Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Hypoxie entsteht, wenn das Sauerstoffangebot bzw. die Sauerstoffversorgung unter ein Niveau sinkt, das benötigt wird, um physiologische O2-Drücke des betreffenden Gewebes aufrecht zu erhalten. Sinkt der Sauerstoff-Partialdruck, so werden adaptive Mechanismen aktiviert. Neben der Anpassung durch das kardiovaskuläre System werden auch verschiedene Gene aktiviert. Die Forschung der letzten Jahre hat gezeigt, dass Hypoxieinduzierte Genexpression insbesondere von zwei Transkriptionsfaktoren, HIF (hypoxia inducible factor) -1 und -2 , gesteuert wird. Man kennt über 70 Gene, die von HIF transaktiviert werden. Dabei handelt es sich um Modulatoren von Angiogenese und Vasodilatation, Erythropoese sowie der Umstellung des Stoffwechsels von oxidativer Phosphorylierung auf Glykolyse. Die Hypoxie-induzierbare Genexpression wird sowohl über eine Steigerung der Transaktivierungsaktivität als auch der Proteinmenge der HIF- -Untereinheiten reguliert. Die Regulation der HIF-Proteinmenge erfolgt über eine vom O2-Partialdruck abhängige Stabilisierung der -Untereinheit des Proteins. Unter normoxischen Bedingungen wird das Protein durch die Prolylhydroxylasen (PHD) O2-abhängig hydroxyliert, pVHL-vermittelt (VHL = von Hippel-Lindau), ubiquitiniert und proteosomal abgebaut. Unter hypoxischen Bedingungen dagegen wird das Protein stabilisiert, akkumuliert im Zellkern und bindet an eine spezifische Zielsequenz, das Hypoxia-responsive element oder HRE, imPromotor von Hypoxie-aktivierten Genen. Die PHDs gehören zu einer Familie von Eisen- und 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen. Neben diesen Faktoren wird eine Regulation von HIF durch Sauerstoffradikale (ROS, reactive oxygen species) in der Literatur sehr kontrovers diskutiert, da die Wirkung von ROS auf HIF sich unter Normoxie, Hypoxie oder dem Einfluss von Wachstumsfaktoren unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Frage, welche Rolle die PHDs bei der ROS-vermittelten HIF-Regulation spielen, beantwortet werden. Der zugrunde liegende Mechanismus wurde anhand von Glioblastom-Zelllinien untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt eine Stabilisierung von HIF nach Verringerung der ROS-Konzentration unter Normoxie. Eine Erhöhung der ROS-Konzentration führt dagegen zu einer dosisabhängigen Verminderung von HIF und der HIF-Targetgen-Expression. Es konnte eine direkte Abhängigkeit der Destabilisierung von VHL und den Prolylhydroxylasen gezeigt werden, da sowohl eine VHL-Defizienz als auch eine Mutation der Prolylreste oder eine Inhibition der PHDs zu einer Aufhebung des Effekts führen. Eine vergleichbare destabilisierende Wirkung auf HIF übt Ascorbat aus. Überraschenderweise führt sowohl die Zugabe von H2O2 mit seiner oxidativen Wirkung als auch die Zugabe des Reduktionsmittels Ascorbat zu einer Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes. Dieser Befund kann durch eine Aktivierung von Enzymen mit eisenreduzierenden Eigenschaften erklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proteinfamilie der Ferrireduktasen (FR) identifiziert und fünf Enzyme, die eine Homologie zur cytb561-Domäne aufweisen, kloniert. Eine detaillierte Charakterisierung zeigte, dass die Enzyme tatsächlich eine eisenreduzierende Aktivität aufweisen, die durch die exogene Zugabe von ROS noch erhöht wird. Eine Überexpression der FR führt zu einem erhöhten Abbau von HIF. Ein knock down mittels siRNA führt dagegen zu einer Akkumulation von HIF und die destabilisierende Wirkung von ROS ist nach einemknock down der FR deutlich reduziert. Aufgrund der in dieser Doktorarbeit gezeigten Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Die primäre oxidative Wirkung von ROS führt vermutlich zu einer Aktivierung der Ferrireduktasen, die in Abhängigkeit von Ascorbat dann vermehrt Eisen reduzieren, so dass dies den PHDs als Substrat zur Verfügung steht. Der regulierende Einfluss auf HIF wird somit vermutlich über eine erhöhte Aktivität der Prolylhydroxylasen durch eine Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes vermittelt. Die erhobenen Daten deuten an, dass die Familie der Ferrireduktasen ein zentrales Bindeglied im O2-Sensing darstellt, das in Abhängigkeit von Redox-Signalen homeostatische Antworten auf Hypoxie moduliert.
Das Zytolysin ClyA von Escherichia coli ist der Prototyp einer neuartigen Familie von porenbildenden, bakteriellen Zytolysinen, welche in verschiedenen Vertretern der Enterobacteriaceae vorkommen. Es handelt sich bei diesem Toxin um ein Protein von 34 kDa, das hämolytische und zytotoxische Aktivität aufweist und das in Zellmembranen stabile Poren einführt, indem es sich zu ringförmigen ClyA-Oligomeren zusammenlagert. Die vorliegende Dissertation sollte einen Beitrag zur funktionalen Charakterisierung des ClyA-Proteins von E. coli K12 liefern. Insbesondere sollte die Bedeutung der N-terminalen Region für den Sekretionsmechanismus, für die hämolytische und porenbildende Aktivität, für die Interaktion mit Zielmembranen und für die Fähigkeit zur Oligomerisierung des Proteins analysiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden hierzu ClyA-Derivate mit spezifischen Mutationen innerhalb des N-terminalen Bereiches hergestellt und auf ihre Funktions-tüchtigkeit überprüft. Diese Untersuchungen gingen von den bestehenden Erkenntnissen aus, dass die Sekretion von ClyA über eine periplasmatische Zwischenstufe verläuft und keine N-terminale Prozessierung des Toxins erfolgt. Es wurde festgestellt, dass bereits kurze, sukzessive Deletionen innerhalb der beginnenden N-terminalen Region, wie die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf (ClyA∆2-5) und sechs bis zehn (ClyA∆6-10), einen deutlich hemmenden Effekt auf den Transfer von ClyA über die zytoplasmatische Membran zur Folge hatte, welcher durch die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis zehn (ClyA∆2-10) weiter verstärkt wurde. Größere N-terminale Mutationen, wie die Deletionen der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn (ClyA∆2-15) und zwei bis zwanzig (ClyA∆2-20) sowie interne Deletionen, die Aminosäuren jenseits von Aminosäureposition zehn betrafen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20), führten zur fast vollständigen Inhibierung (ClyA∆6-15) oder totalen Blockierung (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) des Transports von ClyA in den periplas-matischen Raum. Während die hämolytische Aktivität der ClyA-Mutanten ClyA∆2-5, ClyA∆6-10 und ClyA∆2-10 zwar abnahm, jedoch im Vergleich zu der des wildtypischen ClyA-Proteins noch verhältnismäßig hoch war, beeinflussten die weiteren Deletionen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-15, ClyA∆2-20) die hämolytische Eigenschaft des Toxins ganz erheblich. So verursachten diese Mutationen eine massive Abnahme (ClyA∆6-15) bzw. einen kompletten Verlust (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) der zytolytischen Aktivität des ClyA-Proteins gegenüber Erythrozyten. Untersuchungen an künstlichen Lipidmembranen ergaben, dass die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf, sechs bis zehn und zwei bis zehn die porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins nur unwesentlich beeinträchtigt. Dagegen störte die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn und zwei bis zwanzig die porenbildende Eigenschaft von ClyA so tiefgreifend, dass keine (ClyA∆2-20) oder nur Transmembranporen mit extrem geringem Innendurchmesser (ClyA∆2-15) erzeugt wurden. Daneben spiegelten instabile Membranporen, die durch die ClyA-Mutanten ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20 und ClyA∆16-20 im künstlichen Lipid-Bilayer gebildet wurden, die negativen Auswirkungen dieser Mutationen auf die porenbildende Aktivität des Toxins wider. Die gesammelten Daten unterstreichen somit nicht nur die essentielle Bedeutung der N-terminalen Region des Zytolysins ClyA von E. coli K12 für den Transport in den periplasmatischen Raum, sondern auch für die hämolytische und porenbildende Eigenschaft des Toxins. Allerdings wurde die hämolytische und porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins erst durch Mutationen ab Aminosäureposition zehn signifikant beeinträchtigt. Demgegenüber verdeutlichten Untersuchungen zum Bindungsverhalten an Zielzellen sowie Crosslinking-Experimente, dass die N-terminale Aminosäuresequenz von Position zwei bis zwanzig von ClyA weder für die Bindung an Erythrozyten noch für die Oligomerisierung des Toxins einen wesentlichen Faktor darstellt.
Die Na,K-Pumpe ist ein integrales Membranenzym und gehört zur Gattung der P-Typ-ATPasen. Das Enzym setzt bei der Hydrolyse von ATP die resultierende freie Energie in aktiven Transport zur Errichtung eines Na+/K+-Konzentrationsgradienten über der jeweiligen Plasmamembran um. Diese Funktion wird mit einer strukturellen Alternierung zwischen zwei Hauptkonformationen E1 und E2 des Enzyms in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine Charakterisierung von Sekundärstruktur- und Proteinmikroumgebungsänderungen bei Teilreaktionen der Na,K-ATPase mittels reaktionsinduzierter und zeitaufgelöster FTIR-Differenzspektroskopie. Die hier verwendete IR-Durchlichttechnik setzt voraus, daß das zu untersuchende Enzym in hochreiner, hochkonzentrierter (1 mM) und aktiver Form in einen Proteinfilm in Gegenwart eines geschützten, photolytisch spaltbaren ATP-Derivats (caged ATP) überführt werden kann. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende IR-spektroskopische Beschreibung von einzelnen Teilreaktionen innerhalb des E1/E2-Reaktionsmodells der Na,K-ATPase durchgeführt. Die Untersuchung des Enzyms in Form eines Proteinfilms mit einer Schichtdicke von etwa 5 µm ist aufgrund der hohen Hintergrundabsorption des Wassers und der geringen Extinktionskoeffizienten der Proteinschwingungsmoden erforderlich. Der überwiegende Teil der Messungen wurde mit (1-(2-nitrophenyl)ethyl)-caged ATP und Schweinenierenenzym bei 5° und 15°C durchgeführt. Nach Abspaltung der Schutzgruppe mittels eines UV-Blitzes und somit der Freisetzung von ATP wurden zeitabhängig (Millisekunden bis Sekunden) die Differenzspektren verschiedener Teilreaktionen im Bereich von 2000 bis 950 cm-1 ermittelt. Der große Vorteil dieser Technik besteht in der Möglichkeit der Registrierung von Zustandsänderungen einzelner Aminosäuren des Proteins, in Bezug auf die Sekundärstruktur, Phosphorylierung, Protonierung und Kationenkoordination. Besonders gut können Änderungen an den Seitenketten der Aminosäuren Aspartat und Glutamat detektiert werden. Die enzymatische ATP-Hydrolyseaktivität der Na,K-ATPase wurde in den Proteinfilmen IR-spektroskopisch anhand der V as (PO2-) bei 1246 cm-1 bestimmt. Die Messungen der spezifischen Aktivität von Schweinenierenenzym ergab bei 15°C einen Wert von 34 nmol Pi mg-1 min-1. Vergleichsmessungen, die mit einem Standardaktivitätstest in Annäherung an die Protein-filmbedingungen durchgeführt wurden, ergaben Ergebnisse von der gleichen Größenordnung. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des kationischen Mediums konnten nach der photochemischen Freisetzung von ATP IR-Differenzspektren von drei verschiedenen Teilreaktionen untersucht werden: (1) ATP-Bindung, (2) Bildung des Phosphoenzyms E1P, (3) Bildung des Phosphoenzyms E2P. Des weiteren wurden Differenzspektren der AMPPNP-Bindung, der ADP-Bindung und der Ammoniumbindung, die mit der K+-Bindung vergleichbar ist, ermittelt. Alle Teilreaktionen führten zu unterschiedlichen Differenzspektren, die charakteristisch für die jeweiligen Zustandsänderungen sind. Durch geeignete Differenzbildung konnten ebenfalls die Differenzspektren der Phosphorylierung (EATP -> E1P) und der Phosphoenzym-Konversion (E1P -> E2P) berechnet werden. Sekundärstrukturänderungen können bei der IR-Spektroskopie innerhalb des Amid I-Bereichs zwischen 1700 und 1610 cm-1 detektiert werden. Die Ergebnisse der IR-Differenzspektroskopie zeigen, daß die Sekundärstruktur der Na,K-ATPase bei allen untersuchten Teilreak-tionen weitgehend konserviert bleibt. Unter den ermittelten Differenzspektren der Teilreaktionen resultiert die größte Netto-Sekundärstrukturänderung in einer Größenordnung von etwa 0,2 % (~3 Aminosäuren/Protomer) bei der E2P-Bildung. Als Folge der Bindung von ATP und ADP an das Enzym gibt es Evidenzen für die Beteiligung von Arginin. Die Bindung von AMPPNP an die Na,K-ATPase hingegen zeichnet sich klar durch andere molekulare Wechselwirkungen unter Beteiligung von Asp und/oder Glu aus. Die Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 1,2 M Na+ (E1P-Bildung) kann anhand von zwei Signalen der V (C=O) bei 1739 und 1709 cm-1, wobei eines der phosphorylierten Seitenkette Asp 369 zugeordnet wird, detektiert werden. Das zweite Signal wird der Protonierung eines Seitenkettenrestes Asp oder Glu zugerechnet, welches in Verbindung mit der Na+-Okklusion bei der E1P-Bildung stehen dürfte. Weitere Signale, die in Zusammenhang mit den molekularen Vorgängen bei der Phosphorylierung und Na+-Koordination stehen, können in der spektralen Region um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) detektiert werden. Das Differenzspektrum der Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 130 mM Na+ (E2P-Bildung) enthält keine Beiträge der Kationenokklusion oder -deokklusion. Dennoch enthält das Differenzspektrum der E2P-Bildung die Information über die Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2. Während E1 den Na+-affinen Zustand darstellt, repräsentiert E2 den K+-affinen Zustand der Na,K-ATPase. Das Signalprofil der Differenzspektren der E2P-Bildung unterscheidet sich stark von dem der E1P-Bildung. Neben der Phosphorylierung an Asp 369, die auch hier oberhalb von 1700 cm-1 anhand eines V (C=O)-Signals detektiert wird, können weitere positive und negative Signale sowohl oberhalb von 1700 cm-1 als auch im Bereich um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) nachgewiesen werden. Bei der Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2 können somit starke Änderungen an den Seitenketten von Asp und/oder Glu detektiert werden, die auf eine Neuorganisation der Kationenbindungsstellen der Na,K-ATPase schließen lassen. An dieser Neuorganisation sind sowohl Ände-rungen des Protonierungszustandes als auch Änderungen in der Koordinationssphäre der kationenkoordinierenden Gruppen Asp und/oder Glu beteiligt. Da von der Na,K-ATPase keine hochauflösenden Kristallstrukturen existieren, wurden die Kristallstrukturen der Ca-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums, ebenfalls eine P-Typ-ATPase, zur Erläuterung des Mechanismus der Kationenbindung herangezogen (Toyoshima et al., 2004b). Zur Ca-ATPase existieren bereits analoge IR-Differenzuntersuchungen. Dies bot die Möglich-keit des direkten Vergleichs gleicher Teilreaktionen innerhalb des gemeinsamen E1/E2-Reaktionsmodells. Dieser Vergleich zeigt, daß die Sekundärstrukturen beider Enzyme bei den jeweiligen Teilreaktionen weitgehend konserviert bleiben. Bei der Ca-ATPase können die größten Netto-Sekundärstrukturänderungen von etwa 0,3 % des Enzyms (~3 Aminosäuren/Enzym) als Folge der ATP-Bindung beobachtet werden (Barth et al., 1996). Bei dieser Teilreaktion werden bei der Na,K-ATPase die kleinsten Sekundärstrukturänderungen detektiert. Beim Vergleich der Signalprofile beider Enzyme weist der sekundärstrukturrelevante Amid I-Bereich bei der Phosphoenzym-Konversion auf konträre Strukturrelaxationen hin. Die Differenzspektren der Ca-ATPase im Vergleich zur Na,K-ATPase deuten auf eine sich unterscheidende Kationenkoordination hin. Durch eine Kombination der Resultate von IR-Differenz- und Fluoreszenzspektroskopie der FITC-Na,K-ATPase zur Charakterisierung von Enzymzuständen, konnte ein Modell zum Mechanismus der Inhibierung der Na,K-ATPase durch das Herzglucosid Ouabain postuliert werden. Durch Fluoreszenzmessungen an der FITC-Na,K-ATPase konnte gezeigt werden, daß Ouabain in Gegenwart von 20 mM Na+ an das Enzym bindet, was bei 130 mM Na+ nicht mehr der Fall ist. Aufgrund von IR-Differenzsignalen der E2P-Bildung, aufgenommen bei 20 mM Na+, ist es möglich, oberhalb von 1700 cm-1 (ν(C=O)), bei 1554 cm-1 (V as(COO-)) und bei 1408 cm-1 (V s(COO-)) zwischen der an Asp 369 phosphorylierten und unphosphorylierten Na,K-ATPase zu unterscheiden. Nach Ouabain-Zugabe hingegen konnten diese Signale nicht mehr detektiert werden. Bezüglich der Inaktivierung des Enzyms im Standardaktivitätstest, für dessen Ablauf Na+-Konzentrationen von um die 130 mM eingesetzt werden, kann gefolgert werden, daß Ouabain nicht an das freie, sondern an das phosphorylierte Enzym bindet und somit die Inaktivierung der Na,K-ATPase nach sich zieht.
Bisher konnte allein für den Magnetkompass der Vögel ein Mechanismus der Magnetperzeption identifiziert werden. In Verhaltensversuchen, die Zugorientierung als Kriterium einsetzten, ob Magnetrezeption ungestört abläuft oder nicht, konnte dieser Mechanismus analysiert werden. Die Experimente zeigten, dass der Magnetrezeptionsmechanismus lichtabhängig ist. Vögel die im blau bis grünen Teil des Spektrums in Orientierungstrichtern getestet wurden bevorzugten signifikant ihre der Jahreszeit entsprechende Zugrichtung. Führte man diese Tests mit längerwelligerem Licht durch, zeigten die Tiere Desorientierung. Durch die gezielte Manipulation des umgebenden Erdmagnetfeldes durch künstliche Felder, ergab sich ein Wirkprinzip des Magnetkompasses der Vögel, welches nichts mit dem der uns bekannten technischen Kompasse gemein hat. Die Tiere richten sich nicht nach der Polarität des Feldes, sondern detektieren vielmehr den Neigungsgrad und den Verlauf der magnetischen Feldlinien. Durch den Einsatz von Hochfrequenzfeldern als diagnostisches Werkzeug, konnte gezeigt werden, dass der Inklinationskompass der Vögel auf einem Radikalprozess basiert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der Sitz des lichtabhängigen Magnetkompasses im rechten Auge lokalisiert ist. Unter bestimmten künstlichen Lichtbedingungen wurden von Rotkehlchen allerdings Verhaltensantworten gezeigt, die von der normalen Zugorientierung abwichen. In der vorliegenden Arbeit werden gerade jene Phänomene genauer analysiert, die in der Vergangenheit zu Nicht-Kompass-Antworten geführt haben. Die Intensitätserhöhung kurzwelliger Lichter hatte zu vermehrt axialem Verhalten geführt, eine Kombination aus langwelligem, gelben Licht mit einer kurzwelligen Komponente hatte zu Fixrichtungen geführt, d.h. die Vögel zeigten nicht mehr die saisontypische Zugumkehr. Auf biogenem Eisen (Magnetit) basierende Rezeptoren der Magnetfeld-wahrnehmung werden als zweites System der Perzeptionsmöglichkeit diskutiert, wobei ihnen im Zusammenhang mit dem ‚Kartensinn’ eher eine Intensitätssensibilität zugeschrieben wird. In der vorliegenden Arbeit wurden Versuche durchgeführt, die das komplexe Zusammenspiel unterschiedlicher Perzeptionsmechanismen des Erdmagnetfeldes untersuchen. Mischlichtbedingungen wurden daraufhin untersucht, ob sie einem radikalpaar-basierenden Inklinationskompass unterliegen, oder nicht. Für türkis-gelbes Mischlicht wird gezeigt, dass die eingeschlagene Fixrichtung nicht mit Hilfe eines Inklinationskompasses aufgesucht wird. Darüber hinaus beruht die Richtungswahl des getesteten Vogels nicht auf einem Radikalpaarmechanismus, ist aber abhängig vom vorliegenden Magnetfeld. Da Magnetit bei Vögeln in der Oberschnabelregion lokalisiert werden konnte, wurden Betäubungsversuche mit einem Lokalanästhetikum durchgeführt. Die Fixrichtung bricht zusammen und die Vögel zeigen desorientiertes Verhalten. Im Gegensatz dazu bleiben Vögel unter Grün und Weisslicht, Bedingungen wo ein Inklinationskompass zum Einsatz kommt, mit Oberschnabelbetäubung unbeeindruckt und suchen die jahreszeitlich passende Richtung auf. Für kurzwellige Lichter wird eine Intensitätsabhängigkeitsstudie durchgeführt, die analysiert ab wann Zugorientierung in Nicht-Kompass-Antworten umschlägt. Die Wellenlängenabhängigkeit der Intensitätssensitivität, die beobachtet wird, lässt auf die Beteiligung des optischen Systems schliessen. Deshalb wurden Versuche durchgeführt, die über die Lateralisation des Magnetkompasses hinaus die Rechtsdominanz des Rotkehlchenauges genauer untersucht haben. Mittels einer Brille, die die gleiche Lichtintensität auf beide Augen fallen ließ, aber in klare und unscharfe Wahrnehmung der Umgebung unterschied, konnte herausgefunden werden, dass über die reine Aktivierung von Licht hinaus Formensehen eine entscheidene Rolle zu spielen scheint. Versuche in absoluter Dunkelheit zeigen, dass von Rotkehlchen trotz der Abwesenheit von Licht signifikant eine Vorzugsrichtung aufgesucht wird, die keiner saisonalen Zugumkehr unterläuft. Die Fixrichtung beruht nicht auf einem Inklinationskompass und sie bricht nach Oberschnabelbetäubung zusammen. Alle bisher analysierten Nicht-Kompass-Antworten scheinen auf einem zweiten, magnetit-basierenden Mechanismus zu beruhen. Diese Rezeptoren scheinen neben Intensitätsinformationen des Erdmagnetfeldes auch Richtungsinformationen zu generieren. Die biologische Relevanz der ihnen unterliegenden Fixrichtungen bleibt allerdings ungeklärt.
Replizierende Murine Leukämieviren (MLV) können wertvolle Werkzeuge für die humane Krebsgentherapie werden, da sie das Transgen innerhalb des gewünschten Gewebes verteilen, ihr Genom stabil integrieren und einen natürlichen Tumortropismus aufweisen. In vorliegender Arbeit wurde ein System zur visuellen Analyse der MLV‐Replikation sowie der Virusbindung an Zielzellen mittels Einfügung fluoreszierender Proteine etabliert und als Werkzeug für dasDesign und die Optimierung dieser Viren als Gentherapievektoren benutzt. Zuerst wurde die Kodierungskapazität dieser Retroviren durch Aufteilen der viralen Gene auf zwei semireplikative Vektoren vergößert. Die Kopplung der Genome mit fluoreszierenden Proteinen ermöglichte ebenfalls in diesem Zusammenhang die Beobachtung der Repliktion aber auch die einfache Aufdeckung von Rekombinationsereignissen. Die Ergebnisse zeigten den Bedarf weiterer Optimierungen, stellten allerdings einen Vorreiter auf diesem Forschungsgebiet dar und zeigten das Potential dieses Systems auf (Sliva et al., 2004a). Zusätzlich zum natürlichen Tumortropismus sollte die Sicherheit von replizierenden Retroviren für die Tumortherapie erhöht werdn. Gezielte Veränderungen des ecotropen Hüllproteins zu EGFR‐exprimierenden Zellen mittels gerichteter Evolution sowie der Versuch, den Wirtstropismus des Env mit der Insertion des Liganden SDF‐1α auf humane CXCR4‐exprimierende Zellen auszuweiten, sind jedoch gescheitert. Diese Daten müssen sich in die Reihe der erfolglos gebliebenen Versuche, den Wirtstropismus des ecotropen Env auf humane Zellen auszuweiten, einreihen (Sliva et al., 2004b). Abschließend wurde shRNA als therapeutisches Effektormolekül erfolgreich mittels replikationskompetenter MLV in Zielzellen überragen, was zur deutlichen Herabsetzung des Proteinlevels des Zielproteins der siRNA führte (Sliva et al., 2006). Diese modifizierten Viren sind ein gutes Werkzeug zur einfachen in vitro Untersuchung von Genfunktionen, und könnten auch eine Erleichterung für die Untersuchung von Genfunktionen innerhalb von proliferierendem Tumorgewebe darstelln. Des Weiteren präsentieren die Ergebnisse und Beobachtungen dieser Arbeit einen großen Schritt in Richtung Anwendung dieser Virn für die humane Gentherapie. Denn gekoppelt mit z.B. einer tumorspezifischen Expression der shRNA‐Expressionskassette und der intelligenten Wahl der siRNA‐(Ziel)Sequenz, die nach Applikation zum Tod von malignen Tumorzellen führt, wären sie die perfekte Waffe gegen solide Tumoren.
Die Entwicklung neuer und die Adaption bestehender Methoden ist weiterhin eine der vordringlichsten Aufgaben der Forschung zur Bekämpfung der tödlichen Infektion mit dem HI-Virus. So wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Methode der Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen Oberflächenproteine, die bereits in der experimentellen Tumortherapie verwendet wird, für die HIV Therapie adaptiert werden kann. In dieser Arbeit war das HIV Hüllprotein Env das Zielmolekül. Der zweite Teil der Arbeit versucht, Erkenntnisse aus der HIV-Forschung für alternative Tumortherapieansätze am Beispiel des kutanen T-Zell Lymphoms zu verwenden. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Verwendung des Hüllproteins Env von HIV als Zielstruktur für die Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen HIV-infizierte Zellen. Hierfür wurden CD4, 5-Helix sowie zwei Varianten von DC-SIGN als HIV Env-bindende Liganden als chimäre T Zell-Rezeptoren, zusammen mit Teilen von CD3 und CD28, in humanen Zellen exprimiert. Die Funktionalität der Konstrukte konnte gezeigt werden, ein therapeutischer Effekt in vitro war jedoch nicht nachweisbar. Der zweite Teil untersucht die Verwendung des HIV Hüllproteins als therapeutischem Gen zur Behandlung des kutanen T-Zell Lymphoms. Die Pseudotypisierung von MLV-basierenden Vektoren mit HIV Env ermöglicht das zielzellspezifische Eindringen der Vektoren in humane CD4-positive Zellen. Aus diesen Zellen besteht auch das kutane T Zell Lymphom (CTCL). MLV/HIV pseudotypisierte retrovirale Vektoren, die die 89.6P Variante des HIV Hüllproteins Env als therapeutisches Gen transportieren, wurden generiert und zunächst in vitro getestet. Das Wachstum von CTCL-Zellen konnte durch Zugabe dieser Vektorpartikel verhindert und die Zellzahl unter den Ausgangswert reduziert werden. Die Verwendung im Maus-Experiment zeigte einen vergleichbaren Erfolg wie die Verwendung der Herpes simplex Thymidinkinase, obwohl von syn Env nur etwa ein Viertel der Vektorpartikel appliziert wurde. Ein bystander-Effekt ließ sich damit also nachweisen. Die Verwendung chimärer T-Zell-Rezeptoren für MHC-unabhängige Immunantworten gegen HIV-Reservoirs im Körper ist ein vielversprechender Therapieansatz. Neben der Verwendung HIV Env-bindender zellulärer Proteine könnte das Spektrum möglicher Liganden durch die Verwendung Subtypen-übergreifender, nicht-inhibitorischer Antikörper, erweitert werden. Dies ist möglich, da für die Immunantwort lediglich die Bindung an das Hüllprotein notwendig ist. Zur Erhöhung des therapeutischen Effektes des retroviralen Gentransfers zur Therapie kutaner T-Zell Lymphome eignen sich hoch fusogene virale Hüllproteine, die auf diese Weise einen noch stärkeren bystander-Effekt ermöglichen. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser sehr groß sein muss, solange replikationsinkompetente Vektoren verwendet werden.
Elche stellen eine Problemart in der Zootierhaltung dar. Sie erreichen im Zoo entgegen dem Trend, dass Tiere in Menschenobhut älter werden als ihre frei lebenden Artgenossen, meist weniger als die Hälfte des biologisch möglichen Alters. Besonders schwierig gestaltet sich die adäquate Fütterung, da die Tiere sehr stark von der Gabe frischer Laubäsung abhängen und die Fütterung mit Ersatzfuttermitteln, wie z.B. Heu, langfristig nicht erfolgsversprechend ist. Zudem sind die Tiere sehr anfällig für Parasiten und eine von Schafen übertragene Viruserkrankung (Bösartiges Katarrhalfieber). Ihr hoher Platzbedarf und das Problem der innerartlichen Aggression machen die Haltung dieser größten Hirschart zusätzlich kompliziert. In dieser Arbeit wird die Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung vorgestellt, die sich die von der Inneren Uhr gesteuerten Verhaltensrhythmen einer Tierart zur Beurteilung ihres Wohlbefindens und ihrer Haltungsbedingungen in der künstlichen Zooumwelt zu Nutze macht. Der Besitz einer Inneren Uhr stellt in der hochgradig rhythmisch organisierten Umwelt einen Selektionsvorteil im Sinne einer frühzeitigen Anpassung an wiederkehrende Umweltbedingungen dar. Die Innere Uhr ist so alt wie das Leben selbst, genetisch fixiert, über Zeitgeberreize mit ihrer Umwelt synchronisiert und regelt die Lebensvorgänge von Organismen auf allen organisatorischen Ebenen, auch auf der Ebene des Verhaltens. Ist der normale Verhaltensrhythmus einer Tierart bzw. eines Individuums bekannt, ist es möglich, aus Abweichungen von der Norm auf Störungen des Organismus - auf Unwohlsein - zu schließen. Anhand des Vergleiches von drei Elchhaltungen mit jeweils zwei Tieren, die unter verschiedenen Bedingungen gehalten wurden, konnten mit Hilfe zeitgeraffter Videoaufzeichnung und dem Einsatz eines Speichertelemetriesystems die folgenden Faktoren als einflussreich auf das Verhaltensmuster von Elchen in Menschenobhut identifiziert werden. Die nächtliche Aufstauung von Elchen ist aufgrund des Raum- und Reizmangels in den Boxen ein erheblicher Eingriff in das natürliche, gleichmäßig über Tag und Nacht verteilte Verhaltensmuster der Tiere. Außerdem sind sie in ihrem Verhalten hochgradig vom täglichen Ablauf des Pflegeralltags im Zoo beeinflusst. Feste Fütterungszeiten können einen starken Zeilgeberreiz darstellen- den die Elche in den beiden naturferneren Haltungen stärker zu antizipieren scheinen als den Zeitgeber „Licht". Größe und vor allem Strukturierung des Außengeheges haben einen Einfluss auf dessen zeitliche und räumliche Nutzung. Abschüssige Gehegeteile können die unerwünschte Verhaltensweise Grasen fördern. In unseren mitteleuropäischen Breiten leiden die Elche im Sommer unter Hitzestress, was sich in verringerter Aktivität widerspiegelt. Ein hohes Besucheraufkommen kann die Tiere ebenfalls in ihrem Verhalten beeinflussen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich der Elch schnell an die Zoogegebenheiten und viele Besucher gewöhnt. Durch den Vergleich der verschiedenen Haltungsbedingungen konnten in der vorliegen Arbeit Vorschläge zur Verbesserung der Haltung von Elchen in Menschenobhut und zu ihrem zeitlichen Management gemacht werden. Der Elch hat sich aufgrund des für Wiederkäuer typischen, sehr geregelten Verhaltensrhythmus aus alternierenden Aktivitäts- und Ruhephasen, der auch unter den verschiedenen Haltungsbedingungen prinzipiell bestehen bleibt, als sehr gut geeignetes Modelltier für die Anwendbarkeit der Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung herausgestellt. Abweichungen von der Norm können leicht erkannt werden. Änderungen im Verhaltensmuster m Form erhöhter lokomotorischer Aktivität lassen bei den untersuchten Tieren auf Unwohlsein (Krankheit, Abweichungen von der täglichen Routine, unterbundenes Brunftverhalten) schließen und können im Sinne eines chronoethologischen Paradigmas als eine indikative Verhaltensweise gewertet werden. Das Ziel einer vollständig automatisierten Verhaltenserfassung- und Auswertung mittels Bewegungsmeldern soll im restringierten Raum der Elchbox in einem weiteren Projekt verwirklicht werden, um damit Tierpflegern, Zooveterinären und Verantwortlichen ein gut handhabbares Mittel zur objektiven und langfristigen Beurteilung des Wohlbefindens ihrer Schützlinge zur Verfügung stellen zu können.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes, converting arachidonic acid to 5-HPETE, and in a second step 5-HPETE to leukotriene A4. Although the 5-LO promoter possesses characteristics of so called housekeeping genes, such as lack of TATA/CCAAT boxes and existence of several Sp1 binding sites, the 5 -LO gene is tissue specifically expressed in primarily immune competent cells of myeloid origin including granulocytes, monocytes, macrophages, mast cells and B-lymphocytes. 5-LO gene expression in MM6 and HL-60 cells is strongly induced after differentiation of the cells with TGF-beta and 1,25(OH)2D3. In some monocytic cancer cell lines, such as HL-60 TB and U937, TGF-beta and 1,25(OH)2D3 treatment are not able to activate 5-LO gene transcription. It was demonstrated, that in these cell lines the 5-LO core promoter is heavily methylated and that only demethylation by the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2 deoxycytidine (Adc) upregulated the 5-LO mRNA levels. It was also shown that the histone deacetylase inhibitor TsA could induce 5-LO mRNA levels, but only in 1,25(OH)2D3/TGF-beta inducible MM6 cells. Interestingly the 1,25(OH)2D3/TGF-beta effect on 5-LO expression is reduced, when combined with TsA. Reporter gene assays revealed that 5-LO promoter activity is strongly induced after 24 h treatment with 330 nM TsA (construct N10 up to 35 fold in HeLa cells). The effect is dependent on the presence of the proximal Sp1 binding site GC4 (-53 bp to –48 bp in relation to the major TIS) in both HeLa and MM6 cells. In vitro binding of the transcription factor Sp1 to this site has been demonstrated in gel shift assays and DNase I footprints. Mutation of the binding site resulted in a loss of basal promoter activity in both 5-LO negative HeLa cells and in 5-LO positive MM6 cells, as well as in the loss of TsA inducibility. The mutational study of different Sp1 binding sites in a larger promoter context revealed the interaction or respectively the additive effect of the multiple Sp1 binding sites of the 5-LO promoter on basal as well as on TsA upregulated promoter activity. However, GC4 seems to be of special relevance for both the basal promoter activity, possibly recruiting the basal transcription machinery, as well as for the TsA induced upregulation of 5-LO promoter activity. TsA does not alter the protein expression levels of Sp1 and Sp3 as investigated in Western blot analysis, neither in HeLa nor in MM6 cells. DNA affinity purification assays revealed that TsA had no effect on the DNA affinity of Sp1 or Sp3. In vitro binding of both Sp1 and Sp3 to the 5-fold GC box, GC4 and GC5 was demonstrated by DAPA analysis, but histone deacetylase inhibition did not change the associated protein amounts. Finally, in vivo binding of Sp1 and Sp3 was investigated in chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) in MM6 cells. TsA clearly induced the association of both proteins to the promoter area surrounding the TIS. Upon TsA treatment also RNA polymerase II binding to the area surrounding the TIS (-318 to +52 bp) was increased and even initiated in the more distal promoter parts –1049 to –292 bp, which are negatively regulated in reporter gene assays. Interestingly histone H4 is already highly acetylated without TsA treatment and the acetylation status of H4 remains unchanged after histone deacetylase inhibition, indicating an open chromatin structure of the 5-LO gene in MM6 cells. In a cotransfection study with Sp1 and Sp3, the transactivating potential of factors was investigated and in accordance with the ChIP data, Sp1 and Sp3 increased the promoter activity, but only after TsA treatment. In gel shift assays, the influence of DNA methylation on Sp1 binding was investigated. The results indicate different roles for the three proximal promoter sites. Whereas Sp1 binding to the 5-fold GC box and GC4 is impaired by DNA methylation, binding to GC5 is even increased. A cotransfection study with methylated 5-LO promoter constructs and the murine methyl-CpG binding proteins suggest MBD1 involvement in the regulation of the 5-LO promoter. Since in gel shifts Sp1 binding is inhibited by DNA methylation, at least to the 5-fold GC box and the activating element GC4, and similarly the mutation/deletion of the same sites strongly reduces or inhibits promoter activity, it is likely to assume, that the loss of promoter activity after in vitro methylation is in the first place due to impaired Sp1/Sp3 binding. Together the data underline the importance and complexity of Sp1/Sp3 binding to the GC rich sites in the regulation of 5-LO promoter activity in response to the histone deacetylase inhibitor TsA as well as in respect to DNA methylation.
Um die Biodiversität Burkina Fasos darzustellen und auszuwerten, wurden umfangreiche Diversitätsdaten aus Sammlungsbelegen, Vegetationsaufnahmen und Literatur zusammengestellt. Die eigene Datenerhebung während dreier Feldaufenthalte hat mit > 300 Vegetationsaufnahmen (einschließlich der Biodiversitätsobservatorien) und > 1200 Herbarbelegen dazu beigetragen. Die Verwendung von relationalen Datenbanken (Microsoft Access) und GIS ermöglichte eine umfassende Analyse dieser enormen Datenmengen (> 100 000 Verbreitungspunkte) unter Einbeziehung von weiteren Art- oder ortsgebundenen Informationen. Datenbankstrukturen und Prozeduren wurden zu einem großen Teil selbst entwickelt. Unregelmäßigkeiten in den Primärdaten konnten durch Artverbreitungsmodelle ausgeglichen werden, die rasterbasierte Umweltdaten verwenden, insbesondere Satellitenbilder, Klima- und Höhendaten. Für die zusammenfassenden Analysen (Artenreichtum nach Familie, Lebensform, Photosynthesetyp; turnover) mussten wiederum eigene Prozeduren entwickelt werden. Räumliche Muster der Biodiversität wurden im landesweiten Rahmen, wie auch lokal für die Regionen Oudalan und Gourma, dargestellt. Die Zusammenfassung der Flora nach taxonomischen und ökologischen Gruppen gewährt dabei Einblicke in ökologische Zusammenhänge und die Eignung einzelner Gruppen als Indikatoren. Deutlich zeigen sich die Veränderungen des Lebensformspektrums und des Artenreichtums sowohl auf Landesebene im Zusammenhang mit dem Makroklima als auch in einer detaillierten Analyse des Oudalan – wo der Einfluss von Boden und Relief deutlich wird. Die großräumigen Muster der Artenvielfalt sind hauptsächlich durch klimatische Faktoren geprägt, auch der menschliche Einfluss ist in Form verschiedener Nutzungsformen vom Klima abhängig und schwer davon zu trennen. Umso deutlicher werden die Folgen intensiver Landnutzung aber in den Detailstudien der nordsudanischen Biodiversitätsobservatorien und des sahelischen Wiederbegrünungsprojektes. Über die in diesem Rahmen dargestellten Ergebnisse hinaus ergeben sich insbesondere aus der umfassenden Datenbasis und der interdisziplinären Zusammenarbeit mit Fernerkundung und Ethnobotanik weitere vielversprechende Möglichkeiten. Unter anderem wird auf der Grundlage der Datenbanken und ergänzender Literaturrecherchen eine aktualisierte Checklist der Gefäßpflanzen Burkina Fasos erstellt und eine Revision der phytogeographischen Zonen für Burkina Faso ist geplant.
Boswellia serrata gum resin extracts (frankincense) have been used for centuries in folk medicine in Asia and Africa. They have shown beneficial therapeutic effects, particularly in the treatment of chronic inflammatory diseases. Clinical studies on humans confirmed an anti-inflammatory and anti-cancer potential of Frankincense preparations. Boswellic acids (BAs) are the major ingredients, responsible for the pharmacological action of the extracts. Molecular and cellular studies with BAs revealed a number of targets including 5-lipoxygenase (LO), topoisomerases and the NF-κB pathway. Since there is little information on the modulation of cellular physiology by BAs, this work was designed to provide a detailed investigation of the cellular and molecular effects of BAs in several cell types related to inflammation. We report that 11-keto-BAs are potent activators of functional responses in human neutrophils, a type of leukocytes mediating acute inflammatory processes. Neutrophil activation by 11-keto-BAs is reflected by enhanced generation of oxygen radicals, release of arachidonic acid (AA) and the subsequent transformation of AA to pro-inflammatory eicosanoids. Investigation of the participating signalling pathways identified Ca2+, phosphoinositide-3 kinase, and members of the MAP kinase family (ERKs) as mediators. Second, we present a detailed study of the modulation of human platelet physiology and intracellular signalling events by BAs. Intriguingly, we discovered an inverse structure-activity relationship of BAs regarding platelet activation, with 11-methylene-BAs being superior over 11-keto-BAs. Thus, 11-methylene-BAs stimulated platelet Ca2+ mobilisation, MAP kinase and Akt activation, AA release, 12-LO and cyclooxygenase product formation, and thrombin generation. Novel Ca2+-independent activation pathways of platelet lipid metabolism were discovered. In contrast, 11-keto-BAs were inactive but found to inhibit platelet (p)12-LO directly. Interaction with p12-LO was confirmed in a pulldown assay using immobilised BAs as bait. Finally, BAs were shown to attenuate the activation of monocytes, a cell type responsible for the maintenance of chronic inflammatory states. Impairment of Ca2+ homeostasis is likely conferred by inhibition of Ca2+ influx channels. Taken together, our results shed light on the modulation of intracellular physiology of inflammatory cells by BAs, contributing to a better understanding of the anti-inflammatory effects exerted by frankincense preparations.