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Für viele pädiatrische Patienten mit Leukämie ist die Durchführung einer Hoch-Dosis- Chemotherapie mit anschließender Stammzelltransplantation oft die einzige Möglichkeit die Heilungsrate zu verbessern. Die Eliminierung der residualen leukämischen Blasten basiert einerseits auf der Konditionierung mit hoch-aggressiver Chemotherapie. Andererseits ist sie auf immunologische Reaktionen zwischen immunkompetenten Zellen, die entweder in dem Transplantat enthalten sind, oder aus diesem neu entstehen und den verbliebenen leukämischen Blasten zurückzuführen. Diese immunologische Interaktion wird auch als Graftversus- Leukämie-Reaktion (GVL) bezeichnet und hauptsächlich von T-und NK-Zellen vermittelt. Trotz zunächst erfolgreicher allogener Transplantation erleidet ein beträchtlicher Anteil der Patienten ein Rezidiv. Während ein offenes Rezidiv oft nicht mehr behandelbar ist, können Patienten mit drohendem Rezidiv oder minimaler Resterkrankung (MRD) durch Infusion immunkompetenter Zellen des Spenders, sogenannte Donor-Lymphozyten-Infusionen (DLI), teilweise erfolgreich behandelt werden. Die Behandlung mit DLI ist limitiert durch die Graft-versus-host-disease (GVHD), eine mit zum Teil schweren Komplikationen verbundene Reaktion, die potentiell tödlich verlaufen kann. Die gentechnische Veränderung der alloreaktiven Zellen mit einem Suizidgen ermöglicht eine kontrollierte, spezifische Eliminierung dieser Zellen im Falle einer GVHD Entwicklung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene retrovirale Selektions/Suizid- Fusionsvektoren für die Transduktion von Spender T-Zellen im Kontext einer DLI entwickelt. Beide Selektions/Suizid-Fusionselemente wurden in einem für die Transduktion in T-Zellen optimierten retroviralen Vektor generiert. Die Selektionsmarker waren so gewählt, dass eine Anreicherung der Transgen-positiven Zellen über eine immunomagnetische Selektion möglich war. Ein Vektor kodierte für ein Fusionsmolekül aus dem zytoplasmatisch trunkierten humanen CD34-Oberflächenmarker (tCD34) und der Zellzyklus-abhängigen GCV-hypersensitiven HSVtk39 (Herpes-simplex Virus I Thymidin Kinase) Mutante. Durch GCV-Applikation konnte in den transduzierten, tCD34/HSV-tk39 exprimierenden Zellen spezifisch die Apoptose induziert werden. Der zweite Vektor wurde so konstruiert, dass ein Fusionsprotein aus dem humanen DLNGFR-Oberflächenmarker und der Zellzyklus-unabhängigen death-effector-domain (DED) des humanen FADD (Fas-associated-protein with death domain) Moleküls entstand. Über zwei zwischengeschaltete FKBP (FK506-binding protein) Domänen wurden die beiden Elemente miteinander fusioniert. In DLNGFR/Fv'Fv/DED-exprimierenden Zellen konnte die Apoptose durch die Applikation eines spezifisch an die beiden FKBP-Domänen bindenden synthetischen Substrats (AP20187), das die Dimerisierung des DED-Moleküls induzierte, ausgelöst werden. Durchflusszytometrische Analysen von transduzierten und selektierten humanen primären TZellen zeigten, dass beide Fusions-Transgene korrekt in den Zielzellen exprimiert wurden. Die spezifische Induktion der Apoptose durch Aktivierung des jeweiligen Suizidmoleküls wurde in Funktionalitätstestungen nachgewiesen. Beide Fusionsmoleküle vermittelten eine effiziente Eliminierung der transduzierten Zellen (90 %-98 %). In vergleichenden Analysen wurde gezeigt, dass die beiden Suizidmechanismen einer unterschiedlichen Kinetik unterlagen. Während die DED-induzierte Apoptose sehr schnell auf die Applikation des Suizidaktivators folgte, vermittelte der HSV-tk39 Mechanismus eine deutlich langsamere aber etwas effizientere Eliminierung der Zellen. Erste Untersuchungen einer Kombination beider Fusionsmoleküle deuten auf einen additiven/synergistischen Effekt hin, der zu einer schnellen und effizienten Eliminierung der Zellen führt (>=99 %). Zur Zeit stellt die Strategie der Suizidgen-transduzierten T-Zellen die am vielversprechendste Methode zur Kontrolle einer GVHD-Reaktion dar. Die hier entwickelten Vektoren ermöglichen eine effiziente, kontrollierte Eliminierung der Zellen und bieten Potential zur Weiterentwicklung einer optimierten Strategie.
Platelets are anucleate cells that play a major role in hemostasis and thrombosis in the vasculature. During primary hemostasis platelets adhere to sites of vascular damage and the initial platelet coat is reinforced by additional platelets forming a stable aggregate. At the same time platelets secrete their intracellular granules containing substances that further activate platelets in an autocrine and paracrine fashion and affect local coagulation and endothelial smooth muscle cell function. The small guanine nucleotide binding protein Rap1 regulates the activity of the platelet integrin alphaIIbbeta3 and thus platelet aggregation. Rap1 activity is controlled by guanine nucleotide exchange factors and GTPase activating proteins. In platelets, Rap1GAP2 is the only GTPase activating protein of Rap1. In order to identify Rap1GAP2-associated proteins, a genetic two-hybrid screening in yeast was performed and synaptotagmin-like protein 1 (Slp1, also called JFC1) was found as a new putative binding partner of Rap1GAP2. Slp1 is a tandem C2 domain containing protein and is known to bind to Rab27, a small GTPase involved in platelet dense granule secretion. The direct interaction between Rap1GAP2 and Slp1 was confirmed in yeast and in transfected cells. More importantly, Slp1 is expressed in platelets and binding of endogenous Rap1GAP2 and Slp1 was verified in these cells. The Rap1GAP2 and Slp1 interaction sites were mapped by mutational analysis. Rap1GAP2 binds through the -TKXT- motif within its C-terminus to the C2A domain of Slp1. Moreover, the Slp1 binding -TKXT- motif of Rap1GAP2 was confirmed by complementary approaches using short synthetic Rap1GAP2 peptides. The C2A domain of Slp1 is a phospholipid binding domain and thus mediates binding of Slp1 to the plasma membrane. Phospholipid overlay assays revealed that simultaneous binding of Slp1 via its C2A domain to Rap1GAP2 and to phospholipids can occur. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is regulated by cAMP-dependent protein kinase (cAK or PKA), and kinase activation in platelets enhanced binding of endogenous Rap1GAP2 to Slp1. In-vitro phosphorylation assays revealed that Slp1 is a substrate of PKA, and serine 111 was identified as phosphorylation site. Since Slp1 is a Rab27 binding protein, a trimeric complex of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 is conceivable. The association of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 was investigated by immunofluorescence and co-immuno-precipitation experiments in both, transfected cells and platelets. By Slp1 affinity chromatography and subsequent mass spectrometric analysis additional Slp1 binding proteins were identified in platelets, and binding of Slp1 to Rab8 was confirmed in pull-down assays. To investigate the functional significance of the interaction between Rap1GAP2 and Slp1, an assay system was established to determine serotonin secretion of streptolysin-O permeabilized platelets. Addition of recombinant Slp1 protein to permeabilized platelets strongly inhibited platelet dense granule secretion, whereas addition of recombinant Rap1GAP2 protein or synthetic Rap1GAP2 peptide enhanced secretion. Deleting the Slp1 binding -TKXT- motif abolished the stimulatory effect of Rap1GAP2 on secretion. Addition of Rap1 to permeabilized platelets had no effect on secretion. These findings indicate that the Rap1GAP2 effect on platelet secretion does not depend on the GTPase activating function of Rap1GAP2, but is rather dependent on the -TKXT- mediated interaction of Rap1GAP2 with Slp1. In addition, in-vitro GAP assays revealed that Slp1 binding to Rap1GAP2 does not affect the Rap1GAP activity of Rap1GAP2, and adhesion assays excluded a role for the Rap1GAP2/Slp1 interaction in cell adhesion. Altogether, the results of the present study demonstrate that besides its function in platelet aggregation by controlling the activity of the small guanine nucleotide binding protein Rap1, Rap1GAP2 is involved in platelet dense granule secretion by the new -TKXT- mediated interaction with the Rab27 and membrane binding protein Slp1. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is embedded into an elaborate network of protein-protein interactions in platelets which appear to be regulated by phosphorylation. Future studies will in particular aim to dissect the molecular details of Rap1GAP2 and Slp1 action in platelet secretion and investigate the potential biochemical and pharmacological value of the unique protein binding -TKXT- motif of Rap1GAP2.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien assoziiert und gelten in den meisten Fällen als Erkrankungsursache. Das MLL-Gen auf der Chromosomenbande q23 des Chromosoms 11 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt, und die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusionsgene sind ausschließlich mit Hochrisikoleukämien assoziiert. Die häufigste Aberration ist eine reziproke Translokation zwischen den beiden Genen MLL und AF4 (4q21), die t(4;11)-Translokation, die in ca. 80% aller Akuten Lymphatischen Leukämien bei Kleinkindern, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie, auftritt. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapien resistent, so dass t(4;11) Leukämien mit einer ungewöhnlich schlechten Prognose verbunden sind. Welches der beiden Fusionsproteine, MLL-AF4 oder AF4-MLL, die bei der t(4;11)-Translokation entstehen für die Entstehung der Leukämie verantwortlich ist, wird noch kontrovers diskutiert. Bisherige Publikationen zeigen die Onkogenität beider Fusionsproteine, und ihr Potential, Leukämien im Mausmodell hervorzurufen. Frühere Studien dieser Arbeitsgruppe zeigen die onkogene Wirkung des AF4-MLL Fusionsproteins, dessen Expression zur Wachstumstransformation von murinen Zellen und einer Akuten Lymphatischen Leukämie in der Maus führt. Die onkogene Wirkung von AF4-MLL entsteht, sobald das Fusionsprotein nach seiner Prozessierung durch die Endopeptidase Taspase1 heterodimerisiert und dadurch vor SIAH-vermitteltem proteasomalen Abbau geschützt wird. So kann sich das heterodimerisierte Protein - anders als das AF4-Wildtyp Protein - in den Zellen anhäufen und zu unkontrolliertem Wachstum führen. Um die Heterodimerisierung des AF4-MLL Fusionsproteins kompetitiv zu inhibieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit kleine Fragmente aus der C-terminalen Interaktionsdomäne FYRC von MLL exprimiert. Dazu wurde die Interaktion kleiner Peptide aus der FYRC-Domäne mit dem N-terminalen Fragment des AF4-MLL Proteins mithilfe eines Biosensorsystems und Co-Immunopräzipitationen getestet. Anschließend wurden die kleinsten Peptide, die noch an das N-terminale Fragment binden können (B1 und B3), ausgewählt, und zusammen mit AF4-MLL co-exprimiert. Mithilfe von Western Blot-Analysen von gereinigtem AF4-MLL·N konnte gezeigt werden, dass die Expression dieser Peptide dazu führt, dass das C-terminale Fragment nicht mehr an das N-terminale Fragment binden kann. Durch diese Inhibition der Heterodimerisierung kann der AF4-MLL Multiproteinkomplex nicht vollständig aufgebaut werden, da auch die C-terminalen Komplexpartner WDR5 und RBBP5 nur noch eingeschränkt binden können. Zusätzlich wurde die Stabilität der prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C im Falle einer Inhibition der Dimerisierung untersucht. Offensichtlich sind beide Fragmente nur stabil, wenn sie miteinander heterodimerisiert sind. Eine Blockierung der Interaktion durch kompetitive Peptide führt dazu, dass sowohl AF4-MLL·N als auch MLL·C proteasomal degradiert werden. Da auch das MLL-Wildtyp Protein über die Interaktionsdomänen FYRN und FYRC heterodimerisiert, wurde zusätzlich der Effekt der Expression der Peptide auf die Viabilität von MLL-exprimierenden Zellen untersucht. Dazu wurden die Peptide B1 und B3 in sechs unterschiedlichen Zelllinen, von denen zwei die t(4;11)-Translokation tragen, exprimiert. Anschließend wurde nach einer PI-Färbung der Anteil apoptotischer Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers ermittelt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass keines der beiden Peptide einen starken Einfluss auf Zelllinien hat, die das Wildtyp-MLL Gen besitzen. Die Apoptose der vier untersuchten Zelllinien war kaum erhöht, wenn diese Peptide exprimiert wurden. Interessanterweise scheint das Peptid B1 dagegen einen Apoptosefördernden Effekt auf diejenigen Zellen zu haben, die das AF4-MLL Protein exprimieren. Basierend auf den vorliegenden Daten kann die Aussage getroffen werden, dass es prinzipiell möglich ist, das AF4-MLL Fusionsprotein spezifisch anzugreifen. Eine Blockierung der Heterodimerisierung blockiert die Ausbildung des onkogenen AF4-MLL Multiproteinkomplexes. Dies führt zudem dazu, dass die beiden Taspase1-prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C proteasomal degradiert werden. Die Inhibition der Heterodimerisierung von AF4-MLL ist mit einer leicht erhöhten Apoptoserate in t(4;11)-positiven Zellen verbunden. Diese Beobachtung könnte in Zukunft von Bedeutung sein, wenn über neue Therapieansätze bei t(4;11) Leukämien nachgedacht werden sollte.
In den letzten Jahren gewann die Photodynamische Therapie deutlich an Bedeutung bei der Behandlung von Neoplasien. Für die nächsten Jahren werden weitere Zulassungen für neue Indikationen erwartet. Diese Neuzulassungen werden einerseits durch neue Photosensibilisatoren und andererseits durch neue Ansätze beim Drug Targeting ermöglicht. Zur Zeit wird der Ansatz forciert, die Sensibilisatoren an einen tumorspezifischen Antikörper zu knüpfen. Eine weitere Möglichkeit für das Drug Targeting besteht darin, den Photosensibilisator an tumorspezifische Rezeptorliganden zu binden. In der vorliegenden Dissertation wird der Versuch einer Kopplung eines Photosensibilisators über einen Spacer an ein nicht steroidales Antiprogestin erarbeitet. Der Progesteron-Rezeptor wurde als Target ausgewählt, da zahlreiche Tumorarten, wie beispielsweise das Mammakarzinom, den Progesteron-Rezeptor überexprimieren. Als Leitstruktur für die Synthese der Antiprogestine wurde ein mariner Naturstoff ausgewählt. Das Cyclocymopol-Derivat besitzt den Vorteil einer im Vergleich zu Mifepriston verbesserten Selektivität für den Progesteron-Rezeptor und eines einfacheren synthetischen Zugangs. Für die Erstellung einer Bibliothek von Progesteron-Antagonisten, die auf den Cyclocymopol-Derivaten aufbauen, sind hinsichtlich der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zwei Merkmale zu beachten. Der aromatische Ring muss eine elektronenziehende Gruppe, der aliphatische Ring eine exocyclische Methylengruppe aufweisen, da diese Gruppen essentiell für die Rezeptorbindung sind. Bei der Synthese des Progesteron-Antagonisten wird zunächst ein Benzaldehyd-Derivat mit dem gewünschten Spacer verknüpft, der in der Folge mit dem Phototherapeutikum verknüpft werden kann. Im nächsten Schritt wird die Aldehydfunktion mit Natriumborhydrid zur Alkoholfunktion reduziert. Die so erhaltenen Alkohole werden anschließend mit Hilfe einer Appelartigen Reaktion in das Bromid überführt. Die Benzylbromide wurden mit Isophoron und Buthyllithium zu dem Naturstoff-Analoga umgesetzt. Durch Variieren der Reaktionsbedingungen konnten die aus der Literatur bekannten Ausbeuten erhöht werden. Für die Einführung der exocyclischen Methylengruppe in die Naturstoff-Derivate mussten zunächst verschiedene Synthesenmethoden untersucht werden. In der Literatur wurde für diesen Synthesewege bisher das Tebbe Reagenz eingesetzt, welches bei den hier eingesetzten Edukten zu keiner Reaktion führte. Es kann vermutet werden, dass die sterische Hinderung durch den Spacer die Umsetzung blockiert. In weiteren Experimenten wurde versucht, über eine Simmons-Smith-ähnliche Reaktion die gewünschte Funktionalität zu erhalten. Da auch bei dieser Reaktion das gewünschte Produkt nicht erhalten werden konnte, wurde in weiteren Ansätzen die Peterson-Olefinierung ausgewählt. Mit dieser Methode gelang es schließlich, geringe Mengen des gewünschten Produktes herzustellen. Als Nebenreaktion kam es dabei jedoch zu einer Methylierung des aromatischen Rings. Durch Anwendung der Horner-Emmons-Reaktion konnte schließlich das Antiproestin in ausreichender Menge und Reinheit erhalten werden. Es war jedoch nicht möglich, das in Abb. 7 erläuterte Zielmolekül aus dem Photosensibilisator, Spacer und Antiprogestin darzustellen.
Die Hyperhomocysteinämie wird als unabhängiger Risikofaktor atherosklerotischer Gefäßerkrankungen angesehen. Viele Studien haben eine deutliche Korrelation zwischen Hyperhomocysteinämie, koronarer Herzkrankheit, cerebrovaskulären und peripheren thromboembolischen Erkrankungen aufgezeigt. Aus diesem Grund hat natürlich die Homocysteinbestimmung in die diagnostischen Maßnahmen, die bei Verdacht auf Arteriosklerose durchgeführt werden, Eingang gefunden. Mit der Zielsetzung, ein zuverlässiges und standardisiertes Verfahren für die Routinediagnostik bereitzustellen, wurde im Rahmen dieser Dissertation eine quantitative HPLC-Methode zur Bestimmung von Homocystein im Blut etabliert. Weiterhin erfolgte auch eine Homocysteinbestimmung mit dem ELISA und im Anschluß daran ein Methodenvergleich zwischen HPLC und ELISA. Der Methodenvergleich ergab, daß die ELISA-Homocysteinwerte immer um etwa 4,77% niedriger lagen als die HPLC-Homocysteinwerte. Dies bestätigte auch die Literatur. Die wichtigste Aufgabenstellung dieser Doktorarbeit war allerdings die Suche nach einer neuen genetischen Mutation auf dem MTHFR-Gen mittels Probenscreening von Patienten mit Hyperhomocysteinämien. Die katalytische Domäne der MTHFR liegt im N-terminalen Bereich des Proteins. Dieser Bereich entspricht Exon 1 bis Exon 6 des MTHFR-Gens. Folglich wurde für diese Exonbereiche 1,2,3,4,5 und 6 das Mutationsscreening etabliert. Dieses ließ sich mit der Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE) erfolgreich durchführen, wobei für jeden Exonbereich 300 Proben aus der Luric-Studie durchgemessen worden sind. LURIC steht für LUdwigshafener RIsikofaktor- und Cardiovaskuläre Gesundheits-Studie. Das Ziel dieser Untersuchungen ist das Erkennen neuer Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere die zum Herzinfarkt führen. Für alle Probenwerte erhielten wir Angaben über Geschlecht, Geburtsdatum, Größe, Gewicht, KHK-Status, Hypertonie, Diabetes mellitus, Homocystein, Vitamin B6, Vitamin B12 und Folsäure. Nach eingehender Betrachtung ließen sich nun drei Kollektive mit unterschiedlichen Homocystein-/ Folsäurewerten ermitteln, welche dann durchgescreent wurden: Das erste Kollektiv erfaßt Homocysteinwerte, welche größer als 16µmol/l sind und zwar unabhängig von den Folsäurewerten. Das zweite Kollektiv enthält Homocysteinwerte, welche größer als 10µmol/l sind und Folsäurewerte, welche ebenfalls größer als 10 µmol/l sind. Das dritte Kollektiv ist das größte und enthält die übrigen Werte, welche negativ auf schon bekannte Mutationen auf Exon 4 und Exon 7 sind. Dieses Kollektiv wurde hier zunächst betrachtet und enthält etwa für jeden Exonbereich 200 Proben. Bei jeder Art von Korrelationsuntersuchungen in den einzelnen Kollektiven (1. Kollekiv, 2. Kollektiv, 3. Kollektiv, homozygotes Kollektiv, heterozygotes Kollektiv und Referenzkollektiv) konnte zwischen Homocystein und Folsäure, zwischen Homocystein und Vitamin B12, zwischen Homocystein und Vitamin B6 und Homocystein und dem Alter keine Korrelation festgestellt werden. Die Korrelationen lagen alle unter -0,5 und 0,3. Einen negativen Korrelationskoeffizienten weisen die Parameter Homocystein/Folsäure, Homocystein/Vitamin B12 und Homocystein/Vitamin B6 auf. Einen positiven Korrelationskoeffizienten weisen Homocystein und das Alter auf. Bei den Signifikanzuntersuchungen ergab sich, daß fast alle Mittelwerte der einzelnen Kollektive signifikant unterschiedlich sind. Die Mittelwerte aller Kollektive von Folsäure/Homocystein, Vitamin B12/Homocystein und das Alter/Homocystein sind signifikant unterschiedlich Nur bei dem Vergleich Vitamin B6/Homocystein ist bei den meisten Kollektiven keine Signifikanz festgestellt worden. D. h. diese Mittelwerte sind annähernd gleich, sie sind nicht bedeutend unterschiedlich. Nur das 1. Kollektiv und das homozygote Kollektiv sind bei dem Vergleich der Mittelwerte Vitamin B6/Homocystein signifikant unterschiedlich. Mit Hilfe der TGGE und anschließender Sequenzierung konnten drei verschiedene Mutationen identifiziert werden: Auf Exon 4 ließ sich eine bekannte Mutation und zwar die (C-677-T) mit dem Basenaustausch Alanin gegen Valin an Patient 540 und Patient 786 feststellen. Dies ließ sich auch durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym Hinfl bestätigen. Auf Exon 6 konnte eine stille Mutation mit dem Basenaustausch (T-1068-C) an zwei Patienten (762 und 624) identifiziert werden. Die Aminosäure Serin bleibt hierbei erhalten (AGT-AGC). Auf Exon 5 ließ sich eine interessante Mutation erkennen, welche weitere Messungen wie Enzymaktivität und Familienanamnesen erfordert. Am Patient 569 entsteht hier durch einen Basenaustausch (C-844-T) aus der Aminosäure Glutamin (CAG) ein Stopcodon (TAG). Dies ließ sich weiterhin durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym Mae III bestätigen. Erhöhte Homocysteinspiegel und reduzierte MTHFR-Aktivitäten erklären ebenfalls das Mutationsergebnis. Auch die Familienanamnese ergab eine interessante Entdeckung. Die gleiche Mutation (C-844-T) vom Patienten 569 ließ sich auch bei seinem Bruder feststellen. Damit wurde die Mutation vererbt und ereignete sich nicht spontan.
Die Protoonkogene Ras und Raf spielen eine wichtige Rolle bei der Übertragung eines extrazellulären Signals in den Zellkern. Die direkte Interaktion zwischen GTP-gebundenem, aktiviertem Ras und der Proteinkinase Raf führt zur Aktivierung der Ras/Raf/MEK/ERK-Kaskade, die eine entscheidende, regulatorische Rolle bei onkogenen, mitogenen und entwicklungsabhängigen Signalwegen besitzt. Die Beeinflussung der Kaskade stellt daher einen interessanten Ansatz für die Arzneistoffentwicklung dar. Trotz der bekannten Proteinstrukturen von Ras und Raf sind bisher nur wenige Stoffe gefunden worden, die die Interaktion direkt beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher ein Testsystem auf der Basis des Hefe-Zwei-Hybrid-System etabliert, mit dessen Hilfe Effektoren der Ras/Raf-Wechselwirkung schnell und einfach identifiziert werden können. Das erste Ziel der Arbeit war die Etablierung einer Testmethode in 96-well-Microtiterplatten, die einen schnellen Durchsatz verschiedener Proben erlaubt. Insgesamt wurden in der vorliegenden Arbeit 469 Reinsubstanzen und Pflanzenextrakte in verschiedenen Konzentrationen getestet. Durch die Verwendung geeigneter Kontroll-Hefestämme konnte außerdem eine Aussage über die Spezifität der Substanzinteraktion getroffen werden. Bei einigen Ras/Raf-aktivierenden Substanzen konnten über die Testung systematischer Substanzreihen Struktur-Wirkungsbeziehungen aufgestellt werden. Cycloalkylidencarbonsäuren wurden als erste potente Ras/Raf-Aktivatoren identifiziert, deren wahrscheinlicher Interaktionsbereich durch die Expression verkürzter Raf-Mutanten auf den Bereich von AS 131-194 von Raf eingeschränkt werden konnte. Sie stabilisieren nicht nur die Bindung von mutiertem, sondern auch von Wildtyp-Ras an Raf. In einem zweiten, unabhängigen Säugerzell-Testsystem, das auf der Aktivierung der Ras/Raf/MEK/ERK-Kaskade und dem anschließendem Nachweis des phosphorylierten MEK-Proteins beruht, lieferten die aktiven Verbindungen erste Hinweise auf eine Aktivierung der Signalkaskade. Mögliche Optimierungen der beiden verwendeten Testsystem, sowie Alternativen, weitergehende Experimente und Einsatzgebiete von Ras/Raf-Effektoren werden abschließend diskutiert.
In dieser Arbeit wurde das Potential des rekombinant in E. coli hergestellten und unter Hochsalzbedingungen in-vitro assemblierten, murinen VP1-Kapsoids als Antisense-Oligonukleotid-Transfersystem in humane Brustkrebszellen untersucht. Die verwendeten Antisense-Oligonukleotide sind gegen den in 25-30 % aller Brustkrebsfälle überexprimierten Wachstumsfaktorrezeptor Pl85erbB-2 gerichtet, der zu einer verschlechterten Prognose in Bezug auf die Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit und das Wiederauftreten des Carcinoms führt. Die Charakterisierung der VP1-Kapsoide als Oligonukleotid-Transfersystem wurde zum einen in Bezug auf den Zelltransfer des Trägers und die mit ihm transportierten Antisense-Oligonukleotide durchgeführt. Zum anderen erfolgte die Überprüfung der resultierenden Antisense-Wirkung der Oligonukleotide sowohl in einem unspezifischen Proliferations- als auch in einem Antisense-Assay, das zwischen sequenzspezifischen und sequenzunspezifischen Oligonukleotid-Wirkungen differenzieren kann. Für die VP1-Kapsoide wurde in den untersuchten humanen Brustkrebszelllinien eine identische Lokalisierung detektiert wie sie für die murinen Targetzellen beschrieben ist. Es kommt zu einer cytosolischen Anreicherung mit perinukleären. vesikulären Strukturen ohne nachweisbare nukleäre Lokalisierung. Die durch VP1-Kapsoide transportierten Oligonukleotide dissoziieren intrazellulär in einem Zeitraum von 3 h nahezu vollständig vom Transfersystem und reichem sich cytosolisch und nukleär an. Zur Testung der biologischen Aktivität der Antisense-Oligonukleotide wurden liposomaltransportierte Oligonukleotide verwendet, da die Beladungsrate der VP1-Kapsoide unter Mediumbedingungen zu gering ist. Im Proliferationsassay wird die Oligonukleotid-Wirkung anhand der resultierenden Proteinreduktion charakterisiert. Die geringe Spezifität dieses Assays wurde durch die Einführung von einer Kontrollzelllinie und Kontroll-Oligonukleotid-Modifikationen verbessert. Die im Proliferationsassay mit Antisense-Oligonukleotiden detektierten Oligonukleotid-Wirkungen beweisen noch nicht, ob eine sequenzspezifische Antisense-Wirkung vorliegt. Deshalb wurde die Sequenzspezifität der verwendeten Antisense-Sequenzen zusätzlich im Antisense-Assay bestätigt. Die etablierten Testsysteme stellen alle Optionen zur umfassenden Charakterisierung eines innovativen Transfersystems zur Verfügung. Die Transfer-Assays untersuchen den verbesserten Zelltransfer des Trägers gegenüber freien Oligonukleotiden und alternativen Trägern. Das Proliferationsassay ermöglicht ein Vorscreening auf Antisense-Wirkungen und reduziert somit die Probenanzahl für das letztendlich notwendige Antisense-Assay.
Glutamat ist einer der wichtigsten erregenden Neurotransmitter im zentralen Nervensystem (ZNS), der unter anderem metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs) aktiviert. Die Signalübertragung der mGluRs erfolgt indirekt durch Aktivierung intrazellulär gekoppelter heterotrimerer G-Proteine, die daraufhin zelluläre Signalprozesse beeinflussen. Es sind acht verschiedene mGluRs bekannt, die in drei Gruppen gegliedert werden, welche sich in ihrer Lokalisation, ihrer Struktur und ihren pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden. Die hauptsächlich präsynaptisch lokalisierten Gruppe III mGluRs sind an der Regulation der Neurotransmission an exzitatorischen Synapsen beteiligt. Sie fungieren als Autorezeptoren, die rückkoppelnd die Glutamatausschüttung hemmen. Um eine möglichst exakte Übersetzung der extrazellulären Glutamatsignale durch mGluRs zu gewährleisten, muss die Signaltransduktion dieser Rezeptoren sehr genau kontrolliert und reguliert werden. Als Regulatoren der Signalübertragung verschiedener G-Protein gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) haben sich Vertreter der RGS-(Regulators of G protein Signalling)-Proteinfamilie erwiesen. RGS-Proteine können direkten Einfluss auf die Kinetik der Signalübermittlung eines GPCRs nehmen. RGS-Proteine beschleunigen mittels ihrer GAP (GTPase Accelerating Protein)-Funktion die GTP-Hydrolyse, wodurch die Geschwindigkeit der Inaktivierung der Ga-Untereinheit und somit der Signalantwort des GPCRs deutlich erhöht wird. Bis heute wurden mehr als 30 verschiedene RGS-Proteine beschrieben, die alle eine konservierte RGS-Domäne besitzen, die die Bindung an die Ga-Untereinheit des G-Proteins und die GAP-Aktivität vermittelt. Für einige GPCRs wurde bereits eine spezifische und selektive Interaktion sowie Regulation durch bestimmte RGS-Proteine gezeigt. An Gruppe III mGluRs gab es bisher keine einschlägigen Untersuchungen, außer am in der Retina exprimierten mGluR6, der jedoch einen Sonderfall innerhalb dieser Rezeptorgruppe darstellt. Deshalb sollte in dieser Dissertation untersucht werden, ob Gruppe III mGluRs, mit besonderem Augenmerk auf eine der zwei bekannten Spleißvarianten des mGluR7 (mGluR7a), durch ein oder auch mehrere Mitglieder der RGS-Familie reguliert werden können. Zwei Vertreter der RGS-Protein Familie, RGS3 und RGS4, die beide im Gehirn exprimiert werden, wurden als potentielle Kandidaten ausgewählt. Biochemische Interaktionsanalysen dieser Dissertation zeigten, dass sowohl RGS3 als auch RGS4 direkt an mGluR7a binden. Die Bindung zwischen mGluR7a und RGS3 bzw. RGS4 war in Abwesenheit von Ca2+ deutlich verstärkt. Da Calmodulin (CaM) in Anwesenheit von Ca2+ sowohl an mGluR7a als auch an RGS3 und RGS4 bindet, wurde postuliert, dass gebundenes Ca2+/CaM ein räumliches Hindernis für die Wechselwirkung zwischen Rezeptor und RGS-Protein darstellen könnte. Die Daten dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die Bindung von Ca2+/CaM an den C-Terminus des mGluR7a die Interaktion zwischen dem Rezeptor und RGS4 abschwächt. Ein physiologischer Effekt der beiden RGS-Proteine auf die mGluR7a-vermittelte Signalübermittlung wurde zunächst in transfizierten HEK-Zellen nachgewiesen. Hierzu wurde die Signalantwort des mGluR7a in An- und Abwesenheit von RGS3 oder RGS4 durch Bestimmung der Menge der sekundären Botenstoffe gemessen und verglichen. RGS3 sowie RGS4 beschleunigten in diesem System durch ihre GAP-Aktivität die GTP-Hydrolyse an der Ga-UE und damit die Inaktivierung der Signaltransduktion des Rezeptors. Mittels hochauflösender Elektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, dass RGS3 und RGS4 wie auch mGluR7a in vivo an der präsynaptischen Membran kortikaler Maus-Neuronen zu finden sind. Da die Proteine in den Nervenzellen kolokalisieren, sollte die Interaktion und Regulation, die in vitro nachgewiesen wurde, auch in vivo möglich sein. Ein in vivo-Nachweis des regulatorischen Effektes von RGS4 auf die Signaltransduktion der Gruppe III mGluRs bzw. des mGluR7a erfolgte durch Vergleich der Signalantworten dieser Rezeptoren in kultivierten kortikalen Neuronen aus Wildtyp- und RGS4-defizienten Mäusen. Mit dem Gruppe III mGluR-spezifischen Agonisten L-AP4 konnte im Vergleich zu den Wildtyp-Neuronen keine Antwort der mGluRs in den RGS4-defizienten Nervenzellen gemessen werden. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass die Signalübermittlung der Gruppe III mGluRs bzw. des mGluR7a ohne das RGS4-Protein nicht korrekt ablaufen kann. Zusammenfassend kann mit den Daten der vorliegenden Arbeit das bereits bestehende Modell eines mGluR7a-Signalkomplexes erweitert werden: Dabei bildet der Rezeptor bereits vor Stimulation durch einen Agonisten einen Komplex mit dem G-Protein und nachgeschalteten Effektoren, die durch den Rezeptor beeinflusst werden. Durch eine solche lokale Organisation funktionell zusammengehöriger Proteine, die die Initiation (wie das G-Protein) und Termination (wie die RGS-Proteine) der Signaltransduktion bewirken, wird eine schnelle und feinregulierte Signalübermittlung gewährleistet.
Cytochrome P450 epoxygenases of the 2C family (CYP2C) are highly expressed in the endothelium and metabolize arachidonic acid to different regioisomers of epoxyeicosatrienoic acids (EET). They have a number of roles in the regulation of vascular tone and homeostasis by activating different signal transduction pathways and have recently been reported to be involved in proliferation and angiogenesis. However, the exact mechanisms by which epoxygenases regulate angiogenesis are still unclear. Therefore, the initial aim of the present study was to characterize the relevance of major signalling molecules that are involved in angiogenesis and to investigate possible signalling pathways involved. Initially the effect of CYP2C9 overexpression on expression levels of EphB4, a tyrosine kinase that plays a role in a number of developmental processes, was investigated. EphB4 protein expression was increased in CYP2C9 overexpressing cells without any effects on expression levels of its ligand ephrinB2. To clarify whether EphB4 is a critical determinant of CYP2C9-induced angiogenesis, endothelial cell sprouting was assessed using a collagen gel-based in vitro angiogenesis assay. Following transfection with EphB4 antisense or scrambled oligonucleotides, capillary-like structures were clearly present after 24 hours in cells overexpressing CYP2C9, while EphB4 downregulation abolished CYP2C9-induced sprouting. In addition stimulation of human umbilical vein endothelial cells with VEGF resulted in an increase in CYP2C expression and a subsequent increase of 11,12-EET production; an effect that was abolished by the CYP epoxygenases inhibitor MSPPOH as well as when cells were infected with a dominant negative mutant of AMPK. In vivo 11,12-EET treatment increased EphB4 expression in mesenteric arteries as well as in Matrigel plugs; an effect that was abolished when plugs were impregnated at the same time with small interfering RNA (siRNA) for EphB4. Furthermore, impregnation of Matrigel plugs with VEGF resulted in endothelial cell and smooth muscle cell recruitment into a Matrigel plug and this effect was mediated by CYP2C9-derived EETs as it was prevented by 14,15-EEZE. When infiltration of EET impregnated plugs with endothelial cells and pericytes/smooth muscle cells in vivo was compared to the effects seen in VEGF treated plugs, it was apparent that only EET treatment resulted in the formation of tube like structures that were covered by smooth muscle cells. Therefore, the final aim of the study was to further define the consequences of EET signalling in vivo as well as to characterize its physiological relevance. This hypothesis could be assessed by isolectin injection through the tail-vein where isolectin was taken up only by the EET-impregnated plug. Moreover ultrasound measurements revealed accumulation of contrast agent in EET impregnated plugs compared to control plugs. Taken together our findings emphasize that CYP2C plays a crucial role in the vessel formation process by modulating the effects mediated by two important control elements of the angiogenic response, namely VEGF and EphB4. CYP2C-derived EETs not only participate as second messengers in the angiogenic response, but have the potential to influence much more than angiogenesis by enhancing smooth muscle cell/pericyte recruitment to endothelial cell tubes to promote vascular maturation.
Bei endogenen Retroviren handelt es sich um feste Bestandteile des Genoms. Im Fall von PERV (porzine endogene Retroviren) existieren zusätzlich infektiöse, xenotrope Vertreter. Aufgrund dieser Tatsache ist es notwendig, diese replikationskompetenten Proviren aus dem Genom potentieller Donortiere für die Xenotransplantation zu entfernen. Mit dem Wissen um die chromosomale Lage und der damit verbundenen Möglichkeit des Nachweises per PCR wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass aufgrund einer polymorphen Verteilung ein Ausschluss dieser funktionellen Proviren, mittels konventioneller Züchtung, möglich ist. Allerdings stellen sowohl die deletierten und mutierten proviralen Sequenzen durch eine Rekombination oder eine Komplementation, als auch ekotrope PERV-C ein Restrisiko im Falle einer Xenotransplantation dar. Es ist eine PERV-A/C Rekombinante beschrieben ex vivo worden, welche eine höhere Infektiösität aufweist als alle bisher untersuchten PERV. Bis auf die Rezeptor-Bindedomäne stellt dieses Virus ein PERV-C dar. Deshalb sollten chromosomal PERV-C identifiziert werden, um bei polymorpher Verteilung im Schweinegenom durch entsprechende Züchtung diese aus dem Genom heraushalten zu können. Im Rahmen dieser Arbeit ist es mit Hilfe einer speziellen PCR gelungen sieben Integrationsorte von PERV-C zu identifizieren. Da das Genom des Schweins bisher noch nicht komplett sequenziert ist, war es noch nicht möglich die gefundenen chromosomalen Bereiche zu kartieren. Dies wäre wiederum die Basis für eine Durchmusterung von Schweinen auf die Anwesenheit der gefundenen Proviren. Des Weiteren ist noch nicht bekannt, ob es sich bei diesen PERV-C um vollständige Proviren handelt, da aufgrund der verwendeten PCR und der sehr hohen Homologie verschiedener PERV untereinander nur provirale 3'Enden mit entsprechenden Flanken identifiziert werden konnten. Zusätzlich wurden in den Proben transgener Schweine PERV-C env spezifische Anteile nachgewiesen. Die Verteilung dieser Sequenzen, welche ebenfalls polymorph ist, gibt zwar keinen Aufschluss über die Anwesenheit eines Volllängen Provirus, jedoch ist aufgrund dieser Verteilung gleichfalls ein Ausschluss dieses Virus durch herkömmliche Züchtung möglich. Auf der anderen Seite besteht ein weiteres Risiko nach einer Xenotransplantation, wenn ein infektiöses PERV durch Komplementation gebildet wird, welches als Erbinformation ein env-deletiertes Provirus trägt. Das komplementierte PERV könnte potentiell, nach erfolgter Xenotransplantation, menschliche Zellen infizieren. Daraufhin wäre es zwar nicht mehr in der Lage infektiöse Partikel zu bilden, jedoch besteht noch das Risiko einer Retrotransposition, welche an sich schon mutagen wirkt. Zusätzlich könnten durch diesen Vorgang Gene zerstört oder Onkogene angeschaltet werden. Um dieses Risiko abschätzen zu können, wurden im Rahmen dieser Arbeit modifizierte Proviren von PERV-B(33) und MoMLV (Positivkontrolle) hergestellt und in einem Retrotranspositions Assay getestet. Die Modifikation der Proviren beinhaltete die Deletion des für die Retrotransposition nicht notwendigen env-Leserahmens, im Austausch gegen eine inserierte Indikatorkassette für die Retrotransposition (neoint). Im Rahmen der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente konnte im Fall des Molekularklons PERV-B(33) eine Frequenz der Retrotransposition von maximal 1,2*10-6 pro Zelle und Generation ermittelt werden. Demzufolge stellt eine Retrotransposition von env-deletierten proviralen porzinen Sequenzen nach erfolgter Xenotransplantation ein minimales Risiko dar.