im Kontext einer HIV-Infektion reprimiert. Als zelluläres Modellsystem wurden P4-CCR5-Zellen verwendet, bei denen eine Infektion mit dem Virusstamm HIV-1Bru eine Induktion der Gene LEREPO4, GLiPR und Moesin sowie eine Repression von SCC-112 bewirkte. Die RNA-Interferenz vermittelte Suppression dieser Gene erfolgte durch Applikation von synthetischen siRNA Oligonukleotiden oder durch intrazelluläre Expression von short hairpin RNAs (shRNA). Durch den Einsatz von shRNAs konnte jedoch unter den vorliegenden Versuchsbedingungen nur eine unzureichende Gensuppression erreicht werden. Aus diesem Grund wurden synthetische siRNA Oligonukleotide verwendet. Es konnte eine deutliche Reduktion der jeweiligen Zielgene bewirkt werden, ohne dass nennenswerte Effekte auf den Phänotyp und die Viabilität der Zellen beobachtet wurden. Der Einfluss der siRNA-vermittelten Gensuppression auf die HIV-Replikation wurde durch Infektion der Zellen ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass die Depletion von GLiPR und LEREPO4 eine deutliche Inhibition der HIV-Replikation bewirkte. Das Ausmaß der Inhibition war ähnlich ausgeprägt, wie durch Verwendung einer bereits publizierten, gegen das virale Gen p24 gerichteten siRNA. Die Depletion von SCC-112 hatte im Gegensatz hierzu keine eindeutige Wirkung auf die HIV-Replikation, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass seine Repression während einer HIV-Infektion ein unspezifischer bzw. sekundärer Effekt ist. Die siRNA-vermittelte Suppression von Moesin führte zu einem unerwarteten Ergebnis, da eine deutliche Steigerung der HIV-Replikation im Vergleich zur Kontrolle festgestellt wurde. Damit konnte erstmals belegt werden, dass Moesin nicht für die HIV-Replikation benötigt wird, wie es durch andere Arbeiten postuliert wurde. Diese Annahme begründete sich auf der Beobachtung, dass Moesin in Viruspartikel inkorporiert wird. Daher wurde eine Beteiligung an der Zusammenlagerung oder Abschnürung viraler Partikel vermutet. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse lassen vermuten, dass LEREPO4 und GLiPR notwendige Faktoren der HIV-Replikation sind, wohingegen Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln scheint. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Wirkung auf die HIVReplikation sind jedoch weitgehend unklar. Da die Proteine LEREPO4, SCC-112 und GLiPR nicht oder nur unzureichend charakterisiert sind, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit zelluläre Funktionen dieser Proteine zu ermitteln, um Rückschlüsse auf ihre Funktion bei der HIV-Replikation zu gewinnen. Es konnten polyklonale Antikörper gegen LEREPO4 generiert werden, mit denen eine Bestimmung der zellulären Lokalisation möglich war. Mittels Co-Immunopräzipitation wurde die Interaktion von LEREPO4 und TRAF-2 nachgewiesen. Die Bestimmung des Einflusses von LEREPO4 auf die NF-κB-Aktivierung lässt vermuten, dass LEREPO4 an der TRAF-vermittelten Signaltransduktion beteiligt ist. Untersuchungen zur Funktion von GLiPR zeigten, dass es sich möglicherweise um ein sekretorisches Protein handeln könnte, wie durch den fluoreszenzmikroskopischen Nachweis eines GLiPR-EGFP-Fusionsproteins in HeLa-Zellen ermittelt wurde. Weiterhin konnte mittels Annexin-V-Färbung und TUNEL-Assay belegt werden, dass eine exogene Expression des GLiPRs in HeLa Zellen zu einem deutlichen Anstieg der Apoptoserate führte. Zusätzlich wurden für jedes Protein Genexpressionsprofile nach siRNA vermittelter Repression mittels Microarray-Analyse erstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass LEREPO4 und GLiPR mögliche Kofaktoren der HIV-Replikation darstellen. Im Gegensatz hierzu scheint Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln. Auf Grundlage der in dieser Arbeit ermittelten Daten können weiterführende Untersuchungen durchgeführt werden, um die genaue Funktion der oben genannten Proteine bei der HIV-Replikation zu klären.
Ein wichtiges Element zur Steuerung der Transkriptionseffizienz im Replikationszyklus des HI-Virus ist das Tat/TAR-System. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige kleine heterozyklische Verbindungen synthetisiert, die als potenzielle Inhibitoren des Tat-TAR-Komplexes von HIV-1 wirken sollten. Nach der Synthese des 1H-Pyrazol-3,4,5-triamin-sulfates sollte diese Verbindung dann in größere Strukturmotive eingebettet werden, von denen man sich erhoffte, dass sie in ihrer reduzierten Form in der Lage sein sollten, weitere H-Brücken zu benachbarten Basen der RNA auszubilden und dadurch die Affinität zu erhöhen. Es zeigte sich, dass die im Rahmen dieser Dissertation synthetisierten Phenazinderivate zwar alle mit Natriumdithionit reduziert werden konnten, diese Strukturen aber nicht luftstabil waren.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden modifizierte Nukleoside synthetisiert, um ihren Einfluss auf die Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen. Bei den fluorierten Benzimidazol-Nukleosidanaloga handelt es sich um universelle Basen, die bei der Basenpaarung nicht zwischen den vier natürlichen Nukleosiden unterscheiden können. Die dabei auftretende Destabilisierung der RNA-Duplexe sollte durch die Änderung physikalisch-chemischer Eigenschaften vermindert werden. Durch die Synthese der fluorierten Indol-Nukleosidanaloga mit denselben Fluoratompositionen sollte nachgewiesen werden, welche Rolle ein ausfallendes Stickstoffatom im Fünfring-System spielt. Weitere Untersuchungen wurden so entwickelt, dass die zwei spC-F in 4,6DFBI wie auch in 4,6DFI mit Stickstoffatomen getauscht wurden. So wurde noch eine neue Serie Nukleosidanaloga synthetisiert (Abbildung 9.2). Schließlich wurde noch 1-Desoxy-D-ribofuranose AS als absischer Baustein synthetisiert. Die Synthese der Indol- und 9-Deazapurin-Nukleosidanaloga wurde über eine Glycsilierungsreaktion mit geeignet geschützter Deoxyribose durchgeführt. Dies wurde über vier Stufen, ohne Aufreinigung, aus Deoxyribose synthetisiert. Die entsprechenden Deoxy-nukleoside wurden danach in fünf Schritten zu Ribo-nukleosiden transformiert. Nach der Entschützung von Toluoyl-Gruppen wurden die 5´- und 3´-OH Gruppen sukzessiv geschützt. Nach simultaner 5´-OH Entschützung und 3´-OMs Eliminierung, wurden die gewünschten Ribonukleoside durch katalytische Dihydroxilierung erhalten. Die Darstellung der Verbindung 7NP erfolgte über die Silyl-Hilbert-Johnson-Reaktion. Der abasische Baustein AS wurde ausgehend von 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribofuranose durch Dehydroxylierung und anschließende Entschützung erreicht. Von allen Nukleosiden gelang es Kristalle aus Wasser oder Methanol zu erhalten und röntgenkristallographisch zu untersuchen. Die Kristallpackungen zeigten eine sehr interessante Anordnung der Moleküle. Alle Fluorindol-Nukleoside mit Ausnahme von 7-N-Purin-Nukleosid 7NP zeigten nicht die für aromatische Systeme normale Fischgräten-Struktur, sondern eine Anordnung, in der die Moleküle gegenüberliegen. Die Kristallpackung besteht abwechselnd aus hydrophilen und lipophilen Schichten. Die hydrophilen Schichten bestehen aus den Zuckeruntereinheiten und die lipophilen aus den Fluoraromaten. Die Zucker sind durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden. Für die Orientierung der Moleküle zueinander sind aber die Fluoratome verantwortlich. In der Kristallpackung von 7-Fluorindol-Nukleosid 7FI kann ein Fluor-Wasserstoff-Abstand von nur 230 pm detektiert werden. Dies ist deutlich kürzer als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff von 2,55 Å. Der Abstand wird zwischen dem Fluor des einen Nukleosids und einem Wasserstoff eines gegenüberliegenden Nukleosids gemessen. Der Abstand von 2,30 Å ist einer der kürzesten jemals in Kristallen gemessenen F-H Abstände des Typs Csp²-F...H-Csp². Bedingt durch diesen kurzen Abstand kann von einer F...H Wasserstoffbrücke gesprochen werden. Auf der anderen Seite in der Kristallstruktur von 4-Fluorindol-Nukleosid 4FI konnte ein F-H Abstand von 2,69 Å nachgewiesen werden, welcher deutlich länger als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff ist. Die Nukleoside wurden auf ihre Lipophilie hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden Octanol-Wasser Verteilungskoeffizienten der Nukleoside gemessen. Die fluorierten Nukleoside zeigten im Gegensatz zu den nichtfluorierten Nukleosiden eine deutlich größere Lipophilie. Nach Umsetzung der Nukleoside zu den Phosphoramiditen konnten diese kupplungsfähigen Monomere in den RNA-Festphasensynthesen eingesetzt und in RNA 12mere eingebaut werden. Um den Einfluss der aromatischen Fluorosubstitutionen auf die thermodynamische Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen, wurden UV/VIS- und CD- spektroskopische Messungen an monomodifizierten RNA 12meren durchgeführt. Aus den erhaltenen Schmelzkurven wurden die Schmelzpunkte bestimmt (Abbildung 9.3) und die thermodynamischen Daten ausgerechnet. Die Anwendung hydrophober, Fluorsubstituierter Nukleobasen führte im Fall der fluorierten Indol-Nukleoside zu Destabilisierung im Vergleich mit natürlichen Basenpaaren. Aus den folgenden Resultaten lässt sich zusammenfassen: 1. Position der Fluoratom in fluorierten Indole spielt eine wesentliche Rolle für die Stabilität des RNA-Duplex 2. 6FI bildet die stabilste Basenpaaren mit natürlichen Basen. 3. Basenpaarung von 4FI trägt eine deutlich höhere Destabilisierung. Für diese Modifikation wurden auch die längsten Abstandwerte zwischen C-F…H in der Kristallpackung gemessen. (Die Vermutung liegt nahe, dass diese Base sich außerhalb des Duplex befindet). 4. Alle Fluorindol-Basenanaloga zeigen die Tendenz zur Paarung mit Adenosin. 5. Bei 4,6DFI handelt sich um universelle Base. Um noch weniger destabilisierende universelle Basen zu finden, wurde das Forschungsfeld mit Methoden aus dem Bereich der strukturellen Bioinformatik, Molekül-dynamiksimulationen und freie Energie-Rechnungen ausgeweitet. Resultierende Simulationen führten zu zwei neuen Basen: 7NP als Analogon zu 4,6DFBI und 9DP als Analogon zu 4,6DFI (siehe Kapitel 8). Theoretische Rechnungen ließen sich bestätigen durch experimentelle Ergebnisse Die so entstandene Serie von Purin-Basenanaloga hat uns gezeigt, dass der Austausch von Fluoratomen durch Stickstoffatome stabilisierende Effekte bringt. Die chemischen Änderungen beeinflussen die physikalischen Eigenschaften, welche dadurch Stabilisierung oder Destabilisierung des RNA-Duuplex dirigieren. In Abbildung 9.5 befinden sich ausgerechnete Dipolmomente. Somit können wir für diese Serie folgendes resümieren: * 4,6FI als universelles Base Analogon zu 4,6DFBI zeigt geringere destabilisierende Effekte auf den 12mer RNA-Duplex. * Umtausch von Fluoratomen in den beiden Basen (4,6DFI und 4,6DFBI) resultiert in deutlich besserer Basenpaarung. * Auserrechnete thermodynamische Parametern (von gemessenen Tm-Werten) wurde ersichtlicht, dass höhere Tm-Werte durch geringere Destabilisierung aus Solvatation resultieren, nicht aus erhöhten Stacking Effekten des RNA-Duplex.