Pharmazie
Refine
Year of publication
- 2008 (24) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (23)
- Article (1)
Has Fulltext
- yes (24)
Is part of the Bibliography
- no (24)
Keywords
- Weihrauch (2)
- AKBA (1)
- Angiogenese (1)
- Antibiotikum (1)
- Bioavailability (1)
- Bioverfügbarkeit (1)
- Boswelliasäuren (1)
- Brain bioavailability (1)
- Calcium (1)
- Celecoxib (1)
Institute
IL-22 ist ein TH17-Signaturzytokin und wird primär von aktivierten T- und NK-Zellen produziert. Die Literatur beschreibt IL-22 als immunregulatorisches Signalmolekül, welches vor allem bei Infektionen und Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle spielt. Typische IL-22-induzierte Gene sind beispielsweise Akut-Phase-Proteine, β-Defensine sowie Matrixmetalloproteasen. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass IL-22 die IFNγ-induzierte iNOS-Expression in humanen DLD-1 Kolonkarzinomzellen massiv verstärkt. Eine gestörte iNOS-Induktion mit folglich extensiver NO-Produktion trägt zu entzündlichen Veränderungen und zur Tumorentstehung bei. Insbesondere gibt es stichhaltige Belege, welche iNOS und NO in Verbindung mit Krebs als potentes Mutagen, als Angiogenesefaktor, als Verstärker der Protoonkogenexpression und als Inhibitor der Apoptose charakterisieren. Demzufolge ist gerade die Identifikation von Signaltransduk-tionswegen von Interesse, welche das Potential zur Regulation der iNOS-Expression in epithelialen Kolonkarzinomzellen besitzen. Der Nachweis des IL-22-Rezeptorkomplexes sowie einer STAT3-Phosphorylierung belegte die IL-22-Responsivität der hier verwen-deten DLD-1 Kolonkarzinomzellen. Der Transkriptionsfaktor STAT3 gilt als prominentes Signalmolekül in der Signaltransduktionskette von IL-22. In der aktuellen Literatur wird STAT3 aufgrund seiner antiapoptotischen und proliferativen Eigenschaften als Onkogen definiert. Sowohl in Patienten mit Morbus Crohn als auch im humanen Kolorektalkarzinom ist eine Überexpression von STAT3 und iNOS beschrieben. Unter Verwendung einer STAT3-spezifischen siRNA konnte der Nachweis erbracht werden, dass STAT3 ein essen-tieller Faktor in der IL-22-vermittelten Induktion der iNOS-Expression ist. Luciferase-Reporterstudien zeigten, dass IL-22 die humane iNOS-Promotoraktivität in DLD-1 Zellen, welche die Photinus pyralis (Firefly)-Luciferase unter Kontrolle eines 16kb-iNOS-Promotor-konstrukts überexprimieren (DLD-1/pXP2-16kb), erhöht. Somit kann eine Regulation der Transkription durch IL-22 angenommen werden. Dennoch vermag diese Arbeit die Frage nach den transkriptionellen Regulationsmechanismen der IL-22-vermittelten iNOS-Expres-sion in DLD-1 Zellen nicht abschließend zu beantworten. Eine Beteiligung ausgewählter Parameter der Zellaktivierung wie beispielsweise NFκB, STAT1α oder IRF-1 an der IL-22-vermittelten iNOS-Induktion konnte durch die vorliegende Arbeit ausgeschlossen werden. Neben transkriptionellen Regulationsmechanismen übernimmt auch die Regulation der iNOS mRNA-Stabilität eine wichtige Funktion bei der Induktion der iNOS-Expression. Allerdings zeigten auch hier die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass IL-22 die iNOS-mRNA nicht stabilisieren kann. Dies bekräftigt wiederum die Annahme, dass IL-22 auf transkriptioneller Ebene den iNOS-Promotor reguliert. Weitere Versuche zeigten auch, dass IL-22 spezifisch an der iNOS-Expression in Kolonkarzinomzellen beteiligt ist und keinen generellen Verstärker der IFNγ-induzierten Genexpression darstellt. Beachtet man hierbei die bedeutende Rolle von STAT3 und iNOS bei Entzündung und Karzinogenese, so repräsentiert IL-22 möglicherweise eine neue Zielstruktur für immuntherapeutische Interventionen im Rahmen dieser Erkrankungen. Der zweite Abschnitt der vorgelegten Arbeit beschäftigte sich mit der Regulation der IL-22-Sekretion im Kontext von Sepsis und systemischer Entzündung. Es stellte sich die Frage, inwiefern IL-22 in diesem komplexen klinischen Syndrom der Sepsis nachzuweisen ist. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass sowohl eine generelle T-Zellaktivierung sowie verschiedene Stimuli der angeborenen Immunität, hier im Besonderen ein hitze-inaktiviertes Lysat von Staphylococcus epidermidis, eine vermehrte IL-22-Produktion anre-gen. Eine wichtige Frage ist hier die pharmakologische Beeinflussung der IL-22-Sekretion. Da bei der Therapie einer Sepsis die Behandlung mit niedrig dosierten Glukokortikoiden Erfolg versprechend ist, wurde im Folgenden der Einfluss des klassischen antientzünd-lichen Pharmakons Dexamethason auf die IL-22-Sekretion in PBMC untersucht. Es konnte eindrucksvoll gezeigt werden, dass Dexamethason sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene einen sehr potenten Inhibitor der S. epidermidis-induzierten IL-22-Sekretion darstellt. Um die in vitro-Daten der IL-22-Sekretion nach Immunaktivierung humaner PBMC durch in vivo-Experimente zu ergänzen, wurde ein kürzlich etabliertes Nagermodell der schweren Sepsis mit akutem Verlauf verwendet (CLI; caecum ligation and incision). In diesem Modell ist IL-22 im Vergleich zu unbehandelten Tieren signifikant erhöht. In Über-einstimmung mit den in vitro-Experimenten in humanen PBMC hat die Applikation von Dexamethason im CLI-Modell die Hemmung der IL-22-Produktion zur Folge. Zur Abrun-dung dieser Ergebnisse wurde das Serum von Patienten mit einer Peritonitis-bedingten Sepsis untersucht und es konnte erstmals eindrucksvoll gezeigt werden, dass IL-22 in dieser Patientengruppe signifikant erhöht ist. Zum aktuellen Zeitpunkt ist die Rolle von IL-22 in der Sepsis noch nahezu unbekannt. Daher ist zu klären, wie die eingehend beschriebene IL-22-vermittelte Aktivierung der epithelialen Immunabwehr, die systemische Immunsuppression über die Induktion von IL-10 sowie das proinflammatorische und destruktive Potential von IL-22 in Einklang zu bringen sind.
Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse ermöglichten die Identifizierung neuer Inhibitoren der bakteriellen Transkriptions-/Translationsreaktion durch den Einsatz eines eigenständig etablierten nicht-kommerziellen zellfreien prokaryotischen GFP-Expressionsassays (ZFTT-Assay) als Screening Werkzeug. Der Nachweis der selektiven Inhibition der ZFTT-Reaktion durch antimikrobielle Translationsinhibitoren im Vergleich zu Antibiotika anderer Wirkmechanismen gelang im Rahmen einer proteomanalytischen Studie. Die parallele Anwendung des etablierten ZFTT-Assays und standardisierter Ganzzellassays ermöglichte die Charakterisierung der Aktivitätsprofile neun antimikrobieller Substanzen aus vier repräsentativen Translationsinhibitorklassen unter zellfreien und Ganzzellbedingungen in Abhängigkeit ihrer physikochemischen Substanzeigenschaften (Weidlich et al., 2008). Der Aufbau mehrerer interdisziplinärer Forschungkooperationen mit unterschiedlichen wissenschaftlichen Arbeitsgruppen wurde genutzt, um eine Substanzbibliothek chemisch heterogener Verbindungen als Quelle potentieller antimikrobieller Inhibitoren der bakteriellen Transkriptions-/Translationsreaktion zu generieren. Sowohl die Anwendung virtueller Screeningansätze und der Einsatz synthetischer Tripeptide ermöglichte die Identifizierung aktiver Substanzen. Im Rahmen einer globalen Identifizierungs- und Charakterisierungsphase wurde neben der zellfreien Aktivität auch die Wirksamkeit gegenüber bakteriellen Zellen, sowie die Toxizität gegenüber humanen Zellen untersucht. Der Einsatz der proteomanalytischen DIGE-Technologie ermöglichte schließlich die Charakterisierung der antimikrobiellen Wirkmechanismen ausgewählter Substanzen.
Cytochrome P450 epoxygenases of the 2C family (CYP2C) are highly expressed in the endothelium and metabolize arachidonic acid to different regioisomers of epoxyeicosatrienoic acids (EET). They have a number of roles in the regulation of vascular tone and homeostasis by activating different signal transduction pathways and have recently been reported to be involved in proliferation and angiogenesis. However, the exact mechanisms by which epoxygenases regulate angiogenesis are still unclear. Therefore, the initial aim of the present study was to characterize the relevance of major signalling molecules that are involved in angiogenesis and to investigate possible signalling pathways involved. Initially the effect of CYP2C9 overexpression on expression levels of EphB4, a tyrosine kinase that plays a role in a number of developmental processes, was investigated. EphB4 protein expression was increased in CYP2C9 overexpressing cells without any effects on expression levels of its ligand ephrinB2. To clarify whether EphB4 is a critical determinant of CYP2C9-induced angiogenesis, endothelial cell sprouting was assessed using a collagen gel-based in vitro angiogenesis assay. Following transfection with EphB4 antisense or scrambled oligonucleotides, capillary-like structures were clearly present after 24 hours in cells overexpressing CYP2C9, while EphB4 downregulation abolished CYP2C9-induced sprouting. In addition stimulation of human umbilical vein endothelial cells with VEGF resulted in an increase in CYP2C expression and a subsequent increase of 11,12-EET production; an effect that was abolished by the CYP epoxygenases inhibitor MSPPOH as well as when cells were infected with a dominant negative mutant of AMPK. In vivo 11,12-EET treatment increased EphB4 expression in mesenteric arteries as well as in Matrigel plugs; an effect that was abolished when plugs were impregnated at the same time with small interfering RNA (siRNA) for EphB4. Furthermore, impregnation of Matrigel plugs with VEGF resulted in endothelial cell and smooth muscle cell recruitment into a Matrigel plug and this effect was mediated by CYP2C9-derived EETs as it was prevented by 14,15-EEZE. When infiltration of EET impregnated plugs with endothelial cells and pericytes/smooth muscle cells in vivo was compared to the effects seen in VEGF treated plugs, it was apparent that only EET treatment resulted in the formation of tube like structures that were covered by smooth muscle cells. Therefore, the final aim of the study was to further define the consequences of EET signalling in vivo as well as to characterize its physiological relevance. This hypothesis could be assessed by isolectin injection through the tail-vein where isolectin was taken up only by the EET-impregnated plug. Moreover ultrasound measurements revealed accumulation of contrast agent in EET impregnated plugs compared to control plugs. Taken together our findings emphasize that CYP2C plays a crucial role in the vessel formation process by modulating the effects mediated by two important control elements of the angiogenic response, namely VEGF and EphB4. CYP2C-derived EETs not only participate as second messengers in the angiogenic response, but have the potential to influence much more than angiogenesis by enhancing smooth muscle cell/pericyte recruitment to endothelial cell tubes to promote vascular maturation.
Acetaldehydaddukte an Hämoglobin werden als potentieller biochemischer Marker für Alkoholmissbrauch betrachtet, konnten aber bisher in vivo noch nicht eindeutig nachgewiesen werden. Es wurden Methoden entwickelt, um Acetaldehydmodifiziertes Hämoglobin sowohl nach Inkubation in vitro als auch in humanen Blutproben nachzuweisen. Verwendung fanden sowohl chromatographische als auch elektrophoretische Trennmethoden in Kombination mit unterschiedlichen Massenspektrometern zur Detektion. Es wurden unterschiedliche Patienten- und Probandenkollektive betrachtet. Aus Blutproben von Patienten aus Alkoholentzugskliniken, von Probanden eines kontrollierten Trinkversuches und Blutproben von Personen mit moderatem Alkoholkonsumverhalten wurde versucht, modifiziertes Hämoglobin mit Alkoholkonsum zu korrelieren. Desweiteren wurden Blutproben von Kindern untersucht, bei denen keine Alkoholexposition zu erwarten war, um eventuell vorhandenes endogenes modifiziertes Hämoglobin nachzuweisen. Zusätzlich zu den Untersuchungen in vitro und in vivo wurden auch post-mortale Proben analysiert, um modifiziertes Hämoglobin mit einem prämortalem Alkoholkonsum zu korrelieren und auf mögliche andere Einflüsse, insbesondere hinsichtlich post-mortaler Parameter zu untersuchen. Modifizierte Globinketten waren nach Synthese aus Hämoglobin und Acetaldehyd zugänglich und konnten in vitro nachgewiesen werden. Hierbei zeigte sich, dass Acetaldehyd auch mehrfach kovalent an beide Hämoglobinketten binden kann. Weder mehr- noch einfach modifizierte Hämoglobinketten konnten allerdings in authentischen humanen Blutproben nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit konnte jedoch nach proteolytischem Verdau so weit gesteigert werden, dass Acetaldehydmodifizierte Hämoglobinpeptide nicht nur nach Inkubation von Hämoglobin mit Acetaldehyd, sondern auch in authentischen Blutproben sämtlicher untersuchter Kollektive nachweisbar waren. Es wurde gezeigt, dass ein intermolekularer Austausch von Acetaldehyd nach proteolytischem Verdau zur Bildung eines Peptidadduktes am neu entstandenen N-Terminus des jeweiligen Peptides führen kann. Ein Hinweis auf andere mögliche Bindungsstellen ergab die Analyse des in vitro synthetisierten Peptides Hbα(17-31)2Ach mit zwei gebundenen Molekülen Acetaldehyd. Insgesamt konnten in authentischen Proben 10 Peptide mit Acetaldehydmodifikation, welche jeweils als chromatographisch trennbare Stereoisomere auftraten, nachgewiesen werden. Dies geht einher mit einer bereits vorgeschlagenen Bildung diastereomerer Imidazolidinonderivate. Acetaldehydmodifizierte Hämoglobinpeptide waren nicht nur in Proben von Patienten und Probanden mit nachweisbarem Blutalkohol vorhanden, sondern auch in Blutproben von Alkoholikern, Studenten und Kindern ohne akuten Alkoholkonsum. Der Nachweis dieser Addukte auch ohne exogene Alkohol- oder Acetaldehydexposition lässt darauf schliessen, dass diese posttranslationale Modifikation im menschlichen Körper abläuft, Acetaldehydaddukte also auch endogen gebildet werden. Ein erhöhtes Verhältnis von modifizierten Peptiden zu deren unmodifizierten Homologen zeigte sich konzentrationsabhängig nach Inkubation von Hämoglobin mit Acetaldehyd in vitro. Langfristiger zurückliegender Alkoholkonsum konnte in Studien mit Patienten einer Rehabilitationseinrichtung und mit Probanden mit moderatem Alkoholkonsum nicht mit Hämoglobinaddukten korreliert werden. Erhöhte Adduktverhältnisse im Vergleich mit Proben ohne Blutalkoholkonzentration des gleichen Kollektivs konnten bei Patienten einer Alkoholentzugsklinik, in post-mortalen Proben und im Rahmen eines kontrollierten Trinkversuches nachgewiesen werden. Die Kinetik der Bildung und Elimination Acetaldehydmodifizierten Hämoglobins wurde sowohl anhand von Blutproben von Patienten einer Alkoholentzugsklinik untersucht, erhöhte Adduktverhältnisse waren hier nur kürzer als 5 Tage nachweisbar. Diese schnelle Elimination wurde im Rahmen eines kontrollierten Trinkversuches bestätigt. Hierbei fand sich ein signifikanter Anstieg Acetaldehydmodifizierter Hämoglobinpeptide bereits nach einmaligem moderatem Alkoholkonsum, welcher bereits bei Blutalkoholkonzentrationen von durchschnittlich 0,12 g/L auftrat und noch mindestens 6 Stunden, aber nicht mehr 24 Stunden nach Trinkende anhielt. Daher liegt die mögliche Anwendung dieses empfindlichen Assays im Nachweis eines kurzfristigen Alkoholkonsums. Sämtliche Peptide wurden hinsichtlich Empfindlichkeit und Spezifität zur Identifizierung eines Alkoholkonsums sowohl in vivo als auch in post-mortalen Proben anhand unterschiedlicher Schwellenwerte untersucht. Desweiteren wurde für diese Peptide die analytische Präzision betrachtet. Als Markerpeptid eines kurzfristigen Alkoholkonsum sowohl in vivo als auch in post-mortalen Blutproben wird hierbei Hbα(32-40)Ach vorgeschlagen. Der mögliche Vorteil bei der Betrachtung dieses Peptids im Vergleich mit anderen bereits etablierten Markern zum Nachweis eines kurzfristigen Alkoholkonsums liegt in der für den Nachweis benötigten geringen Materialmenge, welche bei der Bestimmung mittels HPLC/TOF-MS 80μg Hämoglobin betrug, was etwa der Hämoglobinmenge entspricht, die in etwa 2,5 Millionen Erythrozyten, entsprechend 0,6 μl Blut enthalten ist. Denkbar ist dadurch die Bestimmung in Blutspuren, aus denen ansonsten kein Nachweis von Ethanol oder anderer Marker eines Alkoholkonsums möglich wäre, z.B. aus getrockneten Blutspuren.
The epithelial absorbing cells of the small intestinal villi, the enterocytes, are the main protagonists for the transport of nutrients from the intestinal lumen to the interstitial fluids. The oriented flow of nutrients is carried out by different and complementary transport systems present in the apical and the basolateral domains of the enterocyte’s plasma membrane. One of the distinctive characteristics of those intestinal cells is the presence of numerous structurally distinct protrusions (referred as microvilli) on the apical surface of the plasma membrane. They confer the brush-like appearance of the microvillus border (commonly referred to as the "brush border") typically observed in the light microscope. Over the years, there has been considerable interest to study the molecular mechanisms driving the transport of molecules across the intestinal brush border membrane (BBM). Defects have been described to cause a variety of pathological conditions, such as disorders in the metabolism of saccharides (glucose and galactose malabsorption, lactose intolerance), amino acids (Hartnup disease, aminoacidurias), ions (sodium and potassium in the case of familiar diarrhea), metals (zinc in acrodermatitis enteropathica) and cholesterol lipids (cardiovascular diseases). In particular, the essential role of the BBM in regulating the delicate balance between cholesterol influx and efflux from the lumen to the enterocyte has been recently highlighted through the genetic analysis of individuals suffering of cholesterol disorders as well as in several clinical studies involving the use of dietary plant sterols (phytostrerols) or specific protein inhibitors blocking essential components of the cholesterol absorption/resorption pathway. ...
Extracts of Boswellia serrata, also known as Indian frankincense, have been used to treat inflammatory diseases in the Indian ayurvedic medicine or Chinese traditional medicine (TCM) for over 3000 years, but the molecular mechanisms of the anti-inflammatory effects are still not well understood. It is obvious that the boswellic acids, the major compounds in the extracts, are responsible for the efficacy. This work employed a protein fishing technique to identify putative targets of boswellic acids at different stages within the inflammatory cascade. For fishing experiments, boswellic acids were immobilized to sepharose and incubated with cell lysates. After washing and boiling, fished proteins were separated by SDS-PAGE and analysed by MALDI-TOF-MS. CatG, DNA-PK and the protein kinase Akt were identified by protein pulldowns with immobilised BAs and characterised as selective and important targets for BAs with an IC50 in the range of physiologically achievable plasma levels up to 5 microM. In addition, the influence on several signal transductions by BAs was tested. Calcium influx, arachidonic acid release, platelet aggregation and TNFalpha-release were assayed to reveal further pharmacological effects of BAs. Celecoxib is a well-known selective COX-2 inhibitor that is in clinical use. In this work, it is demonstrated that celecoxib is also a highly potent direct 5-LO inhibitor. Celecoxib is used in arthritis and its gastro-intestinal side effects are reduced compared to non-selective NSAIDs. In patients with a familiar disposition to polyp forming, celecoxib reduced polyps and the incidence of colon cancer. Because of lowered leukotriene levels in patients under celecoxib therapy it was plausible to test whether celecoxib interferes with 5-LO. Here it is shown that the activity of 5-LO is inhibited in PMNL and cell-free assays with IC50 of 8 microM in intact cells, 20 microM with supplemented arachidonic acid and 30 microM in cell-free systems. Thus, celecoxib is a dual inhibitor of COX-2 and 5-LO. Since 2006, celecoxib has been approved as an orphan drug for the treatment of familial adenomatous polyposis. Aside from this indication, it could be useful for treatment of asthma and other diseases where 5-LO is implicated.
Die allogene Nierentransplantation ist im Vergleich zur extrakorporalen Blutreinigung die optimale Therapie, um Patienten mit terminaler Nieren-insuffizienz eine signifikante Erhöhung der Lebenszeit bei gleichzeitig hoher Lebensqualität zu ermöglichen. Die schwerwiegendsten Komplikationen und die in Bezug auf das Transplantatüberleben limitierenden Faktoren bei einer Nieren-transplantation haben ihren Ursprung in immunologischen Prozessen. IL-18, auch bekannt als Interferon-gamma(IFN-gamma)-induzierender Faktor, ist ein proximaler Mediator in der Regulation der angeborenen sowie erworbenen Immunabwehr. Es wird konstitutiv in Zellen des Immunsystems wie Makrophagen und in verschiedenen Gewebetypen in einer inaktiven pro-Form exprimiert und bis zu seiner Aktivierung gespeichert. Aktiviertes IL 18 induziert die Bildung einer Vielzahl proinflammatorischer Mediatoren, darunter sind IFN-gamma, TNF-alpha, IL 1beta und ver-schiedene Chemokine. Gleichzeitig ist IL 18 als Kostimulator von IL-12 an der Steuerung des Gleichgewichtes der Th1- und Th2-Antwort beteiligt. Damit könnte IL-18 maßgeblich zu der Entstehung von Abstoßungsreaktionen sowie einem verzögerten Funktionsbeginn des Nierentransplantates („Delayed Graft Function“ = DGF) beitragen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Beteiligung von lokal in der menschlichen Niere exprimiertem IL-18 an immuno-logischen Prozessen prinzipiell möglich ist, da die Expression von IL-18 und weiterer für seine Funktion essentieller Komponenten auf mRNA- und Protein-ebene in der gesunden menschlichen Niere nachgewiesen wurde. Über immun-histochemische Färbungen konnte eine Lokalisation des IL-18 im distalen Tubulussystem und Sammelrohrabschnitten der Niere nachgewiesen werden. Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen von IL-18 zusammen mit Proteinen, die für einzelne Tubulus- und Sammelrohrabschnitte spezifisch sind, zeigten, dass IL-18 in den Schaltzellen des distalen Konvolutes, des Verbindungstubulus und des Sammelrohrs lokalisiert ist. Weiterhin sind die für die Aktivierung von IL-18 notwendigen Komponenten, der purinerge Rezeptor P2X7 und Caspase-1, in der Niere mit IL-18 kolokalisiert. Damit sind grundlegende Voraussetzungen für eine Aktivierung von IL-18 in diesen Bereichen gegeben. Im Zuge von Abstoßungs-reaktionen nach Nierentransplantation könnte das im Nierengewebe exprimierte IL-18 an immunologischen Vorgängen beteiligt sein. Es wurde festgestellt, dass die Menge an konstitutiv exprimiertem IL-18 in den Schaltzellen von Tubulus- und Sammelrohrabschnitten bei akuten Abstoßungen sowie bei der chronischen Allograftnephropathie im Vergleich zur gesunden Niere abnahm, gleichzeitig lagen vermehrt infiltrierende Makrophagen sowie T- und B-Lymphozyten im Nieren-parenchym vor. Diese Beobachtung lässt die Spekulation zu, dass durch eine Ausschleusung von aktivem IL-18 aus den Schaltzellen eine Immunantwort unterhalten wird, und es im Zuge dessen zu einer Infiltration von Immunzellen kommt. Durch immunhistochemische IL-18 Färbungen an Transplantatbiopsien konnte keine de novo Expression von IL-18 in Bereichen der Tubuli oder der Glomeruli bei immunologischen Komplikationen nach Nierentransplantation nachgewiesen werden. Bei der chronischen Allograftnephropathie wurde IL-18 an kleineren Blutgefäßen nachgewiesen, was für eine Beteiligung von IL-18 an atherosklerotischen Veränderungen bei dieser Diagnose spricht. Weitere Rückschlüsse auf einen Effekt des IL-18 bei Komplikationen nach Nierentransplantation sollten durch die Analyse von IL-18 Genpolymorphismen erhalten werden. Funktionelle Einzelbasenaustausch-Polymorphismen („Single Nucleotide Polymorphisms“ = SNP´s) des IL-18 Promotors scheinen sich auf die Expression von IL-18 auszuwirken und wurden für eine Beteiligung an der Entstehung oder dem Verlauf verschiedener Erkrankungen verantwortlich gemacht. In dieser Arbeit wurde durch Assoziationsanalysen und Haplotypen-analysen gezeigt, dass sich die IL-18 Promotor SNP´s 607C/A und 137G/C des Empfängers auf die Entstehung einer DGF auswirken. Der 137CC Genotyp und das -137C Allel sowie der kombinierte Genotyp -607CA und -137CC des Empfängers sind mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung einer DGF assoziiert. Im Gegensatz dazu scheinen sich Unterschiede in der Genexpression des IL 18, welche durch die SNP´s 607C/A und 137G/C verursacht werden, nicht auf die Entstehung von Abstoßungsreaktionen auszuwirken. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass aus dem Empfänger stammendes IL 18 sowie lokal im Spenderorgan exprimiertes IL-18 an immunologischen Komplikationen nach Nierentransplantation beteiligt sein könnte. Durch seine Stellung am Beginn von proinflammatorischen Kaskaden stellt das IL-18 ein attraktives Target für die Entwicklung neuer Immunsuppressiva dar.
Disruption of the complex gastrointestinal ecosystem between the resident microflora and the colonic epithelial cells has been associated with increased inflammation and altered cell growth. Possible endpoints of this disturbance are IBD and CRC. The data presented in this thesis, entitled "PPARgamma as molecular target of epithelial functions in the gastrointestinal tract", shed further light on the underlying molecular mechanisms contributing to the well ordered homeostasis of this gastrointestinal ecosystem. Except for elucidating important roles for mesalazine and the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN in a) the modulation of cellular growth, b) the induction of APs, and c) the control of NFkappaB signalling in CRC cells, the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma und VDR as "gatekeepers" in these intricate regulatory mechanisms were established. Future work will be engaged in analysing whether these in vitro findings are also physiologically relevant in regard to prevention and therapy of gastrointestinal diseases. Within the scope of this work, in Paper I and II it could be demonstrated that butyrate and mesalazine act via PPARgamma to induce their anti-proliferative and pro-apoptotic actions along the caspase signalling pathway. Activation of the intrinsic and extrinsic signalling trail and the down-regulation of anti-apoptotic proteins are responsible for increased caspase-3 activity caused by butyrate. In contrast, mesalazine merely activates this cascade via the extrinsic trail and the IAPs. Moreover, a signal transduction pathway leading to increased cell death via p38 MAPK - PPARgamma - caspase-3 in response to butyrate was unveiled. In addition, there is strong evidence that mesalazine-mediated pro-apoptotic and growth-inhibitory abilities are controlled by PPARgamma-dependent and -independent mechanisms which appear to be triggered at least in part by the modulation of the tumor suppressor gene PTEN and the oncoprotein c-myc, respectively. In Paper III and IV the induction of the APs HBD-2 and LL-37 in response to the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN was pinpointed. Regarding the molecular events of this regulation, the data presented in this thesis provide strong evidence for the involvement of VDR in HBD-2- and LL-37-induced gene expression, while the participation of PPARgamma was excluded. Moreover, the role for p38 MAPK and TGF-beta1 in the up-regulation of LL-37 caused by butyrate was established. In contrast, SFN-mediated induction of HBD-2 is modulated via ERK1/2 signalling. The findings in Paper V clearly refer to the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma and VDR in butyrate-mediated suppression of inducible NFkappaB activation dependent on the stimulated signalling pathway caused by LPS or TNFalpha. Moreover, an inhibitory role for VDR in the regulation of basal NFkappaB activation was revealed. On the contrary, a modulating role for PPARgamma on basal NFkappaB could be debarred. Altogether the data presented in this thesis not only provide new insights in the understanding of the fundamental gastrointestinal physiology regulated by nuclear hormone receptors, but also may offer opportunities for the development of potential drug targets and therapeutic strategies in the treatment of IBD and CRC.
Eine große Anzahl pharmakologischer und klinischer Studien zeigt die Wirksamkeit des standardisierten Ginkgo biloba Extraktes EGb 761 bei vaskulären und kognitiven Stö-rungen, wie der Alzheimer-Krankheit, der vaskulären Demenz und der peripheren arte-riellen Verschlusskrankheit. Experimentelle Ergebnisse weisen darauf hin, dass Terpen-laktone und Flavonolglykoside für die meisten pharmakologischen Wirkungen von EGb 761 verantwortlich sind. Allerdings gibt es wenige Studien, die die orale Biover-fügbarkeit von Terpenlaktonen und besonders von Flavonolglykosiden aus Ginkgo bilo-ba im Blut oder Zentralnervensystem untersuchten. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Fähigkeit der Flavonoidglykosiden bzw. deren Metaboliten die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden im Tierversuch an männlichen Sprague-Dawley-Ratten erforscht. Unter-sucht wurden dabei orale Einfach- und Mehrfachgaben von EGb 761 über einen Zeit-raum von 8 Tagen in den Dosierungen 100 bzw. 600 mg Extrakt pro kg Körpergewicht. Zusätzlich wurde die Verteilung der Ginkgoflavonolmetabolite in den unterschiedlichen Bereichen des Gehirns untersucht (Hippocampus, frontaler Cortex, Striatum und Klein-hirn). Zu diesem Zweck wurde eine HPLC-Fluoreszenzmethode für die Ermittlung der Plasma- und Gehirnkonzentrationen der Flavonoidmetaboliten (Derivate von Quercetin, Kämpferol und Isorhamnetin) entwickelt und validiert. In beiden Studien (Einfach- und Mehrfachgabe) wurden Flavonoidmetaboliten im Plasma und im Gehirn nachgewiesen. Dabei wurden Metaboliten in allen untersuchten Gehirnbereichen gefunden. Bei der Dosierung von 100 mg/kg war Kämpferol vorzugsweise im frontalen Cortex lokalisiert, während die anderen Flavonole in allen Regionen vergleichbare Konzentrationen auf-wiesen. Bei der höheren Dosierung von 600 mg/kg waren die Konzentrationen der Fla-vonolmetaboliten in allen Gehirnbereichen vergleichbar. Obgleich die vier untersuchten Gehirnbereiche nur 38% des gesamten Gehirns darstellten, wurden die meisten Gink-goflavonole in diesen Regionen gefunden. Im übrigen Gehirngewebe wurden nur be-grenzte Mengen von Flavonolen nachgewiesen. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass es erstmalig gelungen ist, im Tier-versuch die Bioverfügbarkeit einer der therapeutisch aktiven Substanzklassen von Ginkgo biloba - die Flavonoide - sowohl im Plasma als auch im ZNS nachzuweisen.
Taspase1 stellt die bisher einzige Typ2-Asparaginase mit proteolytischer Aktivität dar. Das wichtigste Substrat der Taspase1 ist das MLL-Protein, einem Homolog des Trithorax- Proteins aus Drosophila melanogaster, das auch dort eine wichtige Rolle bei Differenzierungsprozessen spielt. Bei Patienten mit einer t(4;11)-Translokation ist Taspase1 maßgeblich an der Ausbildung einer t(4;11)-assoziierten Leukämie beteiligt. Die Inhibierung der proteolytischen Aktivität der Taspase1 könnte daher einen Ansatzpunkt für eine neuartige Krebstherapie darstellen. Aufgrund der ungewöhnlichen Eigenschaften von Taspase1 ist es bisher nicht gelungen einen selektiven Inhibitor für das katalytische Zentrum der Taspase1 zu identifizieren. Unter nativen Bedingungen (ca. 50 mM NaCl) befindet sich Taspase1 bereits in einem nahezu vollständig inhibierten Zustand, da im katalytischen Zentrum der Taspase1 ein Chloridion komplexiert ist. Dieses Chloridion wird einzig und allein nach Interaktion mit dem natürlichen Substrat MLL aus dem katalytischen Zentrum verdrängt, was zu einer kurzfristigen Aktivierung der Taspase1 führt. Nach Ablauf der hydrolytischen Spaltung des Substrates nimmt das Chloridion wieder seine Position im katalytischen Zentrum ein. Unter diesen Bedingungen ist aus sterischen Gründen die Bindung eines potentiellen Inhibitors im katalytischen Zentrum nicht möglich. Durch Herstellung von Mutanten der Taspase1 und deren Substrats konnte der Mechanismus der katalytischen Spaltung durch Taspase1 aufgeklärt werden. Dabei erwiesen sich drei Aminoäuren als essentiell für die Hydrolyse. Interessanterweise ist die Anwesenheit des Substrates, insbesondere des Aspartates an Position Sieben der cleavage sites CS1 bzw. CS2 notwendig um den katalytischen Prozess zu starten. Das negativ geladene Aspartat, verdrängt zunächst das Chloridion von seiner Position und aktiviert dadurch das katalytische Zentrum (Rotation von Threonin 234). Erst dadurch wird Threonin 234 zu einer katalytisch aktiven Aminosäure und kann einen nukleophilen Angriff auf die Peptidbindung zwischen Aspartat und Glycin des Substrates durchführen. Die Hydrolyse wird dabei durch die OH-Gruppe des Serins 252 durch Wechselwirkung mit dem Carboxylsauerstoff unterstützt. Durch Mutation beider Aspartate an Position sieben im artifiziellen Substrat 2CL zu Glycin oder Lysin führte zu einem vollständigen Verlust der hydrolytischen Spaltung an CS1 und zu einem starken Rückgang der hydrolytischen Spaltung an CS2. Die Mutationen T234D und S252D der Taspase1 führten beide zum vollständigen Verlust der katalytischen Spaltung, sowohl in cis, als auch in trans. Unter Verwendung des Taspase1-Aktivitätsassays konnte der transkriptionelle Regulator MLL4 als potentielles Substrat der Taspase1 identifiziert werden.