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Bioaktive Sphingolipide spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation vieler entscheidender Prozesse in Endothelzellen. Speziell dem S1P wird eine Schlüsselfunktion in der Regulation der Proliferation und Migration von Endothelzellen beigemessen. Diese Prozesse sind notwendige Teilschritte in der Angiogenese, welche eine wichtige biologische und medizinische Bedeutung hat. So ist die umorangiogenese eine Voraussetzung für die adäquate Versorgung des Tumors mit Sauerstoff und Nährstoffen und trägt des Weiteren zu dessen Aggressivität bei. Ein weiteres Merkmal vieler solider Tumoren ist das Vorkommen hypoxischer Bereiche und erhöhter NO-Spiegel, die zudem, je nach Konzentration, als proangiogene Faktoren wirken können. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung des Einflusses hypoxischer Bedingungen und des Signalmoleküls NO auf das Sphingolipidgleichgewicht in der humanen Endothelzelllinie EA.hy 926. Ein spezieller Fokus wurde dabei auf die Regulation der S1P synthetisierenden Sphingosinkinasen (SK) und der daraus resultierenden Beeinflussung angiogener Zellantworten gelegt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl Hypoxie als auch NO die Aktivität der SK-1, jedoch nicht der SK-2, langanhaltend erhöhten. Dieser Aktivitätsanstieg wurde durch eine Aktivierung des SK-1-Promotors mit einer nachfolgenden verstärkten mRNA- und Proteinexpression vermittelt. Dabei war unter Hypoxie der Transkriptionsfaktor HIF-1α der entscheidende SK-1 regulierende Faktor. Zusätzlich führte die durch Hypoxie ausgelöste Hochregulation der SK-1 zu einem Anstieg der zellulären S1P-Spiegel und zu einer Reduktion der Sphingosinkonzentration. Mechanistische Untersuchungen des Effekts von NO auf die SK-1 zeigten, dass dieser unabhängig von erhöhten cGMP-Konzentrationen aufgrund einer Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) durch NO war. Zum einen hatte die Verwendung des cGMP-Analogons 8-Bromo-cGMP und des Aktivators der sGC YC-1 keinen Einfluss auf die SK-1-Proteinexpression, und zum anderen hatte die Kostimulation mit dem sGC-Inhibitor ODQ keinen hemmenden Effekt auf die durch NO ausgelöste Hochregulation der SK-1. Demgegenüber ist die klassische MAPK-Kaskade essenziell für die Wirkung von NO auf die SK-1, da der MEK-Inhibitor U0126 die erhöhte Proteinexpression der SK-1 verhindern konnte. Die Aktivierung des vorgeschalteten kleinen GTP-bindenden Proteins p21ras ist ein möglicher Mechanismus, über den NO die Aktivierung der MAPKKaskade verursachen könnte (Lander et al, 1995). In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die funktionelle Konsequenz einer Regulation der SK-1 durch Hypoxie und NO in EA.hy 926 Zellen untersucht. Sowohl Hypoxie als auch NO wurden als pro-angiogene Faktoren beschrieben. Daher wurde anhand von Migrationsassays und in-vitro-Angiogeneseassays untersucht, ob die SK-1 bei diesen Zellantworten eine Rolle spielt. Die Depletion der SK-1 durch die Verwendung einer spezifischen siRNA oder mit Hilfe von lentiviralen shRNA-Konstrukten zeigte, dass die Hochregulation der SK-1 unter Hypoxie und NO essenziell für die erhöhte Migration der Endothelzellen ist. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass hypoxische Bedingungen und NO zu einer Hochregulation der SK-1 in EA.hy 926 Zellen führten und eine erhöhte Migrationsrate dieser Zellen zur Folge hatten. Somit ist die SK-1 ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer pathologischen Angiogenese einhergehen, wie es im Tumorgeschehen der Fall ist.
Aß spielt im Krankheitsgeschehen der AD eine zentrale Rolle, es zeigt neurotoxisches Potential und wird deshalb auch direkt mit der Neurodegeneration in Zusammenhang gebracht. Vermittelt werden die Effekte mitochondrial über den intrinsischen Apoptoseweg. Jedoch kann basierend auf den vorliegenden Daten behauptet werden, dass altersbedingte Veränderungen der mitochondrialen Funktion überhaupt erst zur Bildung von Aß führen und Aß durch die intrazelluläre Kumulation über Jahre sein toxisches Potential entwickelt. Im Einzelnen zeigen Komplex I-Defiziente Mäuse erhöhte Aß-Spiegel im Gehirn. Desweiteren führt die Hemmung der Atmungskettenkomplexe I und III mit Rotenon oder Antimycin in den untersuchten HEK-Zellen zu erhöhter Superoxidanionradikal-Produktion und ist, wie auch die Erzeugung von oxidativem Stress mit H2O2 oder nitrosativem Stress mit SNP, von einem Anstieg der Aß-Produktion begleitet. Daraus geht hervor, dass die Aß-Produktion durch eine mitochondriale Fehlfunktion ROS-vermittelt induziert werden kann. Eine Senkung der ROS-Spiegel durch Ascorbinsäure reduziert die Aß-Produktion und belegt den Zusammenhang zwischen Aß- und ROS-Bildung. Die ROS-Abnahme ist zugleich mit einer verringerten BACE1-Aktivität assoziiert. Für dieses Enzym konnte vielfach eine ROS-vermittelte Aktivierung nachgewiesen werden. Aß selbst generiert ROS und induziert darüber seine eigene Bildung. Weiterhin beeinträchtigt Aß die mitochondriale Funktion. In HEK APPwt und APPsw sind morphologische und funktionelle Parameter dieser Organellen verändert. Die chronische Behandlung von HEK-293-Zellen bestätigt den Aß-Einfluss auf die mitochondriale Funktion und Morphologie. Mitochondrien scheinen ein direktes Target von Aß zu sein. So sind Kolokalisationen zwischen den Organellen und den Aß-Peptid-Aggregaten nachweisbar. Durch die Aß-bedingte mitochondriale Fehlfunktion können wiederum ROS entstehen und die Aß-Bildung und Kumulation fördern. Zwischen ROS und Aß entsteht ein Teufelskreislauf, der die zelluläre Funktion stört und in Apoptose und Nekrose mündet. Wie im HEK-Zellmodell lassen sich auch in der Peripherie von AD-Patienten Hinweise auf eine mitochondriale Fehlfunktion finden. So zeigen Lymphozyten von MCI- und AD-Patienten besondere Auffälligkeiten in basalen mitochondrialen Parametern, wie dem Membranpotential, der ROS-Produktion, der NAD(P)H-abhängigen Redoxenzymaktivität und der Apoptoserate. Im Einzelnen scheint der Komplex III betroffen zu sein, da sich nach Hemmung mit Antimycin besonders viele Unterschiede zwischen MCI- bzw. AD-Patienten und nichtdementen alten Kontrollen herauskristallisieren. Als Biomarker sind die Befunde derzeit nicht anzuwenden, da sie noch zu wenig spezifisch sind. Hier müssen weitere Untersuchungen folgen.
Als ein wichtiges Teilgebiet der Organokatalyse hat sich in kurzer Zeit die Wasserstoffbrückenvermittelte Katalyse etabliert. Bisher ist eine breite Palette an strukturell und funktionell unterschiedlichen Wasserstoffbrückendonoren synthetisiert worden. Als priviligierte katalytische Einheiten haben sich dabei diejenigen Donorgruppen erwiesen, die zwei Wasserstoffbrücken simultan ausbilden können. Hierzu gehören vornehmlich (Thio-) Harnstoffe sowie die strukturell verwandten Guanidinium‐ und Amidinium-Ionen. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden mehrere neue axial‐chirale Amidine als asymmetrische Katalysatoren synthetisiert. Dazu wurden drei aromatische Fragmente mittels zweier Suzuki‐Kupplungen zu terarylischen Nitrilen verknüpft, welche dann mit einem chiralen Aminoalkohol verethert wurden. Die Amidin-Funktion wurde jeweils durch eine diastereokonvergente Makrocyclisierung erzeugt, bei der das Amin an das Nitril addiert wurde und das Chiralitätszentrum der Seitenkette die Konfiguration der chiralen Achse bestimmte. In der protonierten Form fungieren die Katalysatoren als Lewis-Säuren, die über die Amidinium-Funktion zwei nahezu parallele H-Brücken zum Substrat ausbilden. Weiterhin verfügen sie über eine Hydroxyl-Gruppe, die in der Lage ist, eine dritte H-Brücke einzugehen. Anhand der Festkörperstruktur eines Formiat-Salzes konnte diese Dreifachkoordination bestätigt werden. Außerdem wurde in Kinetik-Experimenten eine signifikante Beschleunigung der mit den neuen Verbindungen katalysierten Reaktion im Vergleich zu der mit anderen axial-chiralen Amidinen beobachtet, bei denen nur zwei H-Brücken ausgebildet werden (können). Es gelang, (+)-Estron enantiomerenrein herzustellen, basierend auf einer asymmetrisch katalysierten Diels-Alder-Reaktion mit einem Diketon als Dienophil. Der benötigte Steroid-Vorläufer wurde mit 80 % ee erhalten. Des weiteren wurden andere Reaktionen auf das katalytische Potential der Amidine hin untersucht. Während etwa für die Umsetzung von N-Methylindolen mit Nitroalkenen drastische Beschleunigungen beobachtet wurden, blieben die Enantiomerenüberschüsse jedoch moderat. Schließlich wurden die Amidine auch in ihrer neutralen Brønsted-basischen Form getestet.
Background: Nitric oxide (NO) is an essential vasodilator. In vascular diseases, oxidative stress attenuates NO signaling by both chemical scavenging of free NO and oxidation and down-regulation of its major intracellular receptor, the alpha/beta heterodimeric heme-containing soluble guanylate cyclase (sGC). Oxidation can also induce loss of sGC's heme and responsiveness to NO.
Results: sGC activators such as BAY 58-2667 bind to oxidized/heme-free sGC and reactivate the enzyme to exert disease-specific vasodilation. Here we show that oxidation-induced down-regulation of sGC protein extends to isolated blood vessels. Mechanistically, degradation was triggered through sGC ubiquitination and proteasomal degradation. The heme-binding site ligand, BAY 58-2667, prevented sGC ubiquitination and stabilized both alpha and beta subunits.
Conclusion: Collectively, our data establish oxidation-ubiquitination of sGC as a modulator of NO/cGMP signaling and point to a new mechanism of action for sGC activating vasodilators by stabilizing their receptor, oxidized/heme-free sGC.
Analysis of knockout/knockin mice that express a mutant FasL lacking the intracellular domain
(2009)
Fas ligand (FasL; CD178; CD95L) is a type II transmembrane protein belonging to the tumour necrosis factor family; its binding to the Fas receptor (CD95; APO-1) triggers apoptosis in the receptor-bearing cell. Signalling through this pathway plays a pivotal role during the immune response and in immune system homeostasis. Similar to other TNF family members, the intracellular domain has been reported to transmit signals to the inside of the FasL-bearing cell (reverse signalling). Recently, we identified the proteases ADAM10 and SPPL2a as molecules important for the processing of FasL. Protease cleavage releases the intracellular domain, which then is able to translocate to the nucleus and to repress reporter gene activity. To study the physiological importance of FasL reverse signalling in vivo, we established knockout/knockin mice with a FasL deletion mutant that lacks the intracellular portion (FasLDeltaIntra). Co-culture experiments confirmed that the truncated FasL protein is still capable of inducing apoptosis in Fas-sensitive cells. Preliminary immune histochemistry data suggest that, in contrast to published data, the absence of the intracellular FasL domain does not alter the intracellular FasL localization in activated T cells. We are currently investigating signalling and proliferative capacities of T cells derived from homozygous FasLDeltaIntra mice to validate a co-stimulatory role of FasL reverse signalling.
Oral presentation from 4th International Conference of cGMP Generators, Effectors and Therapeutic Implications ; Regensburg, Germany. 19–21 June 2009 Background: An exaggerated pain sensitivity is the dominant feature of inflammatory and neuropathic pain both in the clinical setting and in experimental animal models. It manifests as pain in response to normally innocuous stimuli (allodynia), increased response to noxious stimuli (hyperalgesia) or spontaneous pain, and can persist long after the initial injury is resolved. Research over the last decades has revealed that several signaling pathways in the spinal cord essentially contribute to the pain sensitization. To test the contribution of cGMP produced by NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) to pain sensitization, we investigated the localization of NO-GC in the spinal cord and in dorsal root ganglia, and we characterized the nociceptive behavior of mice deficient in NO-GC (GC-KO mice). Results: We show that NO-GC (β1 subunit) is distinctly expressed in neurons of the mouse spinal cord, while its distribution in dorsal root ganglia is restricted to non-neuronal cells. GC-KO mice exhibited a considerably reduced nociceptive behavior in models of inflammatory or neuropathic pain, but their responses to acute pain were not impaired. Moreover, GC-KO mice failed to develop pain sensitization induced by spinal administration of drugs releasing NO. Surprisingly, during spinal nociceptive processing cGMP produced by NO-GC may activate signaling pathways different from cGMP-dependent protein kinase I (cGKI), while cGKI can be activated by natriuretic peptide receptor-B (NPR-B) dependent cGMP production. Conclusion: Taken together, our results provide evidence that NO-GC has a dominant role in the development of exaggerated pain sensitivity during inflammatory and neuropathic pain. Furthermore, beside the NO-mediated cGMP synthesis, cGMP produced by NPR-B contributes to pain sensitization by activation of cGKI.
Platelets are anucleate cells that play a major role in hemostasis and thrombosis in the vasculature. During primary hemostasis platelets adhere to sites of vascular damage and the initial platelet coat is reinforced by additional platelets forming a stable aggregate. At the same time platelets secrete their intracellular granules containing substances that further activate platelets in an autocrine and paracrine fashion and affect local coagulation and endothelial smooth muscle cell function. The small guanine nucleotide binding protein Rap1 regulates the activity of the platelet integrin alphaIIbbeta3 and thus platelet aggregation. Rap1 activity is controlled by guanine nucleotide exchange factors and GTPase activating proteins. In platelets, Rap1GAP2 is the only GTPase activating protein of Rap1. In order to identify Rap1GAP2-associated proteins, a genetic two-hybrid screening in yeast was performed and synaptotagmin-like protein 1 (Slp1, also called JFC1) was found as a new putative binding partner of Rap1GAP2. Slp1 is a tandem C2 domain containing protein and is known to bind to Rab27, a small GTPase involved in platelet dense granule secretion. The direct interaction between Rap1GAP2 and Slp1 was confirmed in yeast and in transfected cells. More importantly, Slp1 is expressed in platelets and binding of endogenous Rap1GAP2 and Slp1 was verified in these cells. The Rap1GAP2 and Slp1 interaction sites were mapped by mutational analysis. Rap1GAP2 binds through the -TKXT- motif within its C-terminus to the C2A domain of Slp1. Moreover, the Slp1 binding -TKXT- motif of Rap1GAP2 was confirmed by complementary approaches using short synthetic Rap1GAP2 peptides. The C2A domain of Slp1 is a phospholipid binding domain and thus mediates binding of Slp1 to the plasma membrane. Phospholipid overlay assays revealed that simultaneous binding of Slp1 via its C2A domain to Rap1GAP2 and to phospholipids can occur. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is regulated by cAMP-dependent protein kinase (cAK or PKA), and kinase activation in platelets enhanced binding of endogenous Rap1GAP2 to Slp1. In-vitro phosphorylation assays revealed that Slp1 is a substrate of PKA, and serine 111 was identified as phosphorylation site. Since Slp1 is a Rab27 binding protein, a trimeric complex of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 is conceivable. The association of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 was investigated by immunofluorescence and co-immuno-precipitation experiments in both, transfected cells and platelets. By Slp1 affinity chromatography and subsequent mass spectrometric analysis additional Slp1 binding proteins were identified in platelets, and binding of Slp1 to Rab8 was confirmed in pull-down assays. To investigate the functional significance of the interaction between Rap1GAP2 and Slp1, an assay system was established to determine serotonin secretion of streptolysin-O permeabilized platelets. Addition of recombinant Slp1 protein to permeabilized platelets strongly inhibited platelet dense granule secretion, whereas addition of recombinant Rap1GAP2 protein or synthetic Rap1GAP2 peptide enhanced secretion. Deleting the Slp1 binding -TKXT- motif abolished the stimulatory effect of Rap1GAP2 on secretion. Addition of Rap1 to permeabilized platelets had no effect on secretion. These findings indicate that the Rap1GAP2 effect on platelet secretion does not depend on the GTPase activating function of Rap1GAP2, but is rather dependent on the -TKXT- mediated interaction of Rap1GAP2 with Slp1. In addition, in-vitro GAP assays revealed that Slp1 binding to Rap1GAP2 does not affect the Rap1GAP activity of Rap1GAP2, and adhesion assays excluded a role for the Rap1GAP2/Slp1 interaction in cell adhesion. Altogether, the results of the present study demonstrate that besides its function in platelet aggregation by controlling the activity of the small guanine nucleotide binding protein Rap1, Rap1GAP2 is involved in platelet dense granule secretion by the new -TKXT- mediated interaction with the Rab27 and membrane binding protein Slp1. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is embedded into an elaborate network of protein-protein interactions in platelets which appear to be regulated by phosphorylation. Future studies will in particular aim to dissect the molecular details of Rap1GAP2 and Slp1 action in platelet secretion and investigate the potential biochemical and pharmacological value of the unique protein binding -TKXT- motif of Rap1GAP2.
Ziel dieser Arbeit war es, die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf Leukämiezellen von pädiatrischen Patienten mit Akuten Leukämien zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in vitro und erste in vivo Untersuchungen durchgeführt: 1. In vitro Untersuchungen Zuerst wurde eine durchflusszytometrische Methode optimiert zum Nachweis der Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf maligne Zellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien. Mit diesem durchflusszytometrischen Assay war es möglich, die Zytotoxizität auf maligne von der auf nicht maligne Zellen zu unterscheiden. Dies war unerlässlich, da in den frisch isolierten Leukämiezellen der Patienten bis zu 55% normale Lymphozyten enthalten waren. Darüber hinaus erlaubte diese Methode die simultane Bestimmung der Zell-Apoptose in jeder Probe. An Leukämie-Zelllinien wurde dieser multiparametrische Assay anschließend mit dem MTT-Assay verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Bestimmung von Zytotoxizitäten mit beiden Methoden an den Zelllinien Molt 4/8 und H9 gut korrelierte (r≥0,95). Für das Arbeiten mit Patientenmaterial wurde ausschließlich die durchflusszytometrische Methode angewendet, da in den Proben der Patienten die Differenzierung zwischen leukemischen Zellen und normalen Lymphozyten essentiell war. In den Leukämie-Zelllinien Molt4/8, H9 und K562 zeigte sich, dass Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität zeigte als Busulfan. In die Untersuchungen frischer Leukämiezellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien konnten 24 Proben unterschiedlicher Leukämien (cALL, reife B-ALL, reife TALL, AML) und unterschiedlicher Erkrankungszeitpunkte (bei Diagnose oder bei Rezidiv) eingeschlossen werden. In diesen Proben zeigte Treosulfan eine deutlich bessere Wirkung als Busulfan. Es wurde trotz des kleinen Patientenkollektivs deutlich, dass die T-ALL gegenüber der cALL sensitiver auf Treosulfan reagiert. Außerdem war die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan gegenüber der T-ALL signifikant höher als gegenüber c-ALL (Treosulfan: p=0,02, Busulfan: p=0,03). Die IC50-Werte stiegen vom Zeitpunkt der Diagnose (Median: Treosulfan: 11,45 μM, Busulfan: 96,45 μM) über die Progression (Median: Treosulfan: 45,95 μM, Busulfan: 253,75 μM) bis zum Rezidiv (Median: Treosulfan: 153,15 μM, Busulfan: 223,3 μM) hin an, und zwar um das 8-fache bei Treosulfan und das 2,5-fache bei Busulfan. Der Unterschied der Zytotoxizität von Treosulfan auf Leukämieproben zum Zeitpunkt der Diagnose gegenüber dem Rezidiv war statistisch signifikant (p=0,02). Für Busulfan ergab sich für diese Untersuchungszeitpunkte keinen signifikanten Unterschied (p=0,13). Vergleichend zu den Ergebnissen an frisch isolierten Leukämiezellen wurde die Wirkung von Treosulfan und Busulfan auf normale Lymphozytensubpopulationen und Stammzellen untersucht. Auch hier zeigte Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität im Vergleich zu Busulfan. Insgesamt reagierten normale Lymphozyten sensitiver auf die Alkylanzien im Vergleich zu den Leukämiezellen (Mediane IC50-Werte für Treosulfan und Busulfan auf Lymphozyten: 12,3 μM und 89,9 μM, auf Leukämieproben: 30,6 μM und 133 μM mit p=0,03 und p=0,02). In einem weiteren Experiment sollte die Interaktion von Treosulfan und Busulfan mit Fludarabin untersucht werden. Fludarabin ist ein Purin-Analogon, das in der Pädiatrie in Kombination mit Alkylanzien zur Chemo-Konditionierung eingesetzt wird. Bei der Inkubation von Fludarabin mit Treosulfan-Konzentration größer 1 μM war ein deutlicher Synergismus zu verzeichnen. Die Kombination von Fludarabin mit Busulfan ergab Antagonismus. 2. In vivo Untersuchungen Es wurde die zelluläre Immunrekonstitution bei pädiatrischen Patienten mit AML (n=9) nach allogener Knochenmarktransplantation überwacht. Ein Patient wurde mit Treosulfan konditioniert (n=1), die anderen Patienten (n=8) erhielten Busulfan zur Konditionierung. Die Rekonstitution der Leukozyten, B-Zellen, NK-Zellen und T-Helferzellen verlief in beiden Gruppen ähnlich. Ein signifikanter Unnterschied konnte für die Rekonstitution der CD3+CD8+ zytotoxischen T-Zellen gezeigt werden, die bei dem Patienten, der mit Treosulfan konditioniert wurde, signifikant niedriger war im Vergleich zur Busulfangruppe. Da bei dem Patienten, der Treosulfan erhielt, die CRP-Werte über einen längeren Zeitraum erhöht waren und Infektionen die Rekonstitution von zytotoxischen T-Zellen maßgeblich beeinflussen, bietet dies eine mögliche Erklärung für diesen Unterschied. Aussagen können jedoch nur mit einem größeren Patientenkollektiv getroffen werden.