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Ziel dieser Arbeit war es, einen genaueren Einblick in die Rolle von PaCLPXP für den Energiemetabolismus von P. anserina zu erhalten und mögliche Komponenten zu identifizieren, welche wichtig für die Langlebigkeit der PaClpP-Deletionsmutante sind. Folgende neue Erkenntnisse konnten hierbei gewonnen werden:
1. Die Substrat-Analyse durch eine Cycloheximid-Behandlung und anschließender Proteom-Analyse legte erfolgreich eine Reihe potentieller bisher nicht bekannter Substrate von PaCLPP offen. Interessanterweise waren unter den identifizierten Proteinen viele ribosomale Untereinheiten und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege des Energiemetabolismus zu finden. Am auffälligsten unter diesen Substraten war die extreme Anreicherung eines Retikulon-ähnlichen Proteins, das einen neuen Aspekt der möglichen molekularbiologischen Rolle von PaCLPP in P. anserina andeutet.
2. Durch die Zugabe von Butyrat zum Medium, konnte erfolgreich die Autophagie sowohl im P. anserina Wildtyp als auch in der PaClpP-Deletionsmutante reduziert werden. Diese Verminderung der Autophagie sorgt bei ΔPaClpP für eine Verkürzung der Lebensspanne. Dieser Effekt ist spezifisch für die PaClpP-Deletionsmutante, während die Auswirkung von Butyrat auf den Wildtyp nur marginal ist. Dieses Ergebnis untermauert frühere Analysen dieser Deletionsmutante, welche besagen, dass die Langlebigkeit von ΔPaClpP Autophagie abhängig ist (Knuppertz und Osiewacz, 2017).
3. Die Metabolom-Analyse von ΔPaClpP im Vergleich zum Wildtyp zeigt, dass das Fehlen der PaCLPP zu Veränderungen in der Menge der Metaboliten der Glykolyse und des Citratzyklus kommt. Außerdem sind die Mengen der meisten Aminosäuren und der Nukleotide betroffen. Diese Analyse beweist, dass das Fehlen dieser mitochondrialen Protease weitreichende Folgen für die ganze Zelle hat. Durch die signifikante Verringerung von ATP und die Anreicherung von AMP in jungen ΔPaClpP-Stämmen und durch den Umstand der gesteigerten Autophagie in dieser Mutante, fiel das Augenmerk auf die AMPK. Dieses veränderte AMP/ATP-Verhältnis ist ein Indiz für eine gesteigerte AMPK-Aktivität und könnte auch den Umstand der gesteigerten Autophagie in ΔPaClpP erklären.
4. Das Gen codierend für die katalytische α-Untereinheit der AMPK (PaSnf1) konnte erfolgreich in P. anserina deletiert werden. Das Fehlen von PaSNF1 führt zu einer reduzierten Wuchsrate, eine beeinträchtige weibliche Fertilität und eine verzögerte Sporenreifung. Es konnte gezeigt werden, dass die Autophagie infolge einer PaSnf1-Deletion nicht gänzlich unterdrückt wird, PaSNF1 allerdings für die Stress-induzierte Autophagie notwendig ist. Überraschenderweise führt die Abwesenheit von PaSNF1 zu einer verlängerten Lebensspanne im Vergleich zum Wildtyp. Die meisten Effekte infolge einer PaSnf1-Deletion konnten durch die Einbringung eines FLAG::PaSNF1-Konstrukts komplementiert werden.
5. Eine gleichzeitige PaSnf1 und PaClpP-Deletion führt zu eine unerwarteten, extremen Lebenspannenverlängerung, die die Verlängerung der Lebensspanne bei der PaClpP-Deletionsmutante noch übertrifft. Interessanterweise geht dieser Phänotyp nicht mit einer erhöhten Autophagie einher. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass das Fehlen von PaSNF1 sowohl in ΔPaSnf1 als auch in ΔPaSnf1/ΔPaClpP zu einer veränderten Mitochondrien-Morphologie im Alter führt. Die Abwesenheit von PaSNF1 verursacht, dass die Stämme auch im Alter (20d) noch überwiegend filamentöse Mitochondrien aufweisen. Zudem zeigen die drei analysierten Deletionsstämme (ΔPaSnf1, ΔPaClpP und ΔPaSnf1/ΔPaClpP) massive Einschränkungen wenn sie auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind.
6. Auffallend war, dass bei ΔPaSnf1, ΔPaClpP und bei ΔPaSnf1/ΔPaClpP die Stämme mit dem Paarungstyp „mat-“ langlebiger sind als die Stämme mit dem Paarungstyp „mat+“. Dieser Effekt ist bei der ΔPaSnf1/ΔPaClpP-Doppelmutante am stärksten ausgeprägt. Weitere Untersuchungen dazu ergaben, dass die Paarungstypen immer dann eine Rolle spielen, wenn die Stämme mitochondrialem Stress ausgesetzt, oder aber auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind. Verantwortlich für diese Unterschiede sind zwei rmp1-Allele, die mit den unterschiedlichen Paarungstyp-Loci gekoppelt sind und mit dem jeweiligen Paarungstyp-Locus vererbt werden (rmp1-1 mit „mat-“; rmp1-2 mit „mat+“).
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle der i-AAA Protease in P. anserina, besonders während des Alterns des Ascomyceten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen:
1. Unter Standardbedingungen ist der PaIap-Deletionsstamm langlebiger als der Wildstamm, ohne feststellbare physiologische Beeinträchtigungen aufzuweisen. Dass dies auf den Verlust von PaIap zurückzuführen ist, bestätigen die PaIap-Revertantenstämme, in denen das Gen wieder eingeführt wurde, wodurch deren Lebensspanne wieder Wildtyp-artig ist. Dies zeigt, dass PaIAP zelluläre Prozesse beeinflusst, die die Lebensspanne kontrollieren.
2. Bei Hitzestress weist der PaIap-Deletionsstamm dagegen eine höhere Hitzesensitivität auf als der Wildstamm, was sich in einer verkürzten Lebensspanne und der Störung vitaler Funktionen äußert. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von PaIAP bei der Hitzestressantwort hin.
3. Im Einklang mit dem hitzesensitiven Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms konnte in mitochondrialen Extrakten des Wildtyps gezeigt werden, dass die Proteinmenge von PaIAP durch Hitzestress signifikant zunimmt. Gleichzeitig weisen mitochondriale Proteinextrakte von PaIap-Deletionsstämmen nach Hitzestress signifikant geringere Mengen an PaHSP60 und PaCLPP auf, zwei weiteren Komponenten der mitochondrialen Proteinqualitätskontrolle. Dies unterstreicht die Beteiligung von PaIAP an der Hitzestressantwort von P. anserina.
4. Darüber hinaus beeinflusst der Verlust von PaIap die Zusammensetzung der mitochondrialen Atmungskette und führt bei 27°C zu einer vermehrten Organisation der Komplexe in stabilere Superkomplexe. Dieser Mechanismus wird beim Wildstamm erst nach Hitzestress beobachtet, wogegen der PaIap-Deletionsstamm die Superkomplexmenge nicht mehr weiter steigern kann.
5. Die Genexpression von proteolytisch inaktiven Varianten von PaIAP (PaIAPE540Q bzw. PaIAPE540QG) kann den Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms bei 27°C nicht komplementieren und führt ebenfalls zu einer Verlängerung der Lebensspanne von P. anserina. Dies liefert wichtige Informationen über den Mechanismus wie PaIAP die Lebensspanne von P. anserina beeinflusst, da dazu die proteolytische Aktivität von PaIAP benötigt wird.
6. Darüber hinaus zeigt die Analyse des PaIap/PaClpP-Deletionsstamms, dass sich die Mechanismen, wie PaIAP und PaCLPP die Lebensspanne von P. anserina beeinflussen, unterscheiden. Die unterschiedlichen zellulären Aufgaben werden auch bei Hitzestress deutlich, wovon der PaIap/PaClpP-Deletionsstamm noch stärker betroffen ist als durch die Deletion von PaIap bzw. PaClpP. Dies verdeutlicht, dass sich die Effekte der Deletionen der beiden Gene addieren.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die i-AAA Protease PaIAP auch bei P. anserina wichtige zelluläre Funktionen besitzt, die sich auf den Alterungsprozess des Ascomyceten auswirken. Dabei war es möglich verschiedene neue Mechanismen zu identifizieren, wie die i-AAA Protease diese Funktionen ausübt. Dazu gehören z.B. der Einfluss der proteolytischen Aktivität auf die Lebensspanne, die durch die Abwesenheit der i-AAA Protease ausgelöste Reorganisation der Atmungskettenkomplexe in stabile Superkomplexe, und die Induktion der Hitzestressantwort durch PaIAP. Diese Befunde tragen zum besseren Verständnis der zellulären Funktion der i-AAA Protease bei und stellen einen entscheidenden Ausgangspunkt für weiterführende Analysen der bislang wenig verstandenen Aufgaben der Protease dar.
In den letzten Jahren findet die Wirkung von Polyphenolen auf den Alterungsprozess oder zur Behandlung von Krankheiten immer mehr Beachtung. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Wirkmechanismen der Polyphenole Gossypol, Curcumin und Quercetin, um Hinweise für neue oder verbesserte Therapieansätze zu erhalten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen lieferten folgende Ergebnisse:
1. Der Ascomycet "P. anserina" eignet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Wirkmechanismen verschiedener Polyphenole, da die bereits aus der Literatur bekannten Effekte auf das Überleben höherer Organismen auch in "P. anserina" beobachtet wurden.
2. Die Mitochondrienfunktion spielt auf unterschiedliche Art eine Rolle in der Kompensation von Dysfunktionen oder Stressbedingungen in der Zelle und wirkt somit positiv auf die Regulation der Lebensspanne von "P. anserina". In der "PaSod3"-Deletionsmutante wurde eine Verschiebung der mitochondrialen Atmung von einer Komplex I-abhängigen hin zu einer vermehrt Komplex II-abhängigen Atmung festgestellt. Die damit verbundene Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials dient neben der bereits bekannten hohen Superoxid-Menge als Signal zur Mitophagie-Induktion. Auch die Anpassung der Mitochondrienfunktion durch die erhöhte Bildung von mtRSCs, wie im Falle von Gossypol oder Quercetin, kann zur Kompensation von Dysfunktionen beitragen bzw. sie abschwächen.
3. Es gibt keinen grundlegenden gemeinsamen Wirkmechanimus der drei untersuchten Polyphenole. Zwar spielt Wasserstoffperoxid bei verschiedenen Stoffen eine Rolle, aber nicht bei allen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Wasserstoffperoxid abhängig von der vorherrschenden Konzentration wirkt und daher auch keine Allgemeingültigkeit des Effektes vorherzusagen ist. In niedrigen Konzentrationen sorgt Wasserstoffperoxid z. B. für eine Induktion der Autophagie und damit einhergehende eine Lebensverlängerung. Im Gegensatz dazu wirken hohe Wasserstoffperoxid-Konzentrationen lebensverkürzend und lösen verschiedene Formen von Zelltod aus.
4. Die Curcumin-vermittelte Langlebigkeit wurde das erste Mal in Verbindung mit einer funktionellen Autophagie gebracht. Im Detail führt die Behandlung mit Curcumin durch eine PaSOD1-abhängige leichte Erhöhung der Wasserstoffperoxid-Menge zu einer Induktion von nicht-selektiver Autophagie. Die induzierte Autophagie ist Ursache der Lebensverlängerung durch Curcumin.
5. Gossypol wirkt in Abhängigkeit der mitochondrialen Permeabilitäts-Transitionspore bzw. von ihrem Regulator Cyclophilin D. Hierbei verstärkt die deutlich erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge wahrscheinlich die Induktion von programmiertem Zelltod. Gleichzeitig wird eine cytoprotektive Form von Autophagie und ein scheinbar ATG-unabhängiger Abbau von Mitochondrien induziert.
6. Quercetin wirkt in "P. anserina" abhängig vom Methylierungs-Status. Untersuchungen mit Mutanten der "O"-Methyltransferase PaMTH1 ergaben die Notwendigkeit der Anwesenheit von PaMTH1 für den lebensverlängernden Effekt von Quercetin. Analysen mit dem methylierten Derivat Isorhamnetin verdeutlichten diese Abhängigkeit und zeigten zudem, dass Quercetin sowohl in der methylierten als auch unmethylierten Form Effekte hervorruft. Jedoch sind nur die Effekte des unmethylierten Quercetin unabhängig von der Lebensverlängerung und eher schädlich für die Zelle.
Es wird davon ausgegangen, dass das ehemalige Larven-Mikrohabitat der Asiatische Tigermücke Aedes albopictus (synonym: Stegomyia albopicta) die Phytotelmata in den Waldgebieten von Südostasien darstellte. In den letzten vier Jahrzehnten adaptierte sich die Art jedoch an urbanere Regionen und ihre Antrotelmata. Dank ihrer Eigenschaft, Eier mit einer gewissen Trocken- und Kältetoleranz zu produzieren, verbreitete sich die Art zusammen mit den international gehandelten Waren weltweit. Zudem ist Ae. albopictus ein theoretischer Vektor für mindestens 27 Viren sowie Parasiten und spielt eine Hauptrolle bei der Übertragung von Dengue-Viren und Chikungunya-Viren und Zika-Vieren. Daher wird die Art als große Gefahr für die öffentliche Gesundheit betrachtet.
Die vorliegende Arbeit thematisiert drei Untersuchungen zum Anpassungs- und Etablierungs-potential der invasiven Asiatischen Tigermücke.
In einem ersten Ansatz wurde das Problem behandelt, dass es lediglich zwei standardisierte toxikologische Testverfahren für Culicidae gab. Daher wurde ein Dosis-Wirkungs-Testsystem entwickelt, das den Weg für weitere biologische Endpunkte und ihre integrativen Parameter freimachte und dadurch ein besseres Verständnis für die Wirkweisen von Insektiziden ermöglicht. Hierdurch konnte nun der Frage nachgegangen werden, ob es Unterschiede in der ökotoxikologischen Reaktion zwischen der invasiven tropisch-subtropischen Asiatischen Tigermücke und der einheimischen nördlichen Hausstechmücke Culex pipiens auf das Insektizid λ-Cyhalothrin gibt. Weiter wurde der Einfluss von Temperatur und die Verfügbarkeit von Nahrung auf die Insektizidsensitivitäten der Arten getestet. Schließlich konnte in einer Risikobewertung festgestellt werden, dass bei falsch angewendeten Bekämpfungsmaßnahmen höhere Temperaturen sowie der Ausfall von aquatischen Top-Prädatoren zu Fitnessvorteilen für die Art führen können.
In einer zweiten Untersuchung wurde der Mechanismus der Kältetoleranz der Eier (Kälteakklimatisierung und Diapause) näher untersucht, da dieser für die erfolgreiche Invasion in gemäßigten Breitengraden verantwortlich gemacht wird. Nachdem eine lang vorherrschende Hypothese verworfen wurde, dass die Einlagerung von Polyolen die Frosttoleranz bewirken würde, war der aktuelle Stand der Wissenschaft, dass eine Verdickung der Wachsschicht des Chorions dafür verantwortlich sei. Jedoch lag keine detaillierte Evaluierung von Stechmücken-Eihüllen vor. Mittels einer transmissionselektronenmikroskopischen Studie konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Wachsschicht nicht in der Serosa-Cuticula zu verorten ist, sondern im Endochorion und sie zudem im Zuge der Diapause in der Mächtigkeit schrumpft. Daher wird auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse auf eine Kompaktierung der Schicht geschlossen.
Die dritte Untersuchung schließlich hatte das hohe Adaptationspotential in gemäßigten Breiten zum Gegenstand. Eine Adaptation auf genetischen Level gilt als unwahrscheinlich, da Gründerpopulationen in den neu besiedelten Gebieten eine niedrige genetische Diversität aufwiesen und ein regelmäßiger Neueintrag von Allelen unwahrscheinlich ist. Jedoch bietet das Konzept der epigenetischen Temperatur-Adaptation einen Erklärungsansatz für dieses Phänomen. Daher wurde die Frage gestellt, ob es möglich ist, eine vererbbare Diversifizierung dieses kältetoleranten Phänotyps nach einer randomisierten epigenetischen Behandlung der DNA zu detektieren. Es wurde eine transgenerationale Untersuchung der Effekte von zwei epigenetischen Agenzien (und einem Lösemittel) auf die Kältetoleranz der Eier durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten ein Korrelationsmuster, das den durch die Agenzien veränderten Methylierungsgrad der DNA mit der Forsttoleranz verband, was die gestellte Hypothese unterstützte.
In Folge dieser drei Untersuchungen wurde festgestellt, dass Ae. albopictus ein hohes Potential hat, in weiteren Ländern – vor allem in gemäßigten Breiten – ein Gesundheitsrisiko darzustellen. Da die Art einerseits Fitnessvorteile durch falsche Bekämpfungsmaßnahmen und andererseits möglicherweise eine hohes epigenetisches Adaptationspotential besitzt, kann zusammenfassend empfohlen werden, dass der Fokus für weitere Forschung maßgeblich auf der Entwicklung von Impfstoffen für die übertragenen Viren und Pathogene liegen sollte. Dadurch kann die Bevölkerung geschützt werden, ohne Ökosysteme und ihre Dienstleistungen zu gefährden, und dies wäre zudem ökonomisch gesehen die effektivere Lösung.
Unter den weltweit in ständigem Gebrauch befindlichen Chemikalien befinden sich nicht nur Verbindungen mit akuter toxischer Wirkung, sondern auch solche mit Wirkung auf das endokrine System. Eine große Rolle spielt hier vor allem die Störung der Geschlechtsdifferenzierung und der Reproduktion, ausgelöst durch natürliche oder synthetische Chemikalien mit endokrinem Potential, sogenannte endokrine Disruptoren (ED). Diese Chemikalien können über unterschiedliche Eintragspfade in die Umwelt gelangen. Seit Mitte des 20. Jahrhunderts werden mehr und mehr Fälle bekannt, in denen anthropogene Chemikalien die Pflanzen- und Tierwelt belasten, darunter zahlreiche Befunde zu Störungen des Hormonsystems von Mensch und Tier.
Im Rahmen der Gefahren- und Risikobewertung steht bereits eine Vielzahl harmonisierter Prüfrichtlinien für die Identifizierung und Evaluierung der Effekte von (potentiellen) ED zur Verfügung. Um die Gesamtheit aller potentiellen Interaktionen von ED mit dem Hormonsystem detektieren zu können, ist die In-vivo-Untersuchung an Vertebraten in der Chemikalienregistrierung bisher unabdingbar. Bei der Untersuchung endokriner Potentiale in höheren Vertebraten spielen vor allem nager- und vogelbasierte Testsysteme eine wichtige Rolle. Diese bergen jedoch einen hohen zeitlichen, personellen und finanziellen Aufwand und erfordern eine massive Zahl an Versuchstieren, die für diese Tests benötigt werden. Darüber hinaus beinhalten Tierversuche eine Vielzahl von Problemen einschließlich ethischer Bedenken, die sich als Konsequenz der Tierhaltung unter Versuchsbedingungen ergeben. Ein sehr interessanter und vielversprechender Ansatz zur Reduktion von Tierversuchen ist die Entwicklung eines standardisierten Verfahrens für die Untersuchung potentieller ED in Vogelembryonen. Auf Vogelembryonen basierende In-ovo-Modelle stellen einen Mittelweg zwischen In-vitro- und In-vivo-Testsystemen dar. Mit dem Vogeleitest wird der sich entwickelnde Embryo, das für ED sensitivste Entwicklungsstadium im Leben eines Organismus, berücksichtigt.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Eignungsuntersuchung eines auf dem Embryo des Haushuhns (Gallus gallus domesticus) basierenden Testsystems für den Nachweis von ED. Das resultierende Testsystem soll als Alternativmethode zu bisher etablierten nager- und vogelbasierten Testsystemen für die Untersuchung der Effekte hormonell aktiver Substanzen auf die Geschlechtsdifferenzierung in höheren Wirbeltieren eingesetzt werden.
Die im Rahmen der vorliegenden Dissertation durchgeführten Arbeiten umfassten sowohl die Charakterisierung der Normalentwicklung des Hühnerembryos, unbeeinflusst durch ED, als auch die morphologisch-histologischen Veränderungen der Gonaden von substanzexponierten Embryonen. Für die Untersuchung substanzbedingter Effekte, welche den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit darstellen, wurden die Embryonen gegenüber verschiedenen (anti)estrogenen und (anti)androgenen Substanzen exponiert. Unter Einfluss der Estrogene Bisphenol A (BPA) und 17α-Ethinylestradiol (EE2) entwickelten sich die Keimdrüsen der Männchen zu Ovotestes, während Weibchen ein Ovar mit deutlich schmalerem Cortex ausbildeten. Unter Einfluss der Antiestrogene Fulvestrant und Tamoxifen blieben Effekte auf die Gonaden männlicher Embryonen aus, eine durch das potente Estrogen EE2 hervorgerufene Feminisierung männlicher Gonaden konnte durch beide Substanzen jedoch effektiv antagonisiert werden. Weibchen bilden unter Einfluss von Tamoxifen deutlich schmalere linke Gonaden mit einem missgebildeten Cortex aus. Unter Einfluss der Androgene Tributylzinn (TBT) und 17α-Methyltestosteron (MT) blieben die Effekte auf männliche Embryonen aus, während die Weibchen anatomisch virilisierte Gonaden und eine Reduktion des linken gonadalen Cortex aufwiesen. Allein die untersuchten antiandrogenen Versuchssubstanzen Cyproteronacetat (CPA), Flutamid und p,p´-Dichlorodiphenyldichloroethen (p,p´-DDE) hatten keinen Effekt auf die gonadale Geschlechtsdifferenzierung männlicher und weiblicher Hühnerembryonen.
Es konnte gezeigt werden, dass der Embryo von G. gallus domesticus einen sensitiven Organismus innerhalb des Tierreichs darstellt und hinreichend sensitiv auf eine Reihe von endokrin wirksamen und reproduktionstoxischen Chemikalien reagiert. Anatomische und histologische Änderungen der Gonaden können daher als Biomarker für die Wirkung von ED bei Vögeln nützlich sein. Die untersuchten Endpunkte beziehen sich jedoch auf apikale Effekte und liefern keine mechanistischen Informationen zu den untersuchten Substanzen. Der
Hühnereitest ist eine sinnvolle Ergänzung zur bestehenden OECD-Testbatterie und zeichnet sich besonders durch seine kostengünstige und einfache Handhabung im Labor sowie einfach durchzuführende Tests aus. Durch die vergleichsweise kurze Versuchsdauer von nur 19 Tagen ist ein schnelles Substanzscreening möglich, welches zeitlich deutliche Vorteile gegenüber den etablierten nager- und vogelbasierten Testsystemen hat. Als Alternative zu bisherigen Assays könnte der vorgeschlagene Hühnereitest dazu beitragen, im Rahmen der (öko)toxikologischen Gefährdungs- und Risikobewertung von Chemikalien künftig weniger Versuchstiere zu verwenden.
Cercosporoid fungi (Mycosphaerellaceae, Mycosphaerellales, Ascomycota) are one of the largest and most diverse groups of hyphomycetes causing a wide range of diseases of economically important plants as well as of plants in the wild. Although more than 6000 species are known for this group, the documentation of this fungal group is far from complete. Especially in the tropics, the diversity of cercosporoid fungi is poorly known. The present study aims to identify and characterise cercosporoid fungi collected on host plants belonging to Fabaceae in Benin, West Africa. Information on their morphology, host species and DNA sequence data (18S rDNA, 28S rDNA, ITS and tef1) is provided. DNA sequence data were obtained by a simple and non-culture-based method for DNA isolation which has been applied for cercosporoid fungi for the first time in the context of the present study. Among the loci used for the phylogenetic analysis, tef1 provided the best resolution together with the multigene dataset. Species delimitation in many cases, however, was only possible by combining molecular sequence data with morphological characteristics. Based on forty specimens recently collected in Benin, 18 species are presented with morphological descriptions, illustrations and sequence data. Among these, six species in the genus Cercospora and two species in Pseudocercospora are proposed as species new to science. The newly described species are Cercospora (C.) beninensis on Crotalaria macrocalyx, C. parakouensis on Desmodium tortuosum, C. rhynchophora on Vigna unguiculata, C. vignae-subterraneae on Vigna subterranea, C. tentaculifera on Vigna unguiculata, C. zorniicola on Zornia glochidiata, Pseudocercospora sennicola on Senna occidentalis and Pseudocercospora tabei on Vigna unguiculata. Eight species of cercosporoid fungi are reported for Benin for the first time, three of them, namely C. cf. canscorina, C. cf. fagopyri and C. phaseoli-lunati are new for West Africa. The presence of two species of cercosporoid fungi on Fabaceae previously reported from Benin, namely Nothopassalora personata and Passalora arachidicola, is confirmed.
Background: Through the rapid development in DNA sequencing methods and tools, microbiome studies on a various number of species were performed during the last decade. This advance makes it possible to analyze hundreds of samples from different species at the same time in order to obtain a general overview of the microbiota. However, there is still uncertainty on the variability of the microbiota of different animal orders and on whether certain bacteria within a species are subject to greater fluctuations than others. This is largely due to the fact that the analysis in most extensive comparative studies is based on only a few samples per species or per study site. In our study, we aim to close this knowledge gap by analyzing multiple individual samples per species including two carnivore suborders Canoidea and Feloidea as well as the orders of herbivore Perissodactyla and Artiodactyla held in different zoos. To assess microbial diversity, 621 fecal samples from 31 species were characterized by sequencing the V3–V4 region of the 16S rRNA gene using Illumina MiSeq.
Results: We found significant differences in the consistency of microbiota composition and in fecal microbial diversity between carnivore and herbivore species. Whereas the microbiota of Carnivora is highly variable and inconsistent within and between species, Perissodactyla and Ruminantia show fewer differences across species boundaries. Furthermore, low-abundance bacterial families show higher fluctuations in the fecal microbiota than high-abundance ones.
Conclusions: Our data suggest that microbial diversity is significantly higher in herbivores than in carnivores, whereas the microbiota in carnivores, unlike in herbivores, varies widely even within species. This high variability has methodological implications and underlines the need to analyze a minimum amount of about 10 samples per species. In our study, we found considerable differences in the occurrence of different bacterial families when looking at just three and six samples. However, from a sample number of 10 onwards, these within-species fluctuations balanced out in most cases and led to constant and more reliable results.
The compound class of the fabclavines was described as secondary or specialized metabolites (SM) for Xenorhabdus budapestensis and X. szentirmaii. Their corresponding structure was elucidated by NMR and further derivatives could be identified in both strains. Biochemically, fabclavines are hybrid SMs derived from two non-ribosomal-peptide-synthetases (NRPS), one type I polyketide-synthase (PKS) and polyunsaturated fatty acid (PUFA) synthases. In detail, a hexapeptide is connected via partially reduced polyketide units to an unsual polyamine. Structurally, they are related to the (pre-)zeamines, described for Serratia plymuthica and Dickeya zeae. Fabclavines exhibit a broad-spectrum bioactivity against a variety of different organisms like Grampositive and Gram-negative bacteria, fungi, protozoa but also against eukaryotic celllines.
In this work, the fabclavine biosynthesis was elucidated and assigned to two independently working assembly lines. The NRPS-PKS-pathway is initiated by the first NRPS FclI via generation of a tetrapeptide, which is elongated by the second NRPS FclJ, leading to a hexapeptide. Alternatively, FclJ can also act as direct start of the biosynthesis, resulting in the final formation of shortened fabclavine derivatives with a diinstead of a hexapeptide. In both cases, the peptide moiety is transferred to the iterative type I PKS FclK, leading to an elongation with partially reduced polyketide units. The resulting NRPS-PKS-intermediate is still enzyme-bound. The PUFA-homologues FclC, FclD and FclE in combination with FclF, FclG and FclH belong to the polyamine-forming pathway. Briefly, repeating decarboxylative Claisen thioester condensation reactions of acyl-coenzym A building blocks lead to the generation of an acyl chain in a PKS- or fatty acid biosynthesis-like manner. The corresponding β-keto-groups are either completely reduced or transaminated in a specific and repetitive way, resulting in the concatenation of so-called amine-units. The final β-keto-group is reduced to a hydroxy-group and the intermediate is reductively released by the thioester reductase FclG. A subsequent transamination step leads to the final polyamine. The NRPS-PKS- as well as the polyamine-pathway are connected by FclL. This condensation domain-like protein catalyzes the condensation of the polyamine with the NRPS-PKS-part, which results in the release of the final fabclavine. The results are described in detail in the first publication (first author).
Fabclavine biosynthesis gene cluster (BGC) are widely spread among the genus Xenorhabdus and Photorhabdus. In Xenorhabdus strains a high degree of conservation regarding the BGC synteny as well as the identity of single proteins can be observed. However, Photorhabdus strains harbor only the PUFA-homologues. While in Photorhabdus no product could be detected, our analysis revealed that the Xenorhabdus strains produce a large chemical diversity of different derivatives. Briefly, the general backbone of the fabclavines is conserved and only four chemical moieties are variable: The second and last amino acids of the NRPS-part, the number of incorporated polyketide units as well as the number of amine units in the polyamine. In combination with the elucidated biosynthesis, these variables could be assigned to single biosynthesis components as diversity mechanisms. Together with the 10 already described derivatives, a total of 32 derivatives could be detected. Interestingly, except for taxonomic closely related strains, all analyzed strains produce their own set of derivatives. Finally, we could confirm that the fabclavines are the major bioactive compound class in the analyzed strains under laboratory conditions. The results are described in detail in the second publication (first author).
Together with our collaboration partner Prof. Selcuk Hazir a potent bioactivity against Enterococcus faecalis, which is associated with endodontic infections, could be contributed to X. cabanillasii. Here, we could confirm that this bioactivity can be assigned to the fabclavines. The results are described in detail in the third publication(co-author).
Among the genus Xenorhabdus, X. bovienii represents an exception as its NRPS and PKS genes of the fabclavine BGC are missing or truncated, resulting in the exclusive production of polyamines. Furthermore, its PUFA-homologue FclC harbors an additional dehydratase (DH) domain. Upon extensive analysis a yet unknown deoxy-polyamine was identified and assigned to this additional domain. Finally, the DH domain was transferred into other polyamine pathways. Regardless of an in cis or in trans integration, the chimeric pathways produced deoxy-derivatives of its naturally occurring polyamines, suggesting that this represents another diversification mechanism. The results are described in detail in the attached manuscript (first author).
My PhD work employed genetic and pharmacological manipulations, coupled with highresolution live imaging, to understand intercellular communications during zebrafish cardiovascular development. The heart is the first organ to form, and it is composed of several tissues, among which interactions are crucial. I identified two important interactions between muscular and non-muscular tissues in poorly characterized contexts, and the molecules required for the signalling. First, I discovered an important cellular and molecular crosstalk orchestrating the development of the cardiac outflow tract (i.e., the aortic root in mammals).
Endothelial-derived TGF-beta signalling controls the generation of the local extracellular matrix (ECM). The ECM in turn affects endothelial proliferation as well as smooth muscle cell organization (Boezio et al, 2020; Bensimon-Brito*, Boezio* et al, 2020). In my second project, I investigated the crosstalk between the epicardial layer and the myocardial wall. By generating epicardial-impairment models, I identified a novel role for the epicardium in regulating cardiomyocyte volume during heart development (Boezio et al, 2021). Ultimately, this research contributed to our understanding of how paracrine signalling controls the multicellular interactions integral to organogenesis.
The heart is the first functional organ that develops in the embryo. To become a functional organ, it undergoes several morphogenetic processes. These morphogenetic events involve different cell types, that interact with each other and respond to the surrounding extracellular matrix, as well as intrinsic and extrinsic mechanical forces, assuming different behaviors. Additionally, transcription factor networks, conserved among vertebrates, control the development.
To have a better understanding of cell behavior during development, it is necessary to find a model system that allows the investigation in vivo and at single-cell resolution. Thanks to the common evolutionary origin of the different cardiac structures, together with the conserved molecular pathways, the two-chambered zebrafish heart offers many advantages to study cell behavior during cardiac morphogenesis. Here, using the zebrafish heart as a model system, I uncovered the cell behavior behind two of the main cardiac morphogenetic events: cardiac wall maturation and cardiac valve formation.
In the first part of this study, I investigated how the cardiac wall is maintained at the molecular level. Using genetic, transcriptomic, and chimeric analyses in zebrafish, we find that Snai1b is required for myocardial wall integrity. Global loss of snai1b leads to the extrusion of CMs away from the cardiac lumen, a process we show is dependent on cardiac contractility. Examining CM junctions in snai1b mutants, we observed that N-cadherin localization was compromised, thereby likely weakening cell-cell adhesion. In addition, extruding CMs exhibit increased actomyosin contractility basally, as revealed by the specific enrichment of canonical markers of actomyosin tension - phosphorylated myosin light chain (active myosin) and the α-catenin epitope α-18. By comparing the transcriptome of wild-type and snai1b mutant hearts at the early stages of CM extrusion, we found the dysregulation of intermediate filament genes in mutants including the upregulation of desmin b. We tested the role of desmin b in myocardial wall integrity and found that CM-specific desmin b overexpression led to CM extrusion, recapitulating the snai1b mutant phenotype. Altogether, these results indicate that Snai1 is a critical regulator of intermediate filament gene expression in CMs and that it maintains the integrity of the myocardial epithelium during embryogenesis, at least in part by repressing desmin b expression.
In the second part of this study, I focused on the behavior of valve cells during cardiac development. Using the zebrafish atrioventricular valve, I focus on the valve interstitial cells which confer biomechanical strength to the cardiac valve leaflets. We find that initially AV endocardial cells migrate collectively into the cardiac jelly to form a bilayered structure; subsequently, the cells that led this migration invade the extracellular matrix (ECM) between the two EC monolayers, undergo an endothelial-to-mesenchymal transition as marked by loss of intercellular adhesion, and differentiate into VICs. These cells proliferate and are joined by a few neural crest-derived cells. VIC expansion and a switch from a pro-migratory to an elastic ECM drive valve leaflet elongation. Functional analysis of Nfatc1 reveals its requirement during VIC development. Zebrafish nfatc1 mutants form significantly fewer VICs due to reduced proliferation and impaired recruitment of endocardial and neural crest cells during the early stages of VIC development. Analysis of downstream effectors reveals that Nfatc1 promotes the expression of twist1b, a well-known regulator of epithelial-to-mesenchymal transition. This study shows for the first time that Nfatc1 regulates zebrafish VICs formation regulating valve EMT in part by regulating twist1b expression. Moreover, it proposes the zebrafish valve as an excellent model to study the cellular and molecular process that regulate VIC development and dysfunction.
In conclusion, my work: 1) identified an unsuspected role of Snai1 in maintaining the integrity of the myocardial epithelium, opening new avenues in its role in regulating cellular contractility; 2) uncovered the function of Nfatc1 in the establishment of the VIC, establishing a new model to study valve development and function.