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Glutamat ist der häufigste Neurotransmitter im menschlichen Hirn. Die Konzentration des Glutamats in der extrazellulären Flüssigkeit wird durch Glutamat-Transporter (Sekundärtransporter) kontrolliert. Liegt es in zu hoher Konzentration im synaptischen Spalt vor, kommt es zur Schädigung von Nervenzellen, ein Prozess, der als Exzitotoxizität bezeichnet wird. Eine Fehlfunktion oder fehlerhafte Produktion der Glutamat-Transporter im zentralen Nervensystem wird bei verschiedenen Krankheiten, wie der amyotrophen Lateralsklerose, der Ischämie, der Epilepsie, der Schizophrenie und der Alzheimer-Krankheit vermutet. Ziel dieser Arbeit war die Funktions- und Strukturanalyse der Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus und GltP aus E. coli, um die Familie der Glutamat-Transporter und die Entstehung der mit diesen Transportern in Verbindung gebrachten Krankheiten besser zu verstehen. Um die für diese Analysen gebrauchten Mengen an Protein herzustellen, mussten die Proteine heterolog produziert werden, da sie in natürlichen Geweben nicht in ausreichender Menge vorkommen. In dieser Arbeit wurde Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus funktional mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem überproduziert. Dazu wurden verschiedene Vektorkonstrukte hergestellt. Die routinemäßige Überproduktion des Transporters wurde im 8 l - Maßstab durchgeführt. In Zellen, die für die Produktion von GLT-1 mit rekombinanten, aktiven SF-Viren infiziert wurden, konnte eine sehr hohe Aktivität des Glutamat-Transporters nachgewiesen werden. Die Menge des hergestellten GLT-1 wurde in Bindungsexperimenten mit (2S,4R)-4-Methylglutamat quantifiziert: jede Zelle enthielt 3,5 x 106 Transporter: 61,04 pmol GLT-1/mg Gesamtprotein. Das entspricht einer Ausbeute von etwa 2-3 mg/8 l Zellkultur. Die hier durchgeführte Überproduktion des GLT-1-Glutamat-Transporters ist die erste Überproduktion eines eukaryotischen Sekundärtransporters mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem, bei dem große Mengen an aktivem Protein hergestellt werden konnten. Zudem ist die Ausbeute an funktionalem GLT-1 mit 61 pmol/mg Gesamtprotein verglichen mit den in der Literatur vorliegenden Daten zur Überproduktion eukaryotischer sekundärer Transporter mit anderen Expressionssystemen die höchste, die bis dato erreicht werden konnte. Der größte Anteil des heterolog produzierten GLT-1 war glykosyliert. Die gelelektrophoretische Analyse des aufgereinigten Transporters ergab zwei Banden, die ein apparentes Molekulargewicht von etwa 70-75 kDa und etwa 53-58 kDa hatten. In einer Western-Blot-Analyse konnten beide Banden des GLT-1-Transporters mit einem anti-His-Antikörper und einem anti-GLT-1-Antikörper nachgewiesen werden. Durch Deglykosylierung mit PNGase F und einer Trennung beider Banden durch Lektin-Affinitätschromatographie konnte gezeigt werden, dass es sich bei der 70-75 kDa-Bande um die glykosylierte Form und bei der 53-58 kDa-Bande um die nicht glykosylierte Form des Glutamat-Transporters handelte. Es wurde gezeigt, dass zwischen der Aktivität des GLT-1 und dessen Glykosylierung kein Zusammenhang besteht. Denn beide Formen lagen als vollständige, funktionale Transporter vor und transportierten nach Rekonstitution in Liposomen Glutamat. Der prokaryotische Glutamat-Transporter GltP aus E. coli wurde in dem E. coli-Stamm C43 (DE3) überproduziert. Die Ausbeute war etwa 2 mg pro Liter Kultur. Die Funktionalität des Transporters nach Rekonstitution in Lipidvesikel wurde durch spezifische Aufnahme von Glutamat gezeigt. Für die Solubilisierung beider Transporter aus den Zellmembranen wurden verschiedene Detergentien getestet. GltP ließ sich am besten mit DM oder DDM aus der Membran extrahieren, für die Solubilisierung des GLT-1 wurde mit großer Effizienz DDM oder CYMAL-7 eingesetzt. GltP und GLT-1 wurden mit einer Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie in großer Menge und hoher Reinheit angereichert werden. Die Aufreinigungsprozedur beeinträchtigte nicht die Funktionalität des prokaryotischen GltP. Bei dem eukaryotischen Transporter GLT-1 war nach der Ni2+-NTA-Säule keine Transportaktivität mehr messbar. Durch Zusatz von Asolectin in den Wasch- und Elutionspuffern während der Aufreinigung konnte die Funktionalität des Transporters jedoch erhalten werden. Aufreinigungen mit anderen Lipiden unter anderem in Kombination mit Cholesterin lieferten einen Glutamat-Transporter, der in seiner Konformation stabilisiert, jedoch nach Rekonstitution nicht aktiv war. Eine weitere Steigerung der Ausbeute an aktivem GLT-1 konnte durch den Einsatz von Reduktionsmitteln, wie DTT oder b-Mercaptoethanol, die die Aggregation des Transporters verhinderten, erreicht werden. GltP katalysiert den elektrogenen Transport von Glutamat bzw. Aspartat unter Symport von mindestens zwei Protonen. GLT-1 transportiert ein Molekül Glutamat zusammen mit drei Na+-Ionen und einem Proton im Austausch gegen ein K+-Ion. Durch Transportmessungen konnte der hochspezifische Glutamat-Transport der aufgereinigten Transporter belegt werden. Der Glutamat-Transport des in Liposomen rekonstituierten GltP zeigte eine klare Abhängigkeit von einem anliegenden Protonengradienten. Aufgereinigtes und rekonstituiertes GLT-1 transportierte nur Aspartat bzw. Glutamat, wenn ein Na+ und ein K+-Gradient vorhanden waren. Die Aspartat- bzw. Glutamat-Aufnahme konnte bei beiden Transportern durch den kompetitiven nichttransportablen Inhibitor (2S,4R)-4-Methylglutamat blockiert werden. Der Assoziationsgrad der Glutamat-Transporter GltP und GLT-1 und das Gleichwicht zwischen den verschiedenen oligomeren Zuständen wurde in dieser Arbeit eingehend mit biochemischen Methoden untersucht: 1. „Cross-linking“-Studien, 2. Blaue Nativgelelektrophorese, 3. Analytische Ultrazentrifugation, 4. Laserlichtstreuung, 5. Gelfiltrationschromatographie. Die dabei erhaltenen Ergebnisse bewiesen eine tetramere Assoziierung beider Proteine. Die Gelfiltrationsexperimente zeigten, dass die Transporter in Detergenzlösung in unterschiedlichen Assoziationsgraden vorliegen. Das Gleichgewicht zwischen den oligomeren Formen war reversibel und abhängig von der Art und Konzentration des Detergenz, der Proteinkonzentration und der Temperatur. Zur Untersuchung der Struktur der Glutamat-Transporter wurden vor allem mit GltP zahlreiche 2D-Kristallisationsexperimente durchgeführt. Trotz Variation aller denkbar möglichen Parameter konnten keine Kristalle erhalten werden. Das beste Ergebnis war ein guter Einbau des Proteins in Lipidvesikel (etwa 80%). Da keine Kristalle erhalten wurden, wurde für beide Proteine eine Einzelpartikelanalyse durchgeführt. Dabei wurde nach zweidimensionaler Alignierung und Klassifizierung die „random conical tilt“-Methode angewendet. Die daraus resultierenden dreidimensionalen Dichtekarten des GltP und GLT-1 waren sehr ähnlich und wiesen vier nicht exakt symmetrische Massen in annähernd quadratischer Anordnung auf. Die Auflösung war 26 Å bzw. 36 Å. Die Größe der Einzelpartikel (für GltP: Höhe 37 Å, Breite 75 Å bzw. 86 Å, Länge 100 Å). ihre annähernd quadratische Anordnung und ihre Symmetrie lassen vermuten, dass es sich dabei um Tetramere der Glutamat-Transporter handelt, die aus zwei nicht symmetrischen Dimeren zusammengesetzt sind. Die hier präsentierten Daten sind die ersten zur dreidimensionalen Struktur von Glutamat-Transportern. Schließlich wurde nachgewiesen, dass der in BHK-Zellen heterolog exprimierte Glutamat-Transporter GLT-1 vorwiegend in „lipid rafts“ lokalisiert ist. Die Größe der „rafts“, die anhand der Größe der „Proteininseln“ in Gefrierbrüchen bestimmt wurde, war etwa 200 nm im Durchmesser. Die „GLT-1-Inseln“ bzw. „lipid rafts“ konnten durch das teilweise Entfernen von Cholesterin aus der Membran zerstört werden. Damit ging eine Reduktion der Glutamat-Transporter-Aktivität von etwa 20% einher. Es ist das erste Mal, dass „lipid rafts“ durch die natürliche Assemblierung von Proteinen mit Hilfe von Gefrierbruchanalysen und Elektronenmikroskopie beobachtet wurden.
1. Die beiden Spargelkäfer sind über die Spargelkulturen fast der ganzen Erde verbreitet. 2. Morphologische Unterschiede zwischen den zwei Arten: Körperform, Färbung, Zeichnung. Insbesondere Cr. asparagi zeigt eine außerordentlich starke Variation des Flügeldeckenmusters. Das Material aus unserem hessischen Beobachtungsgebiet wurde daraufhin an anderer Stelle von mir vergleichend untersucht. Beide Käfer besitzen ein Stridulationsorgan (daher "Zirpkäfer"), dessen Bau und Wirkungsweise beschrieben werden. Vasa Malpighi bei Cr. 12punctata schwarzbraun, bei Cr. asparagi weiß. Weibliche Genitalorgane: Ovarien mit durchschnittlich je 12 telotrophen Ovariolen, Receptaculum seminis, keine Anhangsdrüsen; Unterschiede bei beiden Arten in der Form des Receptaculums und vor allem im Bau des Ohitingerüstes. Ein Weibchen bringt etwa 70-100 Eier hervor. Männliche Genitalorgane : Lebhaft dunkelgelb gefärbte, annähernd kugelige Hoden, Vasa deferentia mit je zwei verschieden geformten Drüsen, unpaarer Ductus innerhalb des Penisgerüstes zur Ampulle erweitert. 3. Biologische Unterschiede der beiden Arten: "Hähnchen" mehr eurytherm, größere Neigung zum "Totstellen", Antennen in der Ruhe parallel nach vorne gerichtet, geringere Thigmotaxis, früherer Beginn der Eiablage; die bräunlich schwarzen Eier werden mit dem einen Pol an die Pflanze geklebt. Larve im allgemeinen dunkel grünlichgrau, Kopf schwarz. "Zwölfpunkt" lebhafter, neigt mehr zum Abfliegen, Antennen in der Ruhe in spitzem Winkel nach vorne gerichtet; die helleren, bräunlich grünen Eier werden der Länge nach an die Zweige geklebt. Larve (ob durchwegs?) schmutziggelb mit gelber Kopfkapsel. Wenigstens in der zweiten Generation in den Spargelbeeren lebend. Beide Arten haben höchstwahrscheinlich doppelte Generation. Überwinterung als Käfer am Boden, unter Pflanzenresten, in Spargelstrünken usw. 4. Die Käfer und besonders ihre Larven skelettieren durch ihren Fraß die grünen Spargeltriebe, indem sie sie ihres Chlorophylls berauben. Die dadurch am meisten gefährdete Altersstufe ist die einjährige Pflanze.
Über ein cretaceisches Geschiebe mit Rhizocorallium Gläseli n. sp. aus dem Diluvium bei Leipzig
(1913)
Die vorliegende Arbeit soll einen Beitrag zur Biologie der Honigbiene darstellen. Sie ist zunächst eine biologisch-deskriptive Arbeit. Ich habe die Biene bei ihrer mannigfachen Tätigkeit in freier Natur wie auch in ihrem Stocke beobachtet und habe festzustellen versucht, wie sie sich verhält, wenn ihr Körper mit irgendeinem Schmutzstoff in Berührung kommt. ...
1. Die Feldbeobachtungen der vorliegenden Untersuchung sind in der Zeit vom 10. VII. bis 9. VIII. 1964 in Westspitzbergen in den Gebieten von Isfjorden und Hornsund (Abb. 2) gemacht worden. Die Fjeldheidevegetation wurde auf 58 Probeflächen von je 25 m2 untersucht. 2. Bei der Besprechung der Fjeldheidevegetation wird zunächst der Begriff »Fjeldheide» definiert und mit dem Begriff »Tundra» verglichen. Zugleich wird die Zonität der (oro)arktischen Vegetation erörtert und mit den in Grönland, Fennoskandien und Nowaja Semlja vorgenommen Zoneneinteilungen verglichen. Im Rahmen der Dreizoneneinteilung der (oro)arktischen Vegetationszone werden in Spitzbergen die mittel- und die oberoroarktische Stufe angetroffen. 3. In der untersuchten Fjeldheidevegetation wurden 5 Artengruppen und entsprechend 5 Heidetypen herausgearbeitet: 1. Deflations-, 2. Flechten-, 3. trockene und 4. frische Moosheide sowie 5.Schneebodenstellen. Die Grenze zwischen den Typen und auch zwischen den innerhalb eines jeden Typs anzutreffenden Westküsten- und Binnengebietvarianten sind fliessend. Das Westküstengebiet umfasst die Untersuchungsstellen 1-6, das Binnengebiet (=Innenfjord- und Binnenlandgebiet) die Punkte 7-20. 4. Das Westküstengebiet gehört vorwiegend ins Bereich der metamorphierten, das Binnengebiet wiederum ins Gebiet der nicht metamorphierten Gesteine. Für die Entstehung der die obigen Gebiete charakterisierenden Varianten wird jedoch nach meiner Meinung dem Grossklima die ausschlaggebende Bedeutung beigemessen. Die Westküste ist hygrisch und thermisch ozeanischer als das Binnengebiet (Abb. 6). Dieser Umstand macht sich in der Vegetation auch in den Mangenverhältnissen der Typen geltend: an der Westküste viele Deflationsheiden und SchneebodensteIlen (siehe S. 43). Ferner ist die Höhengrenze der mittelarktischen Stufe an der Westküste tiefer (siehe S. 43). Die Phänologie der Pflanzen lässt an der Westküste Verspätung der Entwicklung erkennen (siehe Tab. 9 und 10). An der Westküste steht die Fjeldheidevegetation auf gröberem Untergrund (siehe Tab. 8), und das Eis reicht weiter herunter als im Binnengebiet. 5. Beim Vergleich der Fjeldheidetypen miteinander wurden Unterschiede in der Dicke des Auftaubodens und in der Phänologie der Pflanzen beobachtet, welche Umstände mit der Dicke der Schneedecke zusammenhängen dürften. Die Dicke des Auftaubodens wird zu den frischen Moosheiden hin geringer und nimmt dann an den SchneebodensteIlen wieder zu (Tab. 8). Die Entwicklung der Pflanzen setzt umso zeitiger ein, je trockener der Typ ist (Tab. 9 und 10). 6. Mit Hilfe der Literatur wird der Versuch gemacht, Vegetationen ausfindig zu machen, die sich mit den Fjeldheidetypen Spitzbergens identifizieren (= Horistisch gleichartig sind; vgL Abb. 11) oder vergleichen lassen (= floristisch andersartig, aber an mehr oder minder gleichartigen Standorten). Zusammenfassend wird hauptsächlich anhand der Literatur ein vorläufiger Vorschlag für die Vegetations gebiete Spitzbergens gemacht (Abb. 10).
Die Wege, die zur Erreichung homozygoter Bestände führen, sind die Inzucht und die Selektion. In der bisher über das Inzuchtgeschehen vorliegenden Literatur ist der stets gleichzeitig wirksame Einfluß der Selektion mit einer Ausnahme (Robbins 21) unberücksichtigt gelassen. Um zu einem möglichst exakten Vergleichsmaßstab zwischen Erwartung und Beobachtung bei Inzuchtversuchen zu kommen, muß die Selektion mit einbezogen werden. Es wurde sowohl für 1 als auch 2 Anlagenpaare unter jeweiliger Aufstellung eines Systems von Differenzengleichungen die prozentuale Zunahme der reinerbigen Individuen bei Geschwisterpaarung + Selektion nach dem Dominantphänotyp ermittelt. Zum Vergleich der anteiligen Häufigkeit der reinerbigen Individuen in den einzelnen Generationen wurde bei 1 Anlagenpaar die Selektion und die Geschwisterpaarung, bei 2 Anlagenpaaren nur die Selektion herangezogen. Der Prozentsatz der homozygoten Individuen liegt bei Geschwisterpaarung + Selektion jeweils über dem bei ausschließlicher Selektion oder Geschwisterpaarung. Um einen zu 99 % homozygoten Bestand zu erhalten, sind im Falle der Monohybridspaltung bei Selektion 198 Generationen, bei Geschwisterpaarung 20 Generationen und bei Geschwisterpaarung + Selektion 12 Generationen notwendig; im Falle der Dihybridspaltung benötigt die Selektion 396 Generationen, die Geschwisterpaarung + Selektion 14 Generationen. Bei Selektion nach dem Dominantphänotyp ist die zur Erreichung eines bestimmten Homozygotenprozentsatzes notwendige Generationenzahl eine lineare Funktion der Zahl der Anlagenpaare. Zum Beispiel gilt y = 19S x; dabei bedeutet x die Zahl der Anlagenpaare und y die Anzahl der Generationen, die notwendig ist, damit der Bestand zu 99% aus Homozygoten besteht. Die Schaffung erbreiner Bestände würde wesentlich b!=günstigt sein, wenn man einige erbreine Tiere kennen würde. Zur Prüfung eines Tieres auf seine Erbveranlagung werden in der Literatur 1. Paarung an die rezessive Form, 2. Paarung an sichere Heterozygote und 3, Paarung an eigene Nachkommen angegeben. Für diese 3 Verfahren ist die notwendige Mindestzahl von Nachkommen von nur dominante Phänotyp bei Monohybridspaltung bereits berechnet. Es wurden die entsprechenden Werte für Dihybridspaltung errechnet und gleichzeitig die Geschwisterpaarung mit einbezogen. Die sich für 2 Anlagenpaareergebendcn Werte liegen nur um ein Geringes höher als die entsprechenden bei einem Anlagenpaar. Bei Geschwisterpaarung werden weniger Anpaarungen benötigt als bei Eltern-Nachkommenpaarung; die erstere Form der Prüfung ist bei uniparen Tieren nicht durchführbar. Abschließend kann man sagen, daß es durchaus möglich ist auch bei den Haustieren erbreine Stämme in zum mindesten 2 Anlagenpaaren planmäßig herauszüchten. Gelingt es nicht, nach einem der entwickelten Genotypprüfungsverfahren einzelne in den gewünschten Erbanlagen erbreine Individnen festzustellen, so ist immer durch Inzucht und planmäßige Selektion - allerdings erst in durchschnittlich längerer Zeit - die Möglichkeit gegeben, solche in größerer Zahl zu erhalten. Für polyhybrid geartete ZüchtuDgsaufgaben kann man eine Aufgabe nach der anderen lösen. Hat man z. B. einen Bestand von der genetischen Konstitution AaBbCcDdEe, dann faßt man zunächst nur 2 Anlagenpaare ins Auge - etwa AaBb - und schafft sich die Tiere, welche in diesen beiden Faktorenpaaren homozygot sind - alle anderon merzt man. Nun geht man zu den nächsten 2 Faktorenpaarcn - CcDd - über und züchtet auf die gleiche Weise AABBOCDD-Tiere. Der Zufall könnte es wollen, daß man gleichzeitig in dem Faktorenpaar EE .homozygote Tiere erhält. Ist dies aber nicht der Fall, so kann man nun in höchstens 2 Schritten auch in dem Anlagenpaar EE homozygote Individuen herauszüchten. Also auch in dem Fall des Polyhybridismus kann man nach und nach erbreine Stämme erhalten. Wünschenswert wäre es allerdings, wenn man auch für den Fall der Mehranlagigkeit möglichst exakte Vergleichsmaßstäbe für die Beurteilung der Inzucht- und Auslesevorgänge haben würde. Es wird eine spätere Aufgabe sein die prozentuale Zunahme der Homozygotie bei Geschwisterpaarung für 2 Anlagenpaare zu ermitteln und dieselben Untersuchungen auf 3 Anlagenpaare auszudehnen. Dann läßt sich vielleicht schon eine Abhängigkeit von der Anzahl der Anlagenpaare erkennen und der Prozentsatz der Homozygoten in einem Bestand bei Inzucht- und Selektionsversuchen als Funktion der Anzahl der Anlagenpaare und der Generationenzahl darstellen. Ferner wird es notwendig sein, die gleichen Untersuchungen unter verschiedenen Selektionsvoraussetzungen und auch für verschiedene Arten der Verwandtschaftspaarung durchzuführen. Schließlich ist bei all diesen Untersuchungen noch ein Moment unerwähnt geblieben: Es kann der Fall eintreten, daß mehrere Genpaare miteinander gekoppelt sind; folglich bleibt auch noch die Abhängigkeit vom Koppelungsgrad zu ermitteln. Aus diesen kurzen Hinweisen geht schon hervor, daß die Mathematik noch viel Arbeit zu leisten hat, damit der Biologie das Rüstzeug erhält, welches er für eine exakte Beurteilung der überall wirksamen Inzucht- und Auslesevorgänge benötigt.
In der vorliegenden Arbeit wurden zehn Substanzen, die im Rahmen des Projekts INTAFERE analytisch in verschiedenen Gewässersystemen des Hessischen Rieds nachgewiesen werden konnten, ökotoxikologisch charakterisiert. Neben der Bestimmung der Akut- und der chronischen Toxizität wurde auch das endokrine Potential mit Hilfe eines rekombinanten Hefe-Assays ermittelt.Die akute Toxizität zeigt zwischen den verschiedenen Substanzen große Differenzen. Die drei Organophosphate TCPP, TBEP und TCEP zeigen selbst bei hohen Konzentrationen keine oder nur sehr geringe Effekte, während 4-NP, 4-t-OP, BPA, TDCPP, AHTN und Terbutryn mit LC50-Werten bis zu 5 mg/l eine höhere Toxizität besitzen.Im Hefe-Assay kann in mehreren Versuchswiederholungen das östrogene Potential von 4-NP (MW: 6,71x10-6 M), 4-t-OP (MW: 7,16x10-6 M) und BPA (MW: 4,88x10-6 M), sowie die antiandrogene Wirkung des Bisphenols (5,29x10-5 M) bestätigt werden. Im Gegensatz dazu können im Yeast Antiestrogen Screen zum ersten Mal Hinweise auf die antiöstrogene Wirkung von TCPP (MW: 6,86x10-5 M), Terbutryn (MW: 3,99x10-5 M), TDCPP (MW: 2,65x10-6 M) und TBP (MW: 2,28x10-5 M) aufgezeigt werden.TBP und TDCPP führen auch in der chronischen Exposition bei Potamopyrgus antipodarum zu einer Reduktion in der Embryonenzahl (mehrfach beobachtete NOEC beider Substanzen: 6,25 mg/kg), ein Effekt, der zunächst nicht von einer toxischen Wirkung unterschieden werden kann. Allerdings scheint sich ein antiöstrogener Wirkmechanismus auf die Schnecken bei den Versuchen zur Mischtoxizität zu bestätigen, da die gleichzeitige Exposition gegenüber BPA und 4-tOP zu einer geringfügigen Aufhebung des Effekts führt. Potamopyrgus reagiert ebenfalls mit einer Reduktion der Embryonenzahl bei der Exposition gegenüber AHTN (mehrfach beobachtete NOEC: 2 mg/kg), zeigt sich aber insensitiv gegenüber der Belastung mit Terbutryn.Die Exposition von Chironomus riparius gegenüber den verschiedenen Substanzen führt bis auf eine Ausnahme zu keinen signifikanten substanzbedingten Beeinträchtigungen. Einzig das s-Triazin Terbutryn verursacht eine hohe Mortalität mit einer NOEC (28 d) von 250 μg/kg. Eine Toxizität auf den Anneliden Lumbriculus variegatus zeigt sich lediglich bei derExposition gegenüber BPA (NOEC: 10 mg/kg; Biomasse, 28 d) und 4-NP (EC10: 6,88 mg/kg; 95% KI: 3,97-11,9; Reproduktion, 28 d). Die durchgeführten Versuche zur Toxizität von Mischungen zeigen eine größere Gefährdung auf als bei Vorliegen der Einzelsubstanzen in Konzentrationen unterhalb ihres Schwellenwertes zu vermuten wäre. Allerdings lassen sich die mit dem Hefe-Assay erzielten Ergebnisse aufgrund großer Variabilitäten zwischen den einzelnen Versuchswiederholungen nicht immer eindeutig mit Hilfe des additiven oder des unabhängigen Modells beschreiben, zeigen dabei jedoch trotzdem ein gegenüber den Einzelsubstanzergebnissen verändertes Risiko auf. Um diesem in der Risikobewertung Rechnung zu tragen, wird ein Verfahrensvorschlag entwickelt, in dem durch zusätzliche Sicherheitsfaktoren für PNECs ein Überschreiten des risikoanzeigenden Werts von 1 des PEC/PNEC-Quotienten einer Mischung verhindert werden kann.
Diese Arbeit beschreibt die verschiedenen Celltypen (ungefähr dreizig), die in die Larve von Alcyonidium ployoum (Hassall) sind, und zeigt ihre Verschiedenheit und ihren specifischen Merkmale, hesonders wegen der elektronischcn Mikroskopie. Die ektodermischen Zellstoffe sind viel mehr verschieden, als die Arbeiten den alten Autoren es zu glauben lasscn. Aborale und pericoronale Zellstoffe, deren einige von Warzen und mancherlei Wimper bedeckt sind, sind beschreibt. Ein besonderer Zellstoff, der die Einmündung des Saugnapfs beschränkt, ist im Kleine gelernt. Ein Ring von infracoronalen und sehr besonderen Wimperzellen, die nachher den grössten Teil der Anfang des ersten Polypid geben werden, hat sehr genau geanalisiert. Speziale palleale und des Saugnapfs Zellstoffekörnchen werden nachher die Kutukula der Ancestrula zu geben. Der verwickelte Bau der Musultnlareinpflanzungzellen ihre ektodermale Natur, der desmosomiale Anblick der Einfüngungen der Muskularfasern sind entdecken. Die mesodermalen Zellstoffe sind sehr verändert, und kann man die Verwandlung einer Typus von mesenchymalen Zell in einen anderen Typus folgen, in Beziehung auf dem Alter der Larve, Die Verteilung und der Bau der verschieden Muskeln sind geanalisiert, und mit den der anderen bekannten Ectoproctlarven vergleichen. Eine kritische Studium der mancherleien Kategorien von mesenchymalen Zellen ist bezüglich auf die histologischen Beschreibungen früherer Autoren gemacht. Die morulären Zellen, die bis nun allein bei die tätigen Alcyonidium´s Zoecien kurz beschreibt waren, sind hier einzeln gelernt, Ein Haupteingebrachte unserer Erforschung bewilligt den Bau des neuroempfindlichkeiten Ganze dieser Larve. Empfindungszellen stellen in der Mitte der Kappe, und sind in Verbindung, wegen synaptischen Vereinigungen, mit einem Dorsalganglion wo ein von einem mesodermalen zusammenhängenden Muff beschtzer Nerv anfangt. Axonen gehen unter dem Nerv fort, folgen den ganzen larva´s peripherie in der untercoronalen Gegend, und bezüglich mehreren Synapsen verbinden sie mit den allen regsamen Wimperstoffe der Larve. Es gibt kein nervöse Zellkörper neben deIn birniformingen Organ (der nun uns «complexe ectodernlique ventro-anterieur» vorziehen nennen); da bermerckt man nur ein Axonenhalftern. Mit den Gesamtheit der vereinigten Urkunden kannt man ein genau Kenntnis der Larva von Alcyonidium haben. Diese Kenntnis war die nötige Vorbedingung für das Studiaum der Vorfälle von der Verwandlung und Polypids´ Ancestrularbildung unternehmen. Dieses Studium wird logisch für uns diese Arbeit folgen.
Die Knochenansammlung im grauen vulkanischen Tuff der Südserengeti gibt als ökologisch unmögliches
Gemisch ein gutes Abbild des Gesamtbestandes und des Lebensraumes der altquartärcn ost- und innerafrikanischen Fauna. Diese lebte formenreich in Urwald, Savanne und offener Steppe. Das Fehlen wasserlebender Tiere ist hier auf örtliche Umstände zurückzuführen: die vulkanischen Aschen gingen auf Steppenboden nieder, Die benachbarten, ungefähr gleichalten Knochenlager enthalten solche Tiere. Neu ist an der Serengetifauna der bereits beträchtliche Anteil von Kleinsäugern (Nager; Insektivoren fehlen noch). Diese wird weitere Forschung vermehren. Die klimatische Entsprechung der Fauna wird in tropischen, feuchtwarmen Bedingungen erblickt. Obwohl viele tertiäre Formen enthaltend, wird die Fauna nicht als jungtertiär angesehen, sondern wegen des Auftretens moderner· Formen als eine Tiergesellschaft, welche das Quartär eröffnet. Als Leitfossil für dessen Beginn wird der Gattung Archidiskodon, aus welcher die echten Elefanten, darunter auch der afrikanische (Loxodonta africana ) entstanden sind, vor den Equiden der Vorzug gegeben.
Ostafrika, das ja als Tierparadies schlechthin gilt, lebte bis vor kurzem noch im Quartär. Das Schrifttum über seine Tierwelt scheint zwar fast unermeßlich groß, aufs Ganze gesehen ist das Wissen weder tief noch auch nur oberflächlich vollständig. Die Hauptleistung des "weißen Mannes" bestand in der Störung und Vernichtung der Fauna. Aber die Natur ist groß; sie hält noch einen Schatz im Inneren ihrer Gebirge bereit, damit der Mensch seine Stellung zu ihr und den Sinn seines Lebens ergründe, einen von vielen: dle quartäre Lebewelt selbst. Möge die hohe Aufgabe, ihn zu heben, uns Deutschen vergönnt sein! Eine Probe hat Dr. KOHL-LARSEN gesichert.
Die Pilzgattung Hygrocybe wird taxonomisch besprochen, wobei die bisherige Sektion Oreocybe Boertmann (subgenus Cuphophyllus) den Status einer eigenen Untergattung erhält. Ein Bestimmungsschlüssel zur Gattung wird vorgelegt, wobei Gruppen sehr ähnlicher Arten, die früher teilweise nicht getrennt wurden, im Hauptschlüssel zu Aggregaten zusammen gefaßt wurden. Diese Aggregate werden getrennt aufgeschlüsselt. 50 europäische Arten der Gattung Hygrocybe werden schließlich hinsichtlich ihrer Morphologie, Taxonomie, Ökologie und Verbreitung vorgestellt.
1975 wurden in diesem Mitteilungsblatt zwei Beiträge mit Fledermaus-Verbreitungskarten von Nordrhein-Westfalen veröffentlicht. In Fortsetzung dieser Kartierung der Bundesrepublik Deutschland legen wir nachfolgend die Ergebnisse des norddeutschen Raumes für den Zeitraum von 1945-75 vor. Die Zahl der hier nachgewiesenen Fledermausarten beläuft sich auf 15. Zur leichteren Übersicht wurde wiederum eine Zweiteilung vorgenommen. In den Listen sind sämtliche erreichbaren Fledermaus-Vorkommen nach Arten getrennt unter Angabe der LokalitSt, des Funddatums, des Quartiertyps sowie der Anzahl nachgewiesener individuen in chronologisclier Reihenfolge zusammengefaßt. Darüber hinaus wurden die Fundorte unter Berücksichtigung der Jahreszeit (Sommer- und Winteraufenthaltsort) und des Quartiertyps (Wochenstubenquartierei) in UTM-Gitterkarten, und zwar getrennt nach den Bundesländern Niedersachsen & Bremen sowie Schleswig-Holstein & Hamburg, eingetragen. Der starke Rückgang einzelner Species machte es aus Gründen der Erhaltung noch besetzter Quartiere in einigen Fällen erforderlich, von einer exakten Ortsangabe in den Listen abzusehen. Es sei darauf hingewiesen, daß diese Verbreitungskarten kein lückenloses Bild vom Vorkommen der Fledermäuse des Gebietes vermitteln können. Das gilt namentlich für unser nördlichstes Bundesland Schleswig-Holstein, wo vielleicht mit Ausnahme des Segeberger Raumes und des Seengebietes um Plön bisher keine systematischen Fledermaus-Beobachtungen vorliegen.
On the occurence of bats (Chiroptera) in South Tyrol (2): Vespertilionidae Since 1988 the author has been collecting and recording bat observations in South Tyrol. From 1990 to 1991 and from 1995 to 1997, in two different studies, he carried on a survey on the presence, the frequency and the horizontal and vertical dispersal of the various species of bats. The first task was on one hand to search the attics and steeples of about 700 churches and chapels; and, on the other hand, to answer the numerous calls telling of the presence of bats in private houses, to capture bats for a check-up and to inform people about European bats beeing harmless for humans, animals and houses. There is good evidence of 23 species of bats in South Tyrol since 1988 and of the reproduction of 18 of them, as well as there are single discoveries of three further species, and finally summer colonies of two species. As there is no certified evidence of the presence of Pipistrellus pygmaeus and of Plecotus alpinus they have not been included in this record. The data-base already provides a good idea of the presence and frequency of bat-species. Species which are frequent in Central Europe have been found almost everywhere in South Tyrol (e.g. Pipistrellus pipistrellus, Plecotus sp.), some of them in several colonies with a considerable number of individuals. The Etsch/ Adige Valley as far up as Meran/Merano - due to its mild climate - makes home for a few Mediterrean species. The few possibilities we got from scientific pubblications to make a comparison with former times let suppose that the bat occurences have diminued only in a few species. The reasons are to search mainly in the diminued offer of food.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Vegetation der Savannenlandschaften der Sahelzone von Burkina Faso analysiert. Diese semiaride bis aride Region, die seit einigen Jahrzehnten von Landdegradation betroffen ist, ist als Untersuchungsgebiet u.a. deshalb besonders interessant, weil sie an einem Nutzungsübergang zwischen sesshafter Landwirtschaft und traditionell nomadischer Viehwirtschaft liegt. Im Vordergrund stand bei der Vegetationsanalyse ihre Klassifikation, die Frage nach der floristischen Struktur sowie dem aktuellen Zustand der Vegetation. Zu Beginn der Feldarbeiten wurde das Untersuchungsgebiet, das einen Niederschlagsgradienten von rund 200 mm umfasst, in geomorphologische Landschaftseinheiten (Inselberge, glacis, Niederungen, mares, Dünenzüge) stratifiziert. Innerhalb dieser Einheiten erfolgte die Vegetationsaufnahme mit Hilfe pflanzensoziologischer Aufnahmen. Die Arten der Gehölz- und Krautschicht wurden getrennt behandelt. Die Vegetationsaufnahmen wurden durch Strukturprofiltransekte in der brousse tigrée und Bodenuntersuchungen ergänzt. Auf verschiedenen Skalenebenen wurden die verschiedenen Vegetationsgesellschaften detailliert beschrieben und zu Standortfaktoren in Beziehung gesetzt. Außerdem wurden Vegetationsprofile zur Veranschaulichung der räumlichen Struktur der Vegetation abgeleitet. Bei der Analyse kamen auch computergestützte Methoden und statistische Verfahren (Tests der absichernden Statistik, Berechnung verschiedener Diversitätsindices, Ordinationsverfahren, numerische Klassifikation) zum Einsatz, um die Interpretation der Vegetationsstruktur zu unterstützen. Rund 320 Gefäßpflanzensippen aus 65 Familien konnten sicher bestimmt werden. Die artenreichste Familie sind die Poaceen. Insgesamt können 20 Gesellschaften der Gehölzschicht sowie 22 Gesellschaften der Krautschicht klassifiziert werden, die zur Mehrzahl weiter in Untereinheiten gegliedert sind. Innerhalb jeder Landschaftseinheit werden die Gesellschaften der Gehölzschicht, anschließend diejenigen der Krautschicht, vorgestellt. In der Regel sind sie in ihrer Verbreitung auf jeweils eine Landschaftseinheit beschränkt. Vor allem die Gesellschaften des glacis und der Niederungen besiedeln auch Habitate in Landschaftseinheiten außerhalb ihres Schwerpunktes. Daraus werden Schlüsse zum Ausbreitungsverhalten gezogen. In keinem Fall sind Einheiten der Krautschicht und der Gehölzschicht ausschließlich miteinander kombiniert; vielmehr sind Einheiten der Krautschicht jeweils mit mehreren Einheiten der Gehölzschicht kombiniert, was ihren selbständigen Charakter betont. Zehn Einheiten der Krautschicht sind überwiegend oder völlig gehölzfrei. Eine floristische Verwandtschaft besteht vor allem zwischen den Landschaftseinheiten glacis und Dünenzügen sowie zwischen mares, Niederungen und Dünenzügen; die Inselberge unterscheiden sich deutlich. Die Gehölzvegetation der Inselberge ist in Abhängigkeit von der menschlichen Nutzung in fünf Gesellschaften gegliedert. Während die Commiphora africana-Gesellschaft für wenig beeinflusste Bereiche typisch ist, hat die Combretum micranthum-Fragmentgesellschaft ihren Verbreitungsschwerpunkt in den intensiv genutzten Bereichen. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft ist an den Unterhängen vertreten. Die Krautschicht der Inselberge gliedert sich in sechs, relativ artenreiche Gesellschaften mit Untereinheiten. Sie stellen zum Teil lokale Besonderheiten dar. Das räumliche Muster der Einheiten der Brachiaria lata-Gesellschaft lässt eine Abhängigkeit von der Art der Beweidung erkennen. Die Vegetation der Sandrampen wird oftmals von Einheiten gebildet, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf den Dünenzügen haben. Die Gehölzvegetation des glacis ist in drei relativ artenarme Gesellschaften gegliedert, die in Abhängigkeit der Lage zum lokalen Vorfluter zoniert und auch über das Untersuchungsgebiet hinaus weit verbreitet sind. Weite Bereiche des glacis sind völlig gehölzfrei. Die häufigste Gesellschaft ist die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft. Die Ordination der Daten unterstützt die Klassifikation und zeigt Übergänge zwischen den Einheiten sowie Beziehungen zu den Standortparametern auf. Die Krautvegetation der glacis-Flächen ist relativ einheitlich; es gibt insgesamt nur zwei Gesellschaften. Der Anteil an Ruderalarten, Arten mit Pioniercharakter und solchen, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf Dünenzügen haben, ist relativ hoch. Bedeutendste Einheit ist die Tribulus terrestris-Untereinheit der Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft, die eine weite ökologische Amplitude besitzt. Vor allem zu den Krautgesellschaften der Niederungen bestehen enge floristische und räumliche Beziehungen. Die krautigen Arten des glacis haben eine weite ökologische Amplitude. Es bestehen floristische Beziehungen zu Vegetationseinheiten der Sahara. Die Vegetation der mares und Niederungen hat die höchste β-Diversität. Die Gehölzvegetation der Niederungen ist in Abhängigkeit der Überflutungsdauer und -höhe zoniert und relativ struktur- und artenreich. In Galeriewäldern kommen sudanische Gehölzarten vor. Während von Viehherden stark frequentierte mares niedrige Gehölzdeckungen aufweisen oder komplett gehölzfrei sind, ist die Gehölzdeckung an den Ufern nur schwach besuchter mares geschlossen. Dies gilt auch für die artenreiche Krautvegetation. Insgesamt ist die Gehölzvegetation der Niederungen und mares in acht Gesellschaften gegliedert; die einzelnen Einheiten zeigen Übergänge miteinander. Die Krautvegetation der Niederungen enthält ebenfalls sudanische Arten. Sie lässt sich in drei Gesellschaften gliedern, die z.T. nur ein kleines Verbreitungsgebiet haben. Einige Uferabschnitte sind stark degradiert und vegetationslos. Die oftmals röhrichtartige Krautvegetation der mares ist ebenfalls in Abhängigkeit der Überflutungshöhe gegliedert, allerdings kommen an den einzelnen mares teilweise unterschiedliche Einheiten vor. Die Melochia corchorifolia-Gesellschaft steht im Mittelpunkt der Krautvegetation der mares, während die Brachiaria mutica-Gesellschaft für die nicht oder nur wenig überfluteten Bereiche typisch ist. Die Gehölzvegetation der Dünenzüge lässt sich im Untersuchungsgebiet in neun Gesellschaften gliedern. Diese gruppieren sich in einem artenreichen Block wenig beeinflusster Bereiche und in einem relativ artenarmen Block intensiv genutzter Dünenabschnitte. Bestände, die zur Pterocarpus lucens-Gesellschaft gestellt werden, bilden auf abgelegenen Dünenzügen kleine Wäldchen. In diese Gesellschaft werden auch die Bestände der brousse tigrée eingegliedert. Es sind in der Region nur noch wenige Flächen mit intakter brousse tigrée vorhanden. Anhand von zwei Strukturprofiltransekten wird ihre floristische und räumliche Struktur mit vier Zonen veranschaulicht. Pterocarpus lucens und Combretum micranthum sind die beiden dominanten Gehölzarten. Im Untersuchungsgebiet ist die Combretum glutinosum-Zentralgesellschaft weit verbreitet. Durch zwei Ordinationsdiagramme wird der ökologische Schwerpunkt wichtiger Dünenarten aufgezeigt. Die numerische Klassifikation lässt sich gut mit der manuellen Klassifikation in Übereinstimmung bringen. Die Krautvegetation der Dünen ist in sieben Gesellschaften mit vielen, z.T. relativ artenarmen Untereinheiten gegliedert, deren ökologische Bindung aufgrund eines starken, nivellierenden Beweidungseinflusses nicht immer geklärt werden kann. Es dominieren annuelle Arten; viele der Arten kommen in anderer Artenkombination auch in der Sudanzone vor. Daneben zeigt sich eine floristische Verwandtschaft zur Sahara. Unter Bäumen wächst die Achyranthes aspera-Gesellschaft. Krauteinheiten, die in anderen Landschaftseinheiten ihren Verbreitungsschwerpunkt haben, sind auf den Dünenzügen ebenfalls vorhanden, z.B. die Enteropogon prieurii-Gesellschaft der Inselberge und die Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft des glacis. Es ist keine floristische Differenzierung entlang des Niederschlagsgradienten erkennbar. Hirsefelder sind mit Kulturbaumparks bestanden. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft gewinnt auch auf den Dünenzügen an Bedeutung. Die Ergebnisse werden in Beziehung zu den in der Literatur vorhandenen, oftmals auf formationskundlichen Kriterien beruhenden Klassifikationen in Beziehung gesetzt. Je nach verwendetem Verfahren und Distanzmaß liefert die numerische Klassifikation unterschiedliche Ergebnisse, die sich nur zum Teil mit der Klassifikation in Deckung bringen lassen. Durch die Betrachtung der aktuellen Verjüngung, aus den Ergebnissen und ihrer Diskussion werden Aussagen über die aktuelle Vegetationsdynamik abgeleitet. Aktuelle Strukturveränderungen der Vegetation sind mit einem Landnutzungswandel verbunden. In erster Linie handelt es sich um Degradation, für die Beispiele auch aus der Literatur gegeben werden. Auf den Inselbergen gehen artenreiche Bestände zurück, gleichzeitig wandern Arten von den glacis-Flächen her ein. Auf dem glacis sind einerseits eine Artenverarmung, andererseits eine Verbuschung tiefliegender Bereiche sowie eine floristische Homogenisierung vieler Flächen zu beobachten, letzteres gilt auch für die Dünenzüge. An den mares und Niederungen findet ebenfalls eine floristische Verarmung statt, sudanische Arten sterben wie auch auf den Dünenzügen aus. Klimaungunst und vor allem Überbeweidung als mögliche Ursachen für den Vegetationswandel werden diskutiert.
I) Durch die vielen Extrem-Faktoren, die im Seewinkel zusammentreffen, erscheint dieses Steppengebiet, das östlich des Neusiedlersees gelegen ist, als besonders geeignetes Untersuchungsobjekt, sowohl für faunistische als auch für ökologische Forschungen. II) Die geologischen Verhältnisse und III) die Entstehungstheorien der Lacken werden in großen Zügen skizziert. IV) Das Klima ist als kontinental zu bezeichnen, es unterscheidet sich aber vom typischen Steppenklima der Ungarischen Tiefebene. V) Die Salzlacken sind durch eine hohe Alkalinitkit, bedeutende Salzgehalte, die zum Großteil auf Soda zurückzuführen sind, ihre große Härte, vor allem aber die Schwankungen im Ionenverhältnis und in der Gesamtkonzentration gekennzeichnet. Die Brunnen sind ebenso wie die Schottergruben als Süßwasser anzusprechen. VI) Es wurden insgesamt 32 Locken, 3 Brunnen, 3 Schottergruben und 7 Kanäle auf ihre Turbellarienfauna untersucht. VII) Die in den Gewässern gefundenen Turbellarien (30 an der Zahl) werden systematisch geordnet. Auch ihre Verteilung auf die einzelnen Lacken in den verschiedenen Monaten wird erläutert. Castrada gigantea ist eine neue Castrada-Art, die in zwei chemisch sehr verschiedenen Lacken gefunden wurde. Die allgemeine Organisation weicht von der der anderen Castraden nicht ab, auffallend ist hier lediglich der sehr große Kopulatiol1sapparat und die eigenartige "pflastersteinartige" Bestachelung der Bursa. Es sind vor allem die Karbonat-, in geringem Maße die Chlorid- und Sulfatkonzentrationen, die für das Artengefüge ausschlaggebend und als auslesender Faktor wirksam sind. Die meisten Turbellarien vertragen nur mittlere und niedere Konzentrationen, die Art der Ionen scheint dann eine untergeordnetere Rolle zu spielen. VIII) Zur Autökologie der Arten in den einzelnen Gewässertypen wird Stellung genommen und mit ihrem von anderen Autoren beschriebenen Vorkommen verglichen. Auf Grund der großen jahreszeitlichen Temperaturschwankungen ist es verständlich, daß wir im Gebiet einen starken Faunenwechsel vermerken können. In den Lacken haben die Temperaturänderungen aber gleichzeitig eine solche der Konzentration zur Folge, diese beiden Faktoren ließen sich nur im Experiment trennen. Man findet in den Lacken hauptsächlich Frühjahrsformen, einige davon erscheinen neben neu hinzutretenden auch im Herbst. Stenostomum leucops ist die einzige Art, die das ganze Jahr hindurch zu finden ist. Übersichtlich sind die Verhältnisse in den Brunnen, da hier die Schwankungen im Chemismus nicht so groß sind. Da das Brunnenwasser viel kühler ist und auch im Sommer nicht versiegt, können sich hier mehrere Arten über das ganze Jahr behaupten. IX) Abschließend wird auf den Entwicklungszyldus von Monocystella Arndti, einer parasitischen Gregarine, die in den Planarien des Brunnens am Sandeck vorkommt, eingegangen.
Zur Toxikologie des Antimons
(1927)
Antimontrioxyd, Antimonpentoxyd, Kaliumantimoniat, Natriummetantimoniat und Brechweinstein wurden, zum Teil mehrere Monate lang, an Ratten, Mäuse, Hunde und Katzen verfüttert. Dabei ergab sich, daß Ratten und Mäuse verhältnismäßig große Mengen von Antimontrioxyd, Antimonpentoxyd und Natriummetantimoniat ohne schwerere Gesundheitsschädigung ertragen. Einmalige Dosen von 2–3 g dieser Verbindungen sind für Ratten so gut wie ungiftig. Daß die praktisch unlöslichen, vom fünfwertigen Antimon abgeleiteten Verbindungen aber für höhere Tiere durchaus nicht harmlos sind, zeigt sich bei Hunden und Katzen deutlich. Hunde sind empfindlicher als die kleinen Nagetiere; sie erkranken nach Darreichung von mehreren Gramm an Verdauungsstörungen, Erbrechen und Durchfällen. Bei Katzen treten nach länger dauernder Zufuhr von Antimontrioxyd und Pentoxyd, etwa nach 450 mg täglich, Krankheitserscheinungen mit Abmagerung auf. Weitaus am giftigsten ist der Brechweinstein; die Erbrechen erregende Dosis liegt für Katzen bei etwa 10 mg per os pro Kilogramm Körpergewicht, für Hunde schon bei etwa 4 mg/kg. Kleine Mengen von Antimonverbindungen, auch von Brechweinstein, können bei wiederholter Darreichung beschleunigend auf das Wachstum junger Ratten wirken, nach größeren Mengen kommt es, auch bei sonst kaum giftigen Antimonverbindungen, zu mehr oder weniger deutlichen Verzögerungen des Wachstums. Für eine Gewöhnung an Antimon ergaben sich keine sicheren Anhaltspunkte.
In der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre Verteilung der beiden Ekto-Nukleotidasen TNAP (gewebeunspezifische Form der alkalischen Phosphatase) und NTPDase2 (Nukleosidtriphosphatdiphosphohydrolase) in den embryonalen, postnatalen und adulten neurogenen Zonen des Mäusehirns untersucht.
• Mittels enzym- und immunhistochemischer Markierungen wurde die TNAP erstmals auf den Zellen der SVZ (subventrikuläre Zone) und des RMS (rostraler Migrationsstrom) nachgewiesen.
• Immunhistochemische Doppelfärbungen von Gewebeschnitten und von akut isolierten Zellen aus der SVZ adulter und postnataler (P15) Mäuse zeigten, dass die TNAP von allen drei Typen neuronaler Vorläuferzellen (Typ B-, C- und A-Zellen) der SVZ exprimiert wird.
• Enzymatische Markierungen verschiedener Embryonal- und Postnatalstadien (ab Embryonalstadium14, E14) ergaben, dass die TNAP schon im Stadium E 14 im Bereich der Seitenventrikel exprimiert wird:
o In den frühen Embryonalstadien lag die TNAP über die gesamte Gewebedicke, von der ventrikulären bis zur pialen Oberfläche vor.
o Im Laufe der weiteren Entwicklung war eine im Kortex beginnende und sich später bis in das Striatum ausweitende Reduktion der TNAP-Aktivität zu beobachten. Mit zunehmender Reifung des Gehirns wurde die Schicht der TNAP-positiven Zellen dünner und beschränkte sich schließlich auf die SVZ.
• Die NTPDase2 war erst im Zeitraum zwischen E18 und P2 nachweisbar. Sie war im Bereich der Seitenventrikel lokalisiert und auf die an die Ventrikel angrenzenden Zellen beschränkt. Im Laufe der weiteren Entwicklung wandern die NTPDase2-positiven Zellen offensichtlich in die SVZ ein und ab P14 waren sie zu hüllartigen Strukturen angeordnet, die eine Doppelmarkierung für TNAP und NTPDase2 aufwiesen und Gruppen DCX-positiver Zellen (Typ-A Zellen, Neuroblasten) umschlossen.
• Die Markierung mit dem Neuroblastenmarker DCX war bereits zum Stadium E14 möglich. In diesem Altersstadium wurden lediglich die Zellen im Bereich des Kortex gefärbt. Im Laufe der postnatalen Entwicklung verlagerten sich die DCX-positiven Zellen ihren Schwerpunkt in den Bereich der SVZ. Bereits ab P10 lagen in der SVZ Gruppen von DCX/TNAP-doppelpositiven Zellen vor, Anzeichen für eine Konzentrierung der Neurogenese auf die SVZ.
• Die Ausschaltung des TNAP-Gens (TNAP-Knockout-Mäuse) hatte keinen offensichtlichen Einfluss auf die Ausbildung der Seitenventrikel oder die Ausbildung und zelluläre Zusammensetzung der SVZ.
• In der zweiten wesentlichen neurogenen Zone des Säugerhirns, dem Gyrus dentatus des Hippokampus, konnte die TNAP nicht nachgewiesen werden, obwohl die dortigen Vorläuferzellen NTPDase2 exprimieren.
Die vorliegenden Daten belegen erstmals eine Assoziation der TNAP mit neuronalen Vorläuferzellen und erlauben zusammen mit den Markierungen für NTPDase2 und weitere zelluläre Marker neue Einsichten in die zelluläre Entwicklung der adulten SVZ. Darüber hinaus stützen sie die Vorstellung einer Beteilung purinerger Signalwege an der Steuerung der embryonalen, postnatalen und adulten Neurogenese.
Die Gattung Phormictopuswurde im Jahre 1901 von POCOCK aufgestellt. In seine neue Gattung nahm er als Typusart Mygale cancerides LATREILLE, 1806 von der Insel Hispaniola auf, dazu kam Lasiodora cautus AUSSERER, 1875, eine Art, die ohne Angabe des locus typicus beschrieben worden war. Bisher waren 14 Arten und 2 Unterarten bekannt, von denen 5 aus Südamerika stammen. Die vorliegende Arbeit reduziert die Artenzahl auf 12, wobei 5 neue Arten beschrieben und 4 synonymisiert, 3 zu nomina dubia (Typus verschollen), und 3 "incertae sedis" (in andere Gattungen gehörig) erklärt werden.
Traditionell-morphologisch begründete Hypothesen zur Großphylogenie der Metazoa sind im Verlauf der letzten Jahre durch molekularbiologische Untersuchungen grundsätzlich in Frage gestellt worden. Die molekularbiologisch begründete Metazoen-Großphylogenie wird seit einem Übersichtsartikel von ADOUTTE et al. (2000) meist als „New Animal Phylogeny“ bezeichnet (kurz: NAP); sie beinhaltet eine Restrukturierung des Stammbaumes (kladogenetischer Aspekt) und die Infragestellung einer morphologischen Komplexitätssteigerung nach dem Schema acoelomat-pseudocoelomat-coelomat (anagenetischer Aspekt). Hinsichtlich der Kladogenese steht die Neueinteilung der Bilateria in drei Superphyla Deuterostomia, Ecdysozoa und Lophotrochozoa im Vordergrund; die Genealogie innerhalb dieser drei Großgruppen ist aber z.Z. relativ schlecht aufgelöst, so daß sich Vergleichsmöglichkeiten mit morphologischen Vorgängermodellen schnell erschöpfen. Aus diesem Grunde wird in vorliegender Arbeit der anagenetische Aspekt als Ausgangspunkt für eine umfassende morphologische Interpretation der molekularbiologischen Resultate gewählt. Momentan wird auf molekularsystematischer und vergleichend-entwicklungsgenetischer Basis davon ausgegangen, daß die frühesten Bilaterier eine acoelomate Organisation aufwiesen, von hier aus eine relativ komplexe, polymer-coelomate Organisation erwarben, welche dann aber in zahlreichen Bilaterierlinien sekundär reduziert wurde. Die ursprünglich acoelomate Organisation wird rezent nur durch eine sehr isolierte Linie, die Acoela (ggf. auch Nemertodermatida) vertreten, während alle anderen Bilaterier von einem polymer-coelomaten „Urbilaterier“ abstammen sollen. In vorliegender Arbeit wird die Auffassung vertreten, daß die morphologische Deutung eines solchen anagenetischen Szenarios am ehesten anhand der Hydroskelett-Theorie von W. F. GUTMANN (1972 et mult.), sowie späteren auf diesem Entwurf aufbauenden Arbeiten (insbesondere der Gallertoid-Hypothese, BONIK et al. 1976) möglich ist, d.h. auf konstruktionsmorphologischer Grundlage. Um den Nachweis einer weitgehenden Übereinstimmung von NAP und Gallertoid-Hydroskelett-Theorie zu führen, werden für 36 Metazoenbaupläne (4 Nonbilaterier, 32 Bilaterier) aktuelle molekularphylogenetische Befunde den jeweiligen konstruktionsmorphologischen Interpretationen gegenübergestellt. Für die vier Nonbilateria-Linien ergibt sich eine Vereinbarkeit auf kladogenetischer Ebene insbesondere dann, wenn die Placozoa vor den Porifera abzweigen (z.Z. aufgrund von mtDNADaten anzunehmen); auf anagenetischer Ebene aufgrund von Studien, welche die „Diploblastica/ Triploblastica“-Unterteilung in Frage stellen (Mesoderm-Problem). Für die Bilateria ist u.a. festzuhalten, daß im Rahmen der Hydroskelett-Theorie kein Schwestergruppenverhältnis Annelida + Arthropoda angenommen wurde, so daß die umstrittene neue Großgruppe Ecdysozoa unproblematisch ist: Ecdysozoa werden durch Ableitung der „Aschelminthen“ von polymeren Vorformen einer Deutung zugänglich. Die Molekularsystematik der Annelida, aber auch der Deuterostomia ist mit konstruktionsmorphologischen Interpretationen vereinbar, bei den Deuterostomia v.a. der hochderivierte Status der Pterobranchia und Tunicata. Als kennzeichnendste Übereinstimmung ist die Einordnung der Tentaculata als hochabgeleitete Protostomier hervorzuheben, was sowohl als „Grundstein“ der NAP gilt (HALANYCH et al. 1995) als auch eine sehr spezifische Position der Hydroskelett-Theorie darstellt. Es wird gefolgert, daß die Gallertoid- Hydroskelett-Theorie zentrale Resultate der NAP besser zu integrieren vermag als andere Entwürfe. Konsequenzen für merkmalsmorphologische Deutungen werden aufgezeigt.
Wein-fränkisches Terroir
(2002)
Das Leben aller Organismen wird grundlegend durch den tages- und jahreszeitlich bedingten Wechsel der Beleuchtungsverhältnisse geprägt. Die Anpassung der Stoffwechselprozesse und Verhaltensweisen an diese Oszillationen erfolgt nicht passiv, sondern wird durch eine innere Uhr gesteuert. Tageszeitliche Rhythmen, die auch ohne den Einfluss äußerer, periodisch verlaufender Umgebungsreize (Zeitgeber) ablaufen, werden als zirkadiane Rhythmen bezeichnet. Im Säugetier steuert ein endogener Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) zirkadiane Rhythmen, indem er periphere Oszillatoren miteinander synchronisiert. Auf molekularer Ebene besteht dieser endogener Rhythmusgenerator aus Aktivatoren (BMAL1 und CLOCK/NPAS2) und Inhibitoren (PER1/2 und Cry1/2), die in Rückkopplungsschleifen die Grundlage für die Rhythmogenese steuern. Die Synchronisation dieses molekularen Uhrwerkes an die Umgebungszeit erfolgt durch Licht, das in der Retina wahrgenommen und an das SCN weitergeleitet wird. Die Signaltransduktionskaskaden nach einem Lichtpuls in der frühen und der späten Nacht unterscheiden sich dabei wesentlich: Ein Lichtpuls während der frühen Nacht führt zu einer erhöhten Freisetzung von Ca2+-Ionen über Ryanodin Rezeptoren (RYR), während ein Lichtpuls während der späten Nacht zu einer erhöhten Guanylylcyclase Aktivität führt. Um zu untersuchen, wie der endogene Rhythmusgenerator seinen Lichteingang reguliert, wurde die Licht-vermittelte Phasenverzögerung in BMAL1+/+- (profizienten) und BMAL1-/-- (defizienten) Mäusen untersucht. Die Befunde aus den in-situ Hybridisierungsstudien, RTQ-PCR und immunhistochemischen Untersuchungen dieser Arbeit zeigten, dass in BMAL1-/--Mäusen die Licht-induzierte mPer-Expression während der frühen Nacht selektiv beeinträchtigt ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass die mRNA- und Proteinmengen von RYRs in BMAL1-/--Mäusen dramatisch reduziert waren. Ryr1:: und Ryr2::Luciferase-Reportersstudien zeigten darüber hinaus, dass die Ryr-Expression durch CLOCK/BMAL1 aktiviert und durch CRY1inhibiert werden kann. Diese Ergebnisse liefern den ersten Beweis dafür, dass der endogene Rhythmusgenerator des Säugers die Signalübertragung seines eigenen Lichteingangs regulieren kann. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und in einem Melatonin-abhängigen peripheren Oszillator, der PT, untersucht und miteinander verglichen. Dazu wurden die Uhrengenproteine im fetalen (E18), postnatalen (P2 & P10) und adulten SCN und in der PT von C3H-Mäusen zu vier verschiedenen zirkadianen Zeitpunkten mittels Immunhistochemie untersucht. Die Anzahl immunreaktiver SCN-Zellen gegen alle untersuchten Uhrengenproteine (außer BMAL1) war im Fetus signifikant niedriger, als in der adulten Maus. Auch im SCN neonataler (P2) Mäuse erreichte die Anzahl immunreaktiver Zellen noch nicht das Niveau der adulten Maus. Erst 10 Tage nach der Geburt (P10) zeigen alle Uhrengenproteine im SCN ein adultes Verteilungsmuster. Offenbar reift das Uhrwerk im SCN von Mäusen graduell während der postnatalen Entwicklungsphase. Dabei besteht eine zeitliche Korrelation zwischen der Reifung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und der Ausbildung von inter-suprachiasmatischen und retino-suprachiaamatischen neuronalen Kontakten. Im Gegensatz zum SCN zeigte der Melatonin-abhängigen Oszilllator in der PT bereits im Fetus einen nahezu vollständig ausgeprägten Rhythmus der Uhrengenproteine. Da das fetale Pinealorgan noch nicht zur rhythmischen Melatonin-Synthese fähig ist, liegt es nahe, dass das mütterliche Melatonin die rhythmische Expression der Uhrengene in der fetalen PT reguliert. Wie in vitro Untersuchungen an PER2::LUCIFERASE-Mäusen zeigten, hat das mütterliche Melatonin offenbar auch einen modulierenden Einfluss auf den fetalen SCN. Bei diesen Mäusen konnte im fetalen und postnatalen SCN ein zirkadianer Rhythmus in der PER2-Synthese nachgewiesen werden, der eine relativ lange Periodenlänge aufwies und nach 3 Tagen zum Erliegen kam. Eine Stimulation mit Melatonin führte zu einer deutlichen Verkürzung der Periodenlänge im PER2-Rhythmus. Folglich scheint das mütterliche Melatonin eine wichtige Quelle für Informationen der Umgebungszeit im Fetus zu sein. Um die Uhrengenexpression während der Maus-Ontogenese in vitro auf zellulärer Ebene darzustellen, wurde in dieser Arbeit zudem ein vom murinen Per2-Promoter angetriebenes DsRed- Reportersystem etabliert und der Versuch begonnen, eine darauf basierende transgene Maus zu generieren.
Da die gesamte Arbeit nur einen vorläufigen Überblick über das bearbeitete Gebiet gibt, können nur wenige Punkte hier herausgegriffen werden. Die Artendichte ist in der Kieler Bucht in der Vegetationszone (= Phytal) am größten, es folgt die Sandregion, am geringsten ist sie in der Schlammzone. Die Tiere des Phytals, der Sandregion und der Schlammregion zeigen in ihrer Organisation wesentliche Unterschiede. Im Sand ist die Mikrofauna stark, die Makrofauna gering entwickelt, in der Schlammregion umgekehrt. Die Verteilung der sessilen, der hemisessilen und der haptischen Tiere mit ihren Haftorganen auf die drei Hauptbiotope wird untersucht. Die Sandregion ist durch Fehlen der sessilen Tiere, Armut an hemisessilen, aber großer Reichtum an haptischen Tieren ausgezeichnet. Die haptischen Tiere des Sandes besitzen besonders Haftröhrchen, Haftpapillen und Haftringe als Haftorgane und diese in großer Zahl und weit über den Körper verteilt. Im Phytal erreichen die sessilen Tiere ihre maximale Arten- und Individuenzahl, in der Schlammregion dominieren die hemisessilen Arten. Die Lokomotion durch Wimperbewegung ist in der Sandregion am reichsten entwickelt (Kriechen auf Wimpern), wird im Phytal geringer und tritt in der Schlammregion ganz zurück. Eine Übersicht über die Ernährungstypen ergibt, daß im groben Sand die Diatomeenflora der Sandoberfläche als wichtigste Nahrungsquelle der Mikrofauna zu betrachten ist. Im Phytal existieren drei Nahrungswege: 1. Ein Weg von den Partikeln des freien Wassers über Mikrophagen zu einer Mikrofauna und Makrofauna ohne Einschaltung der Nährstoffe der Pflanzen des Phytals. Diesem Weg gehören im gesamten Phytal über ein Drittel der Arten an, im Extremfalle (tiefe Fucusregion) weitaus die Mehrzahl. 2. Ein Weg von der epiphytischen Mikroflora zu einer Mikro- und Makrofauna. 3. Ein Weg von den Teilen der Großpflanzen (Laminaria, Fucus, Zostera, Delesseria) zu einer Mikrofauna und Makrofauna. Diesem letzten Nahrungsweg gehören auffallend wenige Tierarten an, relativ am größten ist der Anteil in der Seegras- und der Ulvaregion. Eine Gliederung in Biozoenosen mit besonderer Berücksichtigung der Mikrofauna ergibt für das Benthal, 6 Unterbiozoenosen, 4 davon (die Halammohydra-Biozoenose, die Turbanella-hyalina-B., die Arenicola-B. und die Otoplanen-B.) gehören der Sandregion, 2 (Corbula-B. und Laophonte-horrida-B.) gehören der Schlammregion an. Das Phytal zeigt trotz der starken Biotopunterschiede nur geringe qualitative Unterschiede seiner Fauna, jedoch starke Verschiedenheiten in der Artenzahl, die wohl in erster Linie auf den verschiedenen durchschnittlichen Salzgehalt der Biotope zurückzuführen sind. Die maximale Besiedelungsdichte zeigt die tiefe Fucusregion.
Camponotus ist die erfolgreichste Ameisengattung der Welt. Neben Pheidole und Crematogaster weist sie die meisten Arten, die höchste Dispersion und die größte Variabilität in morphologischer, ethologischer und ökologischer Hinsicht auf. Die Ursachen dieses Erfolges zu erkennen, war bisher nicht möglich, da nur fragmentarische Ergebnisse aus Freiland- und Laboruntersuchungen zur Verfügung standen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Biologie und Ökologie ausgewählter Arten und gibt einen Einblick in die Komplexität ihrer Lebensstrategien. Um zu klären, welche ethologischen und ökologischen Anpassungen zur Gesamtfitness der Arten beitragen, wurden acht Arten der Gattung Camponotus in vier unterschiedlichen Habitaten ausgewählt. C. vagus und C. ligniperda in Laubmischwäldern Deutschlands, C. cruentatus und C. truncatus im mediterranen Klima der Pyrenäenausläufer Südfrankreichs, C. gombaki und C. gigas in offenen Park- und Uferregionen Malaysias sowie C. texens und C. gombaki im tropischen Sekundärwald der malaiischen Halbinsel. Das Verhalten dieser Arten wurde in den für das Überleben einer Kolonie zentralen Bereichen, nämlich Nisten, Außenaktivität und Nahrungserwerb untersucht. Als soziale Insekten sind Ameisen auf permanente und effektive Kommunikationssysteme angewiesen. Deshalb wurde die Rekrutierung, die mit Nestumzug und Nahrungserwerb im Zusammenhang steht, in das Untersuchungsprogramm aufgenommen. Unter Einbeziehung bereits publizierter Daten wird es möglich, den Erfolg von Camponotus zu verstehen. ...
In einem ausführlichen Verzeichnis sind alle bayerischen Fundorte mit näheren Angaben zusammengestellt. Darüber hinaus soll ein Überblick über die Verbreitungsverhältnisse der Art in Europa und auf der Erde vermittelt werden. Die bis heute bekannte Verbreitung tn Europa läßt den Schluß zu, daß Octodiceras fontanum mit großer Wahrscheinlichkeit noch an vielen Stellen aufzufinden sein wird. Die bryosoziologischen Verhältnisse des Octodiceratetum werden durch soziologische Aufnahmen aus Ostbayern belegt. Der Vergleich mit Literaturangaben aus anderen europäischen Gebieten ergibt eine recht einheitliche Ausbildung dieser Wassermoosgesellschaft. Außerdem wird versucht, die ökologischen Verhältnisse des Octodiceratetum zu erfassen. Die entsprechenden Ausführungen müssen sich dabei v.a. auf die Untersuchungen in Ostbayern stützen, da aus anderen europäischen Gebieten nur wenige, vergleichbare Angaben vorliegen. Es wird daher in erster Linie angestrebt, vergleichbare Werte für zukünftige Untersuchungen in anderen Gebieten zu liefern. Die derzeitige Kenntnis des ökologischen Faktorenkomplexes für Octodiceras fontanum läßt noch manche Frage offen. Das Literaturverzeichnis enthält den Großteil der Veröffentlichungen über europäische Octodiceras-Standorte. Es wurden bewußt nur die Arbeiten aufgenommen, die auch eingesehen werden konnten.
Australia has a diversity of vectors and vector-borne human diseases. Mosquito-borne arboviruses are of greatest concern, but there are issues with other vector and pathogen systems. Mosquitoes were responsible for more than 35,000 cases of Ross River virus during 1991-1997. Barmah Forest virus is increasing nationwide, and unidentified bunyaviruses suspected of causing illness have been isolated. Cases of Murray Valley encephalitis have occurred in 14 of the past 20 years in northern Australia. Dengue is a continuing problem for northern Queensland, with various serotypes being active. Japanese encephalitis has appeared in the Torres Strait Islands and threatens mainland Australia. Although malaria is eradicated, almost 1,000 cases are imported annually and occasional cases of local transmission occur. With ticks, paralysis in children occurs annually in eastern Australia. Tick typhus (Queensland Tick Typhus--Rickettsia australis) occurs down the east coast, and (Flinders Island Spotted Fever--Rickettsia honei) in Bass Strait and probably Tasmania. Lyme disease is reported but its presence is controversial. Fleas were responsible for a recent outbreak of murine typhus (Rickettsia typhi) in Western Australia. Mites cause scrub typhus (Orientia tsutsugamushi), and there was a recent fatality in the Northern Territory. Overall, resources for investigation and control of vector-borne disease have generally been meager. However, various avenues of basic and applied research have been pursued, and have included investigations into mosquito ecology, vector competence, disease epidemiology, and vector control. Disease surveillance programs vary between states, and mosquito control programs are organized and effective in only a few regions. There are concerns for import of vectors such as Aedes albopictus and export of pathogens such as Ross River virus; the former has occurred but the species has not become established, and the latter has occurred and has resulted in a major outbreak in the South Pacific. The predicted scenarios of increased temperature and rainfall with global warming are also causing concern for increases in vector-borne diseases, particularly the endemic arboviruses. Interest by health authorities is gravitating more towards epidemiological reporting and less towards public health action. In many respects, humans have much to do to get "on top" of vectors and their pathogens "down under" in Australia.
Untersuchungen über die antialkoholische Wirkung des Faltentintlings, Coprinus atramentarius Bull
(1959)
Untersuchungen zur ZNS-Bioverfügbarkeit wirksamkeitsbestimmender Inhaltsstoffe von Johanniskraut
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde die ZNS-Bioverfügbarkeit der Quercetin-Flavone und der Naphthodianthrone aus Hypericum perforatum untersucht. Hierzu wurde jew. eine HPLC-gestütze Methode zur Quantifizierung der genannten Stoffe in ZNS und Plasma erstellt und in enger Anlehnung an internationale Richtlinien (ICH- u. FDAGuidelines) validiert. Mit Hilfe dieser Methoden wurden im Anschluss Rattenfütterungsstudien durchgeführt und ausgewertet. Im Falle der Quercetin-Flavone konnte eindeutig gezeigt werden, dass diese Stoffgruppe ZNS-bioverfügbar ist und bei wiederholter Gabe (1 x tgl.) über den beobachteten Zeitraum von 8 Tagen im ZNS kumuliert. Ferner ist es gelungen, erste ZNS-Spiegelkurven der Quercetin-Flavone nach Einmal- und Mehrfach-Gabe aufzuzeichnen. Im Gegensatz hierzu weisen die Naphthodianthrone, unter Berücksichtigung der analytischen Grenzen, keine ZNS-Bioverfügbarkeit auf. Betrachtet man diese Ergebnisse im Kontext der bisher erschienenen Publikationen zu Johanniskraut, lässt sich sagen, dass durch die vorliegende Arbeit die Rolle der Flavonoide eindeutig an Bedeutung gewinnt und die der Naphthodianthrone eindeutig an Bedeutung verliert. Schaut man auf die bisher untersuchten Inhaltsstoffe von Johanniskraut, wird deutlich, dass den Phloroglucinolen die wohl herausragendste Bedeutung zukommt, was nicht zuletzt durch Keller et al.[137] und Müller et al. [27,59,67] gezeigt werden konnte. Für die klinische Wirksamkeit des Hypericum-Extraktes sind jedoch auch die Flavonoide essentiell, was durch Tierstudien gezeigt und durch diese Arbeit unterstüzt werden konnte[114]. Der Mechanismus, durch den die Flavonoide zur antidepressiven Wirksamkeit beitragen, liegt, im Gegensatz zu dem der Phloroglucinole, jedoch noch im Dunklen. Durch die Präsenz von Quercetin bzw. dessen Metaboliten im ZNS auf der einen und den Ergebnissen von Tierstudien zur antidepressiven Wirksamkeit isolierter Flavonoide mit Hilfe des Porsolt-Tests auf der anderen Seite[33] lässt sich jedoch spekulieren, dass die Flavonoide einen direkten antidepressiven Effekt ausüben und nicht nur indirekt durch Verbesserung, beispielsweise der ZNS-Bioverfügbarkeit der Phloroglucinole o. ä., zu den antidepressiven Eigenschaften des Extraktes beitragen. Durch ihr Unvermögen, die Blut-Hirn-Schranke in nennenswerten Konzentrationen zu überschreiten, treten die Naphthodianthrone, die in der Vergangenheit als für die Wirksamkeit wichtigsten Inhaltsstoffe angesehen wurden, eindeutig in den Hintergrund. Als Beitrag dieser Stoffgruppe zur antidepressiven Wirksamkeit ist demnach erstens ein wie auch immer gearteter indirekter Effekt durch Verbesserung der ZNS-Bioverfügbarkeit der ZNS-gängigen Substanzen, zweitens ein wegen der bestenfalls möglichen, niedrigen Konzentrationen schwacher antidepressiver Effekt im ZNS, drittens ein antidepressiver Effekt durch aktive Metaboliten oder viertens ein antidepressiver Effekt, der sich in der Peripherie beispielsweise durch Beeinflussung der HPA-Achse abspielt, denkbar. Für ersteres existieren bis dato keinerlei Anhaltspunkte, für den zweiten Punkt existieren weder Beweis noch Gegenbeweis noch Spekulationen in der Literatur, dasselbe gilt für den dritten Punkt, der vierte Punkt wird hingegen kontrovers diskutiert[44,97,143]. In Publikationen wurde hierzu festgestellt, dass unter dem Einfluss von Hypericin sich die Blutspiegel an Cortisol und ACTH, die bei Depressiven erhöht bzw. gestört sind, wieder normalisieren. Der Einwand der Kritiker dieses Wirkmodells scheint hierbei aber plausibel, da es sich bei dem mit Hilfe von Hypericin beeinflussbaren, beobachteten Phänomen der Erhöhten Cortisol- und ACTH-Plasmaspiegel auch nur um ein Symptom einer Depression und nicht um einen für die Depression ursächlichen Vorgang handeln kann. Nicht jeder, bei dem erhöhte Cortisol- und veränderte ACTH-Spiegel vorliegen ist zwangsläufig depressiv. Das exakte Zusammenspiel der einzelnen Extrakt-Komponenten, von denen die bisher in den Focus der Untersuchungen geratenen Stoffe nur etwa 10 bis 15% ausmachen, bleibt jedoch auch weiterhin zum größten Teil im Unklaren, wenngleich gerade dieses Zusammenspiel die besonderen Eigenschaften des Extraktes und dessen Wirkung ausmachen. Unverzichtbare Bestandteile sind hierbei Phloroglucinole und Flavonoide, die in angemessenen Konzentrationen im Extrakt repräsentiert sein müssen, um ein klinisch hochwertiges Produkt zu gewährleisten. Inwieweit ein repräsentativer Gehalt an Hypericinen im Extrakt vorhanden sein sollte, ist nicht zuletzt auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit mit einem Fragezeichen zu versehen, wenngleich die Datenlage zur Zeit keinesfalls ausreicht, die Hypericine gänzlich aus dem Extrakt zu verbannen. In wie weit die An- oder Abreicherung einzelner Komponenten zu einer Verbesserung der klinischen Wirksamkeit führt, muss jedoch stets in zusätzlichen Studien eruiert werden. Insgesamt steht aber mit dem Johanniskraut-Extrakt für die erfolgreiche Therapie von milden bis mittelschweren Depressionen ein wichtiges, fast unverzichtbares Werkzeug zur Verfügung, das sich insbesondere durch sein verglichen mit synthetischen Antidepressiva, überaus günstiges Profil an unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen auszeichnet. Trotz in jüngster Zeit propagierter Bedenken hinsichtlich der Unbedenklichkeit der Anwendung von Johanniskraut Extraktpräparaten besonders in Kombination mit anderen Arzneistoffen, was jedoch einer genaueren Betrachtung nur schwer standhält[144], stellt der Johanniskraut-Extrakt zur Behandlung milder bis mittelschwerer Depressionen ein unverzichtbares Werkzeug dar.
Das Y-Chromosom war, mit Ausnahme der Pseudoautosomalen Regionen, während der Genomevolution einer enormen Veränderung unterworfen, die zu einem weitesgehenden Verlust oder der Inaktivierung von Genen führte, die nicht in den Prozess der Geschlechtsdetermination bzw. –differenzierung, oder Spermatogenese involviert sind. Gleichzeitig kam es durch Amplifikation von funktionellen Kopien der Spermatogenesespezifischen Genen zu sog. amplifikonischen Genfamilien, die fast ausschliesslich im Testis exprimiert werden. TSPY (Testis Specific Protein Y-encoded) ist nach bisherigen Untersuchungen mit 35 Kopien, bestehend aus funktionellen Kopien und inaktiven Pseudogenen, die grösste und homogenste Protein-kodierende amplikonische Genfamilie auf dem Y-Chromosom und wurde im Rahmen dieser Arbeit genauer analysiert. Es wird unter normalen Bedingungen in den Spermatogonien des Testis exprimiert, aber es ist auch eine aberrante Expression in malignen Geweben, wie Gonadoblastom, Carcinoma in situ (CIS) des Testis oder in einer Fraktion von Prostatakarzinomen detektierbar. Aufgrund der Expression und der korrelierten Kopplungsanalyse wurde postuliert, dass es sich bei TSPY um ein Kandidatengen für den sog. Gonadoblastom-Locus auf dem Y-Chromosom (GBY) handelt. TSPY gehört ausserdem aufgrund einer evolutionär konservierten Domäne zur Familie der SET/NAP-Proteine. Andere Mitglieder dieser Familie sind z.B. in Proliferation, Zell-Zyklus-Regulation, Chromatin-Umbau und Kerntransport involviert. Durch die Analyse der TSPY-Transkription konnte anhand des LNCaP-Zellkultursystems die postulierte Androgen-abhängige TSPY-Transkription widerlegt werden. Zusätzlich wurden zwei TSPY-Transkripte unterschiedlicher Grösse und Transkriptionsraten detektiert, wobei das grössere Transkript TSPY-S stärker exprimiert wird als das kleinere Transkript TSPY-L. Ursache hierfür ist alternatives Splicing in Intron 4 des TSPY-Gens, das zur Expression der beiden Protein-Varianten mit unterschiedlichen C-Termini führt. Die durchgeführte Haplotyp-Analyse zur Identifizierung transkribierter TSPY-Gene konnte aufzeigen, dass das einzige funktionelle Gen des sog. TSPY minor Clusters (mit dem Haplotyp G-G-18) als einziges nicht alternativ gespliced wird und andererseits das häufigste TSPY-S Transkript (44 %) darstellt. Hierfür wird die Möglichkeit einer „locus-control-region“ diskutiert. Um Interaktionspartner von TSPY-S zu identifizieren und dadurch möglicherweise Hinweise auf die Funktion von TSPY zu erhalten, wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System eingesetzt. Vorversuche lokalisierten eine mögliche Transkriptions-Aktivierungsdomäne im N-Terminus von TSPY, weshalb eine N-terminale Deletion von TSPY-S, die einen grossen Teil der NAP Domäne und den C-Terminus enthält, als Köder eingesetzt wurde, um eine Testis-cDNABibliothek nach interagierenden Proteinen zu durchsuchen. Die Interaktion von TSPY mit den drei interessantesten Kandidaten hTid-1, dem menschlichen Homolog eines Tumor-Suppressor-Gens aus Drosophila, einem Mitglied der Ubiquitin-like-Proteinfamilie Ubiquilin 3 (UBQLN3), das aufgrund der Protein-Struktur eine Funktion bei der Regulation des Zellzyklus haben könnte und Isopetidase T (USP5), einer Ubiquitin-spezifische Protease, die an der proteasomalen Protein-Degradation beteiligt ist wurde durch Co-Transformation verifiziert und genauer analysiert. Immunhistochemische Experimente bestätigten die ausschliessliche zelluläre Lokalisation von TSPY in den Spermatogonien. Es konnten jedoch leichte entwicklungsspezifische Unterschiede gezeigt werden. In post-pubertärem und adulten Testis-Gewebe wird TSPY im Kern und Cytoplasma der mitotischen Spermatogonien exprimiert, aber in einem sehr grossen Anteil der ruhenden Spermatogonien im früh-kindlichen Testis (6 Monate) fehlt ein Kernsignal. Expression der EGFP (enhanced green fluorescent protein) -markierten Wildtyp cDNAs von TSPY-S und –L in HEK-293 Zellen bestätigte eine Protein-Lokalisation in Cytoplasma und Kern. Gezielte Deletion des C-Terminus der EGFP-TSPY-Fusionsproteine führte zur Degradation der Proteine, was die Bedeutung des variablen C-Terminus hervorhebt. Selektive Mutation einer mit den Computer vorhergesagten und durch einen Phosphorylierungs-Assay experimentell bestätigten CK2-Phosphorylierungs-Stelle im C-Terminus von TSPY-S verhinderte die Kern-Lokalisation, was darauf hindeutete, dass die C-terminale Phosphorylierung für die Lokalisation im Zellkern notwendig ist. Für TSPY-L konnte dieses Muster nicht bestätigt werden, da Mutationen im direkten C-Terminus von TSPY-L zur Protein-Degradation führten. Aufgrund der Datenlage wurde die Arbeitshypothese aufgestellt, dass TSPY im Cytoplasma durch CK2 phosphoryliert und in den Zellkern transportiert wird. Nach Androgen-Stimulus und Signal-Transduktion kommt es zur Kern-Lokalisation von CK2 und dadurch zur verstärkten Phosphorylierung von TSPY im Kern. Dort führt die Interaktion von TSPY mit den einzelnen identifizierten Proteinen zur Regulation des Zellzyklus und der mitotischen Proliferation der Spermatogonien, aber auch zur pathologischen Funktion von TSPY bei der Entstehung von Keimzelltumoren. Diese Arbeitshypothese müsste überprüft und verbessert werden, um die Funktion von TSPY bei der Proliferation der Spermatogonien und der Krebsentstehung aufzuklären.
Bis zur Entfaltung der Wirkung eines Pharmakons laufen zahlreiche komplexe Vorgänge ab, die sich in drei wesentliche Phasen unterteilen lassen. Die pharmazeutische Phase umfasst mit der Applikation und dem Zerfall der Arzneiform sowie dem Auflösen des Wirkstoffes Vorgänge, die im wesentlichen von den galenischen Eigenschaften des Arzneistoffes abhängen. In der pharmakokinetischen Phase erfolgt mit der Resorption die Aufnahme des Wirkstoffes in den Organismus, dem sich die Verteilung in die unterschiedlichen Gewebe über die Blutbahn anschließt. Durch verschiedene Eliminationsprozesse wird der Wirkstoff zuletzt wieder aus dem Körper ausgeschieden. Mit dem Erreichen des Wirkortes beginnt die pharmakodynamische Phase, in der die pharmakologischen Effekte des Arzneistoffes zur erwünschten klinischen Wirkung führen. Der Nachweis des Pharmakons am Wirkort in klinisch-relevanten Konzentrationen ermöglicht somit Rückschlüsse auf die Wirksamkeit des Arzneistoffes, aber unter bestimmten Voraussetzungen auch auf dessen Wirkmechanismus. Während mittlerweile ein Großteil neuer Arzneistoffe mit Hilfe unterschiedlicher Mechanismen durch exaktes Drug Targeting an den Wirkort gesteuert werden, weisen andere Substanzen teilweise ungewollt eine gewebespezifische, dirigierende Komponente auf, die neben der eigentlichen Hauptwirkung weitere unterstützende oder auch unerwünschte Effekte auslösen. Von besonderem Interesse ist diese Gewebespezifität für pflanzliche Arzneistoffe, deren Wirkkomponenten bislang noch nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Gemeinsam mit anderen pharmakologischen Befunden kann der analytische Nachweis eines wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffes am Wirkort in ausreichenden Konzentrationen ein weiterer deutlicher Hinweis auf dessen Wirkbeteiligung sein. Besonders vor dem Hintergrund einer rationalen, evidenz-basierten Pharmakotherapie, deren Anforderungen die pflanzlichen Arzneien mittlerweile ebenso wie die synthetischen Wirkstoffe erfüllen müssen, ist die Erforschung sowohl des Wirkprinzips als auch der Pharmakokinetik des Wirkstoffes von besonderer Bedeutung. Obwohl Johanniskrautextrakte bereits seit dem 17. Jahrhundert gegen die Melancholie und somit als Antidepressivum eingesetzt wurden, sind sowohl der exakte Pathomechanismus der Depression als auch die Wirkkomponente und der Wirkmechanismus der Extrakte aus Hyperici herba noch immer Gegenstand umfassender Forschung. Vor allem wegen der geringen Nebenwirkungsrate sind Johanniskrautpräparate gegenüber synthetischen Antidepressiva eine bevorzugte Alternative für die Therapie leichter bis mittelschwerer Depressionen. Ähnlich den Effekten der synthetischen Antidepressiva sind Johanniskrautextrakte in der Lage, durch eine Wiederaufnahmehemmung der Neurotransmitter Noradrenalin, Serotonin, Dopamin, sowie GABA und L-Glutamat deren Konzentration im synaptischen Spalt zu erhöhen, was zu einer nachfolgenden adaptiven Veränderung der jeweiligen Rezeptoren führt. In mehreren Studien konnten diese Effekte vornehmlich den Phloroglucinolderivaten Hyperforin und Adhyperforin zugeordnet werden. Unterstützt wurden diese in vitro und in vivo Befunde durch die Ergebnisse einer Vielzahl verhaltenspharmakologischer Untersuchungen, die einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit in antidepressiven Modellen und dem Gehalt an Hyperforin in den Extrakten ergeben haben. Zahlreiche klinische Studien belegen darüber hinaus die Wirksamkeit und Verträglichkeit von Johanniskrautextrakten. ...
Die Replikation und Pathogenese von HIV ist in hohem Maße von zellulären Faktoren abhängig. Das Virus muss einerseits die protektiven und antiviralen Abwehrmechanismen der Wirtszelle umgehen können und gleichzeitig ist seine Replikation an die Nutzung zellulärer Faktoren adaptiert. Neben der Interaktion mit konstitutionell exprimierten zellulären Proteinen bewirkt das HI-Virus auch eine transkriptionelle Regulation zellulärer Gene, um sich einen für seine Replikation vorteilhaften Funktionszustand der Wirtszelle zu schaffen. Durch eine HIV-Infektion differentiell exprimierte Gene stellen daher potentielle Kandidatengene zur Identifizierung essentieller Wirtsfaktoren oder zellulärer Restriktionsfaktoren der HIV-Replikation dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die durch HIV-Infektion differentiell regulierten Gene LEREPO4, GLiPR, SCC-112 und Moesin auf eine mögliche Funktion bei der HIV-Replikation analysiert. Dabei wurden diese durch RNA Interferenz (RNAi) im Kontext einer HIV-Infektion reprimiert. Als zelluläres Modellsystem wurden P4-CCR5-Zellen verwendet, bei denen eine Infektion mit dem Virusstamm HIV-1Bru eine Induktion der Gene LEREPO4, GLiPR und Moesin sowie eine Repression von SCC-112 bewirkte. Die RNA-Interferenz vermittelte Suppression dieser Gene erfolgte durch Applikation von synthetischen siRNA Oligonukleotiden oder durch intrazelluläre Expression von short hairpin RNAs (shRNA). Durch den Einsatz von shRNAs konnte jedoch unter den vorliegenden Versuchsbedingungen nur eine unzureichende Gensuppression erreicht werden. Aus diesem Grund wurden synthetische siRNA Oligonukleotide verwendet. Es konnte eine deutliche Reduktion der jeweiligen Zielgene bewirkt werden, ohne dass nennenswerte Effekte auf den Phänotyp und die Viabilität der Zellen beobachtet wurden. Der Einfluss der siRNA-vermittelten Gensuppression auf die HIV-Replikation wurde durch Infektion der Zellen ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass die Depletion von GLiPR und LEREPO4 eine deutliche Inhibition der HIV-Replikation bewirkte. Das Ausmaß der Inhibition war ähnlich ausgeprägt, wie durch Verwendung einer bereits publizierten, gegen das virale Gen p24 gerichteten siRNA. Die Depletion von SCC-112 hatte im Gegensatz hierzu keine eindeutige Wirkung auf die HIV-Replikation, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass seine Repression während einer HIV-Infektion ein unspezifischer bzw. sekundärer Effekt ist. Die siRNA-vermittelte Suppression von Moesin führte zu einem unerwarteten Ergebnis, da eine deutliche Steigerung der HIV-Replikation im Vergleich zur Kontrolle festgestellt wurde. Damit konnte erstmals belegt werden, dass Moesin nicht für die HIV-Replikation benötigt wird, wie es durch andere Arbeiten postuliert wurde. Diese Annahme begründete sich auf der Beobachtung, dass Moesin in Viruspartikel inkorporiert wird. Daher wurde eine Beteiligung an der Zusammenlagerung oder Abschnürung viraler Partikel vermutet. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse lassen vermuten, dass LEREPO4 und GLiPR notwendige Faktoren der HIV-Replikation sind, wohingegen Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln scheint. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Wirkung auf die HIVReplikation sind jedoch weitgehend unklar. Da die Proteine LEREPO4, SCC-112 und GLiPR nicht oder nur unzureichend charakterisiert sind, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit zelluläre Funktionen dieser Proteine zu ermitteln, um Rückschlüsse auf ihre Funktion bei der HIV-Replikation zu gewinnen. Es konnten polyklonale Antikörper gegen LEREPO4 generiert werden, mit denen eine Bestimmung der zellulären Lokalisation möglich war. Mittels Co-Immunopräzipitation wurde die Interaktion von LEREPO4 und TRAF-2 nachgewiesen. Die Bestimmung des Einflusses von LEREPO4 auf die NF-κB-Aktivierung lässt vermuten, dass LEREPO4 an der TRAF-vermittelten Signaltransduktion beteiligt ist. Untersuchungen zur Funktion von GLiPR zeigten, dass es sich möglicherweise um ein sekretorisches Protein handeln könnte, wie durch den fluoreszenzmikroskopischen Nachweis eines GLiPR-EGFP-Fusionsproteins in HeLa-Zellen ermittelt wurde. Weiterhin konnte mittels Annexin-V-Färbung und TUNEL-Assay belegt werden, dass eine exogene Expression des GLiPRs in HeLa Zellen zu einem deutlichen Anstieg der Apoptoserate führte. Zusätzlich wurden für jedes Protein Genexpressionsprofile nach siRNA vermittelter Repression mittels Microarray-Analyse erstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass LEREPO4 und GLiPR mögliche Kofaktoren der HIV-Replikation darstellen. Im Gegensatz hierzu scheint Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln. Auf Grundlage der in dieser Arbeit ermittelten Daten können weiterführende Untersuchungen durchgeführt werden, um die genaue Funktion der oben genannten Proteine bei der HIV-Replikation zu klären.
Gephyrin ist ein Protein mit strukturellen und enzymatischen Eigenschaften. Ein Aspekt der strukturellen Funktion ist die synaptische Verankerung inhibitorischer Rezeptoren an das Zytoskelett. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass ein Interaktionspartner von Gephyrin, Collybistin, die Organistion des Aktin-Zytoskeletts reguliert. Die enzymatische Funktion von Gephyrin besteht in der Synthese eines Kofaktors, welcher für die Aktivität von Molybdoenzymen notwendig ist. Das gezielte Ausschalten des für Gephyrin kodierenden Gens weist im Mausmodell einen letalen Phänotyp auf. Als Ursache hierfür kommen die fehlende synaptische Aggregation von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren in neuronalem Gewebe, sowie die fehlende Aktivität von Molybdoenzymen in peripheren Organen in Frage. Da sowohl Molybdän-Kofaktor-Defizienzen beim Menschen, wie auch bestimmte Mutationen von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren bei Mäusen letal sind, kann der beobachtete Phänotyp nicht eindeutig zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit verfolgt zwei Ziele. Das erste ist eine Einengung der Binderegion von Collybistin an Gephyrin. Dabei konnte diese durch immunzytochemische und biochemische Methoden auf wenige Aminosäuren genau beschrieben werden. Verschiedene Strukturvorhersageprogramme weisen auf eine helikale Struktur für diesen Sequenzabschnitt hin. Der Austausch der Aminosäuren R107, D108, R111 und E117 mit Alanin führt über den Verlust ionischer Ladungen zum Verlust der Bindungseigenschaft. Das zweite verfolgte Ziel ist die Einführung eines transgenen Konstrukts, welches nur die Molybdän-Kofaktor-Synthesefunktion wiederherstellen soll, in den genetischen Hintergrund der Gephyrin-„knock-out“ Maus. Ziel dieser Analyse ist die Herstellung eines Phänotyps, bei dem die inhibitorische Transmission in einer Weise gestört ist, welche Symptome der Molybdän-Kofaktor-Insufizienz ausschließt. So sollte die Ursache für die Letalität der Gephyrin-Mutation zugeordnet werden können. Dazu wurde das pflanzliche Gephyrin-Homolog Cnx1 in ein Expressionskonstrukt kloniert, und nach biochemischer, immunzytochemischer und funktioneller Analyse in heterologen Zellen in eine Wildtyp-Mauslinie injiziert. Diese wurde mit Geph-/--Mäusen gekreuzt und die daraus resultierenden homozygoten, transgenen Tiere analysiert. Diese Tiere sterben ebenso wie die Geph-/--Mäuse am Tag der Geburt. mRNA des Transgens konnte in Hirn und Leber nachgewiesen werden, das Protein allerdings nur in Hirnextrakten. Dementsprechend lag die Aktivität des für die Lebensfähigkeit von Säugetieren wichtigsten Molybdoenzyms, der Sulfitoxidase, in Leberextrakten nur bei 30%. Eine morphologische Untersuchung von Gehirnschnitten ergab keine Auffälligkeiten. Eine Immunhistochemische Analyse von Rückenmarkschnitten zeigte in Übereinstimmung mit Beobachtungen an Gephyrin-„knock out“-Mäusen diffus verteilte Glyzin-Rezeptoren. Somit wurde eine Maus mit beeinträchtigter inhibitorischer synaptischer Transmission und partiell wiederhergestellter Molybdän-Kofaktor Biosynthese hergestellt. Aufgrund der großen Schwankungsbreite der Aktivität der Sulfitoxidase in Leberextrakten verschiedener Geph-/- + cnx Tiere wäre ein Unterschied in der Lebenserwartung verschiedener Tiere zu erwarten gewesen, wenn die Defizienz dieses Molybdoenzyms die Ursache für den letalen Phänoyp gewesen wäre. Da die transgenen Tiere aber wie die Geph-/- Mäuse wenige Stunden nach der Geburt sterben, ist davon auszugehen, dass der beschriebene Phänotyp auf das Fehlen der strukturellen Eigenschaften von Gephyrin zurückzuführen ist, und nicht von einer durch Beeinträchtigung des Schwefelstoffwechsels hervorgerufene progressive Schädigung des ZNS.
Das Epsilon-Proteobakterium Wolinella succinogenes wächst unter anaeroben Bedingungen durch Nitrit-Atmung. Als Elektronendonoren werden Formiat oder Wasserstoff verwendet. Die terminale Reduktase der Elektronentransportkette von Formiat zu Nitrit ist der Cytochrom C-Nitrit-Reduktase-Komplex (NrfHA), welcher die Reduktion von Nitrit zu Ammonium katalysiert. Menachinon dient als Redoxmediator. Die katalytische Untereinheit NrfA ist ein Pentahäm Cytochrom c, dessen Struktur bekannt ist. Die Häm c-Gruppe im aktiven Zentrum von NrfA wird über ein ungewöhnliches CXXCK-Motiv kovalent gebunden, während die übrigen vier Häm c-Gruppen über konventionelle CXXCH-Motive gebunden werden. Der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs ist der axiale Ligand des Häm-Eisens der Häm-Gruppe im katalytischen Zentrum. Die Untereinheit NrfH ist ein membranständiges Tetcahäm-Cytochrom C, das den Elektronentransport von Menachinol zu NrfA katalysiert. Im Nitrit-Reduktase-Operon nrfHAIJ wird das Nrfl-Protein kodiert, das ähnlich zu verschiedenen Cytochrom c-Biogenese Proteinen (Ccsl und CcsA) anderer Organismen ist. Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion und Charakterisierung von Mutanten, in denen der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs (K134) von NrfA ausgetauscht wurde oder konservierte Aminosäure-Reste am katalytischen des NrfAProteins ausgetauscht wurden. Weiterhin wurden Mutanten konstruiert und charakterisiert, in denen das nrfl-Gen inaktiviert wurde. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Es wurde eine Mutante konstruiert (W. succinogenes K134H), in der das CXXCK-Motiv im aktiven Zentrum von NrfA in ein konventionelles CXXCH-Motiv gewandelt wurde. Die spezifische Nitrit-Reduktase-Aktivität, gemessen mit reduziertem Benzylviologen als Elektronendonor, betrug maximal 40% der Aktivität des Wildstammes. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug 6% der Aktivität des Wildstamms. Durch MALDI-Massenspektroskopie wurde gezeigt, dass das NrfA-Protein aus dieser Mutante, ebenso wie das Protein aus dem Wildstamm, fünf Häm-Gruppen enthielt. In W. succinogenes Mutanten, in denen der Lysin-Rest 134 gegen Leucin oder Glutamin ausgetauscht wurde, ließ sich das Nrf-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht mehr nachweisen. 2. In W. succinogenes R114L, Y21 8F, H277L wurden konservierte Aminosäure-Reste in NrfA ausgetauscht, die nach dem postulierten Mechanismus der Nitrit-Reduktion an der heterolytischen Spaltung der ersten N-O-Bindung des Nitrits beteiligt sind. Alle diese Mutanten wachsen nicht durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes H277L und R114L besitzen keine Nitrit-Reduktase-Aktivität, obwohl das NrfA-Protein in allen Mutanten nachweisbar war. Die Elektronentransport-Akivität von Formiat zu Nitrit in W. succinogenes Y218F betrug 6% im Vergleich zum Wildstamm und die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug 14% gegenüber dem Wildstamm. Aus der Struktur von W. succinogenes NrfA ist ersichtlich, dass der Glutamin-Rest 276 Teil eines Substrat-Kanals ist, der von der Oberfläche des NrfA-Proteins zur Häm-Gruppe im aktiven Zentrum führt (Einsle et al. 2000). in W. succinogenes Q276E wurde der Glutamin-Rest gegen einen negativ geladenen Glutamat-Rest ausgetauscht. W. succinogenes Q276E wächst nicht durch Nitrit-Atmung. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug in dieser Mutante 6% im Vergleich zum Wildstamm. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität war gegenüber dem Wildstamm um 90% erniedrigt. 3. In der Mutante W. succinogenes stopl wurde das nrfl-Gen durch Einführen von zwei Stop-Codons an den Positionen 47 und 48 inaktiviert. Diese Mutante wächst nicht durch Nitrit-Atmung und besitzt keine Nitrit-Reduktase-Aktivität. Im NrfA-Protein aus W.succinogenes stopl fehlte die über das CXXCK-Motiv ligandierte Häm-Gruppe im aktiven Zentrum, während die übrigen über konventionelle CXXCH-Motive ligandierten Häm-Gruppen vorhanden waren. 4. Die Mutante W. succinogenes Kl34H/stopl, in der das stopl-Gen inaktiviert war und das CXXCK-Motiv in ein fünftes CXXCH-Motiv geändert wurde, entsprach in ihren Eigenschaften dem Stamm W. succinogenes K134H. Daraus ist zu folgern, dass das Nrfl-Protein speziell am Einbau der Häm-Gruppe am CXXCK-Motiv in NrfA beteiligt ist, während Nrfl für den Einbau an CXXCH-Motiven entbehrlich ist. Nrfl ist vermutlich eine spezielle Häm-Lyase, die den Lysin-Rest des CXXCK-Motivs erkennt. 5. Campylobacter jejuni kodiert ein NrfA-Protein, das fünf CXXCH-Motive anstelle von einem CXXCK-Motiv und vier CXXCH-Motiven enthält. In C. jejuni wird die vermutliche Häm-Gruppe des aktiven Zentrums von einem CMNCH-Motiv ligandiert, während in W. succinogenes die Bindung an einem CWTCK-Motiv erfolgt. In den Mutanten W. succinogenes CMNCK und W. succinogenes CMNCH wurde das Häm-Bindemotiv im aktiven Zentrum von NrfA dem von C. jejuni angeglichen. Keine der beiden Mutanten wuchs durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes CMNCK katalysierte den Elektronentransport von Formiat zu Nitrit mit 6% der Aktivität des Wildstamms. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug unter 3% im Vergleich zum Wildstamm. In W. succinogenes CMNCH war das NrfA-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht nachzuweisen. 6. Um die Präparation des NrfA-Proteins und des NrfHA-Komplexes zu erleichtern und um die Präparation der Untereinheit NrfH zu ermögiichen, wurden W, succinogenes Mutanten konstruiert, die einen Hexa-Histidin-Tag an NrfA oder einen Strep-Tag II am N- oder C-terminus von NrfH tragen. Es war aber nicht möglich, den Nitrit-Reduktase-Komplex oder einzelne Untereinheiten durch entsprechende Affinitätschromatographien anzureichern.
Das Volumen von tierischen Zellen ist durch äußere und innere Einflüsse Veränderungen unterworfen. Um die zelluläre Homöostase zu gewährleisten und bedrohliche Volumenänderungen zu verhindern, verfügen die meisten Zellen daher über regulatorische Mechanismen zur Verringerung (regulatory volume decrease, RVD) oder Erhöhung (regulatory volume increase, RVI) des Zellvolumens. Darüber hinaus finden diese Mechanismen auch im Rahmen physiologischer Prozesse, wie z. B. der Zellbewegung oder der Proliferation Verwendung. Der RVD erfordert einen Sensor-Mechanismus, der die Veränderung des Zellvolumens registriert. Die nachfolgende Signaltransduktion führt zur Aktivierung von Transportmechanismen, die v. a. dem Export von K+- und Cl--Ionen, aber auch organischen Osmolyten, dienen und zum Ausstrom von Wasser aus der Zelle führen, bis das Sollvolumen erreicht ist. Bisher ist noch nicht sicher, welcher Mechanismus den RVD einleitet; in verschiedenen Geweben wurden Hinweise auf mehrere mögliche Kandidaten gefunden. In dieser Arbeit wurde der RVD von HaCaT-Zellen, einer humanen Keratinozyten-Zelllinie hinsichtlich der Beteiligung des Aktin-Zytoskeletts mit mikroskopischen, pharmakologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. HaCaT-Zellen schwellen in hypotonem Medium schnell an (30 s) und führen einen RVD durch, der nach ca. 5 min das Ausgangsvolumen wieder herstellt. Der RVD von HaCaT-Zellen ist vom Einstrom extrazellulärer Ca2+-Ionen abhängig. Dieser Einstrom erfolgt durch einen Kanal, der durch die Inhibitoren von stretch activated channels (SAC) Gd3+ und GsMTx-4, sowie den spezifischen Inhibitor des transient receptor potential vaniloid 4 (TRPV4), Rutheniumrot, gehemmt werden kann. TRPV4 wird in HaCaT-Zellen exprimiert. Der RVD und der damit verbundene Einstrom von Ca2+-Ionen, nicht aber das Anschwellen der Zellen werden durch den Abbau des Aktin-Zytoskeletts durch 2 μM Cytochalasin D (CD) gehemmt. Die Hemmung durch CD ist reversibel; nach dem Entfernen von CD bildet sich innerhalb von 30 min erneut ein Netzwerk von Aktinfilamenten aus. Ein zwei-stufiges Absenken der Osmolarität (jeweils ca. 20%), zunächst in Anwesenheit von CD führt zu einer Volumenzunahme, löst aber keinen RVD aus. Auch nach dem Entzug von CD bleibt das Volumen konstant erhöht. Erst das zweite Absenken löst eine Volumenregulation aus, allerdings nur bis zu dem Volumen, das nach dem Entfernen von CD etabliert war. Die mikroskopische Struktur des Aktin-Zytoskeletts von HaCaT-Zellen ändert sich während des RVD kaum. Durch die Messung der Fluoreszenz von gebundenem Rhodamin-Phalloidin konnte ein vorübergehender Anstieg der Menge von Aktinfilamenten (F-Aktin) während des RVD gezeigt werden. Ein quantitativer biochemischer Ansatz zeigt, dass die relative Menge des Triton- X-100-löslichen Anteils des Aktin-Zytoskeletts im gleichen Zeitraum zunimmt. Der RVD von HaCaT-Zellen hängt ebenfalls von der Geschwindigkeit der Osmolaritätsänderung ab; die langsame Verringerung der Osmolarität (≤ 5 mosM/min) führte zum Anschwellen, nicht aber zum RVD. Auf Basis der erzielten Ergebnisse wird ein Modell für den RVD von HaCaTZellen vorgeschlagen, bei dem der Anstieg des Zellvolumens zu einer Zunahme der mechanischen Spannung im kortikalen Zytoskelett führt. Dadurch wird – indirekt, etwa durch Phospholipase A2, oder direkt - TRPV4 aktiviert. Dies führt zu einem Einstrom von extrazellulären Ca2+-Ionen und über Ca2+-abhängige Aktin-bindende Proteine (z. B. Gelsolin) zu einer Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts (Gel-Sol-Übergang) und verbunden damit zu einer Abnahme der mechanischen Spannung. Ca2+-Ionen und kurze Aktinfilamente aktivieren Transportmechanismen, die zum Ausstrom von K+- und Cl-- Ionen und einer Abnahme des Zellvolumens führen.
Einige Teilergebnisse dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Mahnke K., Schönfeld K., Fondel S. et al (2007), Int. J. Cancer 120; 2723-2733 Depletion of CD4+CD25+ human regulatory T cells in vivo: Kinetics of Treg depletion and alterations in immune functions in vivo and in vitro Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Treg depletierende Wirkung von ONTAK, einem Fusionsprotein aus Interleukin-2 und Diphterietoxin, untersucht. Hierzu wurde ONTAK in Zellkultur auf humanen Lymphozyten getestet und anschließend Melanomapatienten verabreicht. ONTAK konnte sowohl in vitro als auch in vivo eine Depletion von Tregs induzieren, wenngleich der in vivo Effekt nicht vollständig war. Des Weiteren wurde der immunologische Effekt, der auf die Reduktion der Tregs zurückzuführen ist, untersucht. Hierzu wurden die Patienten mit DCP behandelt, welches normalerweise zu einer schwachen Entzündungsreaktion führt. Nach Treg Depletion wurden starke Kontaktekzeme in den Patienten induziert. Aufgrund dieser verstärkten Immunantwort erfolgte eine Applikation der Tumorpeptide MART1 und gp100 in das Kontaktekzem. Anschließend konnten peptidspezifische CD8 T-Zell Populationen detektiert werden, die sowohl INF-γ sekretierten, als auch zytotoxisch aktiv waren. Solche starken Immunantworten wurden bisher nur unter zu Hilfenahme starker Adjuvanzien induziert. ONATK führt bereits nach einmaliger Applikation zu einer Depletion regulatorischer T-Zellen in vivo. Dabei wird der Gehalt von 4 % regulatorischen T-Zellen im Blut auf einen Gehalt von 1 % gesenkt. Diese Depletion der Tregs verstärkt eine Immunisierung mit Peptiden, die eine starke CD8 T-Zell vermittelte Immunantwort induziert. Allerdings kam es zu keiner vollständigen Depletion der Tregs, was durch die geringe in vivo Halbwertszeit von ONTAK, sowie durch unbekannte Mechanismen der Treg Homöostase erklärt werden könnte. Die Wirkweise von ONTAK konnte nur im Blut, aber nicht in anderen Organen wie z.B. Lymphknoten erforscht werden, daher besteht die Möglichkeit, einer unvollständigen Depletion der Zellen in peripheren Organen. In wieweit Tregs im Blut mit anderen Zellen wechselwirken ist weitgehenst unerforscht. Die meisten Untersuchungen zeigen Zell-Zell Interaktionen in den Lymphknoten und im entzündeten Gewebe. Der Ort, an dem die Tregs aber wirklich ihr suppressives Potential auf andere Zellen entfalten, ist noch unbekannt. Hiermit beschäftigt sich der zweite Teil dieser Arbeit. Zur Beantwortung dieser Frage sollten Tregs in vivo in Mäusen in die Haut oder den Lymphknoten geleitet werden. Um das Vorhaben auszuführen, wurden die Zytokinrezeptoren CCR7, CCR9 und CCR10 sowie die Adhäsionsmoleküle PSGL-1, ESL-1 und CD103 kloniert und in zwei Expressionssystemen getestet. Ein lentivirales System zeigte eine schlechte Transduktionseffizienz, so dass ein zweites System mit einer Elektroporationstechnik, der Nucleofection gewählt wurde. Dieses führte zu Expressionseffizienzen von ca. 40 %. Zuerst wurde die Funktionalität der klonierten Moleküle in vitro in der murinen T-Zellline EL-4 in Transwell- und Flowchamberversuchen demonstriert, anschließend wurden murine in vitro expandierte Tregs nucleofiziert. Eine umfassende Analyse der nucleofizierten Zellen zeigte eine Heraufregulation von CD69 und eine Herunteregulation von CD62L, was auf eine Aktivierung der Zellen deutet. Mit einhergehender Aktivierung nahm auch die Apoptoserate der Zellen zu, diese konnte auch durch Modifikationen der Nucleofections- sowie der Kulturbedingungen nicht verringert werden. Nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden nach der Nucleofection ließen sich noch adhäsive Eigenschaften der exprimierten Moleküle in der Flowchamber nachweisen. Im Suppressionstest, in dem die Zellen über einen Zeitraum von drei Tagen inkubiert wurden, waren die Zellen jedoch nicht mehr suppressiv. Daher wären die in vivo Versuche, die den suppressiven Einfluß der Tregs auf die Ohrschwellung in Abhängigkeit ihrer Lokalisation untersuchen sollten, erfolglos geblieben. Mit der Induktion der Apoptose stießen die hier verwendeten Methoden an ihre Grenzen. Zur Realisierung des Projekts müssten andere Transduktionssysteme oder Tregs aus knock out Mäusen verwendet werden. Regulatorische T-Zellen nehmen eine Schlüsselrolle bei der Suppression von anti-Tumor Immunantworten aber auch bei dem Schutz vor Autoimmunerkrankungen ein. Eine erfolgreiche Manipulation dieser Zellen in vivo oder in vitro bildet eine solide Basis für neuartige Immuntherapien gegen entsprechende Krankheiten. ONTAK ist ein wirkungsvolles Medikament, um die Anzahl der regulatorischen Zellen in vvo zu reduzieren. Es trägt dadurch zu einer verstärkten Immunantwort bei. Eine einmalige Gabe von ONTAK ist sicherlich nicht ausreichend, um Tumore zu bekämpfen, es kann aber Immuntherapien unterstützen. Eine Manipulation von Tregs, durch die Expression von Transgenen um ihr Migrationsverhalten in vivo zu beeinflussen und damit die Suppression von Autoimmunerkrankungen zu bedingen, ist noch nicht ausgereift und bedarf noch weiterer Forschung.
Untersuchungen zum Target und Wirkmechanismus der eNOS-Transkriptionsverstärker AVE9488 und AVE3085
(2008)
Die Substanzen AVE9488 und AVE3085 der neuen chemischen Klasse der eNOS-Transkriptionsverstärker führen zu einer signifikanten Aktivierung des eNOSPromotors, die in vitro und in vivo in einer Erhöhung der eNOS-Expression auf mRNAund Proteinebene resultiert. Als Folge davon kommt es zu einer signifikant gesteigerten Synthese von bioverfügbarem Stickstoffmonoxid (NO). Dieser Effekt führt in Kombination mit einer ebenfalls beobachteten Normalisierung der eNOS-Entkopplung zu einer deutlichen antiatherosklerotischen Wirkung in ApoE-Knockout-Mäusen. AVE9488 und AVE3085 wurden initial durch eine phänotypische Reihentestung chemischer Bibliotheken in einer stabilen eNOS-Promotor-Reporter-Endothelzelllinie identifiziert. Daher waren bis zum heutigen Zeitpunkt molekulare Targets und ihre Wirkweise unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, Targetproteine der eNOS-Transkriptionsverstärker zu identifizieren, zu validieren und Hinweise auf den zugehörigen Wirkmechanismus zu sammeln. Zur Identifizierung potenzieller Zielproteine wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. In einem genomischen Ansatz sollten einzelne, für die Aktivierung des eNOSPromotors durch AVE9488 und AVE3085 essentielle Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. Eine in silico-Analyse des für die Substanzwirkung notwendigen 300bp-Promotorbereichs vor Transkriptionsstart auf konservierte Transkriptionsfaktor-Bindemotive ergab potenzielle Bindungsstellen für insgesamt 105 Transkriptionsfaktoren. In Gel-Retardierungsexperimenten mit Oligonukleotiden, die aufbauend auf der bioinformatischen Analyse die konservierten cis-Elemente in diesem Sequenzbereich abdeckten, und Kernextrakten aus Endothelzellen, die mit AVE9488 behandelt worden waren, konnte eine Abschwächung der DNA-Protein-Komplexbildung beobachtet werden. Diese Effekte konnten jedoch mit dieser Technologie aufgrund der hohen Anzahl möglicher bindender Transkriptionsfaktoren nicht auf einzelne eingeengt werden. Im Folgenden wurden daher einzelne Transkriptionsfaktoren ausgewählt, die eine nachgewiesene Rolle bei der Regulation der eNOS-Transkription besitzen, und auf ihre Bedeutung bei der Substanz- ermittelten eNOS-Promotoraktivierung untersucht. Nach Ausschaltung durch siRNA von Sp1, GATA-2, Ets-1, MAZ und PATZ1 im eNOS-Transkriptionstest konnten bei Sp1, GATA-2 und MAZ lediglich eine Erniedrigung der basalen eNOS-Promotoraktivitätfestgestellt werden. Da die Substanz-induzierte eNOS-Transkriptionserhöhung bei keinem der untersuchten Transkriptionsfaktoren beeinflusst wurde, scheinen diese Proteine bei diesem Prozess keine Rolle zu spielen. Als zweite Strategie kamen Proteomik-Techniken zur Identifizierung möglicher Targetprot eine durch ihre direkte biochemische Affinität zum Pharmakophor der eNOS-Transkriptionsverstärker zum Einsatz. Durch die chromatographische Anreicherung bindender Proteine aus Endothelzelllysaten an spezifischen Affinitätsmaterialien und der Markierung rekombinanter, humaner Proteine auf Protein-Mikroarrays mit Biotinmarkierten eNOS-Transkriptionsverstärkern konnte eine Gesamtliste mit insgesamt 18 potenziellen Targetkandidaten ermittelt werden. Die weitere zelluläre Validierung dieser Kandidaten erfolgte durch ihre siRNA-vermittelte Ausschaltung im eNOS-Transkriptionstest. Innerhalb aller potenziellen Targets konnte nur nach Ausschalten von Häm-bindenden Protein 1 (HEBP1) der eNOS-Promotor durch AVE3085 nur noch signifikant abgeschwächt gegenüber der Kontrolle aktiviert werden. Dieses Protein stellte somit den einzigen Targetkandidaten dar, der bei der Aktivierung des eNOS-Promotors eine Rolle zu spielen scheint. Nach rekombinanter Expression des humanen HEBP1 konnte die Bindung der eNOS-Transkriptionsverstärker an dieses Protein durch zwei unabhängige biochemische Methoden konfirmiert werden. Bei Messungen der Tryptophanfluoreszenz des HEBP1 konnte der eNOS-Transkriptionsverstärker 9257 den Liganden Hämin, der eine Quenchung der Fluoreszenz bewirkt, aus der Bindung verdrängen. Weiterhin konnte mit Hilfe einer Fluoreszenz-markierten eNOS-Substanz ihre direkte Bindung an das HEBP1 durch Messung der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen und ein KD-Wert von 11,7μM ermittelt werden. Abschließend konnte in ersten Untersuchungen der Hebp1-Expression in einem Herz-Kreislauf-relevanten Tiermodell für chronische Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt die differentielle Hochregulation des Hebp1-Gens um den Faktor 2,5 unter pathologischen Bedingungen nachgewiesen werden, die jedoch nicht durch die Behandlung mit AVE3085 beeinflusst wurde.
Ein früherer Vorschlag zum Reaktionsmechanismus der DFPase, der eine Wasseraktivierung durch den Rest H287 postulierte, mußte nach neuen experimentellen Daten verworfen werden. Daher lag zu Beginn der hier vorliegenden Arbeit kein Vorschlag für den Mechanismus der DFPase vor, der die experimentellen Daten erklären konnte. Für das längerfristige Ziel, die katalytischen Eigenschaften der DFPase gezielt verändern zu können, war es daher notwendig, zunächst den Mechanismus der Hydrolyse von Verbindungen wie DFP durch die DFPase näher zu untersuchen. Durch computergestützte Modellierung im aktiven Zentrum der DFPase (Docking) wurde die Bindung von DFP und anderen Substraten der DFPase genauer untersucht und mit vorhandenen experimentellen Daten verglichen. Diese Arbeiten führten auch zur theoretischen Untersuchung des Bindungsverhaltens von O,O-Dialkylphosphoroamidaten als potentiellen Inhibitoren der DFPase. Diese den Dialkylfluorophosphaten strukturell sehr ähnlichen Substanzen werden durch die DFPase nicht umgesetzt. Die Ergebnisse der Dockinguntersuchung führten schließlich zu der Synthese von drei Phosphoroamidaten unter der Untersuchung ihres Verhaltens als Inhibitoren der DFPase. DIe Charakterisierung erfolgte dabei über enzymkinetische Methoden sowie NMR-Experimente. Mit dem stärksten Inhibitor O,O-Dicyclopentylphosphoroamidat gelang die Kristallisation eines Komlexes mit der DFPase, der mit der Methode der Röntgenbeugung strukturell bestimmt werden konnte. Dieser Komplex belegt die Bindung der Phosphorylgruppe von Substraten an das katalytisch wirksame Calciumion im aktiven Zentrum der DFPase und zeigt die vorherrschenden Bindungskräfte zwischen Ligand und Protein auf. Eine Reihe von Mutanten der DFPase, bei denen gezielt die koordinierenden Aminosäuren des katalytischen Calciumions verändert wurden, ergänzte die bereits in früheren Arbeiten erzeugten Mutanten. Die katalyischen Eigenschaften dieser Mutanten und ihre Fähigkeit zur Metallbindung gestatten es, diese Metallbindungsstelle genauer zu beschreiben und lassen zusammen mit den Dockingexperimenten und der Struktur des Inhibitor-Enzymkomplexes vermuten, dass der calciumkoordinierende Aminosäurerest D229 als aktives Nukleophil im Reaktionsmechanismus der DFPase fungiert. Diese Vermutung ließ sich mit experimentellen Daten untermauern. Durch 18O-Isotopenmarkierung konnte gezeigt werden, dass ein Sauerstoffatom von D229 auf das entstehende Produkt übertragen wird. Hierdurch konnte die Existenz eines Phosphoenzymintermediats nachgewiesen werden. Des weiteren gelang es, Kristalle der DFPase zu züchten, die für Neutronenbeugungsexperimente geeignet waren. Im Rahmen dieser Experimente gelang die Aufnahme eines vollständigen Datensatzes und die Lösung der Neutronenbeugungsstruktur der DFPase in einer Auflösung von 2,2 Å. Diese Neutronenstruktur, in der Wasserstoffatome im Unterschied zu Röntgenstrukturen gut sichtbar sind, zeigt eindeutig, dass der Rest D229 wie erforderlich deprotoniert und dass das in der Bindungstasche an das Calciumion koordinierende Wassermolekül nicht als Hydroxid vorliegt. Damit ließ sich die direkte Aktivierung von Wasser durch das Metallion ausschließen. Neben wichtigen Informationen über die Bindungstasche der DFPase lieferte die Neutronenstruktur auch detaillierte Einblicke in das Wasserstoffbrückennetzwerk im zentralen, wassergefüllten Tunnel des Proteins. Über die Bestimmung des Wasserstoff/Deuteriumaustausches von Proteinrückgradamiden konnten weitere Aussagen über die Solvenszugänglichkeit von verschiedenen Proteinbereichen gemacht werden. Für die DFPase konnten strukturell und funktionell ähnliche Proteine identifiziert werden. Neben der Paraoxonase 1 waren dies das Calciumbindeprotein Regucalcin aus Agrobacterium thumefaciens sowie das Drug Resistance Protein 35 aus Staphylococcus aureus. Es konnte gezeigt werden, dass diese Proteine eine der katalytischen Calciumbindestelle der DFPase vergleichbare Metallbindestelle aufweisen und verschiedene Enzymaktivitäten dieser Proteine durch einen Mechanismus mit einem zu D229 analogen Nukleophil erklärt werden können. Ein direkter Vergleich zwischen der DFPase und der humanen Paraoxonase gelang durch Untersuchungen mit fluorogenen Organophosphaten als Substrate. Hierbei konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die DFPase in der Lage ist, Substrate mit einer P-O Bindung hydrolytisch zu spalten. Die unterschiedlich gute Umsetzung der verschiedenen Substrate durch die beiden Enzyme konnte auf der Grundlage der Proteinstrukturen erklärt werden, wobei für die Paraoxonase postuliert wurde, dass der calciumbindende Aminosäurerest D269 als zu D229 analoges Nukleophil wirkt. Abschließend gelang es, zusätzlich eine Zusammensetzung für eine Enzympräparation zu finden, die eine Gefriertrocknung der DFPase mit nur geringem Verlust an enzymatischer Aktivität erlaubt. Ein solches lagerstabiles Enzympulver ist ein notwendiger Schritt hin zu einer praktischen Anwendung der DFPase für die technische Dekontamination von hochtoxischen Nervenkampfstoffen.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein weit verbreitetes Humanpathogen, welches den menschlichen Magen besiedelt und zu schwerwiegenden entzündlichen Erkrankungen des gastralen Traktes führen kann. Bereits 1994 wurde das Bakterium als ein Klasse 1 Karzinogen deklariert, da H. pylori im erwiesenen Maße mit der Entstehung von hochinvasivem Magenkrebs in Verbindung gebracht wird. In vitro induziert H. pylori eine starke Migration der infizierten Epithelzellen, die unter anderem mit der Auflösung der Zellkontakte einhergeht. Die zugrunde liegenden molekularen Zusammenhänge konnten bisher noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Die Mechanismen der Auflösung der Zelladhäsion wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht, um einen tieferen Einblick in die H. pylori vermittelten Virulenz zu erhalten. So konnte eine H. pylori-induzierte Dissoziation des E-Cadherin Komplexes, bestehend aus p120, 􀄮- und 􀈕-Catenin beobachtet werden, der in einem Verlust der Zelladhäsion resultierte. Es konnte darüber hinaus eine Spaltung der extrazellulären Domäne von ECadherin detektiert werden, die wahrscheinlich zu einer Destabilisierung und somit zur Auflösung des gesamten E-Cadherin Komplexes führte. Durch den Zerfall der Adhärenzverbindungen wurden Catenine in den zytoplasmatischen Pool freigegeben, von denen p120 in den Zellkern translozierte und die Transaktivierung von Zielgenen auslöste, die in diesem Zusammenhang mit Hilfe von Reportergenanalysen quantifiziert wurden. Diese Prozesse zeigten sich von dem Pathogenitätsfaktor CagA (cytotoxin associated gene A) unabhängig, der über das bakterielle Typ IV Sekretionssystem in die Wirtszellen transloziert wird und krebsassoziierte Signaltransduktionswege aktivieren kann. In weiteren Untersuchungen wurden deshalb die Auswirkungen löslicher H. pylori Faktoren auf die Spaltung von E-Cadherin und folglich auf die Zellmotilität und Morphologie epithelialer Zellen analysiert. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden in weiteren Experimenten proteolytische Aktivitäten von H. pylori untersucht. Dabei konnte erstmalig die hypothetische Protease HtrA (high temperature requirement protein A) von H. pylori durch massenspektrometrischen Analysen als eine caseinolytisch aktive Protease gefunden werden. Nach der Klonierung und Aufreinigung von HtrA konnte darüber hinaus auch E-Cadherin als spezifisches biologisches Substrat der Wirtszellen für HtrA identifiziert werden. Diese selektive Fragmentierung von E-Cadherin durch HtrA fügt sich als ein neues Element in das Modell der H. pylori Pathogenese, die einen initialen Schritt in der frühen Phase der Infektion darstellen könnte.
Ziel der vorliegenden Arbeit sind Strukturuntersuchungen an geplant gezüchteten Einkristallen elektronenreicher Iod- und Schwefel-Verbindungen, ergänzt durch zugehörige Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen. Besonderes Augenmerk gilt insbesondere Molekülen mit Thiophenyl-Substituenten R-S-(C6H5) und ihren isovalenzelektronischen Derivaten vom Typ R-NH-(C6H5) sowie den bisher unbekannten Donator/Akzeptor-Komplexen des Iodanils. Durch optimierte Auswahl jeweils geeigneter Lösungsmittel und Kristallisationsbedingungen gelingt es, zahlreiche unterschiedliche Typen kristalliner Nichtmetall-Verbindungen zu züchten. Die Strukturen der isolierten Einkristalle werden durch Vergleich mit bereits literaturbekannten sowie anhand quantenchemischer Berechnungen diskutiert und vertiefen das Verständnis der experimentellen Befunde wesentlich. ... Insgesamt belegen die in der Dissertation detalliert beschriebenen Ergebnisse, daß Kombinationen von gezielter Kristallzüchtung, anschließender Strukturbestimmung und quantenchemische Berechnungen zahlreiche Informationen über Wechselwirkungen in Kristallen liefern. So verdeutlicht die anschauliche Betrachtung der I2-Komplexe durch zugehörige Einkristallstrukturen sowie quantenchemische Modellrechnungen, daß auch geringe Wechselwirkungen teils beträchtliche Einflüsse auf Stöchiometrien und Strukturparameter in Kristallen ausüben. Das Schlußbeispiel Tris(thiophenyl)methan-Dimer belegt durch alle notwendigen Messungen wie Kristallstrukturanalyse, quantenchemische hochkorrelierte Berechnungen und massenspektrokopische Messungen, wie sich durch das Zusammenwirken moderner Methoden unerwartete Ergebnisse für einen neuartigen Verbindungstyp festigen lassen. Die lohnenden Ergebnisse der Untersuchungen erweitern die Kenntnisse statischer Aspekte bei Selbstorganisations-Phänomenen.
Organismen besitzen die Fähigkeit sich Temperaturerniedrigungen anzupassen, wobei über die molekularen Mechanismen der Kälteadaptation wenig bekannt ist. Für die Untersuchung dieser Mechanismen stellt die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ein ausgezeichnetes Modellsystem aufgrund der einfachen Struktur und der Möglichkeit zur genetischen Manipulation dar. In dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Antwort von S. cerevisiae auf Kälte mit Hilfe von DNA Chips (6330 ORFs) charakterisiert, wobei Proben von Hefekulturen mit einer Inkubationsdauer von 10 und 30 min, 2, 12 und 60 h bei 10°C verwendet wurden. 634 Gene reagierten mit einer signifikanten Expressionsänderungen auf den Kälteeinfluss, wobei zwei distinkte Phasen, definiert als frühe und späte Kälteantwort, identifiziert wurden. Vergleiche der Kälteantwort mit Expressionsdaten verschiedener Umweltstressbedingungen ergaben differentielle Expressionsmuster. Im Vergleich zu anderen Stressreaktionen zeigten Gene der frühen Kälteantwort entweder ein entgegengesetztes Expressionsmuster (“inverser Hitzeschockeffekt”) oder keine transkriptionelle Reaktion. Dieser Effekt kehrte sich während der späten Kälteantwort in eine allgemeine Stressantwort um. Messungen des Trehalose- und Glykogengehalts sowie Studien mit einer in der Stressinduktion beeinträchtigten Doppelmutante Δmsn2/Δmsn4 bei 10°C zeigten, dass die allgemeine Stressantwort ein Teil der späten Kälteantwort ist. Dagegen deuten die Daten der frühen Kälteantwort auf eine Kälte-spezifische Reaktion hin, wobei Anpassung der Membranfluidität sowie RNA-Modifikation eine essentielle Rolle spielen. Im Zusammenhang mit der Untersuchung der Kälteanpassung in S. cerevisiae wurde der ORF YBR255W mit unbekannter Funktion, dessen Deletion einen Kälte-sensitiven Wachstumsdefekt besitzt, auf molekular-biologischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die transkriptionelle Reaktion einer Δybr255w-Mutante bei Kälte (10ºC) wurde mit den Expressionsdaten des Wildtyps verglichen und zeigte starke Veränderungen während der frühen Kälteantwort, wobei nach 2 Stunden der größte Expressionsunterschied zum Wildtyp beobachtet wurde. 65% der Gene der frühen Kälteantwort zeigten YBR255Wabhängige Veränderungen, darunter Gene des Zellzyklus, des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung. Interaktionsstudien auf genetischer und Proteinebene ergaben, dass Ybr255p mit einer Komponente des „Mitotic Exit Network“ und Komponenten des PKC1-Wegs interagiert. Die Überexpression von Ybr225p zeigte drastische Veränderungen der Zellmorphologie, wie sie ebenfalls für Mutanten des „Mitotic Exit Network“ beschrieben sind. Zusammengenommen mit der transkriptionellen Reaktion der Δybr255w-Mutante auf Kälte deuten diese Ergebnisse auf eine essentielle Rolle von Ybr255p im Zellzyklus bei Kälte hin.
Recently, the first part of the morphological revision of the Southeast Asian water monitor lizards of the Varanus salvator (Laurenti, 1768) species group provided a taxonomic overview over the members of this successful and widespread species complex (Koch et al. 2007). There, the Philippine taxa marmoratus, nuchalis and cumingi were reelevated to species status due to diagnostic morphological characteristics, e.g. significantly enlarged scales on the neck region. In this second part of the ongoing revision, these three species are re-investigated using additional voucher specimens and advanced statistical techniques including canonical variates analysis and principal component analysis. Our new investigations indicate that V. marmoratus represents a composite species, comprising at least three distinct taxa. Hence, the populations of the Sulu Archipelago (Tawi-Tawi Island) and those of the Palawan region are described as new species, viz. Varanus rasmusseni sp. nov. and V. palawanensis sp. nov., respectively. The allopatric island populations of V. cumingi inhabiting Samar, Leyte, and Bohol (the East Visayan subregion) show characteristic and geographically correlated colour patterns distinct from the type locality Mindanao (the second subregion of Greater Mindanao), warranting subspecific partition of this species. The new subspecies is named V. cumingi samarensis ssp. nov. In contrast, the taxonomic status of V. nuchalis remained unchanged, although this species shows some considerable variation in colour pattern. The systematic chapters are supplemented with notes about biology and conservation status. The hitherto underestimated diversity and zoogeography of Philippine water monitors is discussed in the light of Pleistocene sea level fluctuations. Finally, we introduce a scenario for the evolution and spread of Southeast Asian water monitor lizards and provide an identification key for the Philippine members of the V. salvatoI' complex.
Ubiquitylation is a three-step process, which results in the attachment of the small protein ubiquitin (Ub) to lysine residues on a substrate protein. SUMO proteins are ubiquitin (Ub)-related modifiers implicated in the regulation of gene transcription, cell cycle, DNA repair and protein localization. The molecular mechanisms by which the sumoylation of target proteins regulates diverse cellular functions remain poorly understood. During my PhD I isolated and characterized SUMO1 and SUMO2 binding motifs. Using Yeast Two Hybrid system, bioinformatics and NMR spectroscopy we defined a common SUMO-interacting motif (SIM) and map its binding surfaces on SUMO1 and SUMO2. This motif forms a β-strand that could bind in parallel or anti-parallel orientation to the β2-strand of SUMO due to the environment of the hydrophobic core. A negative charge imposed by a stretch of neighboring acidic amino acids and/or phosphorylated serine residues determines its specificity in binding to distinct SUMO paralogues and can modulate the spatial orientation of SUMO-SIM interactions. Mutation of the SUMO interacting motif of TTRAP (TRAFS and TNF receptor associated protein) influences both its localization and dynamic behaviour in living cells. Ubiquitin (Ub)-binding domains (UBDs) are key elements in conveying Ub-based cellular signals. UBD-containing proteins interact with ubiquitylated targets and control numerous biological processes including receptor trafficking, DNA repair, virus budding and gene transcription. They themselves undergo UBD-dependent monoubiquitylation, which promotes intramolecular binding of the UBD to the attached Ub and consequently leads to their functional inhibition. During the second part of my PhD I could show that, in contrast to the established ubiquitylation pathway, the presence of UBDs allows the monoubiquitylation of host protein independently of classical E3 ligases. UBDs of different types including UBA, UIM, UBM, NFZ and UBZ, can directly cooperate with E2 Ub-conjugating enzymes to promote monoubiquitylation of their host proteins. Using FRET technology I verified that the E2 enzyme and the substrate directly interact in cells. Moreover, UBD-containing proteins Stam2 and Sts2 promote self-ubiquitylation and not ubiquitylation of other targets or form polyUb chains from free Ub. Our study revealed a yet unappreciated role of E2 enzymes in ubiquitylation reactions of UBD containing proteins.
Trématodes parasites provenant des campagnes scientifiques du Prince Albert Ier de Monaco <1886-1912
(1938)
The siliceous claystone and chert lithologic units of the Triassic-Jurassic chert-clastic sequence are well exposed in the Inuyama, Mt. Kinkazan and Hisuikyo areas of the southeastern Mino Terrane. Twenty-one continuous sections from those areas were investigated in order to establish comprehensive radiolarian biozones and clarify the successive lithologic changes through the Triassic and lowest Jurassic. Twenty new radiolarian zones are established; the lowest two are assemblage zones and the others are defined by the first or last occurrence of index taxa. The definitions are as follows in chronological order: TR 0, Follicucullus Assemblage Zone (early Spathian or older); TR 1, Parentactinia nakatsugawaensis Assemblage Zone (late Spathian); TR 2A, Eptingium nakasekoi Lowest-occurrence Zone (early Anisian); TR 2B, Triassocampe coronata group Lowest-occurrence Zone (early Anisian); TR 2C, Triassocampe deweveri Lowest-occurrence Zone (late Anisian); TR 3A, Spine A2 (possiblly derived from Oertlispongus inaequispinosus) Lowest occurrence Zone (late Anisian) ; TR 3B, Yeharaia elegans group Lowest-occurrence Zone (early Ladinian); TR 4A, Muelleritortis cochleata Lowest-occurrence Zone (late Ladinian); TR 4B, Spongoserrula dehli Lowest-occurrence Zone (late Ladinian to early Carnian); TR 5A, Capnuchosphaera Lowest-occurrence Zone (early Carnian); TR 5B, Poulpus carcharus sp. nov. Lowest-occurrence Zone (early to late Carnian); TR 6A, Capnodoce- Trialatus Concurrentrange Zone (late Carnian to early Norian), TR 6B, Trialatus robustus-Lysemelas olbia gen. et sp. nov. Partial-range Zone (early Norian); TR 7, Lysemelas olbia gen. et sp. nov. Lowest-occurrence Zone (early to late Norian); TR 8A: Praemesosaturnalis multidentatus group Lowest-occurrence Zone (late Norian); TR 8B: Praemesosaturnalis pseudokahleri sp. nov. Lowest-occurrence Zone (late Norian) ; TR 8C: Skirt F (possiblly derived from Haeckelicyrtium takemurai) Lowest-occurrence Zone (late Norian to early Rhaetian); TR 8D: Haeckelicyrtium breviora sp. nov. Taxon-range Zone (early to late Rhaetian) ; JR OA: Haeckelicyrtium breviora sp. nov.-Bipedis horiae sp. nov. Partial-range Zone (Hettangian); and JR OB: Bipedis horiae sp. nov. Lowest-occurrence Zone (Hettangian/Sinemurian) . These zones are correlated to previousy established radiolarian assemblages and zones in Japan and other regions. Age assignment of the zones is also discussed on the basis of the correlation and other available chronological data. The original stratigraphic succession of the Triassic in the studied area, which ranges in age from Early Triassic to Early Jurassic, is more than 100 m in thickness and can be reconstructed in detail. The succession is subdivided into seven units based on lithologic features. Each unit was probably accumulated under a particular sedimentary condition, thus successive changes of paleoceanographic environments during Triassic time can be traced continuously. Nine new genera including Ayrtonius, Blonzella, Braginella, Bulbocampe, Enoplocampe, Lysenzelas, Parvibrachiale, Spongoxystris and Veles, and 47 new species are described herein. A comprehensive list of identified taxa is presented.
The present catalogue is an attempt to bring together the genera and species of Trematoda currently known to parasitize Chiroptera Blumenbach, 1774, throughout their world distribution, as published in various journals. Since many of these are difficult to obtain for consultation, it is hoped that this catalogue may be of some utility in facilitating the work of helminthologists working with trematodes from bats.
Gehirne von an Scrapie erkrankten Tieren sind histopathologisch durch Vakuolisierung, Astrogliose, Neurodegeneration und charakteristische PrPSc-Ablagerungen gekennzeichnet. Die pathologischen Mechanismen, die zu diesen Veränderungen führen, sind noch weitgehend unverstanden. Die Untersuchung der differentiellen Genexpression in Scrapie-infizierten Mausgeweben kann zu einem besseren Verständnis der pathogenen Mechanismen dieser Erkrankung auf molekularer Ebene beitragen. Auch könnten einige der differentiell exprimierten Gene zur Entwicklung eines auf Surrogatmarkern basierenden Testsystems beitragen oder für die Entwicklung von Strategien zur therapeutischen Intervention nützlich sein. Um im Verlauf der Scrapieerkrankung in Mäusen hoch- oder herunterregulierte Gene zu identifizieren, wurden RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) und suppression subtractive hybridisation (SSH) an Hirn- und Milzproben Scrapie-infizierter Mäuse und gesunder Kontrolltiere durchgeführt. Die Ergebnisse wurden anhand eines differentiellen Screening-Schrittes, Sequenzanalysen und Northernblots bestätigt. Durch einen Datenbankabgleich der erhaltenen Sequenzen wurden mehrere Kandidaten identifiziert. Einige davon, wie GFAP, Apolipoprotein D, Vimentin, Mx-Protein, MHC I und II wurden bereits als in Scrapie-infizierten Gehirnen hochreguliert von anderen Arbeitsgruppen publiziert. Eine differentielle Regulation weniger weiterer Kandidaten, wie Cytochromoxidase, Ubiqitinierungsfaktor E4a und das herunterregulierte Stathmin wurden bisher noch nicht beschrieben. Auch eine bisher unbekannte differentiell exprimierte Sequenz wurde gefunden. Ergänzend zu den Untersuchungen auf Nukleinsäureebene wurde die 2DElektrophorese für Gehirngewebe zur Untersuchung der differentiellen Expresssion auf Proteinebene unter Berücksichtigung posttranslationaler Modifikationen etabliert. Protokolle für die Vorbereitung von Mäusegehirnproben, die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung und der 2. Dimension, sowie Färbeprotokolle für qualitative und quantitative Analysen der Gele unter Berücksichtigung der Erfordernisse nachfolgender MALDI-Analysen wurden erarbeitet.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Fusionstranskripte, welche normalerweise bei Leukämie-assoziierten chromosomalen Translokationen auftreten, in hämatopoetischen Zellen gesunder Personen gefunden. Da diese Personen keine entsprechenden chromosomalen Abberationen aufwiesen, ist es sehr wahrscheinlich, dass diese Fusionstranskripte durch trans-Spleißen entstehen. Während dieser Arbeit konnten durch inverse PCR, welche an unbehandelter cDNA gesunder Probanden durchgeführt wurde, intragenische trans-Spleiß-Produkte nachgewiesen werden. Interessanterweise weisen das MLL-Gen und seine fünf häufigsten Translokationspartner AF4, AF9, AF10, ELL und ENL ein großes Spektrum an trans-gespleißten RNAs auf. Nur in einem weiteren Mitglied der MLL-Familie (MLL3) konnte intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Für verschiedene als Kontrolle verwendete Haushaltsgene konnte kein intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Intergenische trans-Spleiß-Ereignisse konnten durch direkte PCR und RACEExperimente für die Gene MLL, ELL und ENL nachgewiesen werden. Bemerkenswerterweise entsprechen ein intragenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL-PTD und ein intergenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL•AF4. In Hefe konnte gezeigt werden, dass RNA als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann. Somit lag der Schluß nahe, dass die oben genannten trans-gespleißten RNAs möglicherweise einen Einfluss auf die DNA-Reparatur haben. Dass RNA nicht nur in Hefen sondern auch in Menschen als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann, konnte im Zuge dieser Arbeit durch mehrere in vitro Experimente mit Kernextrakten aus humanen Zelllinien bestätigt werden. Allerdings konnte keinerlei Einfluss von (trans-)gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur in zahlreichen in vitro Experimenten nachgewiesen werden. Mit einem daraufhin etablierten in vivo System konnte ebenfalls ein Einfluss von (trans-) gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten mit Hilfe der durchgeführten RACE-Experimente vorzeitige Polyadenylierungen von Transkripten in den Bruchpunktsregionen von MLL, AF4, AF9 und ENL identifiziert werden. Durch diese ungewöhnliche Termination der Transkription werden stark verkürzte Transkripte erzeugt, welche in kurze Proteinisoformen translatiert werden können. Ein Vergleich von 274 unterschiedlichen Bruchpunktsequenzen mit größeren direkten und indirekten Sequenzwiederholungen zwischen der Bruchpunktsregion von MLL und den Bruchpunktsregionen seiner häufigsten Translokationspartner wurde ebenfalls durchgeführt. Eine signifikante Korrelation zwischen den Sequenzwiederholungen und der Lokalisation der Bruchpunkte war jedoch nicht erkennbar. Bei diesem Vergleich fielen allerdings Häufungen von Bruchpunkten im MLL-Gen mit AF4, AF9 und ENL als Translokationspartner auf, wobei sich die Ursache für diese Häufungen auf Topoisomerase II Spaltstellen zurückführen ließ.
The heat stress (hs) response is universal to all organisms. As the cell senses increase in temperature, heat stress transcription factors (Hsfs) are activated to upregulate the expression of a number of genes encoding heat stress proteins (Hsp) which act as molecular chaperones to protect cells against heat damages. In higher plants, the phenomenon seems to be unusually complex both at the level of Hsfs and Hsps (e.g., 21 Hsf encoding genes in Arabidopsis and at least 17 in tomato). Upon prolonged hs, another characteristic property of plant cells is the assembly of large cytosolic aggregates called heat stress granules (HSG), which are composed of Hsps, HsfA2, RNA and RNA-binding proteins. The present work was aimed to understand plant hs response using tomato as a model system. To study the function of tomato Hsfs in their native system, we generated transgenic tomato lines altered in expression of HsfA1, HsfA2, and HsfB1. Tomato plants with 10-fold overexpression of HsfA1 (OE plants) were characterised by integration of a single HsfA1 expression cassette, whereas the plants harbouring a tandem inverted repeat (IR) of the cassette showed cosuppression of HsfA1 (CS plants). The lack of HsfA1 expression in CS plants results from posttranscriptional gene silencing connected with the formation of small interfering RNA (siRNA). Under normal growth conditions, major developmental features were similar for wild-type (WT), OE and CS plants. However, in contrast to the former two, CS plants and fruits were extremely sensitive to elevated temperature because hs-induced synthesis of major chaperones and Hsfs was strongly reduced or lacking. Despite the complexity of the plant Hsf family, the function of tomato HsfA1 is unique as master regulator of induced thermotolerance. On the other hand, maintenance of essential chaperones in CS plants during seed development suggests involvement of other Hsfs and/or transcription factor(s). HsfB1 and HsfA2 transgenic tomato plants, unaffected in thermotolerance, further supported the function of HsfA1 as the major factor regulating hs-inducible genes. Hs87 independent phenotypes of plants with altered expression of HsfB1 indicates developmental role of this Hsf. Using transient reporter assays with mesophyll protoplasts from WT tomato, we demonstrated that plasmids encoding Hsfs A1, A2 and A3 were well expressed which could function as activators for reporter gene expression. However, in protoplasts derived from CS plants, plasmids encoding HsfA2 and HsfA3 were normally expressed but even higher amounts of HsfA1 expression plasmids were completely silenced. Therefore, silencing of HsfA1 in CS plants was also reproduced in its mesophyll protoplasts. Lacking thermotolerance in CS protoplasts could be restored after transformation with expression plasmids encoding functionally equivalent HsfA2 or HsfA3 resulting in (i) expression of chaperones, (ii) survival of the cells at otherwise lethal temperature, (iii) thermoprotection of firefly luciferase, and (iv) assembly of heat stress granules (HSGs). The strong silencing caused by an IR in CS plants opened the possibility of a broad use of RNAi for gene knock-down also in the transient system of mesophyll protoplasts. Using this technology, we attempted to dissect essential components of thermotolerance and HSG assembly. We demonstrated the previously reported function of chaperones such as Hsp70 and Hsp101, and could discriminate the in vivo chaperone functions of different isoforms of Hsp20 and Hsp70 proteins. Hsp17-CI, Hsp70 (hs-inducible isoforms), and Hsp101 are absolutely essential chaperones for thermotolerance in plants. Furthermore, the results also show that despite Hsp17-CI and -CII being major components of HSG complexes, they are dispensable for assembly of these complexes. Based on these results, it is proposed that in the transient protoplast system an approach with gene-specific IRs can be used to discriminate functions of closely related isoforms among protein-families and to dissect complex protein networks.
Plastids are complex plant organelles fulfilling essential physiological functions, such as photosynthesis and amino acid metabolism. The majority of proteins required for these functions are encoded in the nuclear genome and synthesized on cytosolic ribosomes as precursors, which are subsequently translocated across the outer and inner membrane of the organelle. Their targeting to the organelle is ensured by a so called transit peptide, which is specifically recognized by GTP-dependent receptors Toc159 and Toc34 at the cytosolic side of outer envelope. They cooperatively regulate the insertion of the precursor protein into the channel protein Toc75, thereby initiating the translocation process. Toc34 is regarded as the primary receptor, while Toc159 probably provides the driving force for the insertion. Precursor transfer is achieved by the physical interaction between both receptors in the GTP loaded state. One translocon unit, also called the Toc core complex, is formed by four molecules Toc34, four molecules Toc75 and one molecule Toc159. In the GDP-loaded state, Toc34 preferably forms homodimers, whose physiological function was investigated in the presented study. It could be shown that the dissociation of GDP and therefore the nucleotide exchange are inhibited by the homodimeric state of Toc34. Dissociation of the homodimer is induced by the recognition of a precursor protein, which renders the binding of GTP and subsequent interaction with Toc159 possible. Thus, the homodimeric conformation could reflect an inactive state of the translocon, preventing GTP consumption in the absence of a precursor protein. Both homodimerization as well as heterodimerization of the receptor are regulated by phosphorylation, which could be demonstrated by in vitro and in vivo approaches using atToc33 from Arabidopsis thaliana as a model system. Since the phosphorylated form of Toc34 cannot be assembled with the Toc core complex, it can be concluded that the interactions between GTPase domains not only regulate the transfer of precursor proteins, but also warrant the integrity of the translocon.
The chemiosmotic theory suggested by Peter Mitchell (Mitchell, 1961, Nature 191:144-148; see Mitchell, 1979, Science 206:1148-1159 for review) postulated that the energy released upon the oxidation of electron donor substrates is transiently stored as electrochemical proton potential, delta-p across energy-transducing membranes, which acts then as the driving force for the ATP synthesis. Membrane protein complexes can both generate and utilise a transmembrane electrochemical proton potential, either by transmembrane proton transfer or by transmembrane electron transfer coupled to protolytic reactions on opposite sides of the membrane. The dihaem-containing membrane protein complex quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic epsilon-proteobacterium Wolinella succinogenes apparently combines both of these mechanisms (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961; Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865; Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728; Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970). QFR is the terminal enzyme of anaerobic fumarate respiration that allows bacteria to use fumarate as the terminal electron acceptor (Kröger, 1978, Biochim Biophys Acta 505:129-45; Lancaster, 2004, In: Respiration in Archaea and Bacteria Volume 1:57-85). QFR couples the two-electron reduction of fumarate to succinate to the two-electron oxidation of quinol to quinone. QFR contains two haem b groups bound by the transmembrane subunit C, which are termed the ‘proximal haem’, bP, and the ‘distal haem’, bD, according to the relative proximity to the hydrophilic subunits A and B (Lancaster et al, 1999, Nature 402:377-85). The two-electron transfer via the two haem groups has been proposed (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 1565:215-231) and demonstrated (Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970) to be coupled to a compensatory, parallel transfer of two protons via a transmembrane proton transfer pathway. The two most prominent constituents of the proposed pathway were suggested to be the haem bD ring C propionate and the side chain of amino-acid residue Glu C180, after which the proton transfer pathway was named the ‘E-pathway’ (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 565:215-231). The essential role of Glu C180 was supported by site-directed mutagenesis and structural and functional characterization of the enzyme E180Q, where the Glu C180 was replaced with a Gln residue (Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865). Moreover, multiconformer continuum electrostatics (MCCE) calculations (Haas and Lancaster 2004, Biophys J 87:4298-4315) and Fouriertransformed infrared (FTIR) spectroscopy experiments (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961) indicated the Glu C180 side chain to undergo a combination of a conformational change and protonation upon haem reduction. The contribution of haem bD propionate is less clear, however, a combination of 13C labelling of the haem propionates with redox-induced FTIR experiments (Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728) and MCCE calculations (Haas and Lancaster, 2004, Biophys J 87:4298-4315) support a change in protonation, possibly accompanied by a change in environment upon haem reduction. These experiments and their results strongly support the existence of the ‘E-pathway’ which is transiently open during the reduction of the haem groups and blocked in the oxidized state of the enzyme (Lancaster, 2002b, Biochim Biophys Acta 1565:215-231). All available crystal structures of the QFR, however, are those of the oxidized enzyme. Therefore, it is advantageous to perform simulations of various redox states of the enzyme to determine for instance, how the side-chain of Glu C180 and haem bD ring C propionate behave upon changes of the redox states of the haem groups and why is the ‘E-pathway’ blocked in the oxidized state of the enzyme. Although the distal haem ring C propionate and Glu C180 were identified as the most prominent components of the proton transfer pathway, it was not clear, on the basis of the structure, how proton transfer could occur between them. In addition, two constituents are not enough to span the membrane region and the additional participants in the proton transfer pathway must be identified. Since an atomistic investigation of proton transfer in this system is not yet possible experimentally, I used available theoretical methods such as classical molecular dynamics (MD) simulation (Alder and Wainwright, 1959, J Phys Chem 31:459-466; McCammon et al, 1977, Nature 267:585-590) and Q-HOP molecular dynamics (Q-HOP MD) simulation (Lill and Helms, 2001, J Chem Phys 115:7993-8005) to investigate the postulated mechanism of electron coupled proton transfer in QFR. MD simulations allowed us to move away from static difference pictures obtained from FTIR experiments and MCCE calculations. The advantage of the MD simulations over the experiments and the simulations performed so far is that the time-dependent properties could now be analyzed. The behaviour of various residues and their side-chains and any environmental changes may be directly observed during MD simulations. Although classical MD simulations cannot be used to study proton transfer reactions, they can provide information on formation of configurations that would allow either direct proton transfer between donor and acceptor residues or indirect proton transfer mediated by water molecules. To avoid the static protonation of residues which is inherent in classical MD simulations, Q-HOP MD simulations were performed which explicitly describe proton transfer reactions by allowing the change of the protonation state of residues ‘on the fly’. The structures obtained after classical molecular dynamics simulations ....
The Indian Hill Mynah (Gracula religiosa) was studied in the field in Assam in north-east India. The aims of the study were two-fold: (i) to understand better this bird's exceptional ability in captivity to imitate human speech; and (ii) to provide background understanding to studies of the importance of early auditory experience and of vocal imitation in the development of normal song patterns in birds. First is given a brief description of the distribution, general behaviour, and breeding biology of this arboreal, sexually isomorphic, semi-gregarious species. The remainder of the monograph deals with vocalizations; these were either tape-recorded in the field, or transcribed directly using a written notation developed for the purpose. Any wild adult Mynah of either sex possesses four categories of vocalizations: (i) 'Chip-call'; a loud piercing squeak made in contexts which include alarm. (ii) 'Um-sound'; a soft grunt, acting in close range social contexts, and (like chip-calls) common to all individuals. (iii) 'Whisper-whistles': several soft sounds of types unique to the individual. (iv) 'Calls': several loud noises, of extremely varied patterns. The bulk of the monograph deals with 'calls', as defined thus. Calls were compared quantitatively with one another by a method developed which measured the degree of overlap of one sonogram with a tracing of a second sonogram. Both by this method and by ear, calls were divided into discrete types, without intermediates. Birds of either sex have a repertoire of usually between five and twelve such call types, some of which are produced much more commonly than others. Repertoires tend to be larger in birds which call more frequently, or which have mates with large repertoires. The repertoire of a given bird stays largely constant from year to year in size. composition, and proportions. No bird shares any of its call types with its mate, but it shares several of them with near neighbours of the same sex. There is a progressive change of dialect with distance, such that birds nesting more than about 14 km apart have no call types in common. No general characteristics of call structure could be found which were indicative of the sex of the caller, but in a known locality the call type made immediately reveals the sex of the bird producing it. Call types are learnt by selective imitation of neighbouring individuals during a young bird's first several months. A call type common in the repertoire of one bird tends also to be common in the repertoire of a neighbour, except at the edge of the limited range of that call type. Which particular call type a calling bird selects from among those in its repertoire is discussed. Few call types could be related to non-auditory contexts. A bird is likely to repeat the call type last made, and also tends to standardize the order in which it produces its different call types; this standard order tends to be the same as that of its neighbours. A birdtends also to reply at once and to standardize the call type it makes in immediate reply to a particular call type of its mate; again, neighbouring pairs of birds tend to use the same standardized call and reply types. The length of the interval between a particular call and its reply tends to be constant in a given pair of birds, and approximately the same in neighbouring pairs. These are all further aspects of extensive but selective vocal imitation by Mynahs of adult birds; other species are not imitated. Information on calling when in contact with other pairs came mainly from playback experiments, when single calls were presented to nesting pairs of Mynahs. Response strength was measured by the incidence of flight, number of subsequent vocalizations, latency of response, and proportion of playbacks ignored. When presented with playbacks of calls of familiar types (of neighbours) and of unknown types (of strangers), birds responded more strongly to the familiar than to the unknown call types. They did, however, respond somewhat to the unknown call types, which were of patterns never previously heard by them, presumably recognizing these as being Mynah calls by their sound quality. Mynahs responded as strongly to playbacks of neighbours' calls which were not in their own repertoire as to playbacks of neighbours' calls which were. A bird tends to match at once the call last heard (either from a tape recorder or from a wild neighbour), itself producing the same call type at once, if it possesses it in its own repertoire. That call type, and others associated with it, also occurs more frequently thereafter. Thus calls heard affect calls made, and vice-versa since other individuals nearby behave similarly. A change of nearest neighbours in successive years was shown to affect one pair's repertoire proportions. Further playback experiments showed that Mynahs were able to distinguish between a single call made by their neighbours and a single call of the same call type made by their mates. Small but consistent differences were found in the sonograms of such calls of the same type made by different birds. The structure of a single call type may change gradually with distance. The development of vocalizations with age is briefly described. In the final discussion sections, the ways in which, and the extent to which, Mynahs are able to determine the species, home locality, sex and individual identity of other Mynahs are outlined. There follow consideration, and comparison with other species: (i) of various aspects of repertoires; (ii) of the distribution of call types among different individuals; (iii) of the dynamic aspects of calling, and a scheme is proposed which accounts for the selection for utterance of a particular call type from the repertoire; and (iv) of the organization and coordination of calling. The lack of imitation of other species in the wild is discussed, and contrasted with the several ways in which wild Mynahs imitate one another in various aspects of their calling.
Carnian (Upper Triassic) fishes from Polzberg bei Lunz have been known since 1886 but no comprehensive account has been published. Eleven species are described nine of which, Saurichthys calcaratus, Polzbergia brochatus, Peltoplellrus dinlmptus, Habroichthys gregarius, Nannolepis elegans, Phaidrosoma lunzensis, Elpistoichthys pectinatus, E. striolatus and Pholidophoretes salvus are new, and two others, Thoracopterus niederristi Bronn and Gigantopterus telleri Abel, previously little-known. New supraspecific taxa defined are: the order Polzbergiiformes, the family Thoracopteridae and the genera Polzbergia, Nannolepis, Phaidrosoma, Elpistoichthys and Pholidophoretes. Habroichthys. Thoracopterus, Gigantopterus and Nannolepis show an unusual skull-roof pattern and are included in the re-defined order Luganoiiformes. Two new ichthyokentemids considerably extend the known time-range of this family. The genus Pholidophoretes is intermediate between the Archaeomenidae Goodrich 1909, and the Pholidophoridae sensu stricto Nybelin 1966. The Polzberg assemblage was probably mainly marine with a small freshwater contribution; it shows less similarity to the Besano and Raibl assemblages than these do to each other. The Luganoiiformes are probably, but not certainly, monophyletic; relationships within the order are analyzed and a cladogram constructed. The Platysiagiformes, Peltopleuriformes, Luganoiiformes and Cephaloxeniformes could all have been derived from a common ancestor at the Perleidus level and are probably offshoots of the perleidid radiation.
Glyptostrobus Endlicher is well represented in early Early Cretaceous to Pleistocene deposits in the middle to high latitudes of North America and Eurasia. Although the taxonomy and nomenclature of the genus is complicated, the fossil record indicates Glyptostrobus was represented by a small number of species. The genus first appears in Aptian age deposits from western Canada and Greenland, and achieved a wide distribution early in its evolutionary history. Exchange of Glyptostrobus between Asia and North America occurred across the Spitsbergen and Beringian corridors, which were functional about 110 and 100 million years ago, respectively The Late Cretaceous fossil record of Glyptostrobus shows that the genus had spread into Russia, China and the shores of the Turgai Strait. By the early Tertiary, Glyptostrobus was a prominent constituent of the polar broad-leaved deciduous forests. Paleocene age deposits across western Canada and the United States indicate the genus was present in great abundance in the lowland warm temperate and subtropical forests east of the Rocky Mountains. The broad distribution in North America and Russia during the Paleocene and Eocene indicates that Glyptostrobus grew and reproduced under a diverse range of climatic and environmental conditions, including the cold and unique lighting conditions of the polar latitudes. The presence of Glyptostrobus in Europe indicates the North Atlantic land bridges that extended between North America and Eurasia (Fennoscandia) and Europe during the early Tertiary were used. In Europe, extensive Glyptostrobus dominated swan1ps occupied the Central European Depression during the late Tertiary. Increasing global aridity and cooling, as well as landscape stabilization together with increasing competition for resources and habitat by representatives of the Pinaceae, seem to have forced the genus out of North America, Europe and most of Asia during the Miocene and Pliocene. In Japan, Glyptostrobus persisted until the early Pleistocene. After the early Pleistocene extinction in Japan, Glyptostrobus reappeared in southeastern China. Details of the taxonomic and biogeographic history of Glyptostrobus are examined.
This paper is a general review of the problem of clutch-size in birds. It grew out of a search through the literature to see to what extent clutch-size trends found in the Robin, Erithaau8 rebecula, might apply generally. Part I. describes those types of clutch-size variation found within any species, Part II. provides a general discussion of the factors involved. In Part IlI, which follows separately later, some of the differences between different species of birds will be considered. Examples are taken mainly from European birds, hence this review is in some ways supplementary to that on African birds by Moreau (1944), to which the present study owes a considerable debt.
(1) a. The mating behavior (including copulation) is described for the first time in the following species: Pardosa modica, P. emertoni, P. saxatilis, P. lapidicina, Lycosa helluo, .L. gulosa, Dolomedes scriptus, Phidippus clarus, P. audax, Philodromus pernix, and Coriarachne versicolor. b. The courtship only is described for the first time in Phidippus purpuratus. c. In Lycosa rabida and Pardosa milvina new data concerning the copulation, and in Schizocosa crassipes new data concerning courtship, are added to what is already available from Montgomery's work. d. In Tibellns oblongus and Xysticus triguttatus new data are added to the accounts of Gerhardt, and of Emerton, respectively. (2) a. On the basis of a large number of observations and experiments with the males of 19 species from 4 families of vagabond spiders, it is pointed out that the senses involved in courtship may vary with the species. b. There is no evidence that a sense of smell is used in sex recognition by any spiders. At least this sense plays no part in initiating courtship activity in the male. c. There is no evidence that Attid males can "recognize" the females by any sense other than sight. At any rate, it appears that the visual stimulus is the only one that suffices to incite courtship in this family. d. In one Lycosid observed, Pardosa emertoni, the courtship behavior is elicited only when the male can both see and touch the female. e. In the Pisaurid, Dolomedes scriptus, the sole stimulus for courtship is the chemoperception by contact of an ether-soluble substance normally covering the cuticle of the female. f. In the Lycosid, Pardosa milvina, the chemoperception by contact of an ether-soluble substance normally covering the cuticle of the female, together with the simultaneous perception of tactile stimuli will elicit courtship. This probably holds for P. saxatilis, Lycosa rabida, Schizocosa crassipes, and perhaps for Pardosa modica. Moreover, the sight of a moving Lycosid of about their own size may, in some cases, be sufficient for these males to start courting. g. In the Lycosids, Pardosa banksi, and probably Lycosn gulosa and L. helluo, only the simultaneous perception of both tactile and tacto-chemical stimuli suffices. Visual stimuli play no part in eliciting courtship. h. The condition in the Thomisids is in all probability similar to that in the preceding group of Lycosids. (3) a. In the case of those species in which contact chemoperception occurs it is shown that perception is not limited to the tarsi. Such stimuli can be perceived on all the segments of the legs as well as on the abdomen. From the known distribution of the slit sense organs it is probable that they are the chemoreceptors involved in courtship.
The seed collection of the species of the Gesneriaceae on which this study is based was obtained, for the most part, during a number of visits to the herbaria of the Smithsonian Institution, Washington, D.C., and the Royal Botanical Garden of Kew, London, and Edinburgh, Scotland. The seed collection comprises well over 800 samples of about 700 species of the Gesneriaceae, representing 113 genera of the 127 in the family, and provides a good taxonomic representation of the Gesneriaceae. Following an examination of all the samples in the seed collection, over 300 species of the 113 genera were selected to represent the wide range of seed morphology characters observed among the examined species of the Gesneriaceae. A system with which to analyze and diagnose seed surface morphology, designed by the author, is based on a format of six major categories and 60 tertiary terms of seed morphology characters and a companion diagnostic table. The categories are arranged in a sequence of increasingly smaller seed characters, ranging from seed shape to the ultrastructural characters of the individual cells. To ensure that the system would also apply to seed plants in general, the seeds, achenes and nutlets of a wide variety of species from families other than the Gesneriaceae were examined. Twenty species from 13 families other than the Gesneriaceae were then selected and are included in this study and, together with the Gesneriaceae, represent eight of the ten subclasses of the flowering plants (Cronquist 1968). The seeds, achenes and nutlets of all the species included in this study are illustrated with SEM photomicrographs on the 54 plates of the Seed Atlas, and the seed morphology data of each species are recorded on the diagnostic tables that face each of the Atlas Plates. To facilitate the comparison of the taxa of the Gesneriaceae, and to assist in the identification of the seeds of the examined species of the Gesneriaceae, the seed morphology data are also recorded on a summary table at the genus, tribe, subfamily and family levels. The seed morphology of the Gesneriaceae is compared and contrasted with the current classifications of the family at the species, genus, tribe, subfamily and family levels. The seed analysis system designed for this study has proven to be a rapid, efficient, uniform, objective method to deal with the analytical, diagnostic, and taxonomic aspects of an investigation of seed morphology. In addition, the system readily lends itself to the substitution or addition of terms and categories if needed, or to programming for a computerized analysis of seed morphology. It is hoped that the system will prove useful to other investigators, as well as prove helpful to standardize future investigations of seed
morphology.
The last decade of research in the field of animal nutrition has Ied to the discovery of a new class of substances in the food stuffs constituting the animal dietary. These compounds have been designated "Vitamines, Accessory Factors of the Diet, Exogenous Hormones of the Diet". They are present in infinitesimal quantities in certain articles of the diet, but their role in the metabolic cycle is one of the greatest importance. Subsequent investigation has shown that they are essential for the wellbeing and even the life of the organism itself. Without these indispensable elements the animal cell is unable to maintain its activities unimpaired, or the adolescent subject to attain normal growth. Continued deprivation leads to disease and ultimately to cessation of life. The discovery of these cornpounds was the result of a generation's work on the etiology of two diseases - Beri-beri and Scurvy. These are now known as "Deficiency Diseases". Each of these pathological conditions is due to the dietary deficiency of a specific substance, which in the case of beri-beri is known as the "Anti-neuritic Vitamin" (Funk); "Water Soluble B substance" (McCollum). In the case of scurvy this element is called the "Antiscorbutic Substance". A third factor associated with fats of animal origin has been subsequently discovered, but its deficiency results in a general malnutrition of a chronic type complicated with Xerophthalmia.
Neogastropods are usualiy accepted as the most advanccd prosobranchs, though their organization is approached in several respects in some higher families of Mesogastropoda. This seems, however, to be due to parallel evolution and the neogastropods originated from a much lower grade of mesogastropod. Although some workers derive them from an archaeogastropod stock there are too many features in their anatomy characteristic of mesogastropods rather than of archaeogastropods for this to bc acceptable. On the whofe, neogastropods are a rather uniform group of prosobranchs in their shell, external features, and internal anatomy. In only one System do they show, by comprison with archaeo- and mesogastropods, both extreme specialization and considerable variation: this is the gut, which is in several ways unlike that of any other prosobranch. This is to be associated with their carnivorous way of life, in which respect they again differ markedly from meso- and archaeogastropods. Taylor, Morris Br Taylor (1980) have shown how neogastropod species differ amongst themselves not, primarily, in their rnode of life, but in their often narrow choice of prey. Since the anatomical requirements for predation are more or less constant, the different species remain similar in organization and are often sympatric. In these respects neogastropods differ markedly from mesogastropods, whose adaptive radiation has been extensive and primarily in relation to mode of life. Separation of neogastropods from mesogastropods rests mainly on the siphonal canal in the shell, the siphon on the mantle edge, the rachiglossate or toxoglossate radula, and the presence of a pleurembolic proboscis or one of its varieties (Smith, 1967). The osphradium is large and its axis carries a double series of lamellae, giving it a gill-like appearance. Males always have a penis and females usually a ventral pedal gland. lnternally the anterior part of the alimentary caiial has becorne elaborate, with a complex glandular equipment, and the wall of the kidney is more folded than in mesogastropods. The nervous systern is concentrated, though the visceral ganglia remain posteriorly placed. Eggs are laid in capsules attached to the substratum. A free larval stage is often suppressed and food eggs are common, but neither of these features has much taxonomic significance, occurring apparently randomly throughout the group. Because of their general similarity classification of the Neogastropoda has proved to be no easy task, and there is still no universally-accepted subdivision of the order into superfamilies. It is generally agreed, however, that the order may be split into two groups, primarily on the basis of radular structure. The more primitive of these, the Rachiglossa, has a radula with typically 3 teeth per row; the more advanced, the Toxoglossa, has a radula which, in more primitive genera, resembles the rachiglossate, but which Comes, in more advanced toxoglossans, to have only a single tooth in action at a time. Each tooth has then become scroll-like and is used for the injection of poison from a poison gland into the prey (Shimek & Kohn, 1981). The group Toxoglossa is agreed to contain the superfamily Conacea which includes (as Recent forms) the families Turridae, Conidae, and Terebridae, all with poison apparatus, though with very different shells. Risbec (1955), followed by Taylor & Sohl (1962), has added a second superfamily Mitracea containing, in the family Mitridae, a grouping of genera selected from that family as earlier understood. These have a rachiglossate radula and an apparent poison gland not irnrnediately comparable with that of undoubted toxoglossans. This reclassification of mitrids has not found favour with subsequent workers (Cernohorsky, 1966, 1970; Ponder, 1972). Ponder (1973) made a case for adding a third suborder to the two mentioncd above. This was to contain the single superfamily Cancellariacea with the one family Cancellariidae. The case rests on the unique character of their radula. It is, however, when one turns to the remaining rachiglossan families and- attempts to assign them to superfamilies that difficulties mount. Three groupings Iiave been conventionally recognized - Muricacea, Buccinacea, and Volutacea, though it has often appeared that the last was a collection of animals not obviously assignable to the other two rather than clearly related amongst thernselves. Ponder (1973) came to the somewhat pessimistic conclusion that all rachiglossans should be put into a single taxon, for which he used the name Muricacea. It seems to us, however, that certainly within the limited group of anirnals with which we have to deal here, but even in a broader context, there is still some validity - and certainly convenience - in the older Separation, when due importance is given to internal anatomy; we propose, therefore, to retain the three superfamilies in dealing with a group which is otherwise too large for easy treatment. We adopt this arrangement the more readily as we have no volutacean mernbers of the fauna with which we have to deal, provided that we accept Ponder's proposal to create a separate superfamily for cancellariids. This allows the remaining superfamilies to be split into Muricacea and Buccinacea, and it is between these two superfamilies that lines of division may most obviously be drawn. Taylor & Sohl (1962) noted about 800 genera and subgenera in the rachiglossan group. The Buccinacea, with nearly 400, is rivalled for size only by the superfamilies Rissoacea and Cerithiacea amongst all the prosobranchs. A difficulty arises at this point in relation to the number of species which have been described. Many neogastropods are not intertidal in occurrence. Their capture is dependent upon dredging, a method which can often do no more than sample a few isolated spots on the ocean bed. Many species have been described on the basis of these samples without any real knowledge of the variation whjch may affect populations. It seems, indeed, probable that many of these are no more than local varieties, especially when it is remembered that the anatomy of many is very imperfectly known. We have, therefore, been conservative in nomenclature and tended to use broad generic groupings where others might have used narrower ones. The latter may be right, but it is prernature to be sure of this.
A cladistic analysis is presented of the hawkmoths of the tribe Acherontiini, Morgan´s Sphinx (Xanthopan morganii (Walker», and related genera. The study aims to test the monophyly of tribe Acherontiini; the hypothesis that all taxa with extremely long probosces (some Acherontiini, Meganoton rubescens, Neococytius, Xanthopan) form a monophyletic group, or at least fall within a single reasonably compact clade; and, within this group, to determine whether Xanthopan is more closely related to Acherontiini or to COCytillS and Neococytius. The data set comprises 109 characters derived from adult and immature stage morphology, biology and behaviour. These data were analysed using equal weighting, successive approximations character weighting (SACW) and implied weighting. All weighting schemes agreed on the monophyly of Acherontiini and of a group of genera comprising Amphimoea, Cocytius and Neococytius (the Cocytius group). Several other generic and suprageneric clades were also consistently recovered. However, those hawkmoths with extremely long probosces were never recovered as a monophyletic group. The relationships of Xanthopan were also ambiguous. Equal weighting and SACW placedXanthopan + Meganoton rztbescens (Butler) as sister to the COCytills group, while implied weighting placed Xanthopan as sister to Acherontiini. This latter relationship is based primarily on shared possession of a pilifer/palp hearing organ. Further analyses suggested the two components of this organ were not biologically independent. Downweighting this feature accordingly resulted in all weighting schemes converging on the topology found by equal weighting. Exclusion of the incomplete subset of immature stage data had no effect under implied weighting but equal weighting and SACW now recovered a Neotropical clade comprising Manduca. and the Cocytius group, while Xanthopan was placed with M. rubescens and Panogena. Downweighting the pilifer/palp hearing organ under implied weighting again caused convergence with the equal weighting/SACW results. Thus, the relationships of Xanthopan remain equivocal and further data, particularly from the immature stages, will be required to elucidate its phylogenetic position further.
A multi-part theorem is presented concerning the morphogenesis of high-symmetry structures made of three-dimensional morphological units (MU's) free to move on the surface of a sphere. All parts of each MU interact non-specifically with the remainder of the structure, via an isotropic function of distance. Summing all interactions gives a net figure of merit, X, that depends upon MU positions and orientations. The structure evolves via gradient dynamics, each MU moving down the local gradient of I. The analysis is reresented with generality in Fourier space, which eases the expression of symmetry. Structures near symmetry, but far from a local minimum of I, are analyzed. For each, a symmetrical configuration can be found, for which X is an extremum with respect to symmetry-breaking perturbations. Under gradient dynamics, a quadratic measure of such deviations from symmetry decreases monotonically, anywhere in the large basin of attraction of a local minimum. Thus: high symmetry is an attractor. Application is made to icosahedral virus capsids. The Symmetrization Theorem shows that a stable capsid, maintained by non-specific interactions among its capsomeres, could arise generically in a "bottom-up" process. For animated evolutions that selfassemble into high symmetry, visit http://www.albany.edu/~cmarzec/
The larvae of Orthocladiinae (Diptera: Chironomidae) of the Holarctic region : keys and diagnoses
(1983)
Material of the domestic fowl of appropriate ages, ranging from twelve hours' incubation to the adult bird, was prepared for the purpose of studying the production and development of the germ cells. The primordial germ cells arise in the extra-embryonic region anterior to the head fold in the region of the zone of junction during the primitive-streak stage. These germ cells migrate, through the blood stream, to the region of the future gonad, where they develop into the definitive germ plasm. There is no widespread degeneration of the primordial germ cells after their arrival in the gonadal region, nor is there any widespread transformation of somatic cells into definitive germ cells.
The theoretical concept of the biological species and the multidimensional species category, as currently applied by a majority of ornithologists and by many other biologists, replaced the typological-morphological species concept during the first half of this century and became a central tenet of the synthetic theory of evolution. The concept of biospecies is a 'horizontal' concept referring to contemporary reproductive communities at any particular period, e.g. the Recent period or any other time level of the geological past. Historical 'species' concepts as applied by cladists and palaeontologists refer to artificially delimited portions of 'vertical' phyletic lineages for which the application of the term 'species' causes severe problems. Discussions would be simplified if the concept and term 'species' was to be restricted to cross sections of phyletic lineages at any time level and a separate taxonomy outside the Linnaean system of genera and species was to be conceived to deal with phyletic lineages. Under each of the theoretical species concepts, species taxa are assigned broadly to intermediate or narrowly defined taxonomic species categories. Ornithologists of the 19th century applied morphological species concepts, emphasizing morphological character differences between species (rather than distinctness) and the fertility of con specific individuals (rather than the isolation from non-conspecific populations). Nearly all leading museum ornithologists in 19th-century Europe delineated monotypic Linnaean species, whereas the explorer-naturalists of the Gloger-Middendorff school (including Panas, Faber, Gloger, Nordmann, Middendorff, Schrenck, Radde, as well as Schlegel and Blasius) delimited widely circumscribed species taxa. Their researches in the vast territories of eastern Europe, Siberia and the Far East from the late 18th century to the 1880s and, in particular, their rich specimen material, demonstrated direct intergradation of many taxa (geographical varieties) of birds, thus revealing the conspecific nature of numerous narrowly conceived morphospecies previously described by museum workers. The ornithologists of the Gloger-Middendorff school also studied several conspicuous phenomena of geographical character variation in birds (and mammals) across Eurasia, especially plumage colouration (and pelage) and body size, but none of them was an evolutionist. They an adhered to a typological-creationist theoretical species concept. During the late 19th century, the museum specialists' taxonomic notion of narrow morphospecies dominated systematic ornithology in Europe, overtaking the work of the naturalists of the Gloger-Middendorff school, which fell into oblivion. The ornithologists of the Bairdian school in North America (Baird, Coues, Allen, Ridgway) further developed the concept of subspecies after the 1850s and especially from the 1870s onward. Their views were fully in accord with Darwin's theories of evolution' thus they defined the subspecies in a somewhat simplified manner as 'nascent species': These ornithologists were able to base their studies on collections of extensive specimen material which they had obtained during a series of exploring expeditions across the North American continent. Their studies led to the discovery of many aspects of both individual and geographic variation in birds. There are interesting historical similarities between the coinciding taxonomic interpretations and the comparable application of fairly broad limits of morphospecies by the North American ornithologists and the earlier exploring ornithologists in Europe, arrived at Independently by these, research groups, The study of specimens in 'series' (,suites'), beginninng with the naturalists of the Gloger-Middendorff school and, in particular, with the naturalists of the Bairdian school in North America, eventually led to the overcoming of the prevating typological view of variation and the development of 'population thinking'. Influenced by the work of Henry Seebohm in Britain and that of the North American ornithologists, Hartert in England and Kleinschmidt in Germany jointly succeeded in overcoming the strong opposition of the leadi.ng ornithologists in Europe during the 1890s and early 19008 and introduced a concept which soon developed into the biological species concept through the work of Stresemann, Rensch, and in particular, Ernst Mayr. Hopefully, ornithologists will continue the study of taxa at low, intermediate and high levels of microtaxonomic differentiation and will identify the subspecies groups, biological species and the biogeographical species in the world's avifaunas. Cladistic analyses will provide historical {'vertical'} overviews of phyletic lineages at different taxonomic levels.
The genus Maculinea van Eecke, 1915 (Lepidoptera: Lycaenidae) from the East Palaearctic Region
(1994)
We revise the classification of taxa belonging to the genus Maculinea from the East Palaearctic Region. In this region, in addition to the well-known three species: M. arion (Linnaeus, 1758), M. ationides (Staudinger, 1887) and M. teleius (Bergstriisser, [1779] 1778-1780), two additional species occur: M. alcon ([Denis & Schiffermiiller], 1775) (upper and middle Amur River, Primor'e, China Northeast/Manchuria and North Korea) and M. kurentzovi sp. nov. (upper and middle Amur River, Primor'e, China Northeast and North Korea). Lycaena kondakovi (Kurentzov, 1970) described from Primor'e is a composite species: the lectotype if' designated here represents an East-Asian subspecies of M. alcon, but its single paralectotype is a female to be assigned to M. kurentzovi sp. nov. Only limited numbers of specimens have been known with M. alcon kondakovi from lowlands of "Far-Eastern" Russia and China Northeast, but in North Korea we found a conspicuous allied taxon arirang nov. (female unknown), which we treat here as a highland subspecies of M. alcon but which may actually represent a good species. Of kurentzovi, we have found a series of specimens which have so far been mostly confused with M. teleius in various collections. We treat Glaucopsyche xiaheana Murayama, 1991 from western Gansu as a subspecies of M. arion along with other subspecies from the central and western parts of China: M. adon philidor (Fruhstorfer, 1915) from the east end of the Qilian Range as well as Mongolia, the type locality, and M. arion inferna nom. nov., a replacement name for Lycaena talsienluica (OberthUr, 1910) (praeoccupied) from Tibet, Sichuan and Qinghai. Because of the similarity of male genitalia and existence of intermediate forms, we regard M. sinalcon Murayama, 1992 described from Qinghai as a subspecies of M. teleius despite a few significant characteristics of the holotype. East continental Asia may be regarded as the headquarter of the genus Maculinea.
Introductory chapters on the geography, vegetation and history of botanical ex loration are followed by a catalogue of 331 species of wild vascular plants, 90% of which represent first records for the island. Synonymy, references, localities and ecological data are given for each species in a condensed form. The taxonomy, nomenclature and distribution of some taxa are discussed; in one case (Silene cythnia) a drawing and a distribution map are supplied. Nomenclatural novelties are validated in the genera Centaurea, Matricana, Melica (by W. Hempel) and Trifolium. A phytogeographical and ecological analysis of the flora demonstrates its striking banality and the unexpectedly high proportion of anthropophytes. No pliytogeographical link with tlie other E. Aegean Isiands and Anatolia exists, but there are some affinities with the Cyclades. The observations are consistent with the hypotliesis of a long insular isolation leading to a strong depletion or even destruction of the original flora, which has been replaced by long-distance dispersed and anthropophytic elements.
The present work deals with the problem of the essential factor regulating the wing-stroke frequency in some insects in wing mutilation and loading experiments and in subatmospheric air pressure experiments. The diverse opinions concerning this factor, appearing in the literature, are reviewed. As appears in this review, one of two factors, the inertia of the wings or the resistance of the gas medium, is claimed to be the main regulator of the wingstroke frequency. Therefore two series of experiments have been performed. In the first series the correlation between the moment oi inertia of the wings and the wing-stroke frequency is examined. The wings are mutilated by cutting them transversely, longitudinally or obliquely or loaded with a drop of collodion. It is found that (1) the wing-stroke frequency is proportional to the -0.35th power of the moment of inertia of the wings, that (2) this applies to both mutilation and loading experiments, that (3) it makes no difference whether the procedures are equal or unequal on both sides or only one-sided, and that (4) the frequency tends not to rise above a certain lirnit in mutilation experiments. In the second series of experiments the correlation between the pressure of the gas medium and the wing-stroke frequency is examined. It is found that the effect of pressure varies greatly in different insects and may even be totally absent. The wing-stroke frequency is proportional to (pressure) exp 0 to (pressure) exp -0.25. The degree of the effect is found to depend on the size and the wing-stroke frequency of the insect; the effect is absent in big insects with a medium or high frequency, and more or less present in insects with a small size or with a low frequency. The results are discussed. A theory is constructed using well established physical concepts by considering the wings as acting simultaneously as bodies performing simple harmonic rotary motion and as paddles working against the air. It is assumed that the kinetic energy is destroyed after each single stroke. By making this assumption, the frequency in the energy equation is found to be, within a constant rate of energy output, proportional to the -0.33rd power of the moment of inertia of the wings, and thus agrees very well with the correlation between these factors found experimentally. Further it is found that the aerodynamic work of the wings is in most cases very much smaller than the work done in overcoming the effect of the inertia of the wings. It is negligible in big insects with, a medium or high frequency, but more or less significant in insects with a small size or a low frequency. The magnitude of this effect thus depends, in theory, on the size and the wing-stroke frequency, which entirely agrees with the effect of atmospheric pressure found experirnentally. The inferences drawn from this theory show that (1) the energy economy in a big insect is very wasteful, that (2) the rate of energy output is not greatly varied, that (3) it is profitable for the insect to vary the aerodynamic work of the wings by altering the amplitude rather than the frequency of the stroke, that (4) the distribution of energy in flight is delicately balanced, and that (5) the frequency must be low and the amplitude large in insects of great size and weight, and that a very high frequency and a small amplitude can be afforded only by small insects. Many such observations as have been made in nature agree with these inferences. Furthermore, (6) attempts are made to calculate the muscle efficiency in some insects on the basis of the theory. In Appendix I, the technique used to check and eliminate some sources of error in the methods is described, in Appendix II, an application of tlie theory to derive a law between the wing-stroke frequency and the morphological properties of insects is attempted, and in Appendix III, some laws relating different morphological properties of the wings of insects are described.