Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (124)
Has Fulltext
- yes (124)
Is part of the Bibliography
- no (124)
Keywords
- Gentherapie (4)
- Akute lymphatische Leukämie (3)
- AF4 (2)
- Genfallen-Vektoren (2)
- Hämatopoese (2)
- LINE-1 (2)
- Primäre Immundefekte (2)
- Promotor <Genetik> (2)
- Transkriptionsfaktor (2)
- Virologie (2)
Institute
- Pharmazie (48)
- Biochemie, Chemie und Pharmazie (46)
- Biochemie und Chemie (27)
- Medizin (6)
- Biowissenschaften (1)
- Georg-Speyer-Haus (1)
- keine Angabe Institut (1)
Die Applikation von therapeutischen Peptiden oder Proteinen kann im Patienten durch Mechanismen des Immunsystems zu unerwünschten Nebenwirkungen führen, die die biologische Wirksamkeit vermindern können. Dies geht mit einer erhöhten Wirkstoffgabe oder einer Therapieresistenz einher und stellt damit ein Sicherheitsrisiko für den Patienten dar. In der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel HIV-inhibitorischer Peptide eine Möglichkeit aufgezeigt, mit der die peptidspezifische humorale und zelluläre Immunogenität vermindert, die Wirksamkeit indes beibehalten werden kann. Als Ausgangspunkt wurden die bereits publizierten Peptide T-20, C46, SC35EK, T-1249 und C34-EHO ausgewählt, welche äußerst effektiv den Eintritt von HIV in dessen Zielzellen verhindern. Alle fünf Peptide sind von der Aminosäuresequenz des transmembranen Hüllproteins gp41 des HIV-1 (T-20, C46, SC35EK), HIV-2 (C34-EHO) bzw. HIV-1/-2/SIV (T-1249) abgeleitet. In dieser Arbeit wurde das HIV-2 Peptid C34-EHO C-terminal um 12 Aminosäuren des HIV-1 verlängert (neue Bezeichnung: C46-EHO). Für die Initiierung einer zellulären Immunantwort muss unter anderem ein Peptidfragment (sog. MHC-I-Epitop) über Ankeraminosäuren an ein MHC-I-Molekül binden. Die in silico Analyse der Aminosäuresequenzen der Peptide ergab diesbezüglich für das Hybridpeptid C46-EHO die geringste potentielle zelluläre Immunogenität, wobei insgesamt fünf starke potentiell immunogene MHC-I-Epitope von den Vorhersageprogrammen BIMAS und SYFPEITHI identifiziert wurden. Die in vitro Analyse der humoralen Antigenität zeigte zudem, dass die überwiegende Mehrheit der HIV-1-infizierten Patienten Antikörper gegen die HIV-1-abgeleiteten Peptide C46 und T-20 im Serum aufwies, nicht jedoch gegen C46-EHO, T-1249 und SC35EK. Die Antikörper waren überwiegend gegen die am C-Terminus lokalisierte HIV-1 MPER (membrane-proximale external region) gerichtet. In den Seren von HIV-2-infizierten Patienten waren hingegen Antikörper gegen T-1249 und C46-EHO detektierbar. Die Peptide T-20, C46, SC35EK, T-1249 und C46-EHO verhinderten spezifisch die Infektion von HIV-1 im nanomolaren Konzentrationsbereich. C46-EHO hemmte überdies den Eintritt von SIVmac251 als auch T-20- und C46-resistenter HI-Viren. T-Zelllinien wurden durch die membranständige Expression von C46-EHO effektiver vor einer HIV-1 Infektion geschützt im Vergleich zu membranständigen C46 Peptid. Aufgrund der geringen Immunogenität und der äußerst breiten und effektiven antiviralen Wirksamkeit wurde C46-EHO für die weitere Optimierung verwendet. Im C46-EHO wurden Aminosäuren an Hauptankerpositionen der MHC-I-Epitope gegen weniger stark bindende Aminosäuren bei fünf potentiellen 9mer MHC-I-Epitopen ausgetauscht. Dies resultierte in den Peptidvarianten V1, V2, V3 und V4, wobei V2 die aussichtsreichsten Eigenschaften aufwies: 1) niedrigste humorale Antigenität in HIV-1 Patientenseren; 2) potente antivirale Wirksamkeit; 3) verringerte potentielle zelluläre Immunogenität. Abschließend wurde basierend auf V2 die optimierte Peptidvariante V2o generiert. Die Glykosylierungsstelle im V2 Peptid wurde an die entsprechende C46 Position verschoben, wodurch die in silico vorhergesagte zelluläre Immunogenität weiter vermindert wurde. Zudem wurde das HIV-1-abgeleitete MPER-Motiv durch die Aminosäuresequenz des HIV-2 Stammes EHO ersetzt, so dass V2o nicht mehr von prä-existierenden Antikörpern in HIV-1 Patientenseren erkannt wurde. Im ELISpot Assay wiesen weder Patienten mit einer HIV-1 bzw. HIV-2 Infektion noch SIV-infizierte Rhesus Makaken eine zelluläre Immunantwort gegen C46-EHO, V2 oder V2o auf. V2o verhinderte den Eintritt von diversen HIV-1 Viren im pikomolaren Konzentrationsbereich und wies somit eine deutlich verbesserte antivirale Wirksamkeit auf. Somit konnte in dieser Arbeit durch Austausch von Aminosäuren die intrinsische Immunogenität des HIV-inhibitorischen Peptids C46-EHO vermindert und zugleich die biologische Wirksamkeit verstärkt werden. Das hieraus resultierende Peptid V2o steht nunmehr für die weitere klinische Entwicklung als Präventativ oder Therapeutikum für die subkutane oder gentherapeutische Applikation zur Verfügung.
The vascular endothelium is a monolayer of endothelial cells that builds the inner lining of the blood vessels and constitutes a regulatory organ within the physiological system to sustain homeostasis. Endothelial cells participate in physiological processes including inflammation and angiogenesis. Dysregulation of these processes, however, can evoke or maintain pathological disorders, including cardiovascular and chronic inflammatory diseases or cancer. Although pathological inflammation and angiogenesis represent treatable conditions, current pharmacotherapeutic approaches are frequently not satisfying since their long-term application can evoke therapy resistance and thus reduced clinical efficacy. Consequently, there is an ongoing demand for the discovery of new therapeutic targets and drug leads. Considering that endothelial cells play a critical role in both angiogenesis and inflammation, the vascular endothelium represents a promising target for the treatment of diseases.
Vioprolide A is a secondary metabolite isolated from the myxobacterium Cystobacter violaceus Cb. vi35. Recently, vioprolide A was identified to interact with NOP14, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis. Ribosome biogenesis is an indispensable cellular event that ensures adequate homeostasis. Abnormal alterations in the ribosome biogenesis, referred to as ribosomopathies, however, can lead to an overall increase in the risk of developing cancer. Accordingly, several studies have outlined the involvement of NOP14 in cancer progression and metastasis, and vioprolide A has been demonstrated to exert anti-cancer effects in vitro. However, the impact of vioprolide A and NOP14 on the endothelium has been neglected so far, although endothelial cells are crucially involved in inflammation and angiogenesis under both physiological and pathological conditions.
In the present study, the effect of vioprolide A on inflammatory and angiogenic actions was analysed. In vivo, the laser-induced choroidal neovascularization (CNV) assay outlined a strong inhibitory effect of vioprolide A on both inflammation and angiogenesis. Furthermore, intravital microscopy of the cremaster muscle in mice revealed that vioprolide A strongly impaired the TNF-induced leukocyte-endothelial cell interaction in vivo.
In further experiments, the specific effect of vioprolide A on activation processes of primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was examined. According to the in vivo results, vioprolide A decreased the leukocyte-endothelial cell interaction in vitro through downregulating the cell surface expression and total protein expression of ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin. Vioprolide A evoked its anti-inflammatory actions via a dual mechanism: On the one hand, the expression of pro-inflammatory proteins, including TNFR1 and cell adhesion molecules, was lowered through a general downregulation of de novo protein synthesis. The inhibition of de novo protein synthesis is most likely linked to the interaction with and inhibition of NOP14 by vioprolide A in HUVECs. On the other hand, the natural product prevented the nuclear translocation and promotor activity of the pro-inflammatory transcription factor NF-ĸB. Interestingly, most anti-inflammatory compounds that interfere with the NF-ĸB signaling pathway prevent NF-ĸB nuclear translocation through recovering or stabilizing the inhibitory IĸB proteins. Vioprolide A, however, decreased rather than stabilized the IĸB proteins and prevented NF-ĸB nuclear translocation through interfering with its importin-dependent nuclear import. By performing siRNA-mediated knockdown experiments, we evaluated the role of NOP14 in inflammatory processes in HUVECs and could establish a causal link between the anti-inflammatory actions of vioprolide A and the deletion of NOP14.
Besides exerting anti-inflammatory actions, we found that vioprolide A potently decreased the angiogenic key features proliferation, migration and sprouting of endothelial cells. Mechanistically, the natural product interfered with pro-angiogenic signaling pathways. Vioprolide A reduced the protein level of growth factor receptors, including VEGFR2, which is the most prominent receptor responsible for angiogenic signaling in endothelial cells. This effect was based on the general inhibition of de novo protein synthesis by the natural product. Downregulation of growth factor receptors impaired the activation of downstream signaling intermediates, including the MAPKs ERK, JNK and p38. To our surprise, however, activation of Akt, another downstream effector of VEGFR2, was increased rather than decreased. Furthermore, vioprolide A lowered the nuclear translocation of the transcriptional coactivator TAZ, which is regulated by the evolutionary conserved Hippo signaling pathway. Interestingly, however, and in contrast to NF-ĸB, TAZ nuclear translocation in mammalian cells seems to be independent of importins. In this context, we found that vioprolide A reduced both the protein level and nuclear localization of MAML1, which is needed to retain TAZ in the nucleus after its successful translocation.
...
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien und Lymphomen assoziiert und gelten in vielen Fällen als Ursache der Erkrankung. Die reziproke Translokation t(4;11) findet man hauptsächlich bei Kleinkindern, die an einer akuten lymphatischen Leukämie erkrankt sind, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapiekonzepte resistent, was zu einer ungewöhnlich schlechten Prognose führt. Die Chromosomenbande 11q23 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt. Die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusiongene sind alle mit der Entstehung einer Hochrisikoleukämie korreliert. Für einige der dabei entstehenden Fusionsproteine konnte nach retroviraler Transduktion in hämatopoietische Vorläuferzellen gezeigt werden, dass sie onkogenes Potential besitzen und eine myeloische Leukämie in transgenen oder transienten Mausmodellen initiieren können. Für die Produkte einer Translokation t(4;11) konnte dies bislang nicht erfolgreich untersucht werden. Bei der Translokation t(4;11) werden die beiden Partnergene MLL und AF4 so miteinander verknüpft, dass auf den neu gebildeten Derivatchromosomen zwei Fusionsgene (MLL•AF4 und AF4•MLL) mit einem intakten Leserahmen entstehen. Da man in den leukämischen Blasten im Regelfall beide Fusionstranskripte findet, nehmen wir an, dass beide Genprodukte zur Fehlregulation und Entartung der Zelle beitragen. Um den potentiell onkogenen Wirkmechanismus der t(4;11) Translokation zu untersuchen, wurde ein induzierbares Expressions-System in murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) etabliert. Anhand dieses Zellsystems gelang es das potententielle onkogene Potential der Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL, bzw.des Wildtyp AF4 Proteins in Focus Formation Assays sichtbar zu machen. Dabei konnte die Bildung zellulärer Foci eindrucksvoll für das Wildtyp AF4 Protein und das AF4•MLL Fusionsprotein dargestellt werden. Das MLL•AF4 Fusionsprotein war nicht in der Lage den Verlust der Kontaktinhibition und damit Focus-Bildung in den Zellen zu initiieren. Die anschließende Definition des AF4 Wildtyp- und AF4•MLL Fusionsproteins als Proto-/Onkoprotein, führte zu der Arbeitshypothese, dass der Nterminale Bereich des AF4 Proteins (AF4•N) Wachstums-transformierendes Potential besitzt. Aufgrund der vorliegenden Daten und zur genaueren Charakterisierung des AF4 Proteins wurden anschließend Interaktions-Studien mit dem AF4•N Protein durchgeführt, wobei die beiden E3 Ubiquitin Ligasen SIAH1 und SIAH2 als Interaktionspartner des AF4•N Proteins identifiziert wurden. E3 Ubiquitin Ligasen sind wichtige Bestandteile der Ubiquitinylierungs-Maschinerie und der damit verbundenen proteasomalen Degradation. Dabei sind die SIAH Proteine, wie alle E3 Ubiquitin Ligasen, für die Spezifität der Proteasom-abhängigen Degradation verantwortlich, indem sie über ihre Substrat-Binde Domäne im C-Terminus mit den abzubauenden Targetproteinen interagieren. Die spezifische Interaktion der SIAH Proteine mit dem AF4•N Protein konnte in unabhängigen Experimenten sowohl in vitro als auch in vivo bestätigt werden. Durch den Einsatz des Proteasom-Inhibitors MG132 konnte zudem der effiziente, SIAH1-vermittelte und Proteasom-abhängige Abbau von AF4•N demonstriert werden. Mit weiterführenden Experimenten konnte auch für das Wildtyp AF4 Protein und für das AF4•MLL Fusionsprotein eine Regulation der Proteinstabilität über das SIAH1 Protein festgestellt werden. Eine SIAH1-vermittelte Degradation ist jedoch nur auf das AF4•MLL full-length Fusionsprotein beschränkt. Eine proteolytische Spaltung des AF4•MLL Fusionsproteins durch die Protease Taspase1 innerhalb des MLL Fusionsanteils führte zur Bildung eines stabilen der4•N/MLL•C Proteinkomplexes und dessen Akkumulation in den Zellen. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte für t(4;11) Translokationen ein erster pathomolekularer Mechanismus zur Leukämie-Entstehung aufgezeigt werden. Dieser beruht im wesentlichen auf der Akkumulation des der4•N/MLL•C Proteinkomplexes, welcher sich der effizienten Kontrolle durch die E3 Ubiquitin Ligase SIAH1 entzieht. Dadurch wird der Wachstums-transformierende AF4•N Proteinanteil in die Lage versetzt sein onkogenes Potential zu vermitteln.
HIV vaccine preclinical testing is difficult because HIV’s only relevant hosts are humans and no correlates of protection are known. To this end, we are working on the humanization of different mouse strains with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) as well as human hematopoietic stem cells (HSC) to generate a useful small animal model.
We generated immune deficient mice (NOD Scid IL2gc -/- /NOD Rag1-/- IL2gc -/-) expressing human MHC class II (HLA-DQ8) on a mouse class II deficient background (Ab-/-). Here, the human HLA-DQ8 should interact with the matching T cell receptors of transferred matching human PBMCs and therefore could support the functionality of the transferred human CD4+ cells in the mice.
Mice that were adoptively transferred with human HLA-DQ8 PBMCs only showed engraftment of CD3+ T cells. Surprisingly, the presence of HLA class II did not significantly change the repopulation rates in the mice. Also, the presence of HLA class II did not advance B cell engraftment, such that humoral immune responses were undetectable. However, the overall survival of DQ8-expressing mice was significantly prolonged, compared to mice expressing mouse MHC class II molecules, and correlated with an increased time span until onset of GvHD.
To avoid GVHD and to increase and maintain the level of human cell reconstitution over a long period of time, the same mouse strains were reconstituted with human HSC. Compared to PBMC-repopulated mice, HSC-reconstituted mice develop almost all subpopulations of the human immune system detectable at week 12 after HSC transfer. These mice developed adaptive immune responses after Tetanus Toxoide (TT) immunizations. In addition, we are testing the susceptibility of these humanized mice to different HIV strains with a detailed look at immune responses.
Cardiac progenitor cells hold great potential for regenerative therapies in heart disorders. However, the molecular mechanisms regulating cardiac progenitor cell expansion and differentiation remain poorly defined. Here we show that the multi- adaptor protein Ldb1, which mediates interactions between different classes of LIM domain transcription factors, is a multifunctional regulator of cardiac progenitor cell differentiation. Ldb1-deficient embryonic stem cells (ESCs) show a markedly decreased expression of second heart field (SHF) marker genes and subsequently impaired cardiomyocyte differentiation. Conditional ablation of Ldb1 in the early SHF using an Isl1-Cre driver led to embryonic lethality at Embryonic day (E)10.5 with cardiac abnormalities including a significantly smaller right ventricle and a shortened outflow tract, supporting a crucial role of Ldb1 in the SHF. Mechanistically we show that the importance of Ldb1 for SHF development is two-fold: On the one hand, Ldb1 binds to Isl1 and protects it from proteasomal degradation, as a consequence of which Ldb1-deficiency leads to an almost complete loss of Isl1+ cardiovascular progenitor cells. On the other hand the Isl1/Ldb1 complex promotes long-range promoter-enhancer interactions at the loci of the core cardiac transcription factors Mef2c and Hand2. Chromosome conformation capture followed by sequencing (3C- seq) identified specific Ldb1-mediated interactions of the Isl1/Ldb1 responsive Mef2c anterior heart field enhancer with genes which play key roles in cardiac progenitor cell function and cardiovascular development. These interactions are of critical importance to regulate the expression of the downstream target genes since their expression levels are strongly dependent on the Ldb1/Isl1 levels. Overexpression of an Ldb1 mutant, which contains the LIM interaction domain and thereby can protect Isl1 protein from degradation, but lacks the dimerization domain and thus cannot promote long-range interactions, does not collaborate with Isl1 to regulate the expression of their common targets and results in defects in Isl1+ cardiac progenitor differentiation. In this thesis we show one of the first examples of genome-wide chromatin reorganization mediated by a developmental regulated, cell type specific, transcription complex. Ldb1 in concert with Isl1 promotes long range promoter- enhancer and enhancer-enhancer interactions in order to create active chromatin hub where gene important for heart development can be co-regulated. Moreover, Isl1 and Ldb1 genetically interact during heart development, as Isl1/Ldb1 haplodeficient embryos show various cardiac anomalies. The dosage-sensitive interdependence between Isl1 and Ldb1 in the expression of these key factors in cardiogenesis, further supports a key role of the Isl1/Ldb1 complex in coordinating a three dimensional genome organization, upstream of a regulatory network driving cardiac differentiation and heart development.
In conclusion, the Isl1/Ldb1 complex orchestrate a genome-wide three dimensional chromatin reorganization resulting in a transcriptional program responsible for the differentiation of multipotent cardiac progenitor cells into cardiomyocytes.
Das Myc-Bindeprotein 2 (MYCBP2) könnte aufgrund seiner enormen Größe, seiner multiplen funktionalen Domänen und seiner ubiquitären Expression in die verschiedensten Signaltransduktionswege involviert sein. Bisher wurde überwiegend die Funktion der C-terminalen RING-Finger-Domäne untersucht, die die E3-Ubiquitinligase-Aktivität des MycBP2 bedingt. Über die Interaktion mit verschiedenen Signalwegen, wie den p38-Signalweg oder die mTOR-Aktivierung, kann MycBP2 über Ubiquitylierung und anschließendem proteosomalen Abbau diverse Prozesse der Synaptogenese und der spinalen Schmerzverarbeitung, aber auch der peripheren Nozizeption regulieren. Über die Funktionen der N-terminalen RCC1-ähnlichen Domäne ist dagegen weniger bekannt. Bisher konnte eine direkte Protein-Protein-Interaktion mit dem neuronenspezifischen elektroneutralen Kalium- und Chlorid-Ionen Co-Transporter KCC2 und mit der Adenylylcyclase nachgewiesen werden. Bindet MycBP2 oder seine RCC1-ähnliche Domäne an membranständiges KCC2 führt dies einem verstärkten Transporteraktivität, während die Bindung an die Adenylylcyclase in deren Hemmung resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollten nun auf Basis eines Antikörperarrays neue Interaktionspartner des MycBP2 und deren Funktion bestimmt werden.
Der Antikörperarray vergleicht die Expression diverser Proteine in DRG-Lysat von SNS-Cre positiven und SNS-Cre-negativen MycBP2lox/lox Mäusen und weist Unterschiede im Vorkommen von SUMO1 auf. Durch Analyse mittels Western Blot zeigte sich ein verstärktes Signal für ein 85 kDa-Protein. Mittels Immunpräzipitation sowohl aus HeLa-Zellen als auch aus DRG-Neuronen wurde das Protein als SUMOyliertes RanGAP1 identifiziert. Durch CO-Immunpräzipitationen konnte eine direkte Protein-Protein Interaktion nachgewiesen werden, die während einer Zymosan-induzierten Hyperalgesie zu einer MycBP2-abhängig Regulation der RanGAP1 Expression und SUMOylierung führt. Die erhöhte RanGAP1 Menge in Abwesenheit von MycBP2 ist dabei nicht auf eine MycBP2-abhängige Ubiquitinierung des RanGAP1 zurückzuführen. Dagegen konnte eine Hemmung der Ubiquitinligaseaktivität des MycBP2 in Anwesenheit von SUMOyliertem RanGAP1 festgestellt werden, die sowohl bei der Autoubiquitylierung als auch beim proteosomalen Abbau von TSC2 nachgewiesen werden konnte. Weitere Untersuchungen zeigen eine durch SUMOyliertes RanGAP1-vermittelte Translokation des MycBP2 an den Zellkern, die durch Transfektion mit RanGAP1 siRNA sowohl in HeLa-Zellen als auch in primären DRG-Kulturen gehemmt werden kann.
Im nächsten Schritt wurde die mögliche Interaktion von MycBP2 mit Ran untersucht. Es zeigte sich, dass die Ranexpression in DRGs von Cre-positiven MycBP2lox/lox Mäusen im Gegensatz zu Cre-negativen MycBP2lox/lox Mäusen signifikant gesteigert ist und auch hier eine MycBP2-abhängige Expressionsregulation während der Zymosan-induzierten Hyperalgesie vorliegt. Ein 3D-Modell von primären DRG-Kulturen nach Immunfärbung weist eine Kolokalisation von MycBP2 und Ran sowohl im Cytosol als auch im Zellkern auf. Immunfärbungen von DRG-Schnitten zeigten außerdem, dass Ran in Abwesenheit von MycBP2 verstärkt im Zellkern vorliegt, was auf eine direkte Interaktion von MycBP2 mit Ran hindeutet. Auf Grund des stationären GTPase Assays konnte eine Integration des MycBP2 in den RanGTPase Zyklus belegt werden, da die Anwesenheit von MycBP2 zu einer gesteigerten GTP-Hydrolyse führte. Anhand des Ein-Zyklus-GAP-Assay wurde daher der Einfluss des MycBP2 auf die GAP-Aktivität des RanGAP1 überprüft, wodurch sich zeigte, dass MycBP2 die GAP-Aktivität des RanGAP1 hemmt. Damit bedingt die MycBP2/RanGAP1-Interaktion eine gegenseitige Hemmung der Enzymaktivität der beteiligten Proteine. Weitere Untersuchungen durch 35S-GTP-Bindeassays deckten eine konzentrationsabhängige GEF-Aktivität des MycBP2 für Ran auf, wobei die GEF-Aktivität von der RCC1-ähnlichen Domäne des MycBP2 vermittelt wird. Des Weiteren zeigte sich anhand von Versuchen mit der konstitutiv aktiven Ran-Mutante Q69L und der inaktiven Ran-Mutante T24N, dass MycBP2 verstärkt die inaktive Form des Ran, also RanGDP bindet.
In dieser Arbeit konnte so zum ersten Mal eine Integration des MycBP2 in den RanGTPase-Zyklus gezeigt werden, die es MycBP2 ermöglicht, sowohl in die nukleare Import/Export-Maschinerie, in den Aufbau der mitotischen Spindel und die Bildung der Kernmembran einzugreifen.
Das NANOG2-Gen ist ein Genduplikat des nur in embryonalen Stammzellen exprimierten Stammzellfaktors NANOG1, der eine Schlüsselrolle bei der Pluripotenz und der Selbsterneuerung der Stammzellen und möglicherweise der Krebsstammzellen hat. Zur Analyse, ob NANOG2 die beschriebenen Funktionen von NANOG1 in Gewebestammzellen und Krebsstammzellen übernimmt und ursächlich für die Leukämieentstehung verantwortlich ist, wurden embryonale Zellen und primäre Leukämiezellen auf NANOG2-Expression durch RT-PCR-Experimente, Western Blot Analysen und ChIP Assays untersucht. Dabei konnte eine Methode zur Unterscheidung der NANOG1 und NANOG2-Transkripte etabliert, neue Genstrukturen dieser Gene charakterisiert und NANOG2-Transkripte in hämatopoetischen Stammzellen und in allen primären Leukämiezellen detektiert werden. Außerdem konnte mit Hilfe von Genexpressionsanalysen eine äquivalente Funktion von NANOG2 zu NANOG1 festgestellt werden.
Die Hodgkin/Reed-Sternberg Zellen des klassischen Hodgkin Lymphoms stammen von Keimzentrums-B-Zellen ab. Dennoch prägen sie fast keine B-Zell-spezifischen Gene aus, stattdessen ko-exprimieren sie Marker anderer hämatopoetischer Linien. Die Ursache für den Verlust des B-Zell-Phänotyps ist weitestgehend unbekannt, da die Transkriptionsfaktoren E2A und PAX5, die in reifen B-Zellen zur Aufrechterhaltung der Expression B-Zell-spezifischer Gene essentiell sind, von primären HRS Zellen ausgeprägt werden. Allerdings wird PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen deutlich schwächer exprimiert. E2A wird durch direkte Interaktion mit dem inhibitor of DNA binding, ID2, negativ reguliert. ID2 besitzt eine bHLH-Struktur und dimerisiert mit Transkriptionsfaktoren. Da ihm jedoch die DNA-bindende Domäne fehlt, wird die Bindung der Heterodimere an die DNA verhindert und die Transkriptionsfaktoren somit inaktiviert. In hämatopoetischen Zellen scheint die ID2-Expression die B-Zell-Entwicklung und auch die Expression B-Zell-spezifischer Gene zu unterdrücken und stattdessen die Ausprägung von Genen anderer Linien zu unterstützen. In reifen B-Zellen wird ID2 während der Plasmazellentwicklung bei gleichzeitigem Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene stark exprimiert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ID2, das in normalen B-Zellen nicht detektiert werden konnte, dagegen in allen HL-Fällen nicht nur auf RNA-Ebene, sondern auch auf Proteinebene stark exprimiert wird. Ko-Immunopräzipitation des E2A mit ID2 aus HL-Zelllinien zeigte die Interaktion und somit vermutlich auch die transkriptionelle Inaktivierung des E2A durch ID2, wodurch es zum Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene kommt. Darüber hinaus wird PAX5 zusammen mit EBF durch E2A induziert. So führt die ID2-vermittelte E2A-Inaktivierung im HL vermutlich dazu, dass ID2 via EBF auch die Regulation von PAX5 beeinflusst. PAX5 spielt bei der Differenzierung eine duale Rolle, denn es aktiviert nicht nur B-Zell-spezifische Gene, sondern es unterdrückt auch die Gene anderer Linien. Demnach könnte ID2 auch an der Expression der nicht-B-Zell-spezifischen Gene im HL beteiligt sein. Darüber hinaus ist ID2 im HL durch die E2A-Inaktivierung via EBF auch möglicherweise an der schwächeren Expression des PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen beteiligt. Obwohl das ID2-Protein in den HL-Zelllinien durch RNA-Interferenz erfolgreich reduziert werden konnte, zeigte sich allerdings weder eine Änderung der Proteinexpression der B-Zell-spezifischen Gene CD19 und CD79A noch der Gene anderer hämatopoetischer Linien GATA-3 und M-CSF-R. Unabhängig von seiner möglichen Beteiligung an der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL, spielt ID2 vermutlich auch eine weitere Rolle in der Pathogenese des HL. Verschiedene Interaktionen weisen darauf hin, dass ID2 auch an der Regulation des Zellzyklus beteiligt ist. Zum einen konnte in dieser Arbeit die Interaktion des ID2 mit dem HLH-Protein HEF1 zumindest in einer der HL-Zelllinien gezeigt werden. HEF1 ist ein Aktivator der Aurora Kinase 1, welche nach Aktivierung Gene phosphoryliert, die den Ablauf der Mitose begünstigen. Zum anderen konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 in HL-Zelllinien durch RNAi-vermittelte Reduktion des ID2-Proteins als ID2-Target-Gen identifiziert werden. Auch wenn die Interaktion mit RB, dem zur Familie der Pocket-Proteine gehörenden Schlüsselregulator des Zellzyklusverlaufs, in HL-Zelllinien nicht nachgewiesen werden konnte, zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die aberrante ID2-Expression offenbar an der Veränderung des Zellzyklus im HL beteiligt ist. Sie lassen jedoch noch keinen endgültigen Schluss zu. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, wird ID2 ebenfalls im analplastisch großzelligen T-Zell-Lymphom aberrant exprimiert. Auch eine Interaktion mit E2A, das auch in der T-Zell-Entwicklung eine Rolle spielt, konnte gezeigt werden. Nicht zuletzt scheint demnach ID2 auch in der Dedifferenzierung des ALCL ein wichtiger Faktor zu sein. ID2 wird im HL aberrant exprimiert und es konnte die Interaktion mit E2A in den HL-Zelllinien nachgewiesen werden, wodurch die transkriptionelle Aktivität des E2A vermutlich inhibiert wird. Auch wenn in Folge der RNAi-vermittelten Herunterregulation von ID2 in den HL-Linien weder eine Re-Expression B-Zell-spezifischer Gene noch eine Beeinflussung der Expression Marker andere hämatopoetischer Linien gefunden werden konnte, spielt ID2 vermutlich dennoch eine wichtige Rolle in der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL. Unabhängig davon konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 als ID2-Target-Gen identifiziert und eine Interaktion mit HEF1 gezeigt werden. Demnach ist ID2 möglicherweise nicht nur an der Dedifferenzierung, sondern auch an der Dysregulation des Zellzyklus im HL beteiligt und somit ein wichtiger Faktor in der Pathogenese des HL.
Die größte Gruppe der Krebserkrankungen bei Kindern sind die Leukämien. Die größte Untergruppe stellen dabei die Leukämien unter Beteiligung des MLL-Gens auf Chromosom 11q23 dar. Die bei MLL-Translokationen gefundenen Partnergene sind äußerst vielfältig. Der häufigste Partner ist jedoch das AF4-Gen auf Chromosom 4. Die bei der t(4;11)-Translokation entstehenden Fusionsproteine MLL-AF4 und AF4-MLL sind die Auslöser der Leukämie, wobei in unterschiedlichen Forschungsarbeiten beiden Fusionsproteinen eine Transformatorische Wirkung bescheinigt werden konnte. Das Wildtyp MLL-Protein liegt in der Zelle in einem Multiproteinkomplex vor, der durch seine Histon-Methyltransferase-Aktivität an Lysin 4 des Histon H3, zu einer offenen Chromatinstruktur führt und dadurch für die Transkriptionsinitiierung essentiell ist. Eine besondere Rolle kommt den MLL-Protein bei der Aufrechterhaltung von epigenetischen Signaturen beispielsweise bei der Embryogenese oder dem Durchlaufen des Zellzyklus zu. Im Gegensatz dazu nimmt der F4-Multiproteinkomplex eine wichtige Stellung in der Transkriptionselongation ein und ermöglicht der RNA-Polymerase II zusammen mit seinen Komplexpartnern die Elongation der mRNA. Die Taspase1 wurde als das Protein entdeckt, dass für die Prozessierung des MLL-Proteins verantwortlich ist und es an den Schnittstellen CS1 bzw. CS2 proteolytisch spaltet. Die hierbei entstehenden Fragmente N320 und C180 können daraufhin dimerisieren und werden gegenüber einem proteasomalen Abbau stabilisiert. Diese Taspase1-Schnittstellen sind auch in dem Fusionsprotein AF4-MLL enthalten und ermöglichen die Stabilisierung des AF4-MLLs nach proteolytischer Spaltung gegenüber seinem proteasomalen Abbau. Die Taspase1 ist eine Threonin-Aspartase aus der Familie der Typ-2 Asparaginasen zu deren weiteren Vertretern die L-Asparaginase sowie die Glycosylasparaginase zählen. Als einziger Vertreter dieser Gruppe ist die Taspase1 jedoch eine Protease. Gemein ist allen Vertretern der Familie, die autoproteolytische Aktivierung des exprimierten Proenzyms hin zu einer katalytisch aktiven Form. Im Falle der Taspase1 kommt es dabei zu einer Spaltung in die als Heterodimer vorliegenden α- und β-Untereinheiten. Das katalytische Nukleophil der aktiven Taspase1 ist dabei das N-terminale Thr234 der β-Untereinheit. Neben ihrer Rolle als Protease des AF4-MLLs und der damit verbundenen Stabilisierung des Onkogens, wird der Taspase1 auch bei den soliden Tumoren eine Rolle als für die Transformation wichtiges Protein zugewiesen, was sich in ihrer häufigen Überexpression in verschiedenen Tumorarten widerspiegelt. Die Taspase1 ist demnach ein interessantes Ziel für die Wirkstoffentwicklung. Hierfür ist die Generierung eines quantitativen Aktivitätstest besonders wichtig und war Ziel dieser Arbeit. Der entwickelte Aktivitätstest basiert auf einem Reporter bestehend aus den beiden Fluoreszenzproteinen TagBFP sowie TagGFP2, die über eine Taspase1 Schnittstelle verbunden wurden. Dieses FRET-Paar lässt dabei die kontinuierliche Beobachtung der Reaktion zu und ermöglicht eine Auswertung der kinetischen Parameter der Reaktion. Von den beiden FRET-Reportern mit den unterschiedlichen Schnittstellen CS1 und CS2,konnte nur der mit der CS2 Schnittstelle exprimiert werden. Dieser Reporter konnte dann für die Validierung des Aktivitätstests eingesetzt werden und ließ die Bestimmung der kinetischen Parameter der Taspase1 für diese Reaktion zu. Die erhaltenen Parameter bewegen sich in einer ähnlichen Größenordnung wie schon publizierte kinetische Parameter eines Peptid-basierten Aktivitätstests. Ausgehend hiervon wurden die dnTaspase, eine dominant negative Taspase1-Mutante, kinetisch untersucht und ihre Inhibition der Taspase1-Aktivität beschrieben. Der Aktivitätstest ließ die Bestätigung der Konzentrationsabhängigen Inhibition der Taspase1-Aktivität durch die dnTaspase zu. Diese Beobachtung konnte auch in einer Zell-basierten Variante des Aktivitätstests bestätigt werden und zeigte sich ferner auch in einer Wachstumsverlangsamenden Wirkung der dnTaspase in der t(4;11)-Zelllinie SEM, wobei dieser Effekt nicht auf einer Zunahme der Apoptose der Zellen zurückzuführen war. Desweiteren wurde der Aktivitätstest benutzt, um eine Reihe von gegen das aktive Zentrum der Taspase1 gerichtete Substanzen auf ihre inhibitorische Wirksamkeit zu untersuchen.Hierbei gelang es einen Kandidat als Leitsubstanz zu identifizieren, der eine konzentrationsabhängige Inhibition der Taspase1 zeigte. Eine Bindung dieser Substanz an die Taspase1 konnte jedoch durch einen Thermal Shift Assay nicht nachgewiesen werden und ein Einfluss auf die Viabilität von proB-ALL Zelllinien konnte nicht beobachtet werden.
Nukleäre Rezeptoren regulieren eine Vielzahl von Genen durch Bindung an bestimmte DNA-Sequenzen im Promotor dieser Gene. Sie fungieren als Transkriptionsfaktoren, die nach Bindung ihres Ligandendie Transkription aktivieren oder supprimieren. In ihrer Funktion werden sie weiterhin durch verschiedene Signale moduliert, beispielsweise durch posttranslationale Veränderungen. Aufgrund der Möglichkeit, durch Liganden, in der Regel kleine lipophile Moleküle, die Aktivität nukleärer Rezeptoren und in der Folge die Transkription definierter Gene zu beeinflussen, sind nukleäre Rezeptoren gute Zielstrukturen für Arzneistoffe und stehen im Zentrum intensiver Forschungsbemühungen. ROR alpha und RevErb alpha sind nukleäre Rezeptoren aus der Gruppe der sogenannten Orphan-Rezeptoren. Die Angehörigen dieser Gruppe wurden als Waisen bezeichnet, da ihr Ligand zum Zeitpunkt ihrer Charakterisierung unbekannt war. 2007 gelang es zwei Gruppen unabhängig voneinander Häm als den Liganden des RevErb alpha zu identifizieren, für ROR alpha werden verschiedene potentielle Liganden diskutiert, wobei bisher keiner allgemein anerkannt wurde. ROR alpha und RevErb alpha steuern die Expression ihrer Zielgene über ein gemeinsames Response-Element, wobei ROR alpha die Expression dieser Gene aktiviert und RevErb alpha sie inhibiert. Gemeinsam nehmen sie eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung zirkadianer Rhythmen und an der Integration dieser in metabolische Prozesse ein. ROR alpha ist weiterhin beteiligt an der Reifung der Cerebellums sowie an der Steuerung der Immunabwehr. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation der beiden Rezeptoren auf molekularer Ebene aufzuklären. Hierfür wurden Untersuchungen auf Ebene der Transkription ebenso wie auf posttranslationaler Ebene durchgeführt. Es zeigte sich, dass ROR alpha - hnRNA in vitro extrem stabile Sekundärstrukturen ausbildet und somit bei der reversen Transkription den Transkriptionsstart selbst initiieren kann. Im Zuge der durchgeführten Untersuchungen konnte nicht nachgewiesen werden, welche Auswirkung diese Sekundärstrukturen in vivo zeigen. Studien anderer Gruppen hatten aber gezeigt, dass die Ausbildung von RNA-Doppelsträngen an vielen Stellen in die Regulationen von Genen eingreift, sei es durch Veränderungen des Spleißmusters, RNA-Editierung oder durch Herabregulierung der Transkriptmenge. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sowohl RevErb alpha als auch ROR alpha einer intensiven Regulation durch posttranslationale Veränderungen unterliegen, im Speziellen durch Phosphorylierung. Vorangegangene Studien hatten Hinweisegeliefert, dass ROR alpha durch ERK-2 phosphoryliert werden kann. In meinen Studien war ich in der Lage nachzuweisen, dass auch RevErb alpha Ziel dieser Kinase ist. Im Gegensatz zu ROR alpha wird RevErb alpha jedoch gleichzeitig an mehreren Stellen phosphoryliert, wobei die physiologische Funktion dieser Phosphorylierungen Gegenstand weiterer Untersuchungen ist. Die Aktivität von ROR alpha am Response-Element wird durch eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels stark stimuliert. Im Zuge meiner Untersuchungen konnte eine Beteiligung sowohl des cAMP-Response-Elementbindenden Proteins CREBals auch des PPAR gamma - Coaktivators 1a an der Vermittlung dieser Aktivitätssteigerung ausgeschlossen werden. Es zeigte sich jedoch, dass der Effekt durch eine Hemmung der Proteinkinase A dosisabhängig aufgehoben werden konnte. In weiteren Untersuchen konnte ich eine direkte Phosphorylierung von ROR alpha, nicht aber von RevErb alpha durch PKA nachweisen und die Phosphorylierungsstelle als Serin 99 des ROR alpha 4 identifizieren. Da eine Mutation der in der C-terminalen Verlängerung der DNA-bindenden Domäne des Rezeptors gelegenen Aminosäure jedoch nicht in der Lage war, die Aktivitätssteigerung zu verhindern, sind auch noch weitere Faktoren, vermutlich zelluläre Coaktivatoren an deren Vermittlung beteiligt. Bereits in früheren Untersuchungen war beschrieben worden, dass die Aktivität von ROR alpha durch eine Erhöhung des intrazellulären Calciumspiegels stark stimuliert wird. Weiterhin fanden sich Hinweise, dass die Calcium/-Calmodulin-abhängige Kinase IV an der Vermittlung dieser Stimulation beteiligt ist, jedoch ohne direkte Phosphorylierung von ROR alpha durch CaMKIV. Es konnte allerdings nicht aufgeklärt werden, über welchen Mechanismus die Signaltransduktion stattdessen erfolgt. In meinen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass eine Inhibition durch Proteinkinase A aktivierter Signalwege auch die Aktivierung von ROR alpha durch CaMKIV dosisabhängig hemmte. Zusammengenommen lieferten meine Untersuchungen weitere Hinweise auf eine wichtige Rolle von ROR alpha in der Regulation metabolischer Prozesse wie des Glycogen- und Lipidstoffwechsels. Außerdem deuten meine Ergebnisse auf eine Verknüpfung der Signalwege von CaMKIV und Proteinkinase A hin und etablieren ROR alpha als gemeinsame Zielstruktur