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Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Modellierung der neuronalen Prozesse, die auditorischen Lokalisationsleistungen zugrunde liegen. Viele der hierzu aktuell diskutierten Modellvorstellungen lassen sich auf ein von L. Jeffress bereits in der Mitte des letzten Jahrhunderts vorgeschlagenes Netzwerkmodell zurückführen: Nach Jeffress werden interaurale Laufzeitunterschiede (ITDs) zwischen beiden auditorischen Pfaden in einem Netzwerk von Detektorneuronen (Koinzidenzdetektoren) ausgewertet. Systematische Laufzeitunterschiede resultieren aus der Architektur des Netzwerks, die sogenannte Delay-Lines realisieren soll. Trotz einer Reihe von Evidenzen für das im auditorischen Diskurs inzwischen als Paradigma geltende Modell, findet Kritik am Jeffress-Modell in jüngerer Zeit zunehmend Beachtung und Interesse. So argumentieren B. Grothe und D. McAlpine gegen die Übertragung des Delay-Line Modells auf die Verhältnisse bei Säugern. Zentrales Moment ihrer Kritik ist eine Afferenz der MSO aus einem weiteren Teilgebiet der Olive (MNTB). Wesentlicher Effekt der von der Projektion gebildeten inhibitorischen Synapse ist eine relative Verschiebung der Best-Delays der MSO-Zellen zur Präferenz contralateraler Delays. Damit besteht nicht nur zu der nach dem Jeffress-Modell notwendigen Aufteilung der Best-Delays ein Widerspruch, die ITDs liegen bei tiefen Frequenzen für kleine Säuger aufgrund deren geringer Kopfgröße außerhalb des Bereichs physiologisch auftretender Delays. In dieser Arbeit werden die Ergebnisse von Grothe und McAlpine durch Compartmental Modeling analysiert. Gegenüber einer Simulationsstudie aus den Gruppen von Grothe und McAlpine werden von uns durch explizite Modellierung der Dendriten zusätzliche Effekte der Inhibiton beschrieben. Wir stellen dar, wie die Topographie von Inhibiton und Excitation die Verarbeitungsprozesse in Bipolar-Zellen durch dendritische Low-Pass Filterung und Kontrastverst ärkung zwischen minimaler und maximaler Spikerate unterstützt. Unsere Ergebnisse können die empirisch nachgewiesene Verteilung excitatorischer (distaler) und inhibitorische (proximaler) Synapsen erklären. In der abschliessenden Analyse der von den Bipolar-Zellen generierten Spike Trains wird das von Grothe und McAlpine entworfene alternative ITD-Codierungsmodell auf der Basis von Ratencodes problematisiert: Bislang erklärt ihr Vorschlag nicht, wie organismische Lokalisationsleistungen auf der Basis weniger Spikes realisiert werden können.
In der vorliegenden Arbeit wurden zehn Substanzen, die im Rahmen des Projekts INTAFERE analytisch in verschiedenen Gewässersystemen des Hessischen Rieds nachgewiesen werden konnten, ökotoxikologisch charakterisiert. Neben der Bestimmung der Akut- und der chronischen Toxizität wurde auch das endokrine Potential mit Hilfe eines rekombinanten Hefe-Assays ermittelt.Die akute Toxizität zeigt zwischen den verschiedenen Substanzen große Differenzen. Die drei Organophosphate TCPP, TBEP und TCEP zeigen selbst bei hohen Konzentrationen keine oder nur sehr geringe Effekte, während 4-NP, 4-t-OP, BPA, TDCPP, AHTN und Terbutryn mit LC50-Werten bis zu 5 mg/l eine höhere Toxizität besitzen.Im Hefe-Assay kann in mehreren Versuchswiederholungen das östrogene Potential von 4-NP (MW: 6,71x10-6 M), 4-t-OP (MW: 7,16x10-6 M) und BPA (MW: 4,88x10-6 M), sowie die antiandrogene Wirkung des Bisphenols (5,29x10-5 M) bestätigt werden. Im Gegensatz dazu können im Yeast Antiestrogen Screen zum ersten Mal Hinweise auf die antiöstrogene Wirkung von TCPP (MW: 6,86x10-5 M), Terbutryn (MW: 3,99x10-5 M), TDCPP (MW: 2,65x10-6 M) und TBP (MW: 2,28x10-5 M) aufgezeigt werden.TBP und TDCPP führen auch in der chronischen Exposition bei Potamopyrgus antipodarum zu einer Reduktion in der Embryonenzahl (mehrfach beobachtete NOEC beider Substanzen: 6,25 mg/kg), ein Effekt, der zunächst nicht von einer toxischen Wirkung unterschieden werden kann. Allerdings scheint sich ein antiöstrogener Wirkmechanismus auf die Schnecken bei den Versuchen zur Mischtoxizität zu bestätigen, da die gleichzeitige Exposition gegenüber BPA und 4-tOP zu einer geringfügigen Aufhebung des Effekts führt. Potamopyrgus reagiert ebenfalls mit einer Reduktion der Embryonenzahl bei der Exposition gegenüber AHTN (mehrfach beobachtete NOEC: 2 mg/kg), zeigt sich aber insensitiv gegenüber der Belastung mit Terbutryn.Die Exposition von Chironomus riparius gegenüber den verschiedenen Substanzen führt bis auf eine Ausnahme zu keinen signifikanten substanzbedingten Beeinträchtigungen. Einzig das s-Triazin Terbutryn verursacht eine hohe Mortalität mit einer NOEC (28 d) von 250 μg/kg. Eine Toxizität auf den Anneliden Lumbriculus variegatus zeigt sich lediglich bei derExposition gegenüber BPA (NOEC: 10 mg/kg; Biomasse, 28 d) und 4-NP (EC10: 6,88 mg/kg; 95% KI: 3,97-11,9; Reproduktion, 28 d). Die durchgeführten Versuche zur Toxizität von Mischungen zeigen eine größere Gefährdung auf als bei Vorliegen der Einzelsubstanzen in Konzentrationen unterhalb ihres Schwellenwertes zu vermuten wäre. Allerdings lassen sich die mit dem Hefe-Assay erzielten Ergebnisse aufgrund großer Variabilitäten zwischen den einzelnen Versuchswiederholungen nicht immer eindeutig mit Hilfe des additiven oder des unabhängigen Modells beschreiben, zeigen dabei jedoch trotzdem ein gegenüber den Einzelsubstanzergebnissen verändertes Risiko auf. Um diesem in der Risikobewertung Rechnung zu tragen, wird ein Verfahrensvorschlag entwickelt, in dem durch zusätzliche Sicherheitsfaktoren für PNECs ein Überschreiten des risikoanzeigenden Werts von 1 des PEC/PNEC-Quotienten einer Mischung verhindert werden kann.
In dem Entwurf einer European Strategy on Invasive Alien Species T-PVS (2002) 8 werden verstärkte Forschungsaktivitäten der Mitgliedstaaten angeregt, die nicht nur auf den biologischen Bereich oder Bekämpfung invasiver Arten beschränkt bleiben, sondern auch die Bewertung der Auswirkungen auf Gesundheitswesen und Volkswirtschaft untersuchen sollen. Derartige Studien wurden bisher nur für die Vereinigten Staaten von Amerika oder mit eher regionalen Charakter durchgeführt. Aus diesem Grunde wurden 20 Tiere und Pflanzen aus verschiedenen Problemgebieten (Gesundheitsgefährdende Arten, Schäden in Forst-, Land-, und Fischereiwirtschaft, im kommunalen Bereich, an aquatischen und terrestrischen Verkehrswegen sowie Kosten von Arten, die einheimische Spezies gefährden oder in der Empfehlung 77 der Berner Konvention aufgeführt sind) ausgewählt und beispielhaft für das Gebiet Deutschlands bearbeitet. Die entstehenden Kosten wurden in drei Kategorien aufgeschlüsselt: a) direkte ökonomische Schäden, beispielsweise durch Vorratsschädlinge, b) ökologische Schäden, verursacht durch Pflege und Schutz gefährdeter heimischer Arten, Biozönosen oder Ökosysteme und c) Kosten für Maßnahmen zur Bekämpfung invasiver Arten. Es zeigte sich, dass auf Grund der Datenlage sowie der unterschiedlichen Biologie und Ökologie der invasiven Arten jeweils individuelle Ansätze notwendig waren. Die hier ermittelten Kosten unterscheiden sich stark von Art zu Art. Nicht alle untersuchten Arten verursachen ökonomische Schäden. Eine differenzierte Betrachtung von Neobiota ist nach dem Prinzip der Einzelfallbewertung erforderlich. Die Monetisierung von ökologischen Schäden gelang hierbei nur in wenigen Fällen. Weitergehende, mehrjährige Studien sollten willingness to pay-Analysen einbeziehen, um offen gebliebene Fragen zu beantworten.
Ulrike Anders hat zwischen Januar und September 2005 Zähne und Gebiß rezenter Schleichkatzen (Viverridae) untersucht und Parameter identifiziert, anhand derer sich Nahrungspräferenzen zuordnen lassen. Viverriden gelten als basale Carnivoren mit omnivorem Nahrungsspektrum. Da die für echte Katzen so typische Brechschere und die Reduktion des Gebisses nur wenig ausgeprägt ist, gilt ihr Gebiss als unspezialisiert. Dennoch besitzen Viverriden Nahrungspräferenzen, die sich in der Umgestaltung ihres Gebisses, auch in einzelnen Zahnpositionen niederschlägt. Diese Veränderungen wurden metrisch charakterisiert.
Rolf van Dick und Holger Horz haben in ihrem UniReport-Essay »Bestmögliche Bildung und Ausbildung für alle« gefordert und die Kritik von Hans Peter Klein und Julian Nida-Rümelin am aktuellen Akademisierungswahn scharf zurückgewiesen. Nida-Rümelin und Klein antworten nun im Gespräch gemeinsam auf die zentralen Thesen von van Dick und Horz.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Vegetation der Savannenlandschaften der Sahelzone von Burkina Faso analysiert. Diese semiaride bis aride Region, die seit einigen Jahrzehnten von Landdegradation betroffen ist, ist als Untersuchungsgebiet u.a. deshalb besonders interessant, weil sie an einem Nutzungsübergang zwischen sesshafter Landwirtschaft und traditionell nomadischer Viehwirtschaft liegt. Im Vordergrund stand bei der Vegetationsanalyse ihre Klassifikation, die Frage nach der floristischen Struktur sowie dem aktuellen Zustand der Vegetation. Zu Beginn der Feldarbeiten wurde das Untersuchungsgebiet, das einen Niederschlagsgradienten von rund 200 mm umfasst, in geomorphologische Landschaftseinheiten (Inselberge, glacis, Niederungen, mares, Dünenzüge) stratifiziert. Innerhalb dieser Einheiten erfolgte die Vegetationsaufnahme mit Hilfe pflanzensoziologischer Aufnahmen. Die Arten der Gehölz- und Krautschicht wurden getrennt behandelt. Die Vegetationsaufnahmen wurden durch Strukturprofiltransekte in der brousse tigrée und Bodenuntersuchungen ergänzt. Auf verschiedenen Skalenebenen wurden die verschiedenen Vegetationsgesellschaften detailliert beschrieben und zu Standortfaktoren in Beziehung gesetzt. Außerdem wurden Vegetationsprofile zur Veranschaulichung der räumlichen Struktur der Vegetation abgeleitet. Bei der Analyse kamen auch computergestützte Methoden und statistische Verfahren (Tests der absichernden Statistik, Berechnung verschiedener Diversitätsindices, Ordinationsverfahren, numerische Klassifikation) zum Einsatz, um die Interpretation der Vegetationsstruktur zu unterstützen. Rund 320 Gefäßpflanzensippen aus 65 Familien konnten sicher bestimmt werden. Die artenreichste Familie sind die Poaceen. Insgesamt können 20 Gesellschaften der Gehölzschicht sowie 22 Gesellschaften der Krautschicht klassifiziert werden, die zur Mehrzahl weiter in Untereinheiten gegliedert sind. Innerhalb jeder Landschaftseinheit werden die Gesellschaften der Gehölzschicht, anschließend diejenigen der Krautschicht, vorgestellt. In der Regel sind sie in ihrer Verbreitung auf jeweils eine Landschaftseinheit beschränkt. Vor allem die Gesellschaften des glacis und der Niederungen besiedeln auch Habitate in Landschaftseinheiten außerhalb ihres Schwerpunktes. Daraus werden Schlüsse zum Ausbreitungsverhalten gezogen. In keinem Fall sind Einheiten der Krautschicht und der Gehölzschicht ausschließlich miteinander kombiniert; vielmehr sind Einheiten der Krautschicht jeweils mit mehreren Einheiten der Gehölzschicht kombiniert, was ihren selbständigen Charakter betont. Zehn Einheiten der Krautschicht sind überwiegend oder völlig gehölzfrei. Eine floristische Verwandtschaft besteht vor allem zwischen den Landschaftseinheiten glacis und Dünenzügen sowie zwischen mares, Niederungen und Dünenzügen; die Inselberge unterscheiden sich deutlich. Die Gehölzvegetation der Inselberge ist in Abhängigkeit von der menschlichen Nutzung in fünf Gesellschaften gegliedert. Während die Commiphora africana-Gesellschaft für wenig beeinflusste Bereiche typisch ist, hat die Combretum micranthum-Fragmentgesellschaft ihren Verbreitungsschwerpunkt in den intensiv genutzten Bereichen. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft ist an den Unterhängen vertreten. Die Krautschicht der Inselberge gliedert sich in sechs, relativ artenreiche Gesellschaften mit Untereinheiten. Sie stellen zum Teil lokale Besonderheiten dar. Das räumliche Muster der Einheiten der Brachiaria lata-Gesellschaft lässt eine Abhängigkeit von der Art der Beweidung erkennen. Die Vegetation der Sandrampen wird oftmals von Einheiten gebildet, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf den Dünenzügen haben. Die Gehölzvegetation des glacis ist in drei relativ artenarme Gesellschaften gegliedert, die in Abhängigkeit der Lage zum lokalen Vorfluter zoniert und auch über das Untersuchungsgebiet hinaus weit verbreitet sind. Weite Bereiche des glacis sind völlig gehölzfrei. Die häufigste Gesellschaft ist die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft. Die Ordination der Daten unterstützt die Klassifikation und zeigt Übergänge zwischen den Einheiten sowie Beziehungen zu den Standortparametern auf. Die Krautvegetation der glacis-Flächen ist relativ einheitlich; es gibt insgesamt nur zwei Gesellschaften. Der Anteil an Ruderalarten, Arten mit Pioniercharakter und solchen, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf Dünenzügen haben, ist relativ hoch. Bedeutendste Einheit ist die Tribulus terrestris-Untereinheit der Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft, die eine weite ökologische Amplitude besitzt. Vor allem zu den Krautgesellschaften der Niederungen bestehen enge floristische und räumliche Beziehungen. Die krautigen Arten des glacis haben eine weite ökologische Amplitude. Es bestehen floristische Beziehungen zu Vegetationseinheiten der Sahara. Die Vegetation der mares und Niederungen hat die höchste β-Diversität. Die Gehölzvegetation der Niederungen ist in Abhängigkeit der Überflutungsdauer und -höhe zoniert und relativ struktur- und artenreich. In Galeriewäldern kommen sudanische Gehölzarten vor. Während von Viehherden stark frequentierte mares niedrige Gehölzdeckungen aufweisen oder komplett gehölzfrei sind, ist die Gehölzdeckung an den Ufern nur schwach besuchter mares geschlossen. Dies gilt auch für die artenreiche Krautvegetation. Insgesamt ist die Gehölzvegetation der Niederungen und mares in acht Gesellschaften gegliedert; die einzelnen Einheiten zeigen Übergänge miteinander. Die Krautvegetation der Niederungen enthält ebenfalls sudanische Arten. Sie lässt sich in drei Gesellschaften gliedern, die z.T. nur ein kleines Verbreitungsgebiet haben. Einige Uferabschnitte sind stark degradiert und vegetationslos. Die oftmals röhrichtartige Krautvegetation der mares ist ebenfalls in Abhängigkeit der Überflutungshöhe gegliedert, allerdings kommen an den einzelnen mares teilweise unterschiedliche Einheiten vor. Die Melochia corchorifolia-Gesellschaft steht im Mittelpunkt der Krautvegetation der mares, während die Brachiaria mutica-Gesellschaft für die nicht oder nur wenig überfluteten Bereiche typisch ist. Die Gehölzvegetation der Dünenzüge lässt sich im Untersuchungsgebiet in neun Gesellschaften gliedern. Diese gruppieren sich in einem artenreichen Block wenig beeinflusster Bereiche und in einem relativ artenarmen Block intensiv genutzter Dünenabschnitte. Bestände, die zur Pterocarpus lucens-Gesellschaft gestellt werden, bilden auf abgelegenen Dünenzügen kleine Wäldchen. In diese Gesellschaft werden auch die Bestände der brousse tigrée eingegliedert. Es sind in der Region nur noch wenige Flächen mit intakter brousse tigrée vorhanden. Anhand von zwei Strukturprofiltransekten wird ihre floristische und räumliche Struktur mit vier Zonen veranschaulicht. Pterocarpus lucens und Combretum micranthum sind die beiden dominanten Gehölzarten. Im Untersuchungsgebiet ist die Combretum glutinosum-Zentralgesellschaft weit verbreitet. Durch zwei Ordinationsdiagramme wird der ökologische Schwerpunkt wichtiger Dünenarten aufgezeigt. Die numerische Klassifikation lässt sich gut mit der manuellen Klassifikation in Übereinstimmung bringen. Die Krautvegetation der Dünen ist in sieben Gesellschaften mit vielen, z.T. relativ artenarmen Untereinheiten gegliedert, deren ökologische Bindung aufgrund eines starken, nivellierenden Beweidungseinflusses nicht immer geklärt werden kann. Es dominieren annuelle Arten; viele der Arten kommen in anderer Artenkombination auch in der Sudanzone vor. Daneben zeigt sich eine floristische Verwandtschaft zur Sahara. Unter Bäumen wächst die Achyranthes aspera-Gesellschaft. Krauteinheiten, die in anderen Landschaftseinheiten ihren Verbreitungsschwerpunkt haben, sind auf den Dünenzügen ebenfalls vorhanden, z.B. die Enteropogon prieurii-Gesellschaft der Inselberge und die Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft des glacis. Es ist keine floristische Differenzierung entlang des Niederschlagsgradienten erkennbar. Hirsefelder sind mit Kulturbaumparks bestanden. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft gewinnt auch auf den Dünenzügen an Bedeutung. Die Ergebnisse werden in Beziehung zu den in der Literatur vorhandenen, oftmals auf formationskundlichen Kriterien beruhenden Klassifikationen in Beziehung gesetzt. Je nach verwendetem Verfahren und Distanzmaß liefert die numerische Klassifikation unterschiedliche Ergebnisse, die sich nur zum Teil mit der Klassifikation in Deckung bringen lassen. Durch die Betrachtung der aktuellen Verjüngung, aus den Ergebnissen und ihrer Diskussion werden Aussagen über die aktuelle Vegetationsdynamik abgeleitet. Aktuelle Strukturveränderungen der Vegetation sind mit einem Landnutzungswandel verbunden. In erster Linie handelt es sich um Degradation, für die Beispiele auch aus der Literatur gegeben werden. Auf den Inselbergen gehen artenreiche Bestände zurück, gleichzeitig wandern Arten von den glacis-Flächen her ein. Auf dem glacis sind einerseits eine Artenverarmung, andererseits eine Verbuschung tiefliegender Bereiche sowie eine floristische Homogenisierung vieler Flächen zu beobachten, letzteres gilt auch für die Dünenzüge. An den mares und Niederungen findet ebenfalls eine floristische Verarmung statt, sudanische Arten sterben wie auch auf den Dünenzügen aus. Klimaungunst und vor allem Überbeweidung als mögliche Ursachen für den Vegetationswandel werden diskutiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre Verteilung der beiden Ekto-Nukleotidasen TNAP (gewebeunspezifische Form der alkalischen Phosphatase) und NTPDase2 (Nukleosidtriphosphatdiphosphohydrolase) in den embryonalen, postnatalen und adulten neurogenen Zonen des Mäusehirns untersucht.
• Mittels enzym- und immunhistochemischer Markierungen wurde die TNAP erstmals auf den Zellen der SVZ (subventrikuläre Zone) und des RMS (rostraler Migrationsstrom) nachgewiesen.
• Immunhistochemische Doppelfärbungen von Gewebeschnitten und von akut isolierten Zellen aus der SVZ adulter und postnataler (P15) Mäuse zeigten, dass die TNAP von allen drei Typen neuronaler Vorläuferzellen (Typ B-, C- und A-Zellen) der SVZ exprimiert wird.
• Enzymatische Markierungen verschiedener Embryonal- und Postnatalstadien (ab Embryonalstadium14, E14) ergaben, dass die TNAP schon im Stadium E 14 im Bereich der Seitenventrikel exprimiert wird:
o In den frühen Embryonalstadien lag die TNAP über die gesamte Gewebedicke, von der ventrikulären bis zur pialen Oberfläche vor.
o Im Laufe der weiteren Entwicklung war eine im Kortex beginnende und sich später bis in das Striatum ausweitende Reduktion der TNAP-Aktivität zu beobachten. Mit zunehmender Reifung des Gehirns wurde die Schicht der TNAP-positiven Zellen dünner und beschränkte sich schließlich auf die SVZ.
• Die NTPDase2 war erst im Zeitraum zwischen E18 und P2 nachweisbar. Sie war im Bereich der Seitenventrikel lokalisiert und auf die an die Ventrikel angrenzenden Zellen beschränkt. Im Laufe der weiteren Entwicklung wandern die NTPDase2-positiven Zellen offensichtlich in die SVZ ein und ab P14 waren sie zu hüllartigen Strukturen angeordnet, die eine Doppelmarkierung für TNAP und NTPDase2 aufwiesen und Gruppen DCX-positiver Zellen (Typ-A Zellen, Neuroblasten) umschlossen.
• Die Markierung mit dem Neuroblastenmarker DCX war bereits zum Stadium E14 möglich. In diesem Altersstadium wurden lediglich die Zellen im Bereich des Kortex gefärbt. Im Laufe der postnatalen Entwicklung verlagerten sich die DCX-positiven Zellen ihren Schwerpunkt in den Bereich der SVZ. Bereits ab P10 lagen in der SVZ Gruppen von DCX/TNAP-doppelpositiven Zellen vor, Anzeichen für eine Konzentrierung der Neurogenese auf die SVZ.
• Die Ausschaltung des TNAP-Gens (TNAP-Knockout-Mäuse) hatte keinen offensichtlichen Einfluss auf die Ausbildung der Seitenventrikel oder die Ausbildung und zelluläre Zusammensetzung der SVZ.
• In der zweiten wesentlichen neurogenen Zone des Säugerhirns, dem Gyrus dentatus des Hippokampus, konnte die TNAP nicht nachgewiesen werden, obwohl die dortigen Vorläuferzellen NTPDase2 exprimieren.
Die vorliegenden Daten belegen erstmals eine Assoziation der TNAP mit neuronalen Vorläuferzellen und erlauben zusammen mit den Markierungen für NTPDase2 und weitere zelluläre Marker neue Einsichten in die zelluläre Entwicklung der adulten SVZ. Darüber hinaus stützen sie die Vorstellung einer Beteilung purinerger Signalwege an der Steuerung der embryonalen, postnatalen und adulten Neurogenese.
Traditionell-morphologisch begründete Hypothesen zur Großphylogenie der Metazoa sind im Verlauf der letzten Jahre durch molekularbiologische Untersuchungen grundsätzlich in Frage gestellt worden. Die molekularbiologisch begründete Metazoen-Großphylogenie wird seit einem Übersichtsartikel von ADOUTTE et al. (2000) meist als „New Animal Phylogeny“ bezeichnet (kurz: NAP); sie beinhaltet eine Restrukturierung des Stammbaumes (kladogenetischer Aspekt) und die Infragestellung einer morphologischen Komplexitätssteigerung nach dem Schema acoelomat-pseudocoelomat-coelomat (anagenetischer Aspekt). Hinsichtlich der Kladogenese steht die Neueinteilung der Bilateria in drei Superphyla Deuterostomia, Ecdysozoa und Lophotrochozoa im Vordergrund; die Genealogie innerhalb dieser drei Großgruppen ist aber z.Z. relativ schlecht aufgelöst, so daß sich Vergleichsmöglichkeiten mit morphologischen Vorgängermodellen schnell erschöpfen. Aus diesem Grunde wird in vorliegender Arbeit der anagenetische Aspekt als Ausgangspunkt für eine umfassende morphologische Interpretation der molekularbiologischen Resultate gewählt. Momentan wird auf molekularsystematischer und vergleichend-entwicklungsgenetischer Basis davon ausgegangen, daß die frühesten Bilaterier eine acoelomate Organisation aufwiesen, von hier aus eine relativ komplexe, polymer-coelomate Organisation erwarben, welche dann aber in zahlreichen Bilaterierlinien sekundär reduziert wurde. Die ursprünglich acoelomate Organisation wird rezent nur durch eine sehr isolierte Linie, die Acoela (ggf. auch Nemertodermatida) vertreten, während alle anderen Bilaterier von einem polymer-coelomaten „Urbilaterier“ abstammen sollen. In vorliegender Arbeit wird die Auffassung vertreten, daß die morphologische Deutung eines solchen anagenetischen Szenarios am ehesten anhand der Hydroskelett-Theorie von W. F. GUTMANN (1972 et mult.), sowie späteren auf diesem Entwurf aufbauenden Arbeiten (insbesondere der Gallertoid-Hypothese, BONIK et al. 1976) möglich ist, d.h. auf konstruktionsmorphologischer Grundlage. Um den Nachweis einer weitgehenden Übereinstimmung von NAP und Gallertoid-Hydroskelett-Theorie zu führen, werden für 36 Metazoenbaupläne (4 Nonbilaterier, 32 Bilaterier) aktuelle molekularphylogenetische Befunde den jeweiligen konstruktionsmorphologischen Interpretationen gegenübergestellt. Für die vier Nonbilateria-Linien ergibt sich eine Vereinbarkeit auf kladogenetischer Ebene insbesondere dann, wenn die Placozoa vor den Porifera abzweigen (z.Z. aufgrund von mtDNADaten anzunehmen); auf anagenetischer Ebene aufgrund von Studien, welche die „Diploblastica/ Triploblastica“-Unterteilung in Frage stellen (Mesoderm-Problem). Für die Bilateria ist u.a. festzuhalten, daß im Rahmen der Hydroskelett-Theorie kein Schwestergruppenverhältnis Annelida + Arthropoda angenommen wurde, so daß die umstrittene neue Großgruppe Ecdysozoa unproblematisch ist: Ecdysozoa werden durch Ableitung der „Aschelminthen“ von polymeren Vorformen einer Deutung zugänglich. Die Molekularsystematik der Annelida, aber auch der Deuterostomia ist mit konstruktionsmorphologischen Interpretationen vereinbar, bei den Deuterostomia v.a. der hochderivierte Status der Pterobranchia und Tunicata. Als kennzeichnendste Übereinstimmung ist die Einordnung der Tentaculata als hochabgeleitete Protostomier hervorzuheben, was sowohl als „Grundstein“ der NAP gilt (HALANYCH et al. 1995) als auch eine sehr spezifische Position der Hydroskelett-Theorie darstellt. Es wird gefolgert, daß die Gallertoid- Hydroskelett-Theorie zentrale Resultate der NAP besser zu integrieren vermag als andere Entwürfe. Konsequenzen für merkmalsmorphologische Deutungen werden aufgezeigt.
Die im Mittelhirn lokalisierten dopaminergen (DA) Neurone sind in einer Vielzahl von Hirnfunktionen involviert und werden aufgrund von anatomischen, molekularen sowie funktionellen Unterschieden in mehrere Subpopulationen aufgeteilt. DA Neurone, die in der Substantia nigra (SN) pars compacta lokalisiert sind, spielen durch ihre Projektion in das dorsale Striatum eine Rolle in der Steuerung der Willkürmotorik. Die Area tegmentalis ventralis (VTA) enthält DA Neurone, die in den präfrontalen Cortex, die basolateralen Amygdala sowie den Nucleus accumbens projizieren und in höheren kognitiven Funktionen, wie dem Arbeitsgedächtnis, der Motivation sowie belohnungsassoziierten Lernvorgängen involviert sind.
In dieser Arbeit wurden die differentiellen Eigenschaften des transienten A-Typ Kaliumstroms sowie dessen Funktion für die intrinsische elektrische Aktivität und die Integration von synaptischen Eingängen in Subpopulationen von DA Neuronen untersucht. Dieser spannungsgesteuerte Strom ist an der Kontrolle der Schrittmacheraktivität beteiligt, beeinflusst die Form und Dauer von Aktionspotentialen und moduliert die Erregbarkeit des somatodendritischen Kompartiments. Der A-Typ Kaliumkanal besteht in DA Neuronen aus einem Tetramer von porenbildenden KV4.3 α-Untereinheiten. Die Koexpression von akzessorischen β-Untereinheiten moduliert maßgeblich die biophysikalischen Parameter des A-Stroms, wie z. B. die Kinetik der Inaktivierung sowie die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung und Inaktivierung. Zu diesen β-Untereinheiten gehören die cytoplasmatischen Kaliumkanal-interagierenden Proteine (KChIPs) sowie die transmembranären Dipeptidylpeptidase-ähnlichen Proteine (DPPLs). Während in DA SN Neuronen vor allem KChIP3 exprimiert wird und einen schnell inaktivierenden A-Strom gewährleistet, sind DA VTA Neurone durch die zusätzliche Expression der KChIP4a Splice-Variante charakterisiert, welche durch Inhibition der schnellen Inaktivierung in einem langsam inaktivierenden A-Strom resultiert. Die Bedeutung der differentiellen KChIP4a-Expression für DA Mittelhirnneurone wurde mit Hilfe von KChIP4-Knock-Out (KO)-Mäusen untersucht. Alle Versuche wurden in vitro an akuten Hirnschnitten adulter Wildtyp (WT)- und KChIP4-KO-Tiere durchgeführt und die DA neurochemische Identität sowie die Lage der gemessenen Zellen im Anschluss immunhistochemisch bestätigt. Die biophysikalischen Eigenschaften des A-Stroms wurden mit der Patch-Clamp Technik in der nucleated outside-out Konfiguration untersucht, welche optimale Bedingungen für Voltage-Clamp Experimente gewährleistet. Der A-Strom in DA VTA Neuronen aus KChIP4-KO-Tieren wies dabei eine siebenfach schnellere Inaktivierungskinetik als in vergleichbaren Neuronen aus WT-Tieren auf, während die Inaktivierungskinetik in DA SN Neuronen aus KChIP4-KO-Tieren lediglich um den Faktor zwei schneller war. Außerdem wurde festgestellt, dass selektiv in DA VTA Neuronen das halbmaximale Aktivierungspotential ebenfalls von der KChIP4-Expression abhängig war. Somit konnte gezeigt werden, dass die Expression von KChIP4 für die charakteristischen A-Strom-Eigenschaften von DA VTA Neuronen verantwortlich ist.
Die funktionelle Rolle des KChIP4-vermittelten langsamen A-Stroms wurde mit Hilfe von Current-Clamp Messungen in Ganzzellableitungen untersucht. Dabei wurde deutlich, dass die Expression von KChIP4 die Spontanaktivität von DA SN und VTA Neuronen nicht beeinflusst. Das für DA VTA Neuronen charakteristische verzögerte Wiedereintreten der Spontanaktivität nach einer Inhibition zeigte allerdings eine Abhängigkeit von der KChIP4-Expression, da der sog. rebound delay in DA VTA Neuronen aus KChIP4-KO-Tieren signifikant kürzer war, als in Zellen aus WT-Tieren. Dies konnte sowohl durch Strominjektionen, die in ihrer Kinetik GABAergen synaptischen Eingängen ähnelten, als auch nach direkter Aktivierung von GABA-Rezeptoren durch iontophoretische GABA-Applikation bestätigt werden. KChIP4 könnte somit einen internen Verzögerungsmechanismus nach einer transienten Inhibition von DA Neuronen gewährleisten, die z.B. bei Präsentation von aversiven Stimuli sowie beim Ausbleiben von erwarteten Belohnungen auftritt. Somit könnte die physiologische Relevanz des KChIP4-gesteuerten A-Stroms in der Integration von inhibitorischen synaptischen Eingängen im Kontext von belohnungsgesteuerten Lernprozessen liegen.
Holzkohlen aus archäologischen Grabungen im Sahel von Burkina Faso belegen die regionale Geschichte der Gehölzvegetation über die letzten 2000 Jahre. Der Bodenbau, den die sesshaft lebende Bevölkerung seit Beginn unserer Zeitrechnung intensiv betreibt, veränderte die Zusammensetzung der Gehölzvegetation vor allem auf den Dünen der Region. Im Vergleich mit der heutigen Vegetation lassen sich zudem klimatische Veränderungen nachweisen. Untersucht wurden über 9000 Fragmente aus sieben verschiedenen archäologischen Grabungen. Sechs Inventare stammen aus Siedlungshügeln. Bei einem Fundplatz handelt es sich um einen Hausgrundriss. Insgesamt wurden 37 Holzkohletypen erkannt und dokumentiert. Die untersuchten Inventare der Siedlungshügel zeigen, dass vor allem die Gehölzvegetation der Dünen und der Galeriewälder zur Brennholzentnahme genutzt wurde. Je nach Lage der Siedlung und dem Schwerpunkt der Wirtschaftsweise können verschiedene Taxa mit höheren Anteilen vertreten sein, möglicherweise zusätzlich verstärkt durch die anthropogene Auswahl von verfügbarem Brennholz. Im Vergleich der Holzkohleinventare lassen sich für die Eisenzeit regionale Entwicklungen erkennen. Die natürlichen Gehölzbestände auf den Dünen, unter anderem aus verschiedenen Akazienarten, wurden, zumindest in der Umgebung der Siedlungen, verdrängt. Stattdessen nahmen aufgrund der selektiven Förderung durch den Menschen die Anteile der Gehölze der Kulturbaumparks, Vitellaria paradoxa und Faidherbia albida zu. Die Landwechselwirtschaft förderte zudem Brachearten insbesondere aus der Familie der Combretaceae. In der späten Eisenzeit nahm Guiera senegalensis zu, die von starker Beweidung der Brachen profitiert. Der Unterwuchs der Galeriewälder an den mares und Wasserläufen wurde mit zunehmender Besiedlungsdauer in der Umgebung der einzelnen Fundplätze aufgelichtet, die Anteile von Combretum micranthum gehen in den Inventaren der einzelnen Siedlungsplätzen jeweils zurück. Klima und Vegetation waren während der Eisenzeit sudano-sahelisch. Auf feuchteres Klima verweisen Vitellaria paradoxa und Detarium microcarpum, die deutlich höhere Niederschläge benötigen, als sie die Region heute erhält. Der hohe Anteil von Taxa, die heute weiter südlich verbreitet sind, belegt zudem den sudanischen Aspekt der Gehölzvegetation. Der Vergleich der anthrakologischen mit den palynologischen und karpologischen Ergebnissen zeigt, dass die Gehölzvegetation sich unter zunehmend arideren Bedingungen in den letzen 2000 Jahren anthropozoogen stark verändert hat. Das Klima scheint aber während der Eisenzeit von 0-1500 AD vergleichsweise stabil gewesen zu sein. Erst danach haben die Niederschläge sich soweit verringert, dass in den letzten 500 Jahren einige sudanische Taxa aus der Region verschwanden, die noch während der Eisenzeit zur regionalen Flora gehört hatten, zum Beispiel Vitellaria paradoxa, Detarium microcarpum und Lannea sp. Der Vergleich der eisenzeitlichen Holzkohleflora mit der rezenten Dynamik der Vegetation und mit der Verbreitung einiger Arten um die Mitte des 20. Jahrhunderts zeigt, dass einige Taxa, wie Terminalia sp. möglicherweise erst in den letzten fünfzig Jahren aus der Region verschwunden sind.
Zottelige Landschaftspfleger
(2013)
Protease-aktivierbare Retroviren bieten die Möglichkeit des gezielten Gentransfers in solche Tumorzellen, die an der Zelloberfläche proteolytisch aktive Proteasen, wie beispielsweise Matrix Metalloproteasen (MMP), exprimieren. Hierfür wird zunächst der Zelleintritt der Retroviren durch eine mit den Hüllproteinen fusionierte Blockierungsdomäne verhindert. Zwischen dieser Blockierungsdomäne und dem Hüllprotein befindet sich ein für eine zelluläre Protease fungierender Substratlinker, worüber die Blockierung entfernt und der natürliche Infektionsmechanismus der Retroviren wieder hergestellt wird. In Bezug auf die Tumortherapie mittels eines solchen Gentransfers ist es jedoch unmöglich vorherzusagen, welches Protease- Substrat für einen bestimmten Tumortyp am besten geeignet ist. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit retrovirale Protease-Substrat-Bibliotheken entwickelt, um erstmalig die Substrate der tumorassoziierten MMPs in lebenden Tumorzellen zu selektionieren und damit verbunden MMP-aktivierbare Retroviren mit verbesserten molekularen Eigenschaften für den gezielten Gentransfer zu evolvieren. Hiefür wurden, ausgehend von einem Protease-aktivierbaren Retrovirus, welches als Substratlinker das MMP-Standardsubstrat P-L-G-L-W-A präsentiert, Retroviren erzeugt, in denen dieses Substrat kombinatorisch diversifiziert wurde. In einer ersten retroviralen Protease-Substrat-Bibliothek wurde zunächst an drei Stellen zu P-X-G-L-X-X unter Ausschluss der Aminosäure Arginin diversifiziert, um die Selektion durch Proprotein-Konvertasen wie Furin zu vermeiden. Anschließend erfolgte die Selektion der Virus-Bibliothek in der Modell-Tumorzelllinie HT1080, wofür hier das entsprechende Protokoll etabliert wurde. Die Substratlinker der am häufigsten selektionierten Retroviren enthielten die beiden Konsensusmotive P-QG- L-Y-[Q/K] und P-Q-G-L-Y-[A/S]. Zur Identifizierung der optimalen Aminosäuren an allen sechs Positionen des Substrates wurden in einer zweiten Bibliothek die variierten Positionen auf Grundlage der selektionierten Konsensusmotive fixiert und die zuvor konstanten Positionen zu X-Q-X-X-Y-[Q/A] diversifiziert. Die aus dieser Bibliothek selektionierten Retroviren enthielten das Konsensusmotiv P-Q-G-[L/I/V]-Y-[Q/A], womit die zuvor selektionierten MMP-aktivierbaren Retroviren bestätigt wurden. Die biochemische Charakterisierung von mit den selektionierten Substratlinkern rekonstituierten Retroviren zeigte, dass ihre Substratlinker eine bemerkenswerte Verbesserung der Spaltung durch MMP-2 und eine erhöhte Inkorporation der dazugehörigen Hüllproteine in die Partikel aufwiesen. Außerdem ermöglichten die selektionierten Substratlinker den entsprechenden Retroviren sich schneller innerhalb der Zellpopulation auszubreiten, ohne dabei die Abhängigkeit von der MMP-Aktivierung zu verlieren. Darüber hinaus konnte sowohl die Kinetik des Zelleintritts bis zu 10-fach als auch die Infektiosität bis zu 1000-fach gegenüber dem parentalen Virus, das den Standard-Substratlinker trug, gesteigert werden. Letztendlich waren hierfür nur zwei selektionierte Aminosäureaustausche gegenüber dem MMP-Standardsubstrat verantwortlich, nämlich Glutamin (Q) und Tyrosin (Y), die zu dem Motiv P-Q-G-L-Y-A führten. Ausschlaggebend für die beschriebenen Selektionen waren die mehrfache Abdeckung der kombinatorischen Vielfalt der Substratlinker auf Partikel-Ebene bereits vor Selektion sowie die langsame Erhöhung des angelegten Selektionsdrucks während der Selektion. Dadurch konnte eine Deletion des kodierenden Bereichs der Blockierungsdomäne (EGF) im Virusgenom vermieden werden. Als treibende Kraft der Selektion stellte sich die proteolytische Aktivierung der selektionierten Retroviren an der Zelloberfläche heraus. Die Ergebnissen führen schließlich zu einem Modell der MMP-Aktivierung EGF-blockierter Retroviren. Danach binden die Partikel an die EGF-Rezeptoren der Zelloberfläche und gelangen so in die räumliche Nähe des MMP-Aktivierungskomplexes. Daraufhin werden sie proteolytisch aktiviert und infizieren die Zielzellen. Die hier selektionierten Substratlinker bzw. die entsprechenden Viren sind in Bezug auf die proteolytische Aktivierung optimal an die gewählte Tumorzelllinie angepasst.
Der tägliche und jahreszeitliche Wechsel in den Lichtverhältnissen bedeutet für alle Lebewesen eine regelmäßige und fundamentale Veränderung ihrer Lebensbedingungen. Mit Hilfe einer Inneren Uhr können Lebewesen regelmäßige Veränderungen ihrer Umwelt antizipieren. Diese Innere Uhr gewährleistet die Generierung eines endogenen, zirkadianen Rhythmus und dessen Synchronisation mit der Umwelt. Bei Wirbeltieren werden diese Funktionen durch einen spezifischen neuronalen Schaltkreis im Gehirn, dem photoneuroendokrinen System (PNS), erfüllt. Das Pinealorgan ist ein essenzieller Bestandteil des PNS. Dort werden photoperiodische Reize und Signale vom endogenen Oszillator in die Synthese des Neurohormons Melatonin umgesetzt. Die vom zentralen Oszillator im SCN gesteuerte Freisetzung von Noradrenalin (NA) aus sympathischen-postganglionären Nervenfasern in das Pinealorgan ist der entscheidende Reiz zur nächtlichen Ankurbelung der Melatoninbiosynthese. Melatonin wird ausschließlich in der Nacht gebildet und fungiert daher als ein Zeithormon. Unmittelbar nach der Synthese wird das Melatonin in die Blutbahn abgegeben und liefert allen Zellen, die mit spezifischen Melatoninrezeptoren ausgestattet sind, die entsprechenden Licht- und Zeitinformationen. NA bewirkt in allen untersuchten Säugetierarten die Aktivierung des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT. Die zellulären und molekularen Regulationsmechanismen für die AANAT unterscheiden sich jedoch artspezifisch. So ruft NA in Pinealozyten der Ratte die cAMP/PKA/pCREB-vermittelte Aktivierung der Transkription des Aanat Gens hervor, wogegen in Pinealozyten des Rindes NA die Regulation der proteasomalen Proteolyse des AANAT Proteins kontrolliert. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, zelluläre und molekulare Mechanismen der noradrenergen Signaltransduktionskaskade zu identifizieren, welche für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan von Säugetieren verantwortlich sind. Deshalb wurden in kultivierten Pinealozyten der Ratte und des Rindes sowohl transkriptionale als auch posttranslationale Regulationsmechanismen untersucht, welche durch NA gesteuert und an der Regulation des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT, beteiligt sind. Mit Hilfe der Immunzytochemie konnte erstmalig das subzelluläre Verteilungsmuster sämtlicher bekannter regulatorischer (R)-Untereinheiten der PKA Typ I und II in Pinealozyten der Ratte nachgewiesen werden. Ebenso wurden die A Kinase Anker Proteine (AKAP) 95 und 150 immunzytochemisch dargestellt, wobei zwischen der AKAP 150-Immunreaktivität (IR) und der IR von RII alpha bzw. RII beta eine weitgehende Kolokalisation in der Nähe der Zellmembran der Pinealozyten vorlag. Diese Kolokalisationen deuten eine funktionelle Interaktion der PKA Typ II mit AKAP 150 in Pinealozyten der Ratte an. Keine Funktion bei der Steuerung der Melatoninbiosynthese scheinen der cAMPregulierte Austauschfaktor EPAC und die monomere GTPase Rap zu besitzen. So konnte eine Stimulation kultivierter Pinealorgane mit 8-CPT-2'-O-Me-cAMP, einem EPAC-spezifischen cAMP-Analog, einzeln oder in Kombination mit Noradrenalin (NA) weder den AANAT Proteingehalt noch die Freisetzung von Melatonin beeinflussen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass die cAMP-vermittelte Aktivierung der Melatoninbiosynthese ausschließlich auf die PKA zurückzuführen ist. Ebenso beeinflussten weder NA noch 8- CPT-2'-O-Me-cAMP den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2. Eine Erhöhung des cAMP-Spiegels in Pinealozyten der Ratte scheint somit keinen Einfluss auf den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2 im Pinealorgan der Ratte auszuüben. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die schnelle Dephoshorylierung von pCREB eine entscheidende Funktion bei der akuten Herabregulation des CRE-tragenden Aanat Gens darstellt und somit eine wichtige Rolle für die Beendigung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte spielt. Nach Entzug des NA-Stimulus kam es innerhalb von 30 Minuten zu einer fast vollständigen pCREB Dephosphorylierung, die mit einer Abnahme der Aanat mRNA, des AANAT Proteingehalts und der Melatoninbiosynthese einherging. Die pCREB Dephosphorylierung und die Abnahme der Melatoninbiosynthese konnten durch PSP-Inhibitoren verhindert werden. Aufgrund der pharmakologischen Untersuchungen und des intrazellulären Verteilungsmusters scheint die PSP 1 die pCREB Dephosphorylierung im Zellkern der Rattenpinealozyten zu steuern. Mit Hilfe eines Ko-Immunpräzipitationsansatzes wurde erstmalig eine NA-abhängige Komplexbildung von AANAT und Protein 14-3-3 in Pinealozyten der Ratte und des Rindes dargestellt. Die vorliegenden Untersuchungen belegen somit, dass Tierarten, welche generell eine unterschiedliche molekulare Strategie zur Regulation der Melatoninbiosynthese entwickelt haben, mit der NA-abhängigen Ausbildung des AANAT/Protein 14-3-3 Komplexes jedoch einen gemeinsamen Mechanismus zur Regulation des AANAT Proteins besitzen. Ferner wurde die funktionelle Bedeutung des Cannabinoidsystems für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte untersucht. Mit Hilfe der Immunhistochemie und des Immunoblotverfahrens konnten erstmalig CB 1- und 2 Rezeptorproteine im Pinealorgan der Ratte dargestellt werden. Die Stimulation kultivierter Pinealorgane der Ratte mit THC hatte keinen Einfluss auf den pCREB- und AANAT Proteingehalt, konnte jedoch die NA-induzierte Aktivierung des AANAT Proteins und die Melatoninfreisetzung hemmen. Das Pinealorgan der Ratte und des Rindes dient als ein gut geeignetes Modellsystem zum Studium von Signalskaskaden, da hier Noradrenalinreize in ein definiertes, einfach messbares Endprodukt, die Biosynthese und Sekretion des Neurohormons Melatonin, umgewandelt werden. Die in dieser Arbeit aufgedeckten Signaltransduktionsprozesse liefern daher nicht nur neue Einblicke in die Regulationsprozesse der Melatoninbiosynthese, sondern dienen ebenso dem besseren Verständnis von Signalübertragungs- und Signalverarbeitungsprozessen in komplexeren neuronalen und neuroendokrinen Systemen.
Das Ziel dieser Dissertation war es die biologische Rolle der Ubiquitinierung und die Bedeutung für Alterungsprozesse im filamentösen Ascomyceten Podospora anserina zu untersuchen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:
1. Ubiquitinierte Proteine wurden nachgewiesen und die Deubiquitinierung von Proteinen konnte durch den Einsatz der Inhibitoren Urea, PR-619 und PIC erfolgreich inhibiert werden, was die Anwesenheit aktiver Deubiquitinasen in P. anserina beweist. Zudem wurden erstmalig ubiquitinierte Proteine in P. anserina unter den zur Aufreinigung
gewählten Bedingungen über die Technik der LC-MS/MS identifiziert.
2. Insgesamt wurden 1745 ubiquitinierte Proteine in P. anserina identifiziert, was ca. 16,4 % des gesamten Proteoms darstellt. Somit wurde erstmalig das Ubiquitinom des Ascomyceten P. anserina charakterisiert, welches Proteine aus allen zellulären Kompartimenten enthält.
3. Die erste im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte umfassende Studie altersabhängiger Veränderungen im Ubiquitinom eines Organismus zeigt eine Herabregulation der Ubiquitinierung im Alter in der gesamten Zelle. Dem gegenüber steigt die Ubiquitinierung an den Mitochondrien leicht an und unterstreicht die Rolle einer mitochondrialen Qualitätskontrolle durch diesen Prozess.
4. Die Untersuchung der am Ubiquitinierungsprozess beteiligten E3-Ligase PaMUS10 zeigt, dass es sich bei Mus10 um ein essentielles Gen in P. anserina handelt, da die Deletion zu starken mitochondrialen Beeinträchtigungen und dem sofortigen Absterben des Organismus direkt nach der Keimung führt.
5. Zur weiteren Untersuchung von PaMus10 wurde erstmalig und vollständig ein Hygromycin-basiertes „Knockdown“-System in P. anserina etabliert, was die detaillierte Untersuchung eines essentiellen Gens in diesem Organismus ermöglichte. Durch dessen Einsatz konnte eine reduzierte Fertilität, eine verkürzte Lebensspanne sowie Veränderungen der mitochondrialen Morphologie und Funktion als direkte Folge einer PaMus10-Herabregulation nachgewiesen werden.
6. PaMUS10 ist vorwiegend cytosolisch lokalisiert wird aber unter oxidativem Stress oder in gealterten Kulturen an die Mitochondrien rekrutiert, was einen vergleichbaren Mechanismus zur menschlichen E3-Ligase PARKIN darstellt.
7. Der Verlust von PaMUS10 verursacht ein Präseneszenzsyndrom und führt zum vorzeitigen Absterben des Organismus, wohingegen die zusätzliche Expression von PaMus10::Gfp offenbar positive Effekte nach sich zieht, da hier eine deutliche Verlängerung der Lebensspanne beobachtet wurde.
8. Der Vergleich der beiden Ubiquitinome von ∆PaMus10/PaMus10 und Wthph1/2 zeigt eine massive Reduzierung der globalen Ubiquitinierung, welche offenbar durch das Fehlen von PaMUS10 ausgelöst wird und damit dessen Funktion als E3-Ligase untermauert.
9. Im Rahmen der hier durchgeführten Substratanalyse wurden insgesamt 131 Proteine identifiziert, von denen ca. 20 % dem Mitochondrium zugeordnet werden können. Aufgrund der diversen biologischen Prozesse und Funktionen dieser Substrate ist PaMUS10 sowohl in die Ubiquitinierung cytosolischer als auch mitochondrialer Proteine involviert und greift womöglich sogar als zentraler Schalter in die gesamte zelluläre Homöostase ein.
Aufgrund der nicht unerheblichen Zahl der identifizierten ubiquitinierten Proteine (Ubiquitinom) und den fatalen Auswirkungen, die der Verlust einer E3-Ligase in diesem Organismus nach sich zieht, lässt sich folgende grundlegende Erkenntnis formulieren:
Die Ubiquitinierung spielt in P. anserina eine bedeutende Rolle zur Aufrechterhaltung zellulärer Prozesse insbesondere der mitochondrialen Homöostase und beeinflusst dadurch positiv die Entwicklung und Alterung in diesem Organismus.
"Stellen Sie sich vor, wir könnten einzelne Zellen mit einer Art Fernbedienung von außen steuern", träumt Ralph Wieneke, Juniorgruppenleiter in der Zellulären Biochemie. Licht als Steuerungsquelle habe entscheidende Vorteile, schildert Institutsleiter Robert Tampé: "Es schadet Zellen nicht und kann schnell und sehr genau reguliert werden." Von ihrem Ziel ist die Arbeitsgruppe gar nicht so weit entfernt.
Neuere Daten weisen p53 eine wichtige Rolle in der Verarbeitung von Mangelsignalen zu und deuten darauf hin, dass p53-abhängige molekulare Mediatoren des Warburg-Effektes Glukoseverbrauch und mitochondriale Funktion regulieren. Wir stellten deshalb die Hypothese auf, dass p53-wildtyp (p53wt) in Gliomzellen den metabolischen Bedarf reduzieren kann, der durch deregulierte Signaltransduktionsprozessen unter Mangelbedingungen zu Stande kommt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die shRNA-vermittelte p53-Gensuppression als auch die Temperatur-sensitive dominant-negative p53V135A Mutante in humanen p53wt-Gliomzellen Glukoseverbrauch und Laktatproduktion erhöht, den Sauerstoffverbrauch reduziert und den Hypoxie-induzierten Zelltod steigert. Überdies konnte beobachtet werden, dass eine zelluläre p53-Suppression die Expression von Synthesis of Cytochrome c Oxidase 2 (SCO2), eines Effektors, der in der Atmungskette benötigt wird, reprimiert. Die Restoration von SCO2 in p53wt-defizient-Zellen konnte Glukoseverbrauch, Laktatproduktion und Sauerstoffverbrauch wieder normalisieren, und vermittelte zugleich eine Resistenz gegenüber Hypoxie von Rotenone, einem Inhibitor des Komplex I der Atmungskette, abhängige Weise. Dies zeigte, dass die SCO2-vermittelten Effekte von einer intakten oxidativen Phosphorylierung abhängig waren. Schließlich vermittelte eine Gensuppression von SCO2 in p53wt-Gliomzellen eine Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber moderater Hypoxie. Es konnte auch gezeigt werden, dass p53 und HIF-1alpha miteinander kooperieren, um SCO2 unter Hypoxie zu induzieren, was suggeriert, dass i) SCO2 ein neues HIF-1alpha Zielgen sein könnte und ii) SCO2 ein neues Zielprotein darstellen könnte, um Atmung und ROS-Prävention über HIF-alpha zu modulieren. Diese Befunde deuten darauf hin, dass Gliomzellen einen Nutzen aus dem Aufrechterhalten eines p53wt-Status erzielen können, da dies ihre Vulnerabilität gegenüber moderater Tumor-Hypoxie reduzieren kann, und dass dieser Effekt SCO2-vermittelt ist. Dennoch konnte die Sensitivität von p53wt-defizient-Zellen gegenüber hochgradiger Hypoxie-induziertem Zelltod nicht über die Effekte von SCO2 erklärt werden, da diese Oxidase ihre Funktionen nur unter ausreichend oxyschen Bedingungen erfüllen kann. Um die Mechanismen aufzuklären, die p53wt-Zellen vor hochgradiger Hypoxie Schutz verleihen, wurde die Rolle von TIGAR (Tp53 Induced Glycolysis and Apoptosis Regulator), eines weiteren kürzlich charakterizierten metabolischen p53-Zielgens, untersucht. TIGAR zeigt Ähnlichkeit mit der Fruktose-Bisphosphatase-2-Domäne des bifunktionalen Enzyms 6-Phosphofrukto-2-Kinase/Fruktose-2,6-Biphosphatase 2, und reduziert die intrazellulären Konzentrationen von Fruktose-2,6-Bisphosphat (FBP-2). FBP-2 ist ein Glykolyse-Regulator, der in höheren Konzentrationen die Glykolyse hemmt und den Pentose-Phosphat-Weg (PPP) induziert, was zu einer Verringerung der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies-Konzentrationen (ROS) führt. Die Überexpression von TIGAR in p53wt-Zellen verstärkte die Glykolyse-Hemmung unter normoxischen Bedingungen und erlaubte oxidative Phosphorylierung als kompensatorischen metabolischen Mechanismus. Zudem förderte TIGAR die Expression von Lon, einer Protease, die Untereinheiten der Atmungskette modulieren kann, und zugleich als Radikalfänger fungiert. Jedoch reduzierte TIGAR die Expression von SCO2. Die Restoration von TIGAR in p53wt-defizient-Zellen konnte die Sensibilität gegenüber hochgradiger Hypoxie aufheben. TIGAR reduzierte auch die ROS-Menge und verringerte die Sensitivität gegenüber oxidativen Stress. Zugleich sensibilisierte die Gensuppression von TIGAR in p53wt-Gliomzellen diese Zellen vor hochgradiger Hypoxie. Zudem korrelierte die Expression von HIF-1alpha mit der TIGAR-Expression, was eine neue Rolle von HIF-1alpha in der Regulation des Hypoxie-induzierten Zelltodes und der Protektion vor ROS vermuten ließ. Die Expression der Transketolase-Like-1 (TKTL1), eines Isoenzym der Transketolase im Pentose-Phosphat-Weg, ist in vielen Tumoren hochreguliert. Es wurde spekuliert, dass TKTL1 Zellen Schutz vor oxidativem Zellstress vermitteln kann. Zugleich ist bekannt, dass TKTL1 mit hohen phospho-Akt-Mengen in Gliomen korreliert. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass TKTL1 ein indirektes p53-Zielgen ist, welches über TIGAR reguliert werden kann. Eine Suppression der TKTL1-Expression in TIGAR-exprimierenden Zellen konnte die über TIGAR vermittelten protektiven Effekte gegenüber endogenen ROS, oxidativem Stress und Hypoxie-induziertem Zelltod aufheben. Folglich wurde hier ein bis jetzt unbekannter Zusammenhang zwischen TIGAR, TKTL1 und HIF-1alpha entdeckt. Ebenso konnte eine TKTL1-Suppression mittels siRNA wie die TIGAR-Suppression die HIF1-alpha-Transaktivierungsfähigkeit reduzieren, was zu der Vermutung Anlass gab, dass TKTL1 HIF1-alpha unter Hypoxie reguliert.
Echoortende Fledermäuse verfügen über ein hochauflösendes Gehör. Sie können anhand einer geringen Zeitverzögerung zwischen ausgesendetem Echoortungsruf und dem Echo die Entfernung von Objekten bestimmen. Je nach Spezies und deren spezifischer Ortungsstrategie gibt es unterschiedliche Typen von Ortungslauten. Die meisten Fledermäuse verwenden frequenzmodulierte (FM) Ortungssignale und zählen zu den FM-Fledermäusen. CF-FM-Fledermäuse verwenden dagegen zusätzlich zu FM-Komponenten konstantfrequente Signalelemente (CF-FM). Diese sind besonders zur Detektion flügelschlagender Beuteinsekten in dichter Vegetation von Vorteil. Im auditorischen Kortex (AC) von Fledermäusen existieren so genannte FM-FM-Neurone, die auf die Auswertung der Verzögerungszeiten zwischen Rufaussendung (FM-Ruf) und Echo (FM-Echo) spezialisiert sind. Eine Besonderheit von FM-FM-Neuronen ist, dass sie bei CF-FM-Fledermäusen systematisch, entsprechend ihrer bevorzugten Echoverzögerungen, im AC angeordnet sind. Somit sind die FM-FM-Neurone chronotop entlang einer rostro-kaudalen Achse organisiert. Solche FM-FM-Neurone wurden bislang auch in FM-Fledermäusen nachgewiesen, jedoch waren sie nicht chronotop organisiert. Ein Ziel dieser Promotionsarbeit war es, FM-FM-Neurone bei der FM-Fledermaus Carollia perspicillata hinsichtlich ihrer Eigenschaften und ihrer räumlichen Anordnung im AC zu untersuchen. Die Befunde der vorliegenden Studie an C. perspicillata zeigen, dass alle untersuchten Neurone im dorsalen AC sowohl auf hochfrequente Reintöne als auch auf FM-FM-Stimulation reagierten. Die Echoverzögerungen, auf welche die Neurone im Areal reagierten, lagen zwischen 1 und 32 ms, was einer Distanz zwischen Fledermaus und Objekt von 16 cm bis 5,3 m entspricht. Überraschenderweise waren die kortikalen FM-FM-Neurone bei C. perspicillata chronotop organisiert, ähnlich wie bei insektenfressenden CF-FM-Fledermäusen. Warum eine chronotope Anordnung von FM-FM-Neuronen im AC bei CF-FM-Fledermäusen von Nutzen sein kann, ist nicht geklärt. Bislang wurde vermutet, dass eine systematische Anordnung die Zeitverarbeitungsprozesse optimiert und vor allem beim Insektenjagen in dichter Vegetation vorteilhaft sein könnte. Der vorliegende Befund ist außergewöhnlich, da er zeigt, dass auch bei der überwiegend frugivoren Fledermaus C. perspicillata FM-FM-Neurone chronotop angeordnet sind, und damit verdeutlicht, dass der funktionelle Rückschluss hinsichtlich des Beutefangs neu diskutiert werden muss. Neben der Charakterisierung von FM-FM-Neuronen bei adulten C. perspicillata war Ziel der vorliegenden Arbeit, die postnatale Entwicklung des AC im Hinblick auf die Frequenzrepräsentation zu untersuchen. Während der Entwicklung von C. perspicillata wurden drei wichtige Veränderungen festgestellt: (1) Das Audiogramm zeigt, dass der Hörbereich von Neugeborenen charakteristische Frequenzen (CF) zwischen 15 und 80 kHz aufweist. Dieser Frequenzbereich entspricht etwa 72% des Hörbereichs von Adulten. Während der ersten vier postnatalen Entwicklungswochen findet eine Frequenzverschiebung um etwa 0,4 Oktaven hin zu höheren Frequenzen statt. Insgesamt erhöhen sich die CF der Neurone im dorsalen AC von Neugeborenen bis hin zu Adulten um 30 kHz. (2) Die Sensitivität der hochfrequenten Neurone nimmt während der ersten postnatalen Woche um 15 dB zu und bleibt ab dieser Entwicklungsphase relativ konstant. (3) Die Sensitivität der tieffrequenten Neurone im ventralen AC nimmt im Laufe der Entwicklung um etwa 30 dB zu. Die CF der tieffrequenten Neurone sinken unerwartet während der postnatalen Entwicklung von Juvenilen zu Adulten um etwa 10 kHz. Diese Ergebnisse könnten auf eine bidirektionale Ausreifung der Cochlea hinweisen. Eine dritte ontogenetische Teilstudie der vorliegenden Arbeit befasste sich erstmalig mit den FM-FM-Neuronen und deren Organisation während der postnatalen Entwicklung. Die Befunde zeigen, dass während der Ontogenese drei wichtige Modifikationen auftreten: (1) Bereits bei Neugeborenen liegt der Anteil an FM-FM-Neuronen bei 21% im Vergleich zur Aktivität auf Reintöne. Dieser Anteil nimmt in der ersten Entwicklungswoche auf 56% zu und steigt einhergehend mit der beginnenden Flugtüchtigkeit der Tiere in der dritten Entwicklungswoche abrupt auf 84%. (2) Bei Neugeborenen werden im Vergleich zu älteren Entwicklungsphasen ausschließlich Entfernungen zwischen Fledermaus und Objekt von 50 cm bis 2,5 m auf neuronaler Ebene mittels FM-FM-Neurone codiert. Bereits nach der ersten postnatalen Woche sind die CD ähnlich verteilt wie bei adulten Tieren. Die Sensitivität an den CD nimmt während der Entwicklung vom Neugeborenen zum Adulten um etwa 20 dB zu. (3) Bereits bei Neugeborenen sind die FM-FM-Neurone im dorsalen AC chronotop angeordnet und über alle Altersgruppen hinweg bleibt die Chronotopie bestehen. Die Befunde der vorliegenden Studie zeigen erstmalig, dass die kortikalen Zeitverarbeitungsareale und die Chronotopie pränatal angelegt werden.
Glioblastoma is the most common and most aggressive type of brain tumor in adults. In contrast to epithelial cancers, glioblastomas do not metastasize. While the major treatment challenge in epithelial cancers is not the primary tumor but metastasis, glioblastoma patients die of the primary tumor.
However, there is a common theme which underlies the malignant properties of progressed epithelial cancers and glioblastoma: invasion from the primary tumor into the surrounding tissue. In the case of epithelial cancers this is the first and necessary step to metastasis, whereas invasion leads inevitably to tumor recurrence after resection in the case of glioblastoma, causing it to be incurable.
A cellular program which has been described in detail to promote the invasive phenotype in epithelial tumors, is the epithelial-mesenchymal-transition (EMT). Differentiated neural cells are not epithelial, thus, strictly speaking, EMT does not occur in glioblastoma. However, the traits acquired in the process of EMT, especially invasiveness and stemness, are highly relevant to glioblastoma. One of the key transcription factors known to induce EMT in epithelial cancers is ZEB1, which has been described only marginally in the central nervous system so far. Here, I investigate the expression and function of ZEB1 in glioblastoma and during human fetal neural development.
ZEB1 mRNA was significantly upregulated in all histological types of glioma, including glioblastoma, when compared to normal brain. There was no correlation between ZEB1 mRNA levels and tumor grade. Immunohistochemical staining of glioma samples demonstrated that ZEB1 was highly expressed in the great majority of tumor cells. In the developing human brain, intense staining for ZEB1 could be observed in the ventricular and subventricular zone, where stem- and progenitor cells reside. ZEB1 positive cells included cells stained with stem- and progenitor markers like PAX6, GFAP and Nestin. In contrast, ZEB1 was never found in early neuronal cells as identified by TUBB3 staining.
To gain insight into ZEB1 function I generated a human fetal neural stem cell line and a glioblastoma cell line with ZEB1 knockdown, which were compared with their respective control cell lines. First, I found that ZEB1 does not regulate the micro RNA 200 family in either cell line, which has been described as an essential ZEB1 target in epithelial cancers. Second, regulated target genes were identified with a genome wide microarray. The third approach was to directly identify genomic binding sites of ZEB1 by chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq). All three approaches showed that the ZEB1 transcriptional program is surprisingly similar in the neural stem cell line and the glioblastoma cell line. In contrast, it bears only little resemblance to the program described in epithelial cancers.
The most interesting, previously unrecognized ZEB1 target gene identified in this study is integrin b1. It was regulated after ZEB1 knockdown detected by microarray analysis, and has a ZEB1 binding site in its promoter region detected by ChIP-seq. Finally, I addressed the question whether ZEB1 influences tumor growth and invasiveness in a glioblastoma model. After intracranial xenotransplantation in mice, ZEB1 knockdown glioblastoma cells formed significantly smaller and less invasive tumors than control glioblastoma cells.
This study demonstrates that ZEB1 is widely expressed in glioma and relevant for glioblastoma growth and invasion. In contrast to what is known about ZEB1 function in epithelial cancers, ZEB1 is not associated with glioma progression, but instead seems to be an early and necessary event in tumorigenesis. Also with regard to ZEB1 target genes, ZEB1 functions differently in glioblastoma than in epithelial cancers. The two most important ZEB1 targets in epithelial cancers are E-cadherin and the miR-200 family members. Both are not relevant to ZEB1 function in glioblastoma. Interestingly, while the ZEB1 transcriptional program is different from the one described in epithelial cancers, it is highly similar in glioblastoma cells and fetal neural stem cells. This suggests that an embryonic pathway restricted to stem- and progenitor cells during development is reactivated in glioblastoma.
Previously known ZEB1 target genes were tissue specific and therefore seemed unlikely to mediate ZEB1 function in the central nervous system. However, the newly identified ZEB1 target gene integrin b1 is well known to play pivotal roles in both glioblastoma tumorigenesis and invasion as well as in neural stem cells. Additionally, integrin b1 is widely expressed and seems a likely ZEB1 target in other organs than the brain.
Taken together, I demonstrate that ZEB1 is a new regulator of glioblastoma growth and invasion. The transcriptional program of ZEB1 differs from the one in epithelial cancers but is strikingly similar to the one in neural stem cells. The newly identified ZEB1 target gene integrin b1 is likely to mediate crucial ZEB1 functios. Thus, this study identifies ZEB1 as a yet unrecognized player in glioblastoma and neural development. Furthermore, it sets the stage for more research which will help to deepen our understanding of ZEB1 function in the central nervous system and beyond.
Ribosomal RNA undergoes various modifications to optimize ribosomal structure and expand the topological potential of RNA. The most common nucleotide modifications in ribosomal RNA (rRNA) are pseudouridylations and 2'-O methylations (Nm), performed by H/ACA box snoRNAs and C/D box snoRNAs, respectively. Furthermore, rRNAs of both ribosomal subunits also contain various base modifications, which are catalysed by specific enzymes. These modifications cluster in highly conserved areas of the ribosome. Although most enzymes catalysing 18S rRNA base modifications have been identified, little is known about the 25S rRNA base modifications. The m(1)A modification at position 645 in Helix 25.1 is highly conserved in eukaryotes. Helix formation in this region of the 25S rRNA might be a prerequisite for a correct topological framework for 5.8S rRNA to interact with 25S rRNA. Surprisingly, we have identified ribosomal RNA processing protein 8 (Rrp8), a nucleolar Rossman-fold like methyltransferase, to carry out the m(1)A base modification at position 645, although Rrp8 was previously shown to be involved in A2 cleavage and 40S biogenesis. In addition, we were able to identify specific point mutations in Rrp8, which show that a reduced S-adenosyl-methionine binding influences the quality of the 60S subunit. This highlights the dual functionality of Rrp8 in the biogenesis of both subunits.
The function of RNA is subtly modulated by post-transcriptional modifications. Here, we report an important crosstalk in the covalent modification of two classes of RNAs. We demonstrate that yeast Kre33 and human NAT10 are RNA cytosine acetyltransferases with, surprisingly, specificity toward both 18S rRNA and tRNAs. tRNA acetylation requires the intervention of a specific and conserved adaptor: yeast Tan1/human THUMPD1. In budding and fission yeasts, and in human cells, we found two acetylated cytosines on 18S rRNA, one in helix 34 important for translation accuracy and another in helix 45 near the decoding site. Efficient 18S rRNA acetylation in helix 45 involves, in human cells, the vertebrate-specific box C/D snoRNA U13, which, we suggest, exposes the substrate cytosine to modification through Watson–Crick base pairing with 18S rRNA precursors during small subunit biogenesis. Finally, while Kre33 and NAT10 are essential for pre-rRNA processing reactions leading to 18S rRNA synthesis, we demonstrate that rRNA acetylation is dispensable to yeast cells growth. The inactivation of NAT10 was suggested to suppress nuclear morphological defects observed in laminopathic patient cells through loss of microtubules modification and cytoskeleton reorganization. We rather propose the effects of NAT10 on laminopathic cells are due to reduced ribosome biogenesis or function.
Jetzt, nach Beendigung vieler Jahre der Lehre und Forschung an der Goethe-Universität, kann ich diese Zeit mit einem Abstand überdenken. Der Freiraum für solch nicht zweckgerichtetes Verhalten ist während der praktischen Tätigkeit an der Universität äußerst gering und muss hart erkämpft werden, wie jedes Stück Freiheit. Rückblickend sehe ich, dass der Wunsch, über das Detailwissen hinaus ganzheitliche Zusammenhänge zu betrachten und über die eigene Fachgrenze hinauszugehen, meinen Weg geprägt hat.
Wirtszellreaktivierung chemisch induzierter Letalschäden im DNS-haltigen Serratia-Phagen Kappa
(1965)
After treating free phage Kappa with nitrous acid, triethylenemelamine, ethylmethanesulfonate, or hydroxylamin and using these phages for infecting Serratia H Y wildtype cells, at least 20% of the lethal damage in the phage-DNA can be reactivated by the host ( = host cell reactivation). It is known that all lethal agents tested so far attack the primary structure of the D N A in different ways. Therefore, we assume that the target for the host cell reactivation consists of some damage in the secondary structure of the DNA, because there is probably some coincidence in the action of all agents. The hypothesis that in the DNA changes of thymine are a prerequisite for host cell reactivation has been disproved by the experiments with nitrous acid and ethylmethanesulfonate because both substances do not act on thymine.
Erstes Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Anzuchtsystems, mit dem ein reproduzierbarer Trockenstreß induziert werden konnte. Mittels dieses Systems erfolgte die Selektion von zwei unterschiedlich trockentoleranten Sorghum bicolor-Kultivaren, die im weiteren Verlauf dieser Arbeit näher charakterisiert wurden. Dabei wurden zunächst Photosynthese, stomatärer Widerstand, Chlorophyll- und Carotinoidgehalt, Fv/Fm-Verhältnis, Blattdruckpotential und Blattschädigungen an allen Blättern von Kontrollpflanzen und gestreßten Pflanzen untersucht. Das jüngste, voll entwickelte Blatt wies die größten Unterschiede zwischen beiden Kultivaren auf, weshalb die weiterführende Untersuchungen nur noch an diesem Blatt durchgeführt wurden. Im Rahmen dieser Untersuchungen erfolgten Gaswechsel- und Chlorophyllfluoreszenz-Messungen unter unterschiedlicher CO2-Versorgung, sowie Messungen der blattflächenbezogenen Aktivität der C4-Enzyme (PEPCase, MDH, NADP-ME, PPDK) und zweier Enzyme des Calvin-Zyklus (Rubisco, FBPase). Darüber hinaus wurde der Gehalt der C4-Metabolite bestimmt und mittels Pigmentanalyse die Kinetik der Xanthophyll-Deepoxidation in Abhängigkeit vom Trockenstreß untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: Das verwendete Modelsystem erlaubt eine reproduzierbare Induktion des Trockenstresses. Aufgrund der relativ schnellen Änderung des Wasserpotentials des Bodens während der Versuchsdauer muß das Blattdruckpotential als Standard für die Trockenstreßbelastung gemessen werden. Es konnten zwei Sorghum-Kultivare mit unterschiedlicher Trockenstreßresistenz selektiert werden. Die äthiopische Landrasse E 36 zeigt dabei trotz größerer Blattschädigung, insbesondere der älteren Blätter, unter vergleichbarem Blattdruckpotential jeweils höhere Photosyntheseraten der ungeschädigten Bereiche als die amerikanische Zuchtsorte B 35. Trotz hoher Korrelation zwischen Photosyntheserate und stomatärem Widerstand scheint die Photosynthese unter Trockenstreß nicht durch verringerte CO2-Konzentrationen im Interzellularraum limitiert zu werden, worauf auch die Daten der Fluoreszenz- und Gaswechselmessungen unter erhöhtem CO2-Gehalt hinweisen. Gaswechselmessungen unter vermindertem CO2-Gehalt bei gestreßten Pflanzen lassen auf eine geringere Aktivität der CO2-Fixierung durch die PEPCase schließen. Unter optimalen Bedingungen ist keine der in vitro gemessenen Umsatzraten der C4-Enzyme limitierend für die Photosynthese. In vivo könnte die Aktivität der PEPCase jedoch durch einen niedrigeren pH-Wert des Cytosols und Malathemmung zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt werden und die Photosyntheserate limitieren. Die starke Übereinstimmung von PPDK-Aktivität und Photosynthese in den Kontrollpflanzen weist auf eine mögliche Limitierung der Photosynthese durch die PPDK unter Kontrollbedingungen hin. Die starken Veränderungen der C4-Metabolit Gehalte deuten auf eine grundlegende Veränderung des C4- Stoffwechsels unter Trockenstreß hin. Höhere Malat Konzentrationen der Sorte B 35 könnten dabei zu einer frühen Inhibierung der PEPCase in den trockengestreßten Pflanzen als in E 36 führen, wodurch die Photosynthese limitiert wird.
Es ist bekannt, dass Curcumin in einer Vielzahl verschiedener Zellarten die Proliferation hemmt und Apoptose induziert. In der Literatur werden Konzentrationen von 10 bis 150 µM (3.7-55 µg/ml) als dafür notwendig beschrieben. Da Curcumin nach oraler Aufnahme, aufgrund seiner schlechten Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt, eine geringe Bioverfügbarkeit im Organismus aufweist, sind therapeutische Lösungen erforderlich um Curcumin besser nutzen zu können. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Wirkung von geringen Mengen Curcumin, die allein keine Effekte zur Folge haben, in Zusammenwirkung mit Licht untersucht. Es wurde gezeigt, dass bereits Konzentrationen von 0,2-1 µg/ml in Keratinozyten die Proliferation hemmen, wenn sie mit UVA- oder sichtbarer Licht-Bestrahlung kombiniert werden. Desweiteren wurde belegt, dass diese Behandlung Apoptose in HaCaT-Zellen induziert, wobei der mitochondriale Apoptoseapparat aktiviert wird. Dies belegen die Freisetzung von Cytochrom c und die frühe Spaltung der Caspase-9 wohingegen Caspase-8 zeitverzögert aktiviert wurde. Weiterhin wurde dargelegt, dass Erk1/2, PKB/Akt und PKC durch Curcumin/Licht gehemmt werden, wohingegen p38 durch diese Behandlung eine Aktivierung erfährt. Zusätzlich ergab sich ein inhibierender Einfluss auf den EGF-Rezeptor, einem “upstream”-Regulator all dieser Kinasen, und den Transkriptionsfaktor NF-kappaB. Bei in vivo-Studien an immundefizienten Mäusen mit A431-Xenografts hatte eine Behandlung mit i.p. verabreichtem Curcumin und anschließender Bestrahlung mit sichtbarem Licht einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf das Tumorwachstum zur Folge. In diesen Tumoren fand eine Reduktion der Ki-67-Expression sowie eine Induktion von „apoptotic bodies“ statt. Western Blot-Analysen bestätigten die Apoptoseinduktion durch eine verstärkte Aktivierung der Caspase-9. Zusätzlich zeigte sich auch eine Hemmung von Erk1/2 sowie EGF-R nach beschriebener Behandlung in den Tumoren. Die Wirkungsweise des Curcumins in Kombination mit Licht in vitro wie auch in vivo weisen auf einen neuen therapeutischen Ansatz einer photodynamischen Therapie hin. Dabei kann durch die Verwendung von sichtbarem Licht auf den Einsatz der karzinogenen UV-Bestrahlung, wie sie in üblichen Phototherapien angewandt wird, verzichtet werden.
Anti-T-Lymphozyten-Globuline (ATG) sind Immunglobuline zur Anwendung am Menschen. Sie werden aus den Seren von Kaninchen oder Pferden gewonnen, die zuvor mit humanen Thymozyten oder einer etablierten humanen T-Zell-Linie immunisiert wurden. ATG besitzen ein sehr starkes immunsuppressives Potenzial. In der klinischen Anwendung werden sie überwiegend bei Organtransplantationen, Knochenmarktransplantationen und zur Behandlung einzelner Autoimmunerkrankungen, wie z. B. der aplastischen Anämie, eingesetzt. Wissenschaftliches Ziel der Arbeit war, einen umfangreichen Beitrag zur immunologischen Charakterisierung und Spezifizierung unterschiedlicher ATG-Präparate zu erbringen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die Entwicklung und Validierung experimenteller Methoden, sodass die bisher verwendeten Praktiken der Wirksamkeitsprüfung von ATG entsprechend dem Stand der Wissenschaft abgelöst und der Tierversuch (Affenhaut-Transplantationstest; Balner H et al., 1968) ersetzt werden können. Darüber hinaus wurde in diesem Zusammenhang der Entwurf einer Arzneibuch-Monografie für ATG vorgelegt. Der immunsuppressive Wirkmechanismus von ATG ist selbst nach 40 Jahren klinischer Erfahrung nicht eindeutig geklärt. Ihre Wirksamkeit vermitteln sie über ihre spezifische Bindung an Lymphozyten, woraus sich modellhaft vier Effekte unterscheiden lassen: Die Reihe der Fc-abhängigen zytotoxischen Mechanismen, eine von ATG ausgelöste Aktivierung, eine über Todesrezeptoren (z.B. Fas/Apo-1) von ATG direkt induzierte Apoptose sowie die Maskierung von Rezeptoren. Die zytotoxische Wirkung von ATG und die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) wurde am Durchflusszytometer (FACS) nach Färbung der toten Zellen bzw. durch den Nachweis von DNA-Fragmentierung analysiert. Der Einfluss von ATG auf die Lymphozyten-Aktivierung in vitro sowie auf die gemischte Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte reaction, MLR) wurde durch Messung der Lymphozyten-Proliferation anhand des Einbaus von radioaktiv markiertem Thymidin bestimmt. Biochemisch wurden die in ATG enthaltenen anti-Lymphozyten-Antikörper durch den sog. Kinase-Assay charakterisiert. In einer nicht radioaktiven Methode wurden Zelloberflächenmoleküle zunächst biotinyliert. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteine mit ATG präzipitiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt sowie mittels Streptavidin und Chemilumineszenz im Westernblot nachgewiesen. Für das Verständnis der klinischen Wirksamkeit von ATG ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen der komplement-unabhängigen, zytotoxischen Wirkung von erheblicher Bedeutung, da die enorme zytolytische, aber auch die breite immunsuppressive Wirkung von ATG nicht allein durch die Fc-abhängige Zytotoxizität erklärt werden kann. ATG können bei bestimmten Zielzellen Fas-abhängige Apoptose auslösen; darüber hinaus sind ATG aber auch in der Lage, einen komplement-unabhängigen Zelltod in Fas-resistenten Zell-Linien und T-Zell-Klonen, die resistent gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (AICD) sind, auszulösen. In Kompetitionsversuchen konnte gezeigt werden, dass ATG entsprechende Antikörper-Spezifitäten gegen das Molekül CD95 (Fas/Apo-1) enthalten. Ferner konnten wir nachweisen, dass die durch ATG initiierte Fas-abhängige Apoptose und/oder der AICD durch Fas-neutralisierende Antikörper inhibiert werden können, was auch von anderen Arbeitsgruppen gezeigt wurde (Genestier L et al., 1998). Die DNA-Fragmentierung, als Nachweis von Apoptose, lässt sich nach der ATG-Inkubation von Fas-sensitiven Zielzellen durch Inhibitoren der Caspase-1 (Z-VAD-FMK) komplett sowie durch Inhibitoren der Caspase-3 (Ac-DMQD-CHO) und -6 (Ac-VEID-CHO) teilweise inhibieren. Die zytotoxische Wirkung von ATG lässt sich jedoch nicht in gleichem Maße durch Inhibitoren der Caspase-1 reduzieren, wie bei einem Apoptose induzierenden mAk gegen Fas. Es wird deutlich, dass ATG eine breit gefächerte zytotoxische Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen ausüben, die alle mehr oder weniger eine Rolle in der klinischen Wirksamkeit von ATG spielen können. ATG sind in der Lage, periphere blutmononukleäre Zellen (PBMC) zu aktivieren, wobei der Proliferationsindex in etwa dem eines Standardmitogens, wie z. B. Phytohämagglutinin (PHA), entspricht. Isolierte T-Lymphozyten werden ebenfalls aktiviert, zeigen jedoch eine geringere Proliferationsrate. In PHA-Blasten lassen sich schwache Veränderungen im Muster der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung erkennen, wobei eine gewisse Ähnlichkeit im Bandenmuster sowie in der Intensität zwischen der Stimulation mit ATG und dem anti-CD2 mAk zu erkennen ist. Im Unterschied zu publizierten Studien konnte in dieser Arbeit kein spezifisch hemmender Effekt der ATG auf die MLR nachgewiesen werden. Aus den Untersuchungen zur Charakterisierung der ATG hat sich der komplement-abhängige Zytotoxizitätstest, gemessen am Durchflusszytometer, als die Methode herausgestellt, die, bezogen auf den Wirkmechanismus der ATG und im Hinblick auf eine Routineanwendung in der Chargenprüfung, am besten geeignet ist. Eine Evaluierung der Methode wurde im Rahmen eines Ringversuches, an dem sich sieben verschiedene Labore beteiligten, durchgeführt. Die mittlerweile gültige Arzneibuch-Monografie für ATG (Ph. Eur.: 1928) sieht diese in vitro Methode zur Wirksamkeitsprüfung von ATG vor, womit die Voraussetzungen zur Abschaffung des Affenhaut-Transplantationstests geschaffen wurden. Neben einer zellulären Charakterisierung der ATG konnte gezeigt werden, dass sich insbesondere biochemische Methoden, wie z. B. der Kinase-assay oder die Biotinylierung von Zelloberflächenmolekülen, sehr gut zur Identitätsprüfung von ATG eignen. Mit beiden Methoden ließen sich produktspezifische Bande nachweisen. Im Rahmen der Entwicklung von ATG sind diese Methoden geeignet, die Konsistenz der Chargenproduktion zu überprüfen, sodass auch hier Alternativen zum Tierversuch vorhanden sind.
Wiederfang von zwei Sumpfmeisen (Parus palustris) nach einer Serie von Orientierungsversuchen
(1989)
We controlled two Marsh Tits in mist nets after they have been in orientation experiments for several weeks and released at the site of capture. One was controlled 1 1/2 years after the tests. There does not seem to be any impact of the experiments on the ability to survive well.
Wie Zootiere kommunizieren
(2022)
Ohne das Eingreifen des Menschen wäre Mitteleuropa fast ein reines Waldgebiet. Noch heute beheimaten die Wälder eine große Vielfalt an Pflanzen und Tieren, die für diese Region spezifisch sind. Regionale Besonderheiten gehen aber verloren, je mehr Menschen in die Ökosysteme eingreifen: So unterscheiden sich die Pflanzenarten auf der North Charles Street in Baltimore nur wenig von denjenigen der Mainzer Landstraße in Frankfurt. Gleichzeitig verdrängen zugewanderte und eingeschleppte Arten heimische Tiere und Pflanzen. Allerdings gibt es auch im Frankfurter Stadtgebiet echte Horte der Biodiversität.
Die Genetik hat die Landwirtschaft erheblich vorangebracht, weil sich mit ihrer Hilfe wesentlich ertragreichere Arten züchten lassen. Dabei werden Pflanzen mit vorteilhaften Eigenschaften ausgewählt und mit solchen gekreuzt, die andere erstrebenswerte Merkmale aufweisen. Auf diese Weise erhält man hybride Pflanzensorten, die beispielsweise widerstandsfähiger gegenüber Schädlingen und Krankheiten sind und sich besser an unterschiedliche Umweltbedingungen anpassen können. Aber das reicht nicht mehr, selbst mit den leistungsfähigsten und ertragreichsten Zuchtpflanzen steht die Landwirtschaft vor großen Herausforderungen: Klimawandel, Wasserknappheit und schlechte Bodenqualität begrenzen die Höhe landwirtschaftlicher Erträge, gleichzeitig wächst mit der Weltbevölkerung natürlich auch der Bedarf an Nahrungsmitteln. Wesentliche Fortschritte in der Nahrungsmittelerzeugung sind allerdings zu erwarten, wenn bei der Entwicklung von Nahrung nicht nur genetische, sondern auch epigenetische Verfahren angewandt werden, um Nahrungspflanzen weiterzuentwickeln – Verfahren, die darauf beruhen, einzelne Gene gezielt an- und abzuschalten. Seit einigen Jahren forscht dazu an der Goethe-Universität der Molekularbiologe Dr. Sotirios Fragkostefanakis.
Die meisten von Menschen in neue Habitate eingeschleppten Arten sind harmlos. Doch einige richten beträchtliche ökologische und ökonomische Schäden an. Rückgängig machen kann man den Prozess nicht, aber vorbeugen sollte man. Computermodelle ermitteln die gefährdeten Knotenpunkte im Handelsnetz und sagen die nächsten Invasoren im marinen Bereich inzwischen zuverlässig voraus.
Wie herzig!
(2019)
Doch Vorsicht – dies ist kein Einblick in die Hirnwindungen eines verliebten Teenagers. Vielmehr handelt es sich hier um einen wissenschaftlichen Blick in die Großhirnrinde einer Maus. Die Forscherinnen und Forscher um Prof. Amparo Acker-Palmer vom Buchmann Institut für Molekulare Lebenswissenschaften und dem Institut für Zellbiologie und Neurowissenschaften der Goethe-Universität haben 2018 in der Zeitschrift "Science" darüber berichtet, dass Blutgefäße bei der Entwicklung neuronaler Zellnetzwerke im Gehirn eine bislang unbekannte Rolle spielen ...
In der vorliegenden Arbeit wurden 10 Typen der Gehölzvegetation und 14 Typen der Krautvegetation für das Untersuchungsgebiet Atakora vorgestellt. Dabei konnten nur Sonderstandorte, wie Galeriewälder und Lateritkrusten, klar abgetrennt werden. Viele Arten besitzen keine eindeutigen ökologischen Präferenzen, was sich gut mit der Einschätzung der lokalen Bevölkerung deckt, die für den Großteil der Arten angaben, dass diese wüchsen wo sie wollten. Dabei fällt auf, dass sich die Typen (vor allem in Gehölzschicht aber auch in Krautschicht) in den einzelnen Dörfern oft nur in Teilen entsprechen. Gründe dafür konnten nur teilweise in den unterschiedlichen ökologischen Gegebenheiten und unterschiedlichen Nutzungspräferenzen einzelner wichtiger Trennarten gegeben werden. Selten findet sich ein hundertprozentiges Zusammentreffen eines Gehölztyps mit einem Krauttyp. Damit bestätigt sich die Annahme unterschiedlicher Entwicklungsbedingungen und teilweise unabhängiger Entwicklung dieser beiden Elemente in der westafrikanischen Savanne. Gesellschaften, in denen eine Krautschicht mit einer Gehölzschicht eng korreliert sind, konnten nur für landwirtschaftlich nicht genutzte Sonderstandorten wie Galeriewälder und Lateritkrusten gebildet werden. Zudem zeigt sich, dass die Vegetation in der dichter besiedelten Ebene klarer strukturiert ist, als in der Bergregion. Dies trifft vor allem auf die Gehölzvegetation zu. Dennoch sind erstaunlich viele Gehölzarten auch in der intensiver genutzten Ebene anzutreffen, was für große Regenerationsfähigkeit und die Anpassung der hauptsächlichen Savannengehölze an das menschliche Wirken spricht. Die geringere Zahl an Gehölzarten in der Ebene ist hauptsächlich Resultat der wesentlich stärker degradierten Galeriewälder. In den Berggebieten sind zudem mehr Gehölzschichttypen und mehr krautige Arten angetroffen worden. Hier zeigt sich, dass Berggebiete auch in dieser Untersuchungsregion als Refugium für Vegetationsformationen und Arten gelten können. Die Nutzung von Wildpflanzen für verschiedene Zwecke wurde dokumentiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Präferenzen für diverse Nutzungen auf ethnischen, teilweise auch auf persönlichen Präferenzen, sowie auf der Verfügbarkeit der Pflanzen basieren. Dabei zeigte sich, dass die Präferenzen von Arten als Bau- und Brennholz eher auf der Verfügbarkeit basieren, während die Präferenzen für Medizinalpflanzen eher auf ethnischnen Vorstellungen von Wirksamkeit und teilweise auch auf kollektiven Erfahrungen basieren. Es erwies sich, dass die traditionelle Nutzung von Wildpflanzen als Brenn- und Bauholz und zu zusätzlichen Ernährung in dem Untersuchungsgebiet einen geringen Einfluß auf die Biodiversität hat, solange diese Pflanzen nicht kommerzialisiert werden. Es gibt genügend Pflanzenarten, die leicht zu finden sind und gute Eigenschaften für die eingesetzten Zwecke aufweisen, so dass man meist auf die jeweiligen in einem Dorfgebiet häufig anzutreffenden Arten ausweichen kann. Für diese geringe Auswirkung der traditionellen Nutzung von Gehölzpflanzen auf die Biodiversität sprechen auch die Aussagen der Bevölkerung über die geringere Verfügbarkeit von Gehölzpflanzen zu bestimmten Nutzungen. Dabei ergab sich eine Reihung von Nennungen, die von weniger Bauholz über weniger Brennholz zu weniger Gehölzpflanzen für die traditionelle Medizin abnahmen. Zudem wurde in allen Befragungen verneint, dass eine Art aus dem Dorfgebiet verschwunden wäre. Daraus läßt sich schließen, dass ein Großteil der wichtigen Gehölzpflanzen in dem Untersuchungsgebiet noch vorhanden ist, aber auf Grund der intensivierten Landwirtschaft nicht mehr in der Lage ist, sich zu richtigen Bäumen zu entwickeln. Da sich dadurch einige Gehölzpflanzen nur noch vegetativ vermehren können, kann eine genetische Verarmung von Populationen bestimmter Arten angenommen werden. Dies wäre ein interessanter Ansatzpunkt für zukünftige Forschungen. Ein negativer Einfluß auf die Biodiversität durch traditionelle Nutzungen ist bei der Nutzung von Gehölzpflanzen für die traditionellen Medizin größer, vor allem wenn Wurzeln verwendet werden. Dennoch lässt sich erkennen, dass der Einfluß der traditionellen Nutzungen von Wildpflanzen im Vergleich zu der landwirtschaftlichen Nutzung der Flächen einen marginalen Effekt auf die Vegetation hat. Im Rahmen der ethnobotanischen Befragungen wurden Pflanzennamen, Umweltwahrnehmung und die Vorstellungen von Krankheit der Bétamaribè und Wama dokumentiert. Diese weisen im Gegensatz zu den Vorstellungen anderer afrikanischer Völker kaum Differenzen auf. Die Vorstellungen von Krankheit sind dabei von einem starken Wandel betroffen, da man sich immer stärker auf westliche Konzepte und Medikamente verläßt. Ein positiver Effekt hiervon auf die Phytodiversität ist jedoch nicht zu erwarten, da die Medikamentkosten eine Intensivierung der Landwirtschaft erfordern. Über 240 traditionelle Heilrezepte wurden gesammelt. Die wichtigste Rolle spielen dabei Gehölzpflanzen. Dabei zeigt sich, dass sich die Präferenzen zwischen den einzelnen Dörfern stärker unterscheiden als bei der Nutzung von Pflanzen zu Brenn- und Bauholzzwecken. Auch erweisen sich große Unterschiede zu Verwendungen von Medizinalpflanzen in anderen Untersuchungsgebieten. Dies liegt an unterschiedlichen Vorstellungen und Erfahrungen zur Wirksamkeit von Pflanzen vor allem bei Krankheiten, die auch von alleine wieder vergehen wie Magen-Darm-Erkrankungen. Das Wissen über Heilpflanzen ist in der Ebene geringer ausgeprägt, als in den beiden Bergdörfern. Gründe hierfür können jedoch nicht alleine in den geringeren pflanzlichen Ressourcen gesehen werden. Ein Wandel in der Landwirtschaft bezieht sich hauptsächlich auf die Anbauprodukte. Während traditionelle angepaßte Cerealien seltener angebaut werden, baut man viele Produkte für den Verkauf an. Die herausragende Stellung darunter nimmt die anspruchsvolle und arbeitsintensive Baumwolle ein. Die Auszahlungsmodalitäten der halbstaatlichen Baumwollgesellschaft kommen dabei den bäuerlichen Bedürfnissen am ehesten entgegen. Um den finanziellen Ansprüchen der Verwandtschaft zu entgehen werden kurzfristige Strategien zur Geldbeschaffung angenommen. Es zeigt sich also, dass die Ursachen von Degradation eher in dem Kulturwandel und einer zunehmenden Abhängigkeit der Bauern von Bareinkünften zu sehen ist als in der oft pauschal genannten Überbevölkerung. Zukünftige Forschungen über Biodiversität und Vegetationswandel sollten auch den Kulturwandel stärker berücksichtigen. Die Degradation zeigt sich in dem Untersuchungsgebiet mehr in der Verarmung der Böden als in einem Rückgang der Biodiversität. Obwohl schon historische Vegetationsbeschreibungen von einer starken Beeinträchtigung der vermuteten natürlichen Wälder sprechen, ist nicht davon auszugehen, dass sich die Vegetation in dem Untersuchungsgebiet die letzten 50 Jahre stark verändert hat. Das in nördlicheren Gebieten von der lokalen Bevölkerung beobachtete Verschwinden von Arten wird kategorisch verneint. Bei den genannten zurückgehenden Arten handelt es sich hauptsächlich um wichtige Nutzarten. Da hierzu historische Daten fehlen, kann es sich auch um selektive Wahrnehmung der Bauern handeln. Dennoch ist anzunehmen, dass sich in Zukunft die Degradationsphänomene verschlimmern werden. Da die Bargeldbedürfnisse der Bauern nicht mehr zurückzuschrauben sind und zudem die Experimentiefreudigkeit in der recht unsicheren Umweltsituation gering ist, muss auf bestehende Produkte zurückgegriffen werden, um sowohl diese Bargeldbedürfnisse zu befriedigen, als auch die Umwelt zu schonen. Eine Chance hierfür könnte eine Vermarktung von Fonio, wie bereits in Mali geschehen, darstellen. Dieses anspruchslose, noch auf sehr ausgelaugten Böden wachsende und zudem sehr nahrhafte und wohlschmeckende Getreide sollte wieder vermehrt angebaut werden und auf lange Sicht die anspruchsvolle und Boden auslaugende Baumwolle ersetzten. Dies ist jedoch nur möglich, wenn Fonio über internationale Strukturen auch in Europa und Amerika vermarktet wird. Eine weitere finanziell nicht ausgeschöpfte Ressource bieten die Mangobäume. In der Hochzeit der Mangoernte werden die Bäume vielfach nicht mehr abgeerntet, weil die Preise für die Früchte stark sinken. Die Früchte fallen dann meist Flughunden und Vögeln zum Opfer. Wie das Beispiel Burkina Faso zeigt, könnten diese Früchte getrocknet, zu Marmelade oder Saft verarbeitet werden und selbst in Europa in dieser haltbaren Form verkauft werden. Leider sind bislang die entsprechenden Initiativen und Strukturen dazu in Benin noch nicht geschaffen. Eine weitere, wenn auch langfristigere Möglichkeit wäre die Ersetzung der Baumwollfelder durch Cashjew-Pflanzungen. Diese werden von der Bevölkerung immer mehr angenommen. Dabei könnten neue Gehölzresourcen geschaffen und die Bodenfruchtbarkeit erhöht werden. Einige Initiativen von kleinen NGO's, die das Pflanzen von Bäumen befürworten, finden großen Anklang. Es muß nur eine Möglichkeit gefunden werden, solche Produkte auch international zu kommerzialisieren, um die Böden stark belastende und zudem arbeitsaufwendige Baumwolle zu ersetzten. Zudem sind Initiativen von einzelnen Dörfern in der Atakoraregion, Teile des Dorfgebietes unter Schutz zu stellen und damit Ressourcen und Wissen vor allem für die traditionelle Medizin zu sichern, ermutigend. Es zeigt, dass die lokale Bevölkerung Bedrohungen ihrer Umwelt ernst nimmt und versucht mit Hilfe von NGO's Gegenmaßnahmen zu schaffen. In diesem Hinblick wäre es wichtig, dass sich zukünftige Forschungen mehr den pharmazeutischen Inhaltsstoffen von Heilpflanzen widmen, so wie dies in Südamerika bereits geschieht. Dabei sollten jedoch die Rechte der autochtonen Bevölkerung gewahrt werden. Zudem wäre es wichtig, mehr über die Ökologie einzelner Gehölzpflanzen unter Berücksichtigung der jeweiligen Nutzungsverhältnisse zu kennen. Hierbei wäre es auch interessant über die Naturverjüngung ausgewählter Arten zu arbeiten. Zudem sollten Forscher, die über Degradationsprobleme arbeiten, vor allem in angewandten Bereichen, mehr auf die Erfahrungen der lokalen Bevölkerung hören und weniger scheinbar offensichtliche und populäre Theorien wie Überbevölkerung strapazieren. Dabei sollten auch vermehrt historische Quellen zu Rate gezogen werden, da es scheint, dass die westafrikanische Savanne nicht so degradiert ist, wie es oft behauptet wird und noch große Potentiale besitzt, wenn diese richtig genutzt werden. Abschließend sei bemerkt, dass, wenn man Berichte aus anderen afrikanischen Regionen hört und sieht, der Norden Benins als "Insel der Glückseeligen" betrachtet werden kann. Die politische Lage ist stabil, die Bevölkerung aufgeschlossen und freundlich, es gibt kaum Kriminalität, große Krankheitsepedemien sind in den letzten Jahren ausgeblieben, Hunger wird selten erlitten und auch die Umweltdegradation hält sich in Grenzen. Möge die hier vorliegende Arbeit dazu beitragen, diese Region und die Bétamaribè ein wenig mehr ins Bewußtsein der Öffentlichkeit bringen und ein wenig dazu beitragen, dass die Situation der Region und ihrer Bevölkerung sich nicht verschlechtert.
Background: Costly structures need to represent an adaptive advantage in order to be maintained over evolutionary times. Contrary to many other conspicuous shell ornamentations of gastropods, the haired shells of several Stylommatophoran land snails still lack a convincing adaptive explanation. In the present study, we analysed the correlation between the presence/absence of hairs and habitat conditions in the genus Trochulus in a Bayesian framework of character evolution. Results: Haired shells appeared to be the ancestral character state, a feature most probably lost three times independently. These losses were correlated with a shift from humid to dry habitats, indicating an adaptive function of hairs in moist environments. It had been previously hypothesised that these costly protein structures of the outer shell layer facilitate the locomotion in moist habitats. Our experiments, on the contrary, showed an increased adherence of haired shells to wet surfaces. Conclusion: We propose the hypothesis that the possession of hairs facilitates the adherence of the snails to their herbaceous food plants during foraging when humidity levels are high. The absence of hairs in some Trochulus species could thus be explained as a loss of the potential adaptive function linked to habitat shifts.
Aging of biological systems ultimately leads to death of the individual. In humans, organ failure as the result of functional impairments after stroke, cardio-vascular disease, tumor development, neurodegeneration and other diseases are certainly crucial in bringing life to an end. But what happens in individuals with no obvious disease or disorders?
Background: The faunal and floral relationship of northward-drifting India with its neighboring continents is of general biogeographic interest as an important driver of regional biodiversity. However, direct biogeographic connectivity of India and Southeast Asia during the Cenozoic remains largely unexplored. We investigate timing, direction and mechanisms of faunal exchange between India and Southeast Asia, based on a molecular phylogeny, molecular clock-derived time estimates and biogeographic reconstructions of the Asian freshwater crab family Gecarcinucidae. Results: Although the Gecarcinucidae are not an element of an ancient Gondwana fauna, their subfamily Gecarcinucinae, and probably also the Liotelphusinae, evolved on the Indian Subcontinent and subsequently dispersed to Southeast Asia. Estimated by a model testing approach, this dispersal event took place during the Middle Eocene, and thus before the final collision of India and the Tibet-part of Eurasia. Conclusions: We postulate that the India and Southeast Asia were close enough for exchange of freshwater organisms during the Middle Eocene, before the final Indian--Eurasian collision. Our data support geological models that assume the Indian plate having tracked along Southeast Asia during its move northwards.
What is in Umbilicaria pustulata? A metagenomic approach to reconstruct the holo-genome of a lichen
(2020)
Lichens are valuable models in symbiosis research and promising sources of biosynthetic genes for biotechnological applications. Most lichenized fungi grow slowly, resist aposymbiotic cultivation, and are poor candidates for experimentation. Obtaining contiguous, high-quality genomes for such symbiotic communities is technically challenging. Here, we present the first assembly of a lichen holo-genome from metagenomic whole-genome shotgun data comprising both PacBio long reads and Illumina short reads. The nuclear genomes of the two primary components of the lichen symbiosis—the fungus Umbilicaria pustulata (33 Mb) and the green alga Trebouxia sp. (53 Mb)—were assembled at contiguities comparable to single-species assemblies. The analysis of the read coverage pattern revealed a relative abundance of fungal to algal nuclei of ∼20:1. Gap-free, circular sequences for all organellar genomes were obtained. The bacterial community is dominated by Acidobacteriaceae and encompasses strains closely related to bacteria isolated from other lichens. Gene set analyses showed no evidence of horizontal gene transfer from algae or bacteria into the fungal genome. Our data suggest a lineage-specific loss of a putative gibberellin-20-oxidase in the fungus, a gene fusion in the fungal mitochondrion, and a relocation of an algal chloroplast gene to the algal nucleus. Major technical obstacles during reconstruction of the holo-genome were coverage differences among individual genomes surpassing three orders of magnitude. Moreover, we show that GC-rich inverted repeats paired with nonrandom sequencing error in PacBio data can result in missing gene predictions. This likely poses a general problem for genome assemblies based on long reads.
Weiterentwicklung und Evaluation eines drei-dimensionalen Hautmodelles zur pharmakologischen Testung
(2008)
The Global South is facing severe challenges in ensuring livelihood security due to climate change impacts, environmental degradation and population growth as well as changing lifestyles. These complex problems cannot be solely solved by single scientific disciplines – they require transdisciplinary research (TDR). Stakeholders from civil society, the corporate sector, government and science need to pool their knowledge to find solutions for sustainable transformations. In Namibia, we have been involved in TDR projects on water supply, and sanitation services as well as livestock management in rangeland systems. In this paper, we review two TDR projects that differ in multiple ways and hence allow us to carve out structural differences and critically discuss research outcomes, lessons learned and the challenge of North–South collaborations. Our review builds upon published and unpublished project documents as well as expert interviews with Namibian and German researchers who were involved in the projects. Our results show that TDR can be put into practice in different ways, depending on the research focus and the period available. The TDR phases of problem framing, inter- and transdisciplinary integration were implemented with different tools and foci points. We discuss the role of project length and funding conditions for project success and outcome generation. In addition, we critically consider the role of Namibian and German researchers in these international collaborations. The conclusions we draw touch upon the points of preparatory research funding, the equal acknowledgement of Global South contributions to joint research projects and the explicit handling of TDR components in project work. Significance: • The current social-ecological challenges are complex and require TDR as a mode of knowledge coproduction, particularly in a development context. • Inter- and transdisciplinary integration are critical processes for a project to be successful and require the allocation of adequate time and monetary resources. • Longer-term projects with a funded preparatory research phase constitute a structural model for TDR as project outcomes can evolve over time. • Global South researchers carry a hidden burden in international collaborations that has to be adequately acknowledged upfront in project planning and final products.
Das Leben aller Organismen wird grundlegend durch den tages- und jahreszeitlich bedingten Wechsel der Beleuchtungsverhältnisse geprägt. Die Anpassung der Stoffwechselprozesse und Verhaltensweisen an diese Oszillationen erfolgt nicht passiv, sondern wird durch eine innere Uhr gesteuert. Tageszeitliche Rhythmen, die auch ohne den Einfluss äußerer, periodisch verlaufender Umgebungsreize (Zeitgeber) ablaufen, werden als zirkadiane Rhythmen bezeichnet. Im Säugetier steuert ein endogener Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) zirkadiane Rhythmen, indem er periphere Oszillatoren miteinander synchronisiert. Auf molekularer Ebene besteht dieser endogener Rhythmusgenerator aus Aktivatoren (BMAL1 und CLOCK/NPAS2) und Inhibitoren (PER1/2 und Cry1/2), die in Rückkopplungsschleifen die Grundlage für die Rhythmogenese steuern. Die Synchronisation dieses molekularen Uhrwerkes an die Umgebungszeit erfolgt durch Licht, das in der Retina wahrgenommen und an das SCN weitergeleitet wird. Die Signaltransduktionskaskaden nach einem Lichtpuls in der frühen und der späten Nacht unterscheiden sich dabei wesentlich: Ein Lichtpuls während der frühen Nacht führt zu einer erhöhten Freisetzung von Ca2+-Ionen über Ryanodin Rezeptoren (RYR), während ein Lichtpuls während der späten Nacht zu einer erhöhten Guanylylcyclase Aktivität führt. Um zu untersuchen, wie der endogene Rhythmusgenerator seinen Lichteingang reguliert, wurde die Licht-vermittelte Phasenverzögerung in BMAL1+/+- (profizienten) und BMAL1-/-- (defizienten) Mäusen untersucht. Die Befunde aus den in-situ Hybridisierungsstudien, RTQ-PCR und immunhistochemischen Untersuchungen dieser Arbeit zeigten, dass in BMAL1-/--Mäusen die Licht-induzierte mPer-Expression während der frühen Nacht selektiv beeinträchtigt ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass die mRNA- und Proteinmengen von RYRs in BMAL1-/--Mäusen dramatisch reduziert waren. Ryr1:: und Ryr2::Luciferase-Reportersstudien zeigten darüber hinaus, dass die Ryr-Expression durch CLOCK/BMAL1 aktiviert und durch CRY1inhibiert werden kann. Diese Ergebnisse liefern den ersten Beweis dafür, dass der endogene Rhythmusgenerator des Säugers die Signalübertragung seines eigenen Lichteingangs regulieren kann. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und in einem Melatonin-abhängigen peripheren Oszillator, der PT, untersucht und miteinander verglichen. Dazu wurden die Uhrengenproteine im fetalen (E18), postnatalen (P2 & P10) und adulten SCN und in der PT von C3H-Mäusen zu vier verschiedenen zirkadianen Zeitpunkten mittels Immunhistochemie untersucht. Die Anzahl immunreaktiver SCN-Zellen gegen alle untersuchten Uhrengenproteine (außer BMAL1) war im Fetus signifikant niedriger, als in der adulten Maus. Auch im SCN neonataler (P2) Mäuse erreichte die Anzahl immunreaktiver Zellen noch nicht das Niveau der adulten Maus. Erst 10 Tage nach der Geburt (P10) zeigen alle Uhrengenproteine im SCN ein adultes Verteilungsmuster. Offenbar reift das Uhrwerk im SCN von Mäusen graduell während der postnatalen Entwicklungsphase. Dabei besteht eine zeitliche Korrelation zwischen der Reifung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und der Ausbildung von inter-suprachiasmatischen und retino-suprachiaamatischen neuronalen Kontakten. Im Gegensatz zum SCN zeigte der Melatonin-abhängigen Oszilllator in der PT bereits im Fetus einen nahezu vollständig ausgeprägten Rhythmus der Uhrengenproteine. Da das fetale Pinealorgan noch nicht zur rhythmischen Melatonin-Synthese fähig ist, liegt es nahe, dass das mütterliche Melatonin die rhythmische Expression der Uhrengene in der fetalen PT reguliert. Wie in vitro Untersuchungen an PER2::LUCIFERASE-Mäusen zeigten, hat das mütterliche Melatonin offenbar auch einen modulierenden Einfluss auf den fetalen SCN. Bei diesen Mäusen konnte im fetalen und postnatalen SCN ein zirkadianer Rhythmus in der PER2-Synthese nachgewiesen werden, der eine relativ lange Periodenlänge aufwies und nach 3 Tagen zum Erliegen kam. Eine Stimulation mit Melatonin führte zu einer deutlichen Verkürzung der Periodenlänge im PER2-Rhythmus. Folglich scheint das mütterliche Melatonin eine wichtige Quelle für Informationen der Umgebungszeit im Fetus zu sein. Um die Uhrengenexpression während der Maus-Ontogenese in vitro auf zellulärer Ebene darzustellen, wurde in dieser Arbeit zudem ein vom murinen Per2-Promoter angetriebenes DsRed- Reportersystem etabliert und der Versuch begonnen, eine darauf basierende transgene Maus zu generieren.
Es wurden Untersuchungen über die Stoffwechselleistungen der im Most und Wein vorkommenden Essigsäurebakterien der Gattungen Acetobacter (13 Stämme) und Gluconobacter (2 Stämme) während der Weinbereitung durchgeführt. Die 15 Stämme der Essigsäurebakterien stammten aus der Sammlung des Fachgebiet Mikrobiologie und Biochemie Forschungsanstalt Geisenheim sowie aus der CCM (Czechoslovak Collection of Microorganisms). Die Stoffwechselleistungen, die unter Berücksichtigung des Zucker-Säure-Stoffwechsels beobachtet wurden, wurden bei Trauben der Sorten Riesling, Rotberger, Portugieser und Reichensteiner, den Mosten der Sorten Riesling, Portugieser und Rotberger und den Weißweinen der Sorten Riesling, Müller Thurgau und Rotwein eines Sortengemisches sowie Weiß- und Rotweinen verschiedener Jahrgänge aus Tunesischen Weinanbaugebieten durchgeführt. Die Essigsäurebakterien wurden auf die Nährböden (Traubenbeeren, Moste und Weine) beimpft und nach festgelegten Zeiten geerntet und analysiert. Die Beimpfung der Traubenbeeren erfolgte durch Besprühen der intakten und angestochenen Beeren mit den Bakterienkulturen. Im Verlauf der Arbeit wurden verschiedene Analyseverfahren angewandt. Dünnschichtchromatographie wurde für die qualitative Analyse der Zuckersäure eingesetzt. Die Ketozuckersäuren wurde durch Flüssigchromatographie sowie HPLC bestimmt. Außerdem auch für die Bestimmung organischer Säuren, Zucker und Alkohole. Ethanol wurden auch mit Titration nach der Methode von Rebelein bestimmt. Gluconsäure, Essigsäure, Glucose, Fructose, D- und L-Milchsäure sowie Dihydroxyaceton wurden enzymatisch spektrophotometrisch quantifiziert. Der Vergleich der Ergebnisse von intakten und angestochenen Beeren zeigte, dass bei angestochenen Beeren ein schnelleres Wachstum der Essigsäurebakterien und damit auch höhere Stoffwechselleistungen erfolgten. Gluconsäure, 2-Ketogluconsäure, 5-Ketogluconsäure sowie 2,5-Diketogluconsäure können von verschiedenen Essigsäurebakterienstämmen produziert werden. Es scheint so, als ob die verschiedenen Arten der Essigsäurebakterien spezifische Muster der Gluconsäure Oxidationprodukte aufweisen. In synthetischen Medien produzierten Essigsäurebakterien große Menge Gluconsäure. Nach 30 Tage produzierten Essigsäurebakterien der Stämme Acetobacter aceti var. aceti, A. liquefaciens Stamm 1347-2, A. xylinum und Gluconobacter oxydans var. suboxydans im Glucosemedium jeweils mehr als 40 g/l Gluconsäure. 5-Ketogluconsäure wurden in allgemein mehr als 2-Ketogluconsäure produziert. Von allen beobachteten Stämmen produzierte nur A. liquefaciens 2,5-Diketogluconsäure. Sowohl in den roten- als auch in den weißen Traubenbeeren produzierten sie Gluconsäure und ihre Oxidationsprodukte. In 15 Tagen wurden bis 11,5 g/l Gluconsäure, 5,3 g/l 2-Ketogluconsäure und bis 9,8 g/l 5-Ketogluconsäure produziert. Das Wachstum der Essigsäurebakterien in den Weinen verlief sehr langsam. In den Weinen wurden von den Essigsäurebakterien nur Essigsäure produziert. Die Produktion von Essigsäure war bei den unterschiedlichen Stämme sehr verschieden. A. aceti var. aceti produzierte die höchste Konzentration von Essigsäure sowohl bei Rotwein als auch bei Rieslingwein. A. aceti var. aceti produzierte bis 87 g/l in Rotwein und bis 61 g/l in Rieslingwein Bei Untersuchungen fertiger Weine wurden außer Gluconsäure auch 2-Ketogluconsäure, 5-Ketogluconsäure und 2,5-Diketogluconsäure gefunden, die auf den Stoffwechsel der Essigsäurebakterien aus Glucose und Gluconsäure zurückgeführt werden müssen. In den untersuchten fertigen Weinen aus Tunesien wurde 0,2 - 7,4 g/l Gluconsäure, 2 - 35 mg 2-Ketogluconsäure, 6 - 30 mg/l 5-Ketogluconsäure und bis 14 mg 2,5-Diketogluconsäure analysiert. Nach den vorliegenden Untersuchungsergebnissen stammen die hohen Gluconsäurekonzentrationen in den Weinen von Gluconobacter oxydans. Die Herkunft der Gluconsäure in diesen Weinen aus dem Stoffwechsel von Essigsäurebakterien wird durch die hochsignifikanten Beziehungen zwischen Gluconsäure und 2-Ketogluconsäure, sowie 2,5-Diketogluconsäure belegt.
Von Schnecken und Menschen : beeinflussen Umweltchemikalien die Entwicklung und Fortpflanzung?
(2003)
In allen Stämmen des Tierreichs werden Entwicklung und Fortpflanzung durch chemische Botenstoffe gesteuert. Obwohl die generelle Strategie der endokrinen Kontrolle im Laufe der Evolution weitgehend unverändert blieb, bildeten die verschiedenen systematischen Gruppen stark divergierende Hormonsysteme aus. Gleichwohl werden einige Hormonklassen, etwa die zu den Steroiden gehörenden Geschlechtshormone der Wirbeltiere, auch von wirbellosen Tieren, wie den Stachelhäutern (Echinodermaten) oder den Vorderkiemerschnecken (Prosobranchier), als Signalstoffe verwendet.
Die Vogelkunde besitzt in Frankfurt eine weitreichende Tradition. So zum Beispiel engagierten sich Naturforscher und -liebhaber schon lange vor Gründung der Universität im Jahre 1914 in Vereinigungen wie der Senckenberg Gesellschaft für Naturforschung (SGN, gegründet 1817) oder der Zoologischen Gesellschaft Frankfurt (ZGF, gegründet 1858). Biografi sche Skizzen zeichnen den Weg von den Pionierzeiten der Frankfurter Ornithologie bis heute nach.
Durch Längenmessungen an Exuvien wurden die Größenverhältnisse von Beinlängen, Drehachsenlängen der Beingelenke und der Fläche des Carapax bei C. salei ermittelt. Für die hydraulisch gestreckten Femoro- Patellar- und Tibio-Metatarsalgelenke wurden die Volumen-Winkel-Kennlinien bestimmt. Das Sprungverhalten wurde durch Hochgeschwindigkeits-Videoaufnahmen (Bildfrequenz 500 Hz) mit drei Kameras dokumentiert. Aus den volumetrischen, kinematischen und morphometrischen Daten wurden die Volumenverschiebungen berechnet, die bei Sprungbewegungen auftreten. Aus der prosomalen Volumenverschiebung konnte der korrespondierende Carapaxhub berechnet werden. Mit einer Miniatur- Kraftmeßplattform und einem mit Schrittmotoren getriebenen "x-y-z-Tisch" wurden Steifigkeiten des Prosomas von Perania nasuta Schwendinger, 1989 und ausgewählten anderen Taxa bestimmt. Bei Cupiennius salei gibt es zwei unterschiedliche Sprungtypen: Unvorbereitete Sprünge als Reaktion auf sehr plötzliche Störungen zeichnen sich durch eine große Vielfalt der Bewegungsmuster aus. Vorbereitete Sprünge zeigen charakteristische Beinstellungen und Kontaktphasenmuster: Zunächst erfolgt eine etwa 20 ms dauernde Ausholbewegung, anschließend beginnt die 22 - 42 ms dauernde Beschleunigungsphase. Die Körperlängsachse vollzieht während der Beschleunigungsphase eine Vorwärtsrotation um etwa 50°, die nach dem Verlust des Bodenkontaktes der Beine gestoppt und umgekehrt wird. Dies erfolgt wohl durch ein kontrolliertes Bremsen des Ausstoßes des Sicherheitsfadens. Bei vorbereiteten Sprüngen konnten Sprungweiten bis zu 0.43 m beobachtet werden, die maximalen vertikalen Geschwindigkeiten betrugen 0.07 - 0.82 ms-1, maximale horizontale Geschwindigkeiten lagen bei 0.65 - 1.25 ms-1. Bei vorbereiteten Sprüngen wurden vertikale Beschleunigungen von 0.74 – 33.70 ms-2 und horizontale Beschleunigungen von 20.5 – 68.4 ms-2 erreicht. Die Kontaktphasen der Beine enden in einer charakteristischen Reihenfolge: Die Vorderbeine haben meist keinen Bodenkontakt, die dritten Beine heben nach durchschnittlich 37 % und die vierten Beine nach durchschnittlich 69 % der Dauer der Beschleunigungsphase ab. Zuletzt verlieren die zweiten Beine den Bodenkontakt. Zu Beginn der Beschleunigungsphasen richten sich innerhalb von durchschnittlich 4.6 ms Stacheln auf der Oberfläche der Beine auf. Die Stachelaufrichtung erfolgt bei Drucken von etwa 35 bis etwa 65 kPa. Dies zeigt einen Druckanstieg in den Beinen auf Werte von ³ 65 kPa während der Beschleunigungsphase an. Der Hauptanteil der Volumenverschiebungen in den Beinen wird durch Bewegungen der Femoro-Patellargelenke verursacht. Die Bewegungen der Tibio-Metatarsalgelenke bewirken nur geringe Volumenverschiebungen. Aufgrund der anatomischen Struktur der Trochantero- Femoralgelenke sind die bei Bewegung dieser Gelenke verschobenen Volumina vernachlässigbar klein. Die Abschätzung der zur Beinstreckung bei Sprüngen erforderlichen Carapaxverschiebungen ergab sehr geringe Werte, es sind nur Verschiebungen um wenige 1/100 bis 1/10 mm erforderlich. Für die vollständige Streckung aller Beine muß der Carapax nur um 10% der aufgrund der anatomischen Gegebenheiten maximal möglichen Strecke verschoben werden. Bei den Untersuchungen an Perania nasuta wurden prosomale Steifigkeiten von mehr als 3500 Nm-1 für Weibchen und mehr als 6500 Nm-1 für Männchen ermittelt. Das Prosoma von Perania nasuta ist sehr viel rigider als bei anderen Spinnen (Pholcus: 131 Nm-1, Zelotes: 79 Nm-1, Pardosa: 72 Nm-1, Dysdera: 1900 Nm-1). Die Carapaxverschiebung, die den zur vollständigen Beinstreckung erforderlichen Volumentransport bewirkte, würde bei Perania eine Verformungsarbeit von bis zu 27.56 myJ erfordern, bei den anderen Spinnen nur maximal 1.67 myJ (Dysdera). Das Sprungverhalten von Cupiennius salei läßt sich keinem der bislang beschriebenen Sprungtypen zuordnen. Hinsichtlich der Sprungweite und Geschwindigkeiten sind die Sprungleistungen von Cupiennius mit denjenigen von Salticiden vergleichbar. Die geringen Carapaxverschiebungen beim Sprung lassen sich im Sinne einer Optimierung der Arbeit extrinsischer coxaler Muskeln interpretieren. Eine Minimierung von Carapaxverschiebungen sollte die Koordinierbarkeit der Bewegungen der Coxae erhöhen, weil ein stärker formkonstanter Bezugsrahmen gegeben ist. Dementsprechend lassen sich Bein- und Carapaxdimensionen bei verschiedenen Spinnentaxa im Hinblick auf die jeweiligen Lokomotionsstrategien interpretieren. Die Untersuchungen an Perania nasuta bestätigen die von Kropf (in Vorb.) aufgestellte Hypothese einer starken Versteifung des Prosoma. Die Druckpumpe scheint hier im Opisthosoma lokalisiert zu sein. Hinsichtlich der möglichen Vorteile einer solchen Entwicklung lassen sich einerseits die besseren Bedingungen der Arbeit extrinsischer coxaler Muskeln im vollständig steifen "Gestell" des Prosoma nennen, andererseits könnte aufgrund entsprechender Lokomotionsmodi bei Perania keine Notwendigkeit zur schnellen Verschiebung großer Haemolymphvolumina aus dem Prosoma bestehen, so daß eine leistungsfähige prosomale Druckpumpe wegfallen konnte.
Along with barley and rice, maize provides staple food for more than half of the world population. Maize ears are regularly infected with fungal pathogens of the Fusarium genus, which, besides reducing yield, also taint grains with toxic metabolites. In an earlier work, we have shown that maize ears infection with single Fusarium strains was detectable through volatile sensing. In nature, infection most commonly occurs with more than a single fungal strain; hence we tested how the interactions of two strains would modulate volatile emission from infected ears. For this purpose, ears of a hybrid and a dwarf maize variety were simultaneously infected with different strains of Fusarium graminearum and F. verticillioides and, the resulting volatile profiles were compared to the ones of ears infected with single strains. Disease severity, fungal biomass, and the concentration of the oxylipin 9-hydroxy octadecadienoic acid, a signaling molecule involved in plant defense, were monitored and correlated to volatile profiles. Our results demonstrate that in simultaneous infections of hybrid and dwarf maize, the most competitive fungal strains had the largest influence on the volatile profile of infected ears. In both concurrent and single inoculations, volatile profiles reflected disease severity. Additionally, the data further indicate that dwarf maize and hybrid maize might emit common (i.e., sesquiterpenoids) and specific markers upon fungal infection. Overall this suggests that volatile profiles might be a good proxy for disease severity regardless of the fungal competition taking place in maize ears. With the appropriate sensitivity and reliability, volatile sensing thus appears as a promising tool for detecting fungal infection of maize ears under field conditions.
Visualization of cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria by electron cryo‐tomography
(2017)
We employed electron cryo‐tomography to visualize cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria. Translation‐arrested ribosomes reveal the clustered organization of the TOM complex, corroborating earlier reports of localized translation. Ribosomes are shown to interact specifically with the TOM complex, and nascent chain binding is crucial for ribosome recruitment and stabilization. Ribosomes are bound to the membrane in discrete clusters, often in the vicinity of the crista junctions. This interaction highlights how protein synthesis may be coupled with transport. Our work provides unique insights into the spatial organization of cytosolic ribosomes on mitochondria.
Die Komplementarität der molekularen Oberflächen und der Pharmakophorpunkte ist ein verbreiteter Konzept im rechnergestützen Moleküldesign. Diesem Konzept folgend wurde die Software SQUIRREL neu entwickelt und in der Programmiersprache Java implemetiert. Die Software generiert die Vorschläge für den bioisosteren Ersatz von Molekülen und Molekülfragmenten. SQUIRREL kombiniert Oberflächen- und Pharmakophoreigenschaften bioaktiver Substanzen und kann im virtuellen Screening und fragment-basierten de novo Design eingesetzt werden. In einer prospektiven Studie wurde SQUIRREL verwendet, um neue selektive PPARalpha-Agonisten aus einer kommerziellen Moleküldatenbank zu identifizieren. Die Software lieferte eine potente Substanz (EC50 = 44 nM) mit über 100facher Selektivität gegenüber PPARgamma. In einer zweiten Studie wurde eine Leitstruktur de novo generiert und synthetisiert. Als Ausgangstruktur diente der bekannte PPARalpha-Agonist GW590735. Während des Designvorgangs wurden zwei Teilstrukturen, die für die Aktivität von GW590735 verantwortlich sind, durch bioisostere Gruppen ersetzt, die von SQUIRRELnovo vorgeschlagen wurden. Die neue Leitstruktur aktiviert PPARalpha in einem zellbasierten Reportergen-Testsystem bei einem EC50 von 0.51 µM.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gram-negatives, mikroaerophiles Bakterium. Es kolonisiert die menschliche Magenschleimhaut, wobei mehr als 50% der Menschheit befallen sind. Als Pathogen begünstigt es die Entstehung von Magengeschwüren und –krebs. Experimentelle Befunde deuten darauf hin, dass H. pylori während der Infektion Kontakt zu Membranproteinen der Wirtszellen aufnimmt, um ein Typ IV Sekretionssystem aufzubauen und den primären Virulenzfaktor CagA (Cytotoxin Associated Antigen A) in die Wirtszelle zu translokieren. Diese Integrine genannten Membranproteine werden bei polaren Epithelzellen allerdings bevorzugt basolateral expremiert. Außerdem können extrazellulär geschnittene E-Cadherinfragmente im Medium mit H. pylori infizierter Zellkulturen nachgewiesen werden. Beide Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass eine Protease von H. pylori sekretiert wird und die Zell-Zell-Kontakte degradiert, um H. pylori den Zugang zur basolateralen Seite der Wirtszellen zu ermöglichen. Das vom Gen hp1019 des Stammes H. pylori 26695 codierte Protein HtrA konnte im Rahmen einer Kooperation mit dem Paul-Ehrlich-Institut in Langen im Überstand von H. pylori mit proteolytischer Aktivität nachgewiesen werden. Um den Einfluss dieser extrazellulären Protease auf die Infektion von Kulturzellen mir H. pylori zu untersuchen, sollte ein niedermolekularer Inhibitor für HtrA gefunden werden. Ein Homologiemodell als Grundlage für ein strukturbasiertes virtuelles Screening wurde berechnet, wobei die aktive Konformation der Protease DegP von Escherichia coli als Vorlage diente (PDB Identifikation 3cs0). Für einen neue, im Rahmen dieser Untersuchung entwickelten Methode wurde PocketPicker eingesetzt, um Größe und Form der die Bindetaschen auf der Proteinoberfläche vorherzusagen. Durch die komplementäre Projektion von Proteinatomtypen auf diese definierte Volumen kann so für eine von PocketPicker vorgesagte Bindetasche ein potentielles Pharmakophormodell berechnet und für Datenbanksuchen eingesetzt werden. In retrospektiven Studien konnte die Funktion dieser Berechungen für eine Auswahl an pharmakologisch wichtigen Proteinen aus verschiedenen Strukturklassen validiert werden. Dabei stellte sich vor allem eine Abhängigkeit der Güte der Modelle von der Güte der Vorhersage von PocketPicker heraus, was den Schluss zulässt, dass eine möglichst genaue Definition der Bindetasche für das Gelingen eines strukturbasierten virtuellen Screening unerlässlich ist. Für die Protease HtrA von H. pylori konnten erfolgreich drei strukturabgeleitete Pharmakophormodelle berechnet werden, wobei jeweils verschiedene von PocketPicker vorhergesagte Bindetaschen einbezogen wurden. Die Molekülkataloge der Firmen Asinex und Specs wurden nach Ähnlichkeit zu diesen Modellen sortiert und nach Begutachtung der jeweils ähnlichsten 100 Substanzen wurden 26 Substanzen ausgewählt und bestellt. In einem in vitro Assay mit der rekombinanten Protease HtrA inhibierten 6 Substanzen den Verdau eines rekombinanten Substrats. Die beste Verbindung erreichte in dem Assay eine maximale Inhibition von ca. 77 % bei einer mittleren inhibitorischen Konzentration bei halbmaximaler Inhibition (IC50) von ca. 26 µM.
Durch die Forschung der letzten Jahre wurde zunehmend deutlich, dass die Tumorumgebung einen starken Einfluss auf Wachstum und Progression eines Tumors ausübt. Ein Schlüsselereignis ist dabei die veränderte Expression von Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren im Tumor selbst oder im Tumor-Stroma und somit eine Veränderung in der Interaktion zwischen Tumor- und Stroma-Zellen. Eine solche de novo Expression der hämatopoetischen Wachstumsfaktoren G-CSF und GM-CSF konnte in der Tumorprogression humaner Plattenepithelkarzinome der Haut ausschließlich im Tumorgewebe hochgradig maligner, schnell und invasiv wachsender und metastasierender Tumore mit einer ausgeprägten Vaskularisierung nachgewiesen werden (Mueller & Fusenig 1999). Um die Wirkung von G-CSF und GM-CSF getrennt analysieren zu können, wurde eine benigne Keratinozyten-Zelllinie, die die Rezeptoren für G-CSF und GM-CSF exprimiert, nicht jedoch die Faktoren selbst, mit G-CSF oder GM-CSF transfiziert. Die Konsequenz der Faktorexpression wurde in je 2 transfizierten Zelllinien in vitro und in vivo analysiert. Beide Faktoren wirkten autokrin stimulierend auf die Tumorzell-Proliferation und Migration in vitro. Darüber hinaus induzierte GM-CSF die Expression von IL-6 in Tumorzellen, welches dann wiederum die Expression von GM-CSF verstärkte. Untersuchungen der transfizierten Zelllinien in vivo demonstrierten einen deutlichen Beitrag von G-CSF und GM-CSF zur Tumormalignisierung. So ergab die subkutane Injektion der G-CSF exprimierenden Zellen in die Nacktmaus nach einer Latenzzeit von 50 Tagen schnell und invasiv wachsende Tumore mit ausgeprägter Vaskularisierung, während GM-CSF exprimierende Zellen nur ein transientes Tumorwachstum zeigten. Subkutane Injektion von Gemischen der G-CSF mit den GM-CSF transfizierten Zellen demonstrierten eine frühere Häufung der Tumorbildung in Abhängigkeit von der Höhe der GM-CSF Produktion durch die eingesetzte Zelllinie. Die in vivo Progression mittels Rekultivierung von Tumorgewebe der mit G-CSF transfizierten Zellen resultierte in Zellen, die ein sehr schnelles und aggressives Tumorwachstum ohne Latenz zeigten. Diese Progression war assoziiert mit einer de novo Expression von GM-CSF, was auf einen synergistischen Effekt beider Faktoren hinweist. Für die Progressions fördernde Wirkung von G-CSF und GM-CSF spielt neben der autokrinen Stimulation der Tumorzellen vor allem die parakrine Beeinflussung des Tumor-Stromas eine Rolle. Die Analyse der Kinetik der Tumor-Stroma Interaktionen im Oberflächentransplantat ergab eine deutlich schnellere und stärkere, zum Tumor hin gerichtete permanente Angiogenese in den G-CSF exprimierenden Zellen. Diese setzte in den durch in vivo Passage entstandenen, G-CSF und GM-CSF positiven Zellen deutlich früher ein. Die Faktor negativen parentalen Zellen und die mit GM-CSF transfizierten Zellen wiesen dagegen nur eine transiente Angiogenese auf. Die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in die Tumorumgebung war bei allen transfizierten Zelllinien beschleunigt, blieb jedoch bei GM-CSF exprimierenden Zellen wie auch bei den parentalen und Kontroll transfizierten Zellen transient, während G-CSF exprimierende und G-CSF und GM-CSF ko-exprimierende Zellen eine anhaltende Rekrutierung zeigten. Die Analyse der Kinetik der Makrophagen-Rekrutierung ergab eine deutliche Beschleunigung nur in den GM-CSF exprimierenden und den G-CSF und GM-CSF ko-exprimierenden Zellen. Die sehr frühe Gegenwart von Makrophagen in Transplantaten der GM-CSF positiven Zellen ohne die Präsenz von Granulozyten deutet im Zusammenhang mit der sehr unregelmäßigen und blasigen Epithelbildung und dem nur transienten Tumorwachstum dieser Zellen nach subkutaner Injektion auf eine durch Makrophagen ausgeübte frühe Anti-Tumor Immunität hin. Als Schlüsselenzyme der Tumorinvasion und Angiogenese wurde weiterhin die Expression Matrix degradierender Enzyme, der Matrix Metalloproteinasen, in Tumor und Stroma untersucht. Dabei konnte mit zunehmender Tumorprogression eine ansteigende Expression von MMP-2 in Tumoren, von MMP-13 in Tumor und Stroma und von MMP-3 und MMP-9 im Tumor-Stroma in direkter Nähe zum Tumor festgestellt werden, wobei die Proteasen eine der Tumor-Invasion vorangehende Deposition am Rand invasiver Bereiche des Tumors zeigten. Ein Teil der stromalen (murinen) MMP-9 positiven Zellen konnte über Immunfluoreszenz-Färbungen als neutrophile Granulozyten identifiziert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ko-Expression von G-CSF, GM-CSF und ihren Rezeptoren in humanen Plattenepithelkarzinomen der Haut einen wesentlichen Beitrag zur Tumorprogression zu einem hochmalignen Tumor-Phänotyp leistet. Dies geschieht zum einen durch eine autokrine Stimulation von Proliferation und Migration der Tumorzellen. Zum anderen stimulieren diese Faktoren parakrin die Induktion einer Tumor fördernden stromalen Umgebung und tragen so zu verstärktem Tumorwachstum und Invasion bei.
In most habitats, vegetation provides the main structure of the environment. This complexity can facilitate biodiversity and ecosystem services. Therefore, measures of vegetation structure can serve as indicators in ecosystem management. However, many structural measures are laborious and require expert knowledge. Here, we used consistent and convenient measures to assess vegetation structure over an exceptionally broad elevation gradient of 866–4550m above sea level at Mount Kilimanjaro, Tanzania. Additionally, we compared (human)-modified habitats, including maize fields, traditionally managed home gardens, grasslands, commercial coffee farms and logged and burned forests with natural habitats along this elevation gradient. We distinguished vertical and horizontal vegetation structure to account for habitat complexity and heterogeneity. Vertical vegetation structure (assessed as number, width and density of vegetation layers, maximum canopy height, leaf area index and vegetation cover) displayed a unimodal elevation pattern, peaking at intermediate elevations in montane forests, whereas horizontal structure (assessed as coefficient of variation of number, width and density of vegetation layers, maximum canopy height, leaf area index and vegetation cover) was lowest at intermediate altitudes. Overall, vertical structure was consistently lower in modified than in natural habitat types, whereas horizontal structure was inconsistently different in modified than in natural habitat types, depending on the specific structural measure and habitat type. Our study shows how vertical and horizontal vegetation structure can be assessed efficiently in various habitat types in tropical mountain regions, and we suggest to apply this as a tool for informing future biodiversity and ecosystem service studies.
In dieser Arbeit wurde erstmals ein monokolonaler Antikörper gegen die GlyRbeta-Untereinheit (GlyRbeta) hergestellt. Zur Immunisierung der Mäuse wurde die 120 AS lange große cytoplasmatische Schleife (engl. loop) zwischen den transmembranen Domänen 3 und 4 von GlyRbeta gewählt, da diese nur geringe Sequenzhomologie zu GlyRalpha-Untereinheiten aufweist. Diese Schleifenregion wurde als GST-Fusionsprotein in Bakterien exprimiert und affinitätsgereinigt. Sowohl die Immunisierung der Mäuse als auch die Herstellung der Hybridoma-Klone wurde in Zusammenarbeit mit Synaptic Systems GmbH (Göttingen) durchgeführt. Die Spezifität der Antikörperbindung an GlyRbeta wurde zunächst in Western Blot-Experimenten mit affinitätsgereinigtem GlyR aus Rattenrückenmark demonstriert. Eine nachfolgende Untersuchung der Antikörperbindestelle führte zur Identifikation der ersten 20 AS des beta-loop (GlyRbeta336-355) als Epitop. Ein 20 AS kurzes, synthetisches Peptid, welches die Epitop-Sequenz enthielt, war ausreichend, um Färbungen von Western Blots und Gewebeschnitten durch den Antikörper effizient zu verhindern. Außerdem wurden Protokolle für die Antikörperfärbung von GlyRbeta in transfizierten Zelllinien und primären Neuronen aus Rattenrückenmark etabliert. Weiterhin ermöglichte die Herstellung dieses Antikörpers erstmals die direkte immunhistochemische Färbung von GlyRbeta-Protein im ZNS von Mäusen. GlyRbeta konnte hierbei im Hirnstamm, Rückenmark, dem Bulbus olfactorius und der Retina von Mäusen nachgewiesen werden, was zeigt, dass GlyRbeta-Protein weit weniger verbreitet ist als aufgrund von in situ Hybridisierungs-Studien vermutet. Die gefundene Verteilung von GlyRbeta-Protein unterscheidet sich demnach stark von der Verteilung der GlyRbeta-mRNA, was für eine posttranskriptionelle Regulation der GlyRbeta-Proteinmenge spricht. Weiterführende immunhistochemische Untersuchungen an der Retina von Mäusen zeigten, dass GlyRbeta in diesem Gewebe wie erwartet mit Gephyrin an inhibitorischen Synapsen kolokalisiert ist. In Bezug auf GlyRalpha-Untereinheiten geht man bislang davon aus, dass sie an Synapsen des adulten ZNS immer mit GlyRbeta assoziiert sind, und somit indirekt mit Gephyrin verbunden werden, wodurch das Clustering der Rezeptoren gewährleistet wird. Entgegen dieser Hypothese wurde in Doppelfärbungen von GlyRbeta und GlyRalpha-Untereinheiten gefunden, dass eine Ansammlung von GlyRalpha4-Clustern in der Retina adulter Mäuse vermutlich eine Ausnahme hierzu bildet. Für GlyRalpha4-Cluster in Stratum 3 und 4 der IPL konnte gezeigt werden, dass sie teilweise nicht mit GlyRbeta, und zu ebenso großem Teil nicht mit Gephyrin kolokalisiert sind. Dennoch scheinen diese GlyRalpha4-Untereinheiten in Clustern angereichert und zudem synaptisch lokalisiert zu sein. Der Mechanismus, durch den GlyRalpha4 in Abwesenheit dieser beiden Proteine an Synapsen immobilisiert wird, ist bislang völlig unklar. Funktionell wäre denkbar, dass derartige Rezeptorkomplexe den synaptischen Eingängen von ON-Starburst-Amakrinzellen besondere Leitungseigenschaften verleihen und somit maßgeblich an der Verarbeitung richtungsselektiver Signale in der Retina beteiligt sein könnten. In dieser Arbeit wurden außerdem Mutagenesestudien durchgeführt, um zu klären, über welchen Mechanismus die Inhibition der Proteinphosphatasen 1 und 2A (PP1 und PP2A) zum Verlust von synaptischem Gephyrin führt. Es konnte gezeigt werden, dass eine direkte Dephosphorylierung von Gephyrin durch PP1 hierfür wahrscheinlich nicht verantwortlich ist, da die Mutation etablierter Phosphorylierungsstellen von Gephyrin keinen, oder nur einen marginalen Einfluss auf dessen synaptische Lokalisation und das Clustering von GABAARs hatte. Dies spricht dafür, dass PP1/PP2A abhängige Dephosphorylierungs-/Phosphorylierungsprozesse wahrscheinlich andere Gephyrin- oder Cytoskelett-assoziierte Proteine beeinflussen, jedoch nicht direkt an Gephyrin wirken. Die Erstellung von genomweiten Expressionsprofilen ist eine effiziente Methode zur Identifikation neuer Regulationsmechanismen und potentieller Interaktionspartner von Genprodukten und wurde in dieser Arbeit auf Vorderhirnproben von WT- und Gephyrin-KO-Mäusen vergleichend angewendet. Hierbei wurde gefunden, dass die Transkription bekannter Gephyrin-Interaktionspartner durch den Verlust des Gephyrin-Gens nicht messbar verändert wird. Weil die ermittelten Unterschiede in Transkriptmengen generell sehr gering waren, ist zu vermuten, dass Gephyrin keine wesentlichen genregulatorischen Funktionen im Mausgehirn ausübt. Andererseits ergab die Expressionchip-Analyse Hinweise auf neue Genprodukte, für die in WT- und Gephyrin-KO-Mäusen signifikant verschiedene Transkriptionsmengen gefunden wurden. Die Validierung dieser Daten mit anderen Methoden steht jedoch noch aus.
Bisher konnte allein für den Magnetkompass der Vögel ein Mechanismus der Magnetperzeption identifiziert werden. In Verhaltensversuchen, die Zugorientierung als Kriterium einsetzten, ob Magnetrezeption ungestört abläuft oder nicht, konnte dieser Mechanismus analysiert werden. Die Experimente zeigten, dass der Magnetrezeptionsmechanismus lichtabhängig ist. Vögel die im blau bis grünen Teil des Spektrums in Orientierungstrichtern getestet wurden bevorzugten signifikant ihre der Jahreszeit entsprechende Zugrichtung. Führte man diese Tests mit längerwelligerem Licht durch, zeigten die Tiere Desorientierung. Durch die gezielte Manipulation des umgebenden Erdmagnetfeldes durch künstliche Felder, ergab sich ein Wirkprinzip des Magnetkompasses der Vögel, welches nichts mit dem der uns bekannten technischen Kompasse gemein hat. Die Tiere richten sich nicht nach der Polarität des Feldes, sondern detektieren vielmehr den Neigungsgrad und den Verlauf der magnetischen Feldlinien. Durch den Einsatz von Hochfrequenzfeldern als diagnostisches Werkzeug, konnte gezeigt werden, dass der Inklinationskompass der Vögel auf einem Radikalprozess basiert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der Sitz des lichtabhängigen Magnetkompasses im rechten Auge lokalisiert ist. Unter bestimmten künstlichen Lichtbedingungen wurden von Rotkehlchen allerdings Verhaltensantworten gezeigt, die von der normalen Zugorientierung abwichen. In der vorliegenden Arbeit werden gerade jene Phänomene genauer analysiert, die in der Vergangenheit zu Nicht-Kompass-Antworten geführt haben. Die Intensitätserhöhung kurzwelliger Lichter hatte zu vermehrt axialem Verhalten geführt, eine Kombination aus langwelligem, gelben Licht mit einer kurzwelligen Komponente hatte zu Fixrichtungen geführt, d.h. die Vögel zeigten nicht mehr die saisontypische Zugumkehr. Auf biogenem Eisen (Magnetit) basierende Rezeptoren der Magnetfeld-wahrnehmung werden als zweites System der Perzeptionsmöglichkeit diskutiert, wobei ihnen im Zusammenhang mit dem ‚Kartensinn’ eher eine Intensitätssensibilität zugeschrieben wird. In der vorliegenden Arbeit wurden Versuche durchgeführt, die das komplexe Zusammenspiel unterschiedlicher Perzeptionsmechanismen des Erdmagnetfeldes untersuchen. Mischlichtbedingungen wurden daraufhin untersucht, ob sie einem radikalpaar-basierenden Inklinationskompass unterliegen, oder nicht. Für türkis-gelbes Mischlicht wird gezeigt, dass die eingeschlagene Fixrichtung nicht mit Hilfe eines Inklinationskompasses aufgesucht wird. Darüber hinaus beruht die Richtungswahl des getesteten Vogels nicht auf einem Radikalpaarmechanismus, ist aber abhängig vom vorliegenden Magnetfeld. Da Magnetit bei Vögeln in der Oberschnabelregion lokalisiert werden konnte, wurden Betäubungsversuche mit einem Lokalanästhetikum durchgeführt. Die Fixrichtung bricht zusammen und die Vögel zeigen desorientiertes Verhalten. Im Gegensatz dazu bleiben Vögel unter Grün und Weisslicht, Bedingungen wo ein Inklinationskompass zum Einsatz kommt, mit Oberschnabelbetäubung unbeeindruckt und suchen die jahreszeitlich passende Richtung auf. Für kurzwellige Lichter wird eine Intensitätsabhängigkeitsstudie durchgeführt, die analysiert ab wann Zugorientierung in Nicht-Kompass-Antworten umschlägt. Die Wellenlängenabhängigkeit der Intensitätssensitivität, die beobachtet wird, lässt auf die Beteiligung des optischen Systems schliessen. Deshalb wurden Versuche durchgeführt, die über die Lateralisation des Magnetkompasses hinaus die Rechtsdominanz des Rotkehlchenauges genauer untersucht haben. Mittels einer Brille, die die gleiche Lichtintensität auf beide Augen fallen ließ, aber in klare und unscharfe Wahrnehmung der Umgebung unterschied, konnte herausgefunden werden, dass über die reine Aktivierung von Licht hinaus Formensehen eine entscheidene Rolle zu spielen scheint. Versuche in absoluter Dunkelheit zeigen, dass von Rotkehlchen trotz der Abwesenheit von Licht signifikant eine Vorzugsrichtung aufgesucht wird, die keiner saisonalen Zugumkehr unterläuft. Die Fixrichtung beruht nicht auf einem Inklinationskompass und sie bricht nach Oberschnabelbetäubung zusammen. Alle bisher analysierten Nicht-Kompass-Antworten scheinen auf einem zweiten, magnetit-basierenden Mechanismus zu beruhen. Diese Rezeptoren scheinen neben Intensitätsinformationen des Erdmagnetfeldes auch Richtungsinformationen zu generieren. Die biologische Relevanz der ihnen unterliegenden Fixrichtungen bleibt allerdings ungeklärt.
Camponotus ist die erfolgreichste Ameisengattung der Welt. Neben Pheidole und Crematogaster weist sie die meisten Arten, die höchste Dispersion und die größte Variabilität in morphologischer, ethologischer und ökologischer Hinsicht auf. Die Ursachen dieses Erfolges zu erkennen, war bisher nicht möglich, da nur fragmentarische Ergebnisse aus Freiland- und Laboruntersuchungen zur Verfügung standen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Biologie und Ökologie ausgewählter Arten und gibt einen Einblick in die Komplexität ihrer Lebensstrategien. Um zu klären, welche ethologischen und ökologischen Anpassungen zur Gesamtfitness der Arten beitragen, wurden acht Arten der Gattung Camponotus in vier unterschiedlichen Habitaten ausgewählt. C. vagus und C. ligniperda in Laubmischwäldern Deutschlands, C. cruentatus und C. truncatus im mediterranen Klima der Pyrenäenausläufer Südfrankreichs, C. gombaki und C. gigas in offenen Park- und Uferregionen Malaysias sowie C. texens und C. gombaki im tropischen Sekundärwald der malaiischen Halbinsel. Das Verhalten dieser Arten wurde in den für das Überleben einer Kolonie zentralen Bereichen, nämlich Nisten, Außenaktivität und Nahrungserwerb untersucht. Als soziale Insekten sind Ameisen auf permanente und effektive Kommunikationssysteme angewiesen. Deshalb wurde die Rekrutierung, die mit Nestumzug und Nahrungserwerb im Zusammenhang steht, in das Untersuchungsprogramm aufgenommen. Unter Einbeziehung bereits publizierter Daten wird es möglich, den Erfolg von Camponotus zu verstehen. ...
Im Rahmen dieser Dissertation wurden unterschiedliche Aspekte der Verbreitung der Vertreter des Pseudoterranova decipiens Komplexes betrachtet und Fragestellungen zur Ökologie und Humanpathogenität der Parasiten bearbeitet. Sie basiert auf drei (ISI-) Fachartikeln, in denen die Nutzung von Fischparasitengemeinschaften als ökologische Indikatoren für entlegene Ökosysteme des Südpolarmeeres (I), die Modellierung geeigneter Verbreitungsgebiete für Arten mit geringen Vorkommensdaten am Beispiel des P. decipiens Komplexes (II) und das Vorkommen potentiell humanpathogener P. bulbosa in unterschiedlichen Mikrohabitaten in Atlantischem Kabeljau (III) thematisiert wurde.
Die Parasitengemeinschaften der in Studie I untersuchten, nahverwandten Antarktisdorsche (Nototheniinae) Nototheniops larseni (n=40), N. nudifrons (n=40) und Lepidonotothen squamifrons (n=49) unterschieden sich hauptsächlich hinsichtlich seltener Parasitenarten. Pseudoterranova decipiens E zählte zu den häufigsten Parasiten der drei betrachteten Wirtsarten. Die Analyse der Wirtsspektren der auf Artebene bestimmten Parasiten zeigte eine geringe Spezifität antarktischer Fischparasiten im Larven- (z.B. Pseudoterranova decipiens E) und Adultstadium (z.B. Elytrophalloides oatesi). Für eine Nutzung als Bioindikatoren ergibt sich die Empfehlung, nicht auf einzelne Parasitenarten, sondern die Zusammensetzung von Parasitenfaunen zurückzugreifen und Parameter wie Abundanz oder Intensität zu berücksichtigen. Vergleiche mit Literaturdaten legten nahe, dass ein Studiendesign, das den periodischen Vergleich der Parasitierungsmuster von Nototheniinae ermöglichen soll, Standorteffekte berücksichtigen sollte. Da es sich bei der Probennahme demersaler Fische um ein aufwändiges und einschneidendes Verfahren handelt, sollten alternative Samplingmethoden vorangetrieben und eine Datenbasis dafür geschaffen werden.
Um die Belastung von Speisefischen mit potentiell humanpathogenen Parasiten in bestimmten Fanggebieten abzuschätzen, kann anhand von Vorkommens- und Umweltdaten mittels statistischer Modelle die Habitateignung für den Parasiten bestimmt werden. Eine Voraussetzung für eine verlässliche Modellierung bilden die Wahl eines geeigneten Algorithmus und die Qualität der Eingangsdaten. Für die Modellierung geeigneter Verbreitungsgebiete für die sechs Arten des P. decipiens Komplexes wurde im Rahmen von Studie II erstmalig ein biotischer Deskriptor herangezogen. Dem Ansatz lag die Annahme zugrunde, dass das Vorkommen geeigneter Endwirte der entscheidende, limitierende Faktor für die Verbreitung eines Parasiten ist, da nur so der Lebenszyklus geschlossen werden kann. Als Hypothesentest dienten Vergleiche der ökologischen Nischen von Parasiten und ihren spezifischen Endwirten im Nischenraum. Anhand der Endwirtdistanz wurde eine Verbesserung der Modellierungsergebnisse mit MaxEnt, gegenüber der ausschließlich auf abiotischen Prädiktoren basierenden Modellierung, für alle Pseudoterranova Arten, insbesondere jene mit einer geringen Anzahl Fundpunkte, erzielt. Grundsätzlich ist der Ansatz auf marine Parasitenarten, deren spezifische Endwirte verlässliche Vorkommensdaten aufweisen, übertragbar. Die Methode stellt jedoch keinen Ersatz für die Erhebung von Vorkommensdaten dar, weshalb die genetische Bestimmung schwer zu identifizierender Taxa sowie die Angabe von Metadaten in jeder parasitologischen Studie obligatorisch sein sollten.
Die Verteilung potentiell humanpathogener Parasitenstadien in für den menschlichen Verzehr vorgesehenen Fischen kann ein entscheidender Faktor für die Übertragung sein. Im Rahmen von Studie III wurde mit dem Referenztranskriptom von P. bulbosa das erste Transkriptom für eine Art den P. decipiens Komplexes erstellt. Anhand einer differentiellen Genexpressionsanalyse wurde untersucht, was die Verteilung der Parasiten auf unterschiedliche Mikrohabitate beeinflusst haben könnte. Dabei wurden siebzig differentiell exprimierte Gene identifiziert, die in aus Leber (32 Gene) und Viscera (38 Gene) von Atlantischem Kabeljau (Gadus morhua) isolierten Proben von P. bulbosa hochreguliert waren. Eine Erklärung für diesen subtilen Unterschied könnte ein Dauerstadium der P. bulbosa Larven zum Zeitpunkt der Probennahmen sein. Ob sich bestimmte Mikrohabitate innerhalb des Wirtes begünstigend auf den Parasiten auswirken, muss mit Hilfe experimenteller Studien gezeigt werden. Erste in Studie III erhobene Daten zum allergenen Potential von P. bulbosa sollten in serologischen Studien getestet werden. Als Grundlage für die Bewertung des pathogenen Potentials von P. bulbosa, sowie der weiteren Arten des P. decipiens Komplexes, sollten in experimentellen Studien NGS-Daten erhoben werden.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde in drei methodisch unterschiedlichen Studien ein Bedarf besserer Referenzdaten aufgezeigt. Bestreben diese Datenlücken zu schließen, um das Potential der Methoden besser ausschöpfen zu können, müssen zukünftig noch weiter verstärkt werden.
The NF-κB-like velvet domain protein VosA (viability of spores) binds to more than 1,500 promoter sequences in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. VosA inhibits premature induction of the developmental activator gene brlA, which promotes asexual spore formation in response to environmental cues as light. VosA represses a novel genetic network controlled by the sclB gene. Bfunction is antagonistic to VosA, because it induces the expression of early activator genes of asexual differentiation as flbC and flbD as well as brlA. The SclB controlled network promotes asexual development and spore viability, but is independent of the fungal light control. SclB interactions with the RcoA transcriptional repressor subunit suggest additional inhibitory functions on transcription. SclB links asexual spore formation to the synthesis of secondary metabolites including emericellamides, austinol as well as dehydroaustinol and activates the oxidative stress response of the fungus. The fungal VosA-SclB regulatory system of transcription includes a VosA control of the sclB promoter, common and opposite VosA and SclB control functions of fungal development and several additional regulatory genes. The relationship between VosA and SclB illustrates the presence of a convoluted surveillance apparatus of transcriptional control, which is required for accurate fungal development and the linkage to the appropriate secondary metabolism.
Background and Objectives: Valuation of life (VOL) represents a construct capturing individuals’ active attachment to their life. The majority of studies on VOL were conducted in North America and Europe where personal autonomy and independence are highly valued, leaving open the question about the relevance of this construct in interdependence-oriented cultures. Using a framework of cross-cultural and life-span theories, the present study compared levels and predictors of VOL between the young-old and old-old individuals from Germany and Japan.
Research Design and Methods: Two hundred fifty-seven Germans and 248 Japanese, matched by age, gender, education, and IADL, answered a 5-item VOL scale and shared information on sociodemographic, social, and health resources.
Results: Germans’ VOL levels were higher than in Japanese participants. Both culture- and age-moderated predictions of VOL: education was significant only in the young-old Japanese, and close social partners mattered in the old-old, not in the young-old. Health determined VOL irrespective of culture and age.
Discussion and Implications: The findings suggest that cultural values and aging processes should be considered to better understand how individuals value their life and to help older adults to feel that his/her life is meaningful and worth living.
One of the most challenging aspects of RT-qPCR data analysis is the identification of reliable reference genes. Ideally, they should be neither induced nor repressed under different experimental conditions. To date, few reference genes have been adequately studied for sugarcane (Saccharum spp.) using statistical approaches. In this work, six candidate genes (αTUB, GAPDH, H1, SAMDC, UBQ, and 25S rRNA) were tested for gene expression normalization of sugarcane root tissues from drought-tolerant and -sensitive accessions after continuous dehydration (24 h). By undergoing different approaches (GeNorm, NormFinder, and BestKeeper), it was shown that most of them could be used in combinations for normalization purposes, with the exception of SAMDC. Nevertheless three of them (H1, αTUB, and GAPDH) were considered the most reliable reference genes. Their suitability as reference genes validated the expression profiles of two targets (AS and PFPα1), related to SuperSAGE unitags, in agreement with results revealed by previous in silico analysis. The other two sugarcane unitags (ACC oxidase and PIP1-1), after salt stress (100 mM NaCl), presented their expressions validated in the same way. In conclusion, these reference genes will be useful for dissecting gene expression in sugarcane roots under abiotic stress, especially in transcriptomic studies using SuperSAGE or RNAseq approaches.
Introduction: Gastropoda are guided by several sensory organs in the head region, referred to as cephalic sensory organs (CSOs). These CSOs are innervated by distinct nerves. This study proposes a unified terminology for the cerebral nerves and the categories of CSOs and then investigates the neuroanatomy and cellular innervation patterns of these cerebral nerves, in order to homologise them. The homologisation of the cerebral nerves in conjunction with other data, e.g. ontogenetic development or functional morphology, may then provide insights into the homology of the CSOs themselves.
Results: Nickel-lysine axonal tracing (“backfilling”) was used to stain the somata projecting into specific nerves in representatives of opisthobranch Gastropoda. Tracing patterns revealed the occurrence, size and relative position of somata and their axons and enabled these somata to be mapped to specific cell clusters. Assignment of cells to clusters followed a conservative approach based primarily on relative location of the cells. Each of the four investigated cerebral nerves could be uniquely identified due to a characteristic set of soma clusters projecting into the respective nerves via their axonal pathways.
Conclusions: As the described tracing patterns are highly conserved morphological characters, they can be used to homologise nerves within the investigated group of gastropods. The combination of adequate number of replicates and a comparative approach allows us to provide preliminary hypotheses on homologies for the cerebral nerves. Based on the hypotheses regarding cerebral nerve homology together with further data on ultrastructure and immunohistochemistry of CSOs published elsewhere, we can propose preliminary hypotheses regarding homology for the CSOs of the Opisthobranchia themselves.
The opportunistic human pathogen Acinetobacter baumannii is one of the leading causes of nosocomial infections. The high prevalence of multidrug‐resistant strains, a high adaptability to changing environments and an overall pronounced stress resistance contribute to persistence and spread of the bacteria in hospitals and thereby promote repeated outbreaks. Altogether, the success of A. baumannii is mainly built on adaptation and stress resistance mechanisms, rather than relying on ‘true’ virulence factors. One of the stress factors that pathogens must cope with is osmolarity, which can differ between the external environment and different body parts of the human host. A. baumannii ATCC 19606T accumulates the compatible solutes glutamate, mannitol and trehalose in response to high salinities. In this work, it was found that most of the solutes vanish immediately after reaching stationary phase, a very unusual phenomenon. While glutamate can be metabolized, mannitol produced by MtlD is excreted to the medium in high amounts. First results indicate that A. baumannii ATCC 19606T undergoes a rapid switch to a dormant state (viable but non‐culturable) after disappearance of the compatible solutes. Resuscitation from this state could easily be achieved in PBS or fresh medium.
Unusual Deep Water sponge assemblage in South China - witness of the end-Ordovician mass extinction
(2015)
There are few sponges known from the end-Ordovician to early-Silurian strata all over the world, and no records of sponge fossils have been found yet in China during this interval. Here we report a unique sponge assemblage spanning the interval of the end-Ordovician mass extinction from the Kaochiapien Formation (Upper Ordovician-Lower Silurian) in South China. This assemblage contains a variety of well-preserved siliceous sponges, including both Burgess Shale-type and modern type taxa. It is clear that this assemblage developed in deep water, low energy ecosystem with less competitors and more vacant niches. Its explosion may be related to the euxinic and anoxic condition as well as the noticeable transgression during the end-Ordovician mass extinction. The excellent preservation of this assemblage is probably due to the rapid burial by mud turbidites. This unusual sponge assemblage provides a link between the Burgess Shale-type deep water sponges and the modern forms. It gives an excellent insight into the deep sea palaeoecology and the macroevolution of Phanerozoic sponges, and opens a new window to investigate the marine ecosystem before and after the end-Ordovician mass extinction. It also offers potential to search for exceptional fossil biota across the Ordovician-Silurian boundary interval in China.
In der vorliegenden Untersuchung wurden Populationen der Gattung Corbicula im Rhein mit Individuen aus der Mosel, der Weser sowie aus Frankreich, Spanien, Nordamerika und dem Nahen und Fernen Osten sowohl mit genetischen als auch morphologischen Methoden untersucht. Aus diesen Daten sollte ermittelt werden, wie viele Taxa bei der rezenten Besiedelung Europas auftraten und welche Migrationsrouten hierbei nachgewiesen werden konnten. Es konnte gezeigt werden, dass im Rhein zwei hybridisierende genetische Linien auftraten, wobei keine Rückkreuzung mit den Eltern nachgewiesen werden konnte. Die Hybride waren morphologisch nicht zu unterscheiden. Hinweise auf einen unterschiedlichen Chromosomensatz dieser Linien bzw. eine Polyploidie konnte nicht gefunden werden. In der Rhone wurde eine weitere Linie entdeckt. Eine der genetischen Linien im Rhein konnte im Vergleich zu Individuen aus Fernost als C. fluminea identifiziert werden. Die Herkunft der beiden Linien aus Rhein und Rhone blieb unklar, da sie nicht Individuen aus Israel oder Nordamerika zugeordnet werden konnten. Eine Polytomie der MP- und ML-Analysen war nicht auf einen zu geringen Datensatz zurückzuführen, vielmehr konnte gezeigt werden, dass Corbicula im Pleistozän eine Radiation durchief. Schalenmorphologisch konnten die genetischen Linien aus dem Rhein nicht durchgehend den zwei auftretenden Morphen zugeordnet werden. Gleichzeitig schienen diese Individuen die Extreme einer weltweiten Variabilität der Schalenform darzustellen. Ein morphologischer Vergleich von Schalen aus der Sammlung Senckenberg zeigte keine Unterschiede zwischen Individuen, die als C. fluminalis und C. fluminea bezeichnet waren. Vielmehr scheint die Schalenform nicht genügend conchologischen Merkmale zu besitzen, um die genetischen Linien zu unterscheiden. Die Besiedelung Europas durch die Körbchenmuschel erfolgte mehrfach unabhängig in verschiedenen Flusssystemen Südwest- und Mitteleuropas Anfang der 1980er Jahre. Auf- grund der hier nachgewiesenen Isolationswirkung von Stauwehren der Bundeswasserstrassen auf Makroinvertebraten und der Ergebnisse der DAF-Fingerprints von Corbicula- Populationen wurde die Mosel vermutlich von Frankreich aus besiedelt.
Das Y-Chromosom war, mit Ausnahme der Pseudoautosomalen Regionen, während der Genomevolution einer enormen Veränderung unterworfen, die zu einem weitesgehenden Verlust oder der Inaktivierung von Genen führte, die nicht in den Prozess der Geschlechtsdetermination bzw. –differenzierung, oder Spermatogenese involviert sind. Gleichzeitig kam es durch Amplifikation von funktionellen Kopien der Spermatogenesespezifischen Genen zu sog. amplifikonischen Genfamilien, die fast ausschliesslich im Testis exprimiert werden. TSPY (Testis Specific Protein Y-encoded) ist nach bisherigen Untersuchungen mit 35 Kopien, bestehend aus funktionellen Kopien und inaktiven Pseudogenen, die grösste und homogenste Protein-kodierende amplikonische Genfamilie auf dem Y-Chromosom und wurde im Rahmen dieser Arbeit genauer analysiert. Es wird unter normalen Bedingungen in den Spermatogonien des Testis exprimiert, aber es ist auch eine aberrante Expression in malignen Geweben, wie Gonadoblastom, Carcinoma in situ (CIS) des Testis oder in einer Fraktion von Prostatakarzinomen detektierbar. Aufgrund der Expression und der korrelierten Kopplungsanalyse wurde postuliert, dass es sich bei TSPY um ein Kandidatengen für den sog. Gonadoblastom-Locus auf dem Y-Chromosom (GBY) handelt. TSPY gehört ausserdem aufgrund einer evolutionär konservierten Domäne zur Familie der SET/NAP-Proteine. Andere Mitglieder dieser Familie sind z.B. in Proliferation, Zell-Zyklus-Regulation, Chromatin-Umbau und Kerntransport involviert. Durch die Analyse der TSPY-Transkription konnte anhand des LNCaP-Zellkultursystems die postulierte Androgen-abhängige TSPY-Transkription widerlegt werden. Zusätzlich wurden zwei TSPY-Transkripte unterschiedlicher Grösse und Transkriptionsraten detektiert, wobei das grössere Transkript TSPY-S stärker exprimiert wird als das kleinere Transkript TSPY-L. Ursache hierfür ist alternatives Splicing in Intron 4 des TSPY-Gens, das zur Expression der beiden Protein-Varianten mit unterschiedlichen C-Termini führt. Die durchgeführte Haplotyp-Analyse zur Identifizierung transkribierter TSPY-Gene konnte aufzeigen, dass das einzige funktionelle Gen des sog. TSPY minor Clusters (mit dem Haplotyp G-G-18) als einziges nicht alternativ gespliced wird und andererseits das häufigste TSPY-S Transkript (44 %) darstellt. Hierfür wird die Möglichkeit einer „locus-control-region“ diskutiert. Um Interaktionspartner von TSPY-S zu identifizieren und dadurch möglicherweise Hinweise auf die Funktion von TSPY zu erhalten, wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System eingesetzt. Vorversuche lokalisierten eine mögliche Transkriptions-Aktivierungsdomäne im N-Terminus von TSPY, weshalb eine N-terminale Deletion von TSPY-S, die einen grossen Teil der NAP Domäne und den C-Terminus enthält, als Köder eingesetzt wurde, um eine Testis-cDNABibliothek nach interagierenden Proteinen zu durchsuchen. Die Interaktion von TSPY mit den drei interessantesten Kandidaten hTid-1, dem menschlichen Homolog eines Tumor-Suppressor-Gens aus Drosophila, einem Mitglied der Ubiquitin-like-Proteinfamilie Ubiquilin 3 (UBQLN3), das aufgrund der Protein-Struktur eine Funktion bei der Regulation des Zellzyklus haben könnte und Isopetidase T (USP5), einer Ubiquitin-spezifische Protease, die an der proteasomalen Protein-Degradation beteiligt ist wurde durch Co-Transformation verifiziert und genauer analysiert. Immunhistochemische Experimente bestätigten die ausschliessliche zelluläre Lokalisation von TSPY in den Spermatogonien. Es konnten jedoch leichte entwicklungsspezifische Unterschiede gezeigt werden. In post-pubertärem und adulten Testis-Gewebe wird TSPY im Kern und Cytoplasma der mitotischen Spermatogonien exprimiert, aber in einem sehr grossen Anteil der ruhenden Spermatogonien im früh-kindlichen Testis (6 Monate) fehlt ein Kernsignal. Expression der EGFP (enhanced green fluorescent protein) -markierten Wildtyp cDNAs von TSPY-S und –L in HEK-293 Zellen bestätigte eine Protein-Lokalisation in Cytoplasma und Kern. Gezielte Deletion des C-Terminus der EGFP-TSPY-Fusionsproteine führte zur Degradation der Proteine, was die Bedeutung des variablen C-Terminus hervorhebt. Selektive Mutation einer mit den Computer vorhergesagten und durch einen Phosphorylierungs-Assay experimentell bestätigten CK2-Phosphorylierungs-Stelle im C-Terminus von TSPY-S verhinderte die Kern-Lokalisation, was darauf hindeutete, dass die C-terminale Phosphorylierung für die Lokalisation im Zellkern notwendig ist. Für TSPY-L konnte dieses Muster nicht bestätigt werden, da Mutationen im direkten C-Terminus von TSPY-L zur Protein-Degradation führten. Aufgrund der Datenlage wurde die Arbeitshypothese aufgestellt, dass TSPY im Cytoplasma durch CK2 phosphoryliert und in den Zellkern transportiert wird. Nach Androgen-Stimulus und Signal-Transduktion kommt es zur Kern-Lokalisation von CK2 und dadurch zur verstärkten Phosphorylierung von TSPY im Kern. Dort führt die Interaktion von TSPY mit den einzelnen identifizierten Proteinen zur Regulation des Zellzyklus und der mitotischen Proliferation der Spermatogonien, aber auch zur pathologischen Funktion von TSPY bei der Entstehung von Keimzelltumoren. Diese Arbeitshypothese müsste überprüft und verbessert werden, um die Funktion von TSPY bei der Proliferation der Spermatogonien und der Krebsentstehung aufzuklären.
Bei Cryptochromen handelt es sich um Blaulichtrezeptoren der Cryptochrom-Photolyase-Proteinfamilie (CPF). Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen Domänen des Lebens zu finden und haben eine essentielle Rolle in der Reparatur der DNA sowie der lichtgesteuerten Regulation der Expression. Cryptochrome sind in der Regel keine DNA-reparierenden Proteine. Sie sind regulativ an der Steuerung der inneren Uhr und des Zellzyklus der Organismen beteiligt. In der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum konnten bisher sechs phylogenetisch unterschiedliche Mitglieder der CPF identifiziert werden. Bei CryP handelt es sich um das einzige pflanzenähnliche Cryptochrom der photoautotrophen Diatomee. Für das Protein CryP konnte bereits ein blaulichtinduzierter Photozyklus durch die Absorption der Chromophore 5-Methenlytetrahydrofolat (MTHF) und Flavinadenindinukleotid (FAD) gezeigt werden. Außerdem ist eine regulative Wirkung des Proteins auf die Lichtsammelkomplexe (Lhc) der Diatomee bekannt. Für eine weitere Charakterisierung des CryPs wurde in dieser Arbeit zunächst das Absorptionsverhalten unter verschiedenen Wellenlängen beobachtet, um so einen Einblick in eine mögliche Aktivierung und Deaktivierung des Proteins durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu erlangen. Es zeigte sich hierbei eine mit pflanzlichen Cryptochromen vergleichbare Anreicherung verschiedener Redoxzustände des FADs in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Für eine Aufklärung der Wirkungsweise des CryP-Proteins wurden verschiedene Hypothesen untersucht: Die phylogenetische Nähe und ein ähnliches Absorptionsverhalten des CryPs zu Cryptochromen mit Reparaturfähigkeit für einzelsträngige DNA (Cry-DASH) führte zu einer Untersuchung des Proteins als möglicher Transkriptionsfaktor. Hierfür konnte eine Kernlokalisation des Proteins nachgewiesen werden, was Rückschlüsse auf eine potentielle Regulation der Expression mittels DNA-Bindung zulässt. Außerdem wurde gezeigt, dass CryP DNA-Bindefähigkeit besitzt. Die bisher nachgewiesenen Bindungen waren jedoch unspezifischer Art. Dies konnte auch für die Promotersequenz eines der durch CryP regulierten Gene lhcf1 festgestellt werden. Auf Grund der unspezifischen DNA-Bindung wurde eine zweite Hypothese für CryP untersucht: CryP wirkt regulativ auf die Expression verschiedener Gene durch Protein-Protein-Interaktionen und ist Teil einer Reaktionskaskade zur Signalweiterleitung in P. tricornutum.
Durch die Untersuchung der zweiten Hypothese konnten drei Interaktionspartner für CryP identifiziert und eine Interaktion verifiziert werden. Hierbei handelt es sich um das Protein AAA mit einer bisher unbekannten Funktion und das Protein BolA, welches Teil der zuerst in Escherichia coli identifizierten BolA-like-Proteinfamilie ist. Außerdem konnte eine Interaktion mit dem Cold-Shock-Domänen-Protein CSDP gezeigt werden. Bei den Proteinen BolA und CSDP handelt es sich um potentiell regulierende Faktoren der Transkription und Translation, was Teil einer Reaktionskaskade sein kann. Die aus anderen Organismen bekannten Funktionen des BolA-Proteins überschneiden sich mit den in CryP-Knockdown-Mutanten beobachteten Effekten. Sie zeigen eine erhöhte Sensitivität für Stresssituationen wie abweichende Nährstoffkonzentration, Osmolaritäten und Temperaturen. Diese Beobachtungen stellen einen Zusammenhang der durch einen CryP-Knockdown beobachteten Effekte und der CryP-BolA-Interaktion her. Durch Homologien zu Cold-Shock-Proteinen aus Chlamydomonas reinhardtii gibt die CryP-Interaktion mit dem Protein CSDP Hinweise auf einen potentiellen Mechanismus zur Regulation der Lhc-Proteine, für welche zuvor ein CryP-abhängiger Effekt beschrieben war.
Über die Protein-Protein-Interaktionen hinaus wurde die Phosphorylierung des CryPs als Möglichkeit der Signalweiterleitung untersucht. Es konnte eine reversible Phosphorylierung des heterolog aus E. coli isolierten CryPs gezeigt werden. Diese zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten Phosphorylierungen pflanzlicher Cryptochrome und gibt Hinweise auf einen Mechanismus der Signalweiterleitung.
Durch die Untersuchung der CryP-regulierten Transkription mit P. tricornutum CryP-Knockdown-Mutanten durch Next-Generation-Sequencing (NGS) konnte die Hypothese der regulativen Proteinkaskade und der Signalweiterleitung weiter bestätigt werden. Die Auswirkungen des CryPs auf die Transkription erwiesen sich als nicht auf einen Teilbereich des Metabolismus begrenzt, sondern sind in einem großen Teil der funktionellen Gengruppen in P. tricornutum zu sehen. Außerdem konnten drei Klassen CryP-regulierter Gene festgestellt werden. Kategorie 1: die ausschließlich unter Blaulicht regulierten Gene; Kategorie 2: die sowohl unter Blaulicht als auch im Dunkeln regulierten Gene und Kategorie 3: die ausschließlich im Dunkeln regulierten Gene. Ein im Dunkeln und unter Blaulicht jeweils unterschiedlicher regulativer Effekt deutet auf eine Doppelfunktion des CryPs hin. Möglicherweise hat das Cryptochrom unterschiedliche lichtabhängige und lichtunabhängige Funktionen.
Durch die Analyse der CryP-regulierten Genexpression konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen CryP und weiteren Photorezeptoren gezeigt werden. Der CryP-Proteingehalt in der Zelle hat einen regulativen Einfluss auf das CPF1-Protein, eine Photolyase mit dualer Funktion aus der gleichen Proteinfamilie. Zusätzlich konnte auch ein Einfluss auf die Lichtsensitivität der Genexpression des Rotlichtrezeptors Phytochrom (DPH) durch CryP gezeigt werden. Vergleichbar mit höheren Pflanzen scheint ein regulatives Netzwerk der Photorezeptoren auch in der Diatomee P. tricornutum vorhanden zu sein.
RT-PCR zur Detektion von HCV: Für die Diagnostik und für Untersuchungen zur Pathogenese des Hepatitis C Virus ist es notwendig, eine sensitive und reproduzierbare RT-PCR zur Verfügung zu haben. Die Austestung verschiedener PCR-Verfahren zeigte, daß der Einsatz einer One-Step-PCR für die Diagnose der HCV-PCR die besten Voraussetzungen in bezug auf die Sensitivität und das Risiko für Produktkontaminationen besitzt. Die RT-PCR zeigte bei der Durchführung mit verschiedenen Primern, welche innerhalb der 5'-NC-Region anlagerten, große Unterschiede in der Sensitivität, welche wahrscheinlich auf die Sekundärstruktur der 5'-NC-Region zurückzuführen sind. Um den Zusammenhang zwischen Virustiter und dem Krankheitsverlauf bzw. die in vitro Replikation von HCV zu untersuchen, wurde eine quantitative RT-PCR etabliert. Für die Generierung einer Standard-RNA wurde mit Hilfe der "site-directed mutagenesis" ein 25 Basen umfassender Bereich innerhalb der 5'-NC-Region des Hepatitis C Virus ausgetauscht. An die resultierende cDNA wurde durch die Amplifikation mit speziell konstruierten Oligonukleotiden eine T7-Promotor-Sequenz angehängt. Mit Hilfe der T7-Polymerase wurde die auf diese Weise konstruierte cDNA in RNA umgeschrieben. Die mit diesem RNAStandard durchgeführte PCR hat nicht, wie andere beschriebene quantitative RT-PCRMethoden, den Nachteil der Bildung von Heteroduplexstrukturen bzw. der bevorzugten Amphfikation kürzerer DNA-Fragmente, was zu einer Unter- oder Überschätzung der HCVRNA führen kann. Mit der hier etablierten quantitativen RT-PCR ist es möglich, zehn RNAMoleküle zu detektieren. Dies entspricht etwa 500 HCV-Molekülen pro ml Serum. Die Anwendung der quantitativen RT-PCR bei 32 Patienten mit chronischer Hepatitis C Infektion zeigte keinen Zusammenhang zwischen dem Virustiter und der Höhe der Transaminasen bzw. des klinischen Erscheinungsbildes. Die Viruskonzentration schwankte von 105 bis 109 HCV-RNA-Molekülen pro ml Serum. Bei Patienten unter Interferon-Therapie zeigte sich, daß das Absinken der Transaminasen nicht in allen Fallen mil einer Eliminierung derHCV-RNA im Serum korreliert. In vitro Replikation von HCV und Untersuchungen zur Tumorigenität: Für viele Untersuchungen zur Pathogenese insbesondere der Tumorigenese des Hepatitis C Virus ist es notwendig, ein in vitro Replikationssystem zu etablieren. Die Replikation von HCV konnte in den Zellinien Molt4, Raji, Huh7 bzw. in PBMLs, immortalisierten Hepatozyten und primären Hepatozyten nachgewiesen werden. Jedoch war die Viruskonzentration nur sehr gering, und das Virus nur sporadisch an einigen Tagen in den Zellen bzw. im Überstand zu detektieren. Die ausgetesteten Zellsysteme waren nicht ausreichend, um Untersuchungen zur Pathogenese des Hepatitis C Virus korrekt durchführen zu können. Der Einsatz von PEG bzw. von Lipoproteinen hatte keinen Einfluß auf die in vitro Replikation des Virus. Sequenzvergleiche zwischen HCV-Isolaten aus Tumorgewebe und Isolaten aus umgebendem "gesundem" Gewebe sollten Aufschluß über mögliche direkte Einflüsse des Hepatitis C Virus auf die Entstehung hepatozellulärer Karzinome geben. Sequenzvergleiche innerhalb der 5'-NC-Region des Hepatitis C Virus zeigten keine Unterschiede zwischen Virus-Isolaten aus Tumor- bzw. Peritumorgewebe. Anhand der direkten Sequenzierung eines Bereiches der NS5- Region konnte das Vorhandensein verschiedener HCV-Varianten im Tumor- und im Peritumorgewebe nachgewiesen werden. Durch Isolierung und Sequenzierung von Isolaten aus jeweils drei verschiedenen Bereichen des Tumors bzw. des Peritumors konnte gezeigt werden, daß es sich nicht um eine zufällige Verteilung von HCV-Varianten über das Lebergewebe handelt, sondern um Tumor- bzw. Peritumor-spezifische Varianten. Die aus dem Tumor isolierten HCV-Core-Sequenzen wiesen alle im Vergleich zur Peritumor- bzw. Serumsequenz Veränderungen auf. Die Tumorsequenzen besitzen Mutationen, die entweder zu einem Abbruch der Proteinsynthese nach 28 bzw. 41 Aminosäuren führen oder zu einem Verschieben des Leserasters und dadurch bedingt, zu einer veränderten Aminosäuresequenz nach 19 bzw. 51 Aminosäuren. In Transformationsexperimenten mit NIH/3T3- und Rat1-Zellen konnte gezeigt werden, dass drei der aus dem Tumor isolierten Sequenzen die Proliferation der Zellen beeinflussen können. So konnten mit diesen Sequenzen transfizierte Zellen in 0.5 % FCS-haltigem Medium wachsen. Keine der Sequenzen konnte im Nacktmausversuch die Entstehung von Tumoren induzieren.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Systematik und phylogenetischen Beziehungen der Familie der Bromeliaceae auf der Basis chloroplastidärer DNA-Sequenzdaten des trnT-trnL-Intergenischen Spacers (33 untersuchte Arten aus 28 Gattungen), des trnL-Introns (129 untersuchte Arten aus 48 Gattungen) und des trnL-trnF-Intergenischen Spacers (120 Arten aus 48 Gattungen). Untersucht wurden Vertreter aller Untergattungen der artenreichsten Gattungen Aechmea (Bromelioideae) und Tillandsia (Tillandsioideae). Mit den editierten Alignments der drei Sequenzdatensätze wurden Analysen zu den Verwandtschaftsverhältnissen durchgeführt. Alle drei untersuchten Marker lieferten phylogenetisch informative Signale. Die Pitcairnioideae erwiesen sich als polyphyletisch. Ayensua und Brocchinia sind nah verwandt und nehmen innerhalb der Familie eine basale Position ein. Hechtia und Navia stellen jeweils eigene Gruppen dar, aber ohne ausreichende Auflösung ihrer Beziehungen zu den übrigen Bromeliaceae. Fosterella und Puya sind gut gestützte Gruppen mit möglicher Schwestergruppenbeziehung zu den Bromelioideae. Die Gattungen Pitcairnia/Pepinia und Deuterocohnia/Dyckia bilden als Pitcairnioideae s.str. einen gut gestützten Ast. Die Tillandsioideae sind monophyletisch, nur die einzige untersuchte Akzession der Gattung Mezobromelia liegt außerhalb dieses statistisch gut gestützten Astes. Innerhalb der Tillandsioideae nehmen Catopsis, Glomeropitcairnia erectiflora und Alcantarea regina/Vriesea racinae basale Positionen ein. Die Gattungen Guzmania, Racinaea, Tillandsia und Vriesea sind keine natürlichen Gruppen. Für die Bromelioideae liegt die Sequenzdivergenz bei 0,1 bis max. 2%. Die beste Auflösung erreichte hier die kombinierte Analyse des trnL-Introns und des trnL-trnF Intergenischen Spacers bei Polarisierung der Daten mit den Tillandsioideae als Außengruppe. Bromelia, Deinacanthon, Greigia, Fascicularia-Ochagavia-Fernseea und eine wenig aufgelöste Kerngruppe der übrigen Bromelioideae bilden eine basale Polytomie. Mit höheren Wiederfindungswahrscheinlichkeiten gestützt sind Ananas, Greigia und von der Gruppe Fascicularia-Ochagavia-Fernseea die Gattung Fascicularia und die kontinentale Ochagavia litoralis. Die Gattungen Fascicularia-Ochagavia-Greigia (Bromelioideae) und Abromeitiella- Deuterocohnia (Pitcairnioideae) wurden mit Fragmentanalysen (AFLPs, RAPDs) untersucht. Analysen der RAPD- und AFLP-Daten mit UPGMA (Unweigthed pair group method using arithmetic averages) und NJ (Neighbor-Joining) stützen die Fassung der Gattung Fascicularia als eine Art (Fascicularia bicolor) mit zwei Unterarten (F. bicolor ssp. bicolor und F. bicolor ssp. canaliculata). F. bicolor ssp. canaliculata weist 28 Fragmente auf, die in keiner untersuchten Akzession von F. bicolor ssp. bicolor vorkommen. Die 5 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. bicolor sind durch 13 Fragmente charakterisiert, die in den 4 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. canaliculata fehlen. Die AFLP-Analysen der Gattungen Abromeitiella- Deuterocohnia stützen die Vereinigung der Gattungen Abromeitiella und Deuterocohnia in der älteren Deuterocohnia. Alle untersuchten Akzessionen der Artengruppe Abromeitiella-Deuterocohnia besitzen 11 gemeinsame charakteristische Banden, die Arten der Gattung Abromeitiella und Deuterocohnia für sich alleine genommen jedoch keine. Die größten genetischen Unterschiede bestehen zwischen der in Chile isoliert vorkommenden Deuterocohnia chrysantha und allen übrigen Arten der Gruppe. Der Informationsgehalt der analysierten chloroplastidären Sequenzen erwies sich für eine Auflösung der phylogenetischen Beziehungen von offenbar schnell evolvierenden Gattungsgruppen der Bromelioideae und Tillandsioideae als unzureichend. Fragmentanalysen, besonders AFLPs, zeigten auf der taxonomischen Ebene nah verwandter Gattungen eine gute Auflösung.
Sowohl die Gifte der Kegel- (Conidae) als auch die der Schraubenschnecken (Terebridae) enthalten eine Vielzahl pharmakologisch aktiver Peptide. Vor allem die Conopeptide bzw. Conotoxine aus den Giften der Kegelschnecken werden aufgrund ihrer Selektivität für Ionenkanäle und Rezeptoren seit langem als Werkzeuge in der neuropharmakologischen Forschung eingesetzt. Hier rücken gerade neuronale nikotinische Acetylcholinrezeptoren immer mehr in den Fokus der medizinischen Forschung, da sie vermutlich an der Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, Demenz, Schizophrenie und Epilepsie beteiligt sind. Ziel dieser Dissertation war es daher, neue Inhibitoren in den Giften Kegelschnecken (Conidae) und der Schraubenschnecken (Terebridae) für nikotinische Acetylcholinrezeptoren, vor allem der neuronalen Subtypen, zu identifizieren. Es erfolgte die:
1. Identifizierung neuer αD-Conotoxine
Aus den Giften von Conus capitaneus und C. mustelinus konnten zwei native αDConotoxine (αD-CAP und αD-MUS) isoliert und charakterisiert werden. Beide Toxine sind Homodimere mit Molekulargewichten von 11 kDa und inhibieren nikotinische ACh-Rezeptoren. Sie blockieren die Subtypen α7>α3β2>α4β2, wobei sich αD-MUS als potenter als αD-CAP erweist (IC50-Werte von αD-MUS: α7 0,12 nM, α3β2 1,08 nM, α4β2 4,5 nM; IC50-Werte von αD-CAP α7 0,25 nM, α3β2 2,8 nM, α4β2 28,6 nM). Hingegen haben die αD-Conotoxine auf die Rezeptorsubtypen α3β4, α4β4 und α1β1γδ keinen hemmenden Einfluss. Zusätzlich konnten drei weitere αD-Conotoxine mit Hilfe der cDNA von C. vexillum und C. betulinus identifiziert werden. Eine Besonderheit hierbei war, dass innerhalb der Familie der αD-Conotoxine zwei unterschiedliche Signalsequenzen vorkommen und somit diese Sequenzen nicht stark konserviert sind.
2. Charakterisierung des α-Conotoxins SI aus dem Gift von C. striatus
Im Gift der Kegelschnecke Conus striatus wurde ein Peptid mit inhibierender Wirkung an α7-Rezeptoren nachgewiesen. Molekulare Masse (1.352,5 Da) und Aminosäuresequenz entsprachen dem α-Conotoxin SI, das als Antagonist muskulärer nACh-Rezeptoren bekannt ist. Da die Ergebnisse mehrere Jahre zurück lagen und bisher keine Analysen im Oozytenexpressions-System durchgeführt wurden, wurdeeine mögliche Aktivität sowohl an neuronalen als auch an muskulären nACh-Rezeptoren vermutet. Voltage Clamp-Messungen bestätigten die spezifische Wirkung am Muskeltyp, wodurch die Aktivität am α7-Rezeptorsubtyp einem anderen Conopeptid, zugewiesen werden muss, das als Beiprodukt isoliert wurde.
3. Identifizierung neuer Conotoxine der A-Superfamilie Mit molekularbiologischen Methoden unter Nutzung von cDNA-Bibliotheken gelang es, 27 Conotoxine (17 neue und 10 bekannte) aus der A-Superfamilie zu identifizieren: drei α- und zwei κA-Conotoxine aus Conus striatus, zwei α-Conotoxine aus C. betulinus, zwei α- und zwei κA-Conotoxine aus C. carinatus, drei α-Conotoxine aus C. catus, drei α- und zwei κA-Conotoxine aus C. circumcisus, ein α-Conotoxin aus. C. geographus, zwei aus C. imperialis, jeweils eines aus C. lividus, C. quercinus, C. sponsalis sowie zwei aus C. terebra Die Vielzahl der identifizierten α-Conotoxine belegt die hohe Diversität dieser Toxine in den Giften der Kegelschecken. Anhand von Vergleichen mit bereits bekannten Toxinen werden die möglichen Wirkungsweisen einiger neuer α-Conotoxine diskutiert. Für einen Teil der α-Conotoxine wurden 3D-Strukturmodelle erstellt, die Einblicke in die Bindung der Toxine an den Rezeptor geben können.
4. Untersuchung der Gifte der Terebridae
Die inhibierende Aktivität einiger Gifte (Terebra consobrina, T. argus, Myurella affinis, Acus felina, A. chlorata, A. maculata und Hastulopsis pertusa) an nACh-Rezeptoren (α7, α3β2, α4β2, α3β4, α4β4 und α1β1γδ) wurde erstmals nachgewiesen. An Kalium- und Natriumkanälen zeigten die Giftextrakte keine Wirkung. Die Giftextrakte von Myurella affinis und Acus maculata waren am potentesten und blockierten alle untersuchten nACh-Rezeptoren. Dies ist besonders ungewöhnlich, da diese Terebriden-Arten nach der Literatur (Puillandre & Holford, 2010) keinen Giftapparat besitzen sollen. Eine weitere Auffälligkeit aller Terebriden-Giftextrakte war neben der Selektivität für a7-Rezeptorsubtypen, eine hohe Aktivität gegenüber α4-enthaltenden Rezeptoren. In den Giften und mit Hilfe von cDNA-Bibliotheken von Kegelschnecken konnte eine Vielzahl neuer Inhibitoren für neuronale nikotinische Acetylcholinrezeptoren identifiziert werden. Sie zeigen ein breites Wirkungsspektrum, das die unterschiedlichsten nAChRSubtypen einschließt, was ihre Verwendung als pharmaklogische Werkzeuge begrenzt. Hingegen zeigen die Gifte der Schraubenschnecken ein Selektivitätsspektrum, das die Analyse ihrer Peptide als vielversprechend erscheinen lässt.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte der Sphingolipid-Biosyntheseweg der Hefe Pichia ciferrii näher charakterisiert werden, um die Entwicklung einer fermentativen Route zur Sphingosin-Produktion zu ermöglichen. Darüber hinaus galt es patentierbare Selektionssysteme für diese Hefe zu etablieren. Durch Sequenzvergleiche mit nahe verwandten Hefen und das Ableiten degenerierter Primer wurden elf für die Sphingolipid-Biosynthese von Pichia ciferrii relevante Gene isoliert und sequenziert: LCB1 (codiert für eine UE der Serin-Palmitoyltransferase), TSC10 (3-Ketosphinganin-Reduktase), LAG1 und LAF1 (Ceramid-Synthasen), LIP1 (UE der Ceramid-Synthasen), DES1 (Dihydroceramid-delta4-Desaturase), YXC1 (Ceramidase), 8DES (Sphingolipid-delta8-Desaturase), 9MTR (Sphingolipid-C9-Methyltransferase), GCS1 (Ceramid-Glycosyltransferase) und LCB4 (LCB-Kinase). Bioinformatische Analysen, sowie in vivo-Experimente dienten der Einordnung der korrespondierenden Genprodukte in den Stoffwechselweg. Die Bestimmung der Substratspezifität einzelner Enzyme aus der Sphingolipid-Biosynthese erfolgte durch Überexpression der korrespondierenden Gene und anschließende Analyse des Einflusses auf die Zusammensetzung der Sphingolipidfraktion von Pichia ciferrii. Zusammengenommen wurde durch die Ergebnisse ein deutlich geschärftes Bild der Biosynthese von Sphingolipiden in Pichia ciferrii erstellt. Die gewonnenen Erkenntnisse über die Sphingolipid-Biosynthese in Pichia ciferrii fanden Anwendung auf die rationale Stammentwicklung eines Sphingosin-Produzenten. Durch die kombinierte Überexpression der die Dihydroceramid-delta4-Desaturase aus Pichia ciferrii, die Ceramid-Synthase aus Coccolithovirus und eine alkalische Ceramidase aus Mus musculus kodierenden Gene wurde eine 8,5-fache Erhöhung der Sphingosin-Konzentration von 7,5 mg/L in vom Wildtyp abgeleiteten Syringomycin-E-resistenten Stämmen auf 64,0 mg/L erzielt. Die Codon-Optimierung der heterolog exprimierten Gene zur Anpassung an die sehr eingeschränkte Codon-Verwendung von Pichia ciferrii erwies sich hierbei als essentiell. Zur Nutzbarmachung von rekombinanten Pichia ciferrii-Stämmen für die industrielle Anwendung wurden darüber hinaus drei neue Selektionssysteme etabliert. Zum einen wurde eine codon-optimierte Form des nat1-Gens genutzt, um eine Nourseothricin-Resistenz zu vermitteln. Zum anderen wurden stabile Uracil- bzw. Lysin-auxotrophe Pichia ciferrii-Stämme erzeugt, die mittels eines entsprechenden Integrationsvektors mit den Auxotrophie-Markergenen URA3 bzw. LYS2 aus Pichia ciferrii zu prototrophen Stämmen komplementiert werden konnten. Zusammengenommen mit der ersten gezielten Disruption eines Gens in Pichia ciferrii (SYR2, codiert für die Sphinganin-Hydroxylase) konnte somit auch die molekularbiologische Handhabbarkeit von Pichia ciferrii deutlich verbessert werden.
Hypoxie entsteht, wenn das Sauerstoffangebot bzw. die Sauerstoffversorgung unter ein Niveau sinkt, das benötigt wird, um physiologische O2-Drücke des betreffenden Gewebes aufrecht zu erhalten. Sinkt der Sauerstoff-Partialdruck, so werden adaptive Mechanismen aktiviert. Neben der Anpassung durch das kardiovaskuläre System werden auch verschiedene Gene aktiviert. Die Forschung der letzten Jahre hat gezeigt, dass Hypoxieinduzierte Genexpression insbesondere von zwei Transkriptionsfaktoren, HIF (hypoxia inducible factor) -1 und -2 , gesteuert wird. Man kennt über 70 Gene, die von HIF transaktiviert werden. Dabei handelt es sich um Modulatoren von Angiogenese und Vasodilatation, Erythropoese sowie der Umstellung des Stoffwechsels von oxidativer Phosphorylierung auf Glykolyse. Die Hypoxie-induzierbare Genexpression wird sowohl über eine Steigerung der Transaktivierungsaktivität als auch der Proteinmenge der HIF- -Untereinheiten reguliert. Die Regulation der HIF-Proteinmenge erfolgt über eine vom O2-Partialdruck abhängige Stabilisierung der -Untereinheit des Proteins. Unter normoxischen Bedingungen wird das Protein durch die Prolylhydroxylasen (PHD) O2-abhängig hydroxyliert, pVHL-vermittelt (VHL = von Hippel-Lindau), ubiquitiniert und proteosomal abgebaut. Unter hypoxischen Bedingungen dagegen wird das Protein stabilisiert, akkumuliert im Zellkern und bindet an eine spezifische Zielsequenz, das Hypoxia-responsive element oder HRE, imPromotor von Hypoxie-aktivierten Genen. Die PHDs gehören zu einer Familie von Eisen- und 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen. Neben diesen Faktoren wird eine Regulation von HIF durch Sauerstoffradikale (ROS, reactive oxygen species) in der Literatur sehr kontrovers diskutiert, da die Wirkung von ROS auf HIF sich unter Normoxie, Hypoxie oder dem Einfluss von Wachstumsfaktoren unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Frage, welche Rolle die PHDs bei der ROS-vermittelten HIF-Regulation spielen, beantwortet werden. Der zugrunde liegende Mechanismus wurde anhand von Glioblastom-Zelllinien untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt eine Stabilisierung von HIF nach Verringerung der ROS-Konzentration unter Normoxie. Eine Erhöhung der ROS-Konzentration führt dagegen zu einer dosisabhängigen Verminderung von HIF und der HIF-Targetgen-Expression. Es konnte eine direkte Abhängigkeit der Destabilisierung von VHL und den Prolylhydroxylasen gezeigt werden, da sowohl eine VHL-Defizienz als auch eine Mutation der Prolylreste oder eine Inhibition der PHDs zu einer Aufhebung des Effekts führen. Eine vergleichbare destabilisierende Wirkung auf HIF übt Ascorbat aus. Überraschenderweise führt sowohl die Zugabe von H2O2 mit seiner oxidativen Wirkung als auch die Zugabe des Reduktionsmittels Ascorbat zu einer Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes. Dieser Befund kann durch eine Aktivierung von Enzymen mit eisenreduzierenden Eigenschaften erklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proteinfamilie der Ferrireduktasen (FR) identifiziert und fünf Enzyme, die eine Homologie zur cytb561-Domäne aufweisen, kloniert. Eine detaillierte Charakterisierung zeigte, dass die Enzyme tatsächlich eine eisenreduzierende Aktivität aufweisen, die durch die exogene Zugabe von ROS noch erhöht wird. Eine Überexpression der FR führt zu einem erhöhten Abbau von HIF. Ein knock down mittels siRNA führt dagegen zu einer Akkumulation von HIF und die destabilisierende Wirkung von ROS ist nach einemknock down der FR deutlich reduziert. Aufgrund der in dieser Doktorarbeit gezeigten Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Die primäre oxidative Wirkung von ROS führt vermutlich zu einer Aktivierung der Ferrireduktasen, die in Abhängigkeit von Ascorbat dann vermehrt Eisen reduzieren, so dass dies den PHDs als Substrat zur Verfügung steht. Der regulierende Einfluss auf HIF wird somit vermutlich über eine erhöhte Aktivität der Prolylhydroxylasen durch eine Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes vermittelt. Die erhobenen Daten deuten an, dass die Familie der Ferrireduktasen ein zentrales Bindeglied im O2-Sensing darstellt, das in Abhängigkeit von Redox-Signalen homeostatische Antworten auf Hypoxie moduliert.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stand die Untersuchung von Faktoren, die eine physiologische Funktion bei der VIP-Induktion cholinerger sympathischer Neuronen des Huhns besitzen. Die essentielle Bedeutung von neuropoietischen Zytokinen bei diesem Differenzierungsprozess wurde bereits durch Geissen et al. (1998) gezeigt. Eine weitere Eingrenzung der in vivo beteiligten Mitglieder dieser Zytokinfamilie sollte nun durch Klärung des beteiligten Rezeptorkomplexes vorgenommen werden. Hierzu wurde zunächst die Klonierung des 5'-Bereiches der Huhn-LIFRb-cDNA unter Verwendung der 5'-RACE-Technik abgeschlossen. Anschließend wurde ein antisense Ansatz etabliert, der es ermöglicht, in vivo die Signaltransduktion über die Rezeptoruntereinheit LIFRb zu blockieren. Unter Verwendung eines retroviralen Expressionsvektors RCAS(B) wurde LIFRb antisense RNA im sich entwickelnden Hühnerembryo exprimiert. Dies bewirkte eine spezifische Reduzierung der endogenen LIFRb-Expression in den infizierten Geweben, die über In situ-Hybridisierung und Immunfärbungen nachweisbar war. Die Reduktion der LIFRb hatte keinen Einfluß auf die allgemeine Entwicklung des sympathischen Ganglions. Sie führte jedoch zu einer selektiven Reduktion der VIP-Expression, wohingegen die frühe cholinerge (ChAT), noradrenerge (TH) und panneuronale (SCG10) Genexpression unbeeinflußt bleibt. Damit ist eindeutig gezeigt, daß neuropoietische Zytokine, die über LIFRb wirken, essentiell sind für bestimmte Aspekte der terminalen Differenzierung (VIP-Expression) cholinerger sympathischer Neuronen. In Anlehnung an die vorangegangene Studie sollten unbekannte Zytokine, die an den Komplex aus LIFRb- und gp130-Rezeptoruntereinheiten binden, über eine Expressionsklonierung identifiziert werden. Hierzu konnten funktionelle LIFRb-Fc/gp130-Fc Rezeptorfusionsproteine hergestellt werden, die in der Lage sind, VIP-induzierende Faktoren in HCM, RCM und AMG zu blockieren. Über Kontrollexperimente wurde ein Expressionsklonierungsprotokoll erarbeitet, das geeignet ist auf Einzelzellebene Zytokin-exprimierende Zellen zu detektieren und aus diesen die Plasmid-Information zu ermitteln. Somit wird das Verfahren als prinzipiell durchführbar erachtet. In der bisher durchgeführten Suchrunde in einer HCM-Bank gelang es jedoch nicht, neuropoietische Zytokine zu identifizieren.
Das Ziel dieser Dissertation war es, die biologische Relevanz der F1Fo-ATP-Synthase für den Alterungsprozess des Ascomyceten P. anserina aufzuklären sowie die Funktion der Dimerisierungsuntereinheiten PaATPE und PaATPG genauer zu untersuchen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:
1. Der Verlust einer Dimerisierungsuntereinheit führt in P. anserina zum Verlust der Dimerisierungsfähigkeit der F1Fo-ATP-Synthase. Dieses Ereignis resultiert in einer vorzeitigen Anhäufung von Seneszenzmerkmalen, einer starken Verkürzung der Lebensspanne und einem beschleunigten Alterungsprozess. Der Phänotyp der Stämme ∆PaAtpe und ∆PaAtpg lässt sich erfolgreich revertieren. Dadurch konnte bestätigt werden, dass der beobachtete Phänotyp der Deletionsstämme auf den Verlust der Dimerisierungsgene zurückzuführen ist.
2. Die konstitutive Überexpression des PaAtpe-Gens führt zu einer Verlängerung der Lebensspanne, die allerdings nicht abhängig von einer Erhöhung der Dimer-Menge, sondern auf eine Verlängerung der Mitochondriennetzwerke und eine erhöhte Atmung zurückzuführen ist.
3. Obwohl die Lebensspannen der untersuchten PaAtpg_OEx-Stämme voneinander abweichen, ist der auf den Organismus ausgeübte Effekt der PaAtpg-Überexpression positiv. Dabei lässt sich eine Erhöhung der Dimer-Menge auch in diesen Stämmen nicht nachweisen und eine Veränderung der Mitochondrienmorphologie tritt nur in einem der fünf untersuchten Stämme auf, was hier allerdings mit dem größten Effekt auf die Lebensspanne korreliert.
4. Die gleichzeitige Überexpression der Gene PaAtpe und PaAtpg führt interessanterweise zu einer Aufhebung der durch die PaAtpe-Überexpression hervorgerufenen positiven Effekte. Die generierte Doppelmutante weist somit wildtypische Eigenschaften auf. Eine Erhöhung der Dimer-Menge kann trotz Überexpression beider Gene nicht festgestellt werden.
5. Trotz gleicher Funktion in der Dimerbildung der F1Fo-ATP-Synthase ist das Expressionsniveau der Dimerisierungsgene in P. anserina unterschiedlich. Bereits im Wildtyp wird das PaAtpe-Gen weniger transkribiert als das PaAtpg-Gen. Letzteres wird durch die PaAtpe-Überexpression sowohl in den PaAtpe_OEx-Mutanten als auch in der Doppelmutante herunterreguliert. Auch im Wildtyp kommt es zu einer altersabhängigen Herunterregulierung des PaAtpg-Gens.
6. Im Wildtyp nimmt die Dimer-Menge im Alter ab und es kommt zu einer altersbedingten Änderung der Superkomplexe von S1 zu S0. Dies sind Hinweise auf eine altersabhängige Remodellierung der Cristae-Membran, die möglicherweise zum Seneszenzphänotyp von P. anserina beiträgt. Somit ist die Aufrechterhaltung des Dimers von großer Bedeutung für die Gewährleistung mitochondrialer Funktionen des Organismus.
Die F1Fo-ATP-Synthase spielt in ihrer dimeren Form eine bedeutende Rolle in der Aufrechterhaltung der Mitochondrienfunktion und gewährleistet den Ablauf von lebenswichtigen mitochondrialen Prozessen, die für die Erhaltung der zellulären Homöostase von essentieller Bedeutung sind.
An die Signalübertragung im ZNS werden in bestimmten Entwicklungsstadien sehr unterschiedliche Anforderungen gestellt. Im adulten Gehirn dient sie nicht nur der Nachrichtenübermittlung, sondern auch der aktivitätsbasierten Umgestaltung neuronaler Verbindungen bei Lernprozessen und der regenerativen Umgestaltung nach Verletzungen. Im sich entwickelnden Gehirn werden schon frühzeitig Nervenzellen elektrisch erregbar und spontan aktiv. Diese elektrische Aktivität und die dadurch verursachte Transmitterausschüttung spielen bei der selektiven Stabilisierung von Synapsen und damit bei der Ausgestaltung des neuronalen Netzwerks eine große Rolle. Im ZNS von Vertebraten beruht die Wirkung des Neurotransmitters und Neuromodulators Acetylcholin auf den nikotinischen und muskarinischen Acetylcholinrezeptoren. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChRen) koppeln, abhängig von den fünf identifizierten Rezeptorsubtypen (M1- M5), an unterschiedliche intrazelluläre Signalketten an. Dabei interagieren für gewöhnlich die M1, M3 und M5 Rezeptoren mit einem G-Protein des Typs Gq/11, während M2 und M4 ein G-Protein des Typs Gi/o aktivieren. Der Colliculus inferior (IC) ist eine wichtige Verschaltungsstation im auditorischen Mittelhirn von Säugetieren. Inhibitorische und exzitatorische Eingänge werden dort während der Entwicklung mit großer Präzision angelegt und konvergieren auf einzelne ICNeurone. Die physiologische Bedeutung von mAChRen im IC ist weitgehend unerforscht und die Subtypen die im juvenilen IC eine Rolle spielen wurden noch nicht charakterisiert. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit mittels elektrophysiologischer Untersuchungen im IC der juvenilen Ratte (P5-P12) folgende Fragen zu klären: i) Gibt es im IC der jungen Ratte eine Modulation der GABAergen Transmission durch muskarinische Acetylcholinrezeptoren? ii) Welcher muskarinische Rezeptorsubtyp spielt dabei eine Rolle? iii) Welcher intrazelluläre Signalmechanismus ist der Aktivierung des muskarinischen Acetylcholinrezeptors nachgeschaltet? Unter Wirkung von Muskarin kam es bei 41,2% der untersuchten Neurone des Colliculus inferior zu einer Erhöhung der Frequenz der spontanen IPSCs. Die sIPSCs wurden durch Bicucullin blockiert, somit handelt es sich um GABAerge IPSCs. Die Wirkung von Muskarin nahm zu, wenn die Tiere älter als 9 Tage waren. Es wurde gezeigt, dass nAChRen keine Rolle spielen bei der Erhöhung der sIPSC-Frequenz, während eine selektive Blockade der M3-(M5-) mAChRen durch 4-DAMP die Muskarinwirkung blockierte. In der Regel sind die M3-Rezeptoren über folgende Signalkaskade aktiv: Phospholipase C, Kalzium-Calmodulin, NO-Synthase, Guanylatzyklase, die NO-Konzentration und cGMP. Alle Glieder dieser Kaskade wurden untersucht, sie hatten aber keinen Einfluss auf die Muskarinwirkung. Im Gegensatz dazu führte die Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels zu einer vergleichbaren Frequenzsteigerung der sIPSCs wie sie unter der Wirkung von Muskarin gemessen wurde. Weiterhin ließ sich die Erhöhung der sIPSC-Frequenz durch Muskarin vollständig aufheben, wenn die intrazelluläre Adenylatzyklase blockiert wurde. Es ist bekannt, dass der M3-(M5-) mAChR über verschiedenste Signalwege den intrazellulären cAMP-Spiegel verringern oder erhöhen kann und dass die Spezifizierung des Rezeptors vom Grad der Rezeptorexpression, dem Zelltyp und der Kombination der Effektormoleküle abhängig ist. Die Abweichung der juvenilen Kaskade vom im erwachsenen Tier üblichen Signalweg hat dabei den Vorteil, dass eine Aufgabentrennung zwischen Netzwerkbildung und Synapsenstabilisierung einerseits und Signalweiterleitung andererseits erfolgt. Beim juvenilen Tier steht die Netzwerkbildung im Vordergrund, beim erwachsenen Tier wird die Signalweiterleitung moduliert. Der sekundäre Botenstoff NO, der weit diffundieren kann, spielt beim juvenilen Signalweg keine Rolle und dies ermöglicht eine klare Trennung der aktivierten von den umgebenden Synapsen. Dadurch wird eine starke Selektion innerhalb der vorhandenen Synapsen ermöglicht und eine aktivitätsbasierte Netzwerkbildung vereinfacht. Die Etablierung funktioneller GABAerger Synapsen ist ausschlaggebend für die Entwicklung des neuronalen Netzwerks. Innerhalb der ersten postnatalen Wochen führt die Aktivierung von GABAA-Rezeptoren zur Depolarisierung der IC-Neurone und zu einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Acetylcholin potenziert also letztlich den GABA-aktivierten Einstrom von Ca2+ und führt damit zur Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration im postsynaptischen Neuron des IC. Diese modulatorische Wirkung von Acetylcholin könnten damit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Stabilisierung von inhibitorischen Synapsen im sich entwickelnden IC der Ratte spielen.
Untersuchungen zur molekularen Kontrolle der Kupferhomöostase in dem Ascomyceten Podospora anserina
(2007)
Das essentielle Spurenelement Kupfer ist Co-Faktor mehrerer Schlüsselenzyme (z B. Cu/Zn-SOD, Cytochrom c Oxidase). Da Kupfer leicht Elektronen aufnehmen und abgeben kann, eignet es sich besonders gut für Redox-Reaktionen. Wenn Kupfer jedoch mit Sauerstoff reagiert, entstehen hoch cytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die nach der „freien Radikaltheorie des Alterns“ (nach D. Harman 1956) ursächlich für Alterung und Zelltod sind. Um deren Bildung zu vermeiden, erfolgen alle Aspekte des Kupferstoffwechsels – Aufnahme, Transport und Speicherung - stets proteingebunden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich bis auf drei Ausnahmen die gesamte bislang bekannte Maschinerie der molekularen Kupferhomöostase aus anderen Modellorganismen (z.B. S. cerevisiae oder H. sapiens) auch im Genom des Ascomyceten Podospora anserina mit Homologen bzw. Orthologen wiederfindet. Die drei Ausnahmen betreffen jeweils Proteine, für die in anderen Organismen mehrere Isoformen existieren und P. anserina nur jeweils ein Homolog/Ortholog besitzt. Für mehrere der neu vorhergesagten Gene (PaAtx1, PaCcc2, PaCcs1, PaCox11, PaCox19, PaCox23, PaSco1) konnte eine Expression im Wildstamm nachgewiesen werden. Dazu wurden Standardtechniken (Northern Blot Analyse, RT-PCR) und auch neu etablierte eGFP-Reporterkonstrukte verwendet. In Podospora anserina scheint Kupfer auf zwei verschiedene Arten Einfluss auf die Lebensspanne zu nehmen: Zum einen mittelbar darüber, dass die Verfügbarkeit von Kupfer über die in der mitochondrialen Atmung verwendete Endoxidase entscheidet. Bei Kupfermangel wird eine Eisen-abhängige alternative Oxidase (AOX) induziert. Durch Atmung über die AOX entstehen weniger ROS, was die Lebensspanne verlängert. Anhand einer Vielzahl langlebiger Mutanten konnte dieser Zusammenhang bereits mehrfach demonstriert werden. Zum anderen scheint Kupfer auch eine unmittelbare Rolle in der Seneszenz von P. anserina zu spielen. In früheren Arbeiten konnten mehrere indirekte Hinweise (Transkript- und Aktivitätsanalysen) gesammelt werden, dass im Alter die cytoplasmatische Kupferkonzentration drastisch ansteigt. Durch Messung der Kupferkonzentration mittels einer direkten chemisch-analytische Methode (TXRF) in fraktionierten Zellbestandteilen (Cytoplasma und Mitchondrien) konnten in dieser Arbeit diese Hinweise weiter untermauert werden. Experimente mit in die mitochondriale Matrix geleitetem eGFP brachten zusätzliche Indizien dafür, dass das mitochondriale Kupfer-Reservoir die Quelle des sich in seneszenten Pilzstämmen im Cytoplasma wiederfindenden Kupfers ist. Durch einen Prozess, der größenabhängig reguliert und in anderen Organismen als „Mitochondrial Permeability Transition – MPT“ zu Beginn der Apoptose bekannt ist, ergiesst sich beim Eintritt in die Seneszenz der Inhalt der mitochondrialen Matrix in das Cytosol. Die Bedeutung dieses Vorgangs und v.a. die Folgen der Umverteilung von Kupfer innerhalb der Zelle bleiben im Detail weiter zu klären. Durch die durchgeführten Arbeiten konnte ein weiterer deutlicher Beweis für das Ablaufen apoptotischer Mechansimen im Alterungsprozeß des Ascomyceten P. anserina erbracht werden.
Die Zusammensetzung der Plasmamembran tierischer Zellen kann unter anderem durch regulierte Exozytose und durch hydrolytische Abspaltung von Ektodomänen membran-assoziierter Proteine (Ectodomain Shedding) modifiziert werden. Regulierte Exozytose spezialisierter Vesikel, den sogenannten GSVs (GLUT4 containing small vesicles), dient der intrazellulären Speicherung des Glucosetransporters4 (GLUT4) sowie seinem insulin-abhängigen Einbau in die Plasmamembran. Die proteolytische Abspaltung der Ektodomänen von Zelloberflächenproteinen wie z.B. des Heparin-bindenden epidermalen Wachstums-faktors (heparin binding-epidermal growth factor = HB-EGF) führt zur Modifikation der Plasmamembranzusammensetzung. Wir zeigten, dass GSVs in vielen Säugerzellen für die intrazelluläre Speicherung spezifischer Plasmamembranproteine und deren stimulations-abhängigen Transfer in die Plasmamembran zuständig sind. Um GSVs eindeutig identifizieren zu können, wurden Rat1-Zellen stabil mit GLUT4myc als heterologem Marker für dieses spezifische Speicherkompartiment transfiziert. Die intrazelluläre GLUT4-Lokalisation in den als positiv identifizierten Rat1/GLUT4myc-Klonen entsprach dem für CHO/GLUT4-Zellen beschriebenen Verteilungsmuster. In der Folge wurden mehrere potentiell vesikel-assoziierte Membranproteine in die Untersuchungen zur Membran-zusammensetzung einbezogen: eine endogene proHB-EGF hydrolysierende Proteaseaktivität und die Metalloproteasen ADAM10 und TACE. Es zeigte sich, dass GSVs eine Proteaseaktivität enthielten, die VSVG-proHB-EGF hydrolysierte. Eine Colokalisation der beiden endogenen Metalloproteasen ADAM10 und TACE mit GLUT4 in GSVs konnte gezeigt werden. Untersuchungen zeigten, dass beide endogenen Proteasen ADAM10 und TACE in Rat1/GLUT4myc-Zellen mit einer Subpopulation von GSVs assoziiert zu sein scheinen. Die Stimulation des G-Protein-gekoppelten Thrombinrezeptors löste in diesen Zellen eine regulierte Exozytose der GSVs aus. Die Metalloproteasen-enthaltenden GSVs reagierten jedoch nicht auf diese Art der Stimulation. Sie bildeten möglicherweise eine Reservepopulation von GSVs, die erst bei stärkerer Stimulation mobilisiert werden kann. Unter Ruhebedingungen schien auch diese Vesikelpopulation über andere intrazelluläre Kompartimente, nicht jedoch über die Plasmamembran, zu rezirkulieren.
Julia Hansen hat zwischen März und Dezember 2006 Untersuchungen zu Funktion und Struktur der Okklusalflächen in der postcaninen Zahnreihe von Viverriden durchgeführt. Unter verschiedenen Ernährungsregimen bilden Höcker und Täler auf Zähnen, die sich im Gebiss gegenüber stehen, eine Funktionseinheit, mit der Schleichkatzen sowohl in der Lage sind, Früchte zu zerquetschen, als auch den Panzer von Insekten aufzuknacken. In ihrer Studie ist es Frau Hansen gelungen, konstruktive Unterschiede zwischen beiden Nutzungsweisen zu identifizieren. Diese Unterschiede hat sie an verschiedenen fossilen Einzelzähnen der Sammlung Koenigswald überprüft.
Die Stat-Proteine (signal transducers and activators of transcription) bilden eine Familie von 7 verschiedenen Signaltranskriptionsfaktoren, die latent im Zytoplasma vorliegen. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Übertragung von zytokin- und wachstumsfaktorvermittelten Signalen von der Zellmembran in den Nukleus. Die Aktivierung der Stat-Proteine ist ein transienter und streng regulierter Signaltransduktionsprozess, dessen Deregulation eine Rolle bei der Krebsentstehung spielt. In verschiedenen Tumorarten werden vor allem konstitutiv aktive Stat3- und Stat5-Proteine gefunden. Stat5 ist das Hauptsignalprotein bei der prolaktinvermittelten Signaltransduktion im Brustgewebe. Neben Stat3 und Stat1 ist vor allem Stat5A maßgeblich an der Entwicklung und Differenzierung (Laktation) des Brustgewebes beteiligt. Bei der Entstehung von Brusttumoren scheint der Prolaktin/JAK/Stat5-Signalweg ebenfalls involviert zu sein. Die Funktion, die Stat5 dabei hat, ist jedoch weitgehend ungeklärt. Eine gezielte, nur Stat5-abhängige Regulation des Zellsystems ist nur schwer zu untersuchen, da Prolaktin noch eine Reihe weiterer Signalkaskaden aktiviert. In dieser Arbeit wird daher mit Hilfe einer konstitutiv aktiven Mutante die Funktion von Stat5A in der Regulation der Proliferation, Migration, Differenzierung und Apoptose, deren Fehlregulation die Transformation zu Tumorzellen bestimmt, untersucht. Es kann gezeigt werden, dass Stat5 multiple Aufgaben in Brustkrebs- und -epithelzellen übernimmt. Einige dieser Funktionen lassen sich mit der Wirkungsweise von Prolaktin korrelieren. In Tumorzellen hat nicht nur Prolaktin, sondern auch die konstitutiv aktive Stat5A-Mutante Einfluss auf die Proliferation und den Zellzyklus. Die Überexpression dieser Mutante führt, ebenso wie die Prolaktinstimulation, zu einer Erhöhung der Proliferationsrate, die im Falle von Prolaktin Cyclin D1 vermittelt ist. Für die konstitutiv aktive Stat5A-Mutante kann keine Regulation einiger am Zellzyklus beteiligter Proteine festgestellt werden. Die Untersuchungen der Zellmobilität dienen als Marker für das Metastasierungspotential. Sowohl in Brusttumor- als auch in -epithelzellen ist die Fähigkeit zur Migration in Zellen mit konstitutiv aktivem Stat5A, oder nach Prolaktinstimulation erhöht. Für die Tumorentstehung zeichnet sich demnach folgendes Bild: Prolaktin und konstitutiv aktives Stat5A erhöhen sowohl die Proliferations- als auch die Migrationsrate von Brustkrebszellen. Zusammenfassung 2 In der nicht transformierten Brustepithelzelllinie HC11 hat die konstitutiv aktive Stat5AMutante eine andere Funktion. Sie wirkt nicht als Mitogen, wie in Tumorzelllinien, sondern ist in Differenzierungsvorgänge involviert. Die konstitutiv aktive Mutante ist in der Lage, die Signaltransduktion in vitro durch Prolaktin und Dexamethason zu ersetzen und unabhängig davon, die ß-Kaseinbildung zu induzieren. In vivo zeigt sich, dass konstitutiv aktives Stat5A in die Kontrolle der Differenzierung des alveolaren Brustepithels involviert ist. Die alveolaren Strukturen bilden sich schon im jungfräulichen Gewebe und nicht erst in trächtigen Mäusen aus. Eine Überexpression der konstitutiv aktiven Stat5A-Mutante führt in HC11 Zellen jedoch nicht nur zu einer Differenzierung der Zellen, sondern ebenfalls zu einem Anstieg der Apoptoserate. Die konstitutiv aktive Stat5A-Mutante induziert die Expression der negativen Regulatoren des JAK/Stat-Signalweges SOCS1 und SOCS3. Diese blockieren die Janus-Kinase 2, welches wiederum eine Deaktivierung von Stat3 zu Folge hat. Als potentieller molekularer Mechanismus für die Förderung der Apoptose kann eine Inhibierung der Bcl-XL-Expression gezeigt werden. Die Ergebnisse zeigen, das Stat5 unterschiedliche Funktionen sowohl bei der Proliferation und Apoptose als auch bei der Differenzierung von Brustepithelzellen hat. Die Funktion von Stat5 auf das Zellgeschehen scheint vom zellulären Kontext und bereits aktivierten Signalwegen abzuhängen.
Das photoneuroendokrine System der Vertebraten steuert die rhythmische Melatoninsynthese. Melatonin ist ein wichtiges Signal für circadiane und saisonale Rhythmen und für die Synchronisation der Föten mit dem mütterlichen Organismus. Bei Säugetieren besteht das photoneuroendokrine System aus den folgenden Komponenten: der Retina für die circadiane Lichtperzeption, dem endogenen Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) und dem Pinealorgan als neuroendokrinem Effektor. Dieses System vermittelt, durch die nächtliche Abgabe des Hormons Melatonin vom Pinealorgan, Änderungen in den Belichtungsverhältnissen der Umgebung an den Körper. Bei der Synthese von Melatonin im Pinealorgan ist die Arylalkylamin Nacetyltransferase (AANAT) das geschwindigkeitsbestimmende Enzym. Die nächtlich erhöhte Expression von Aanat in Pinealozyten wird vor allem durch die Freisetzung des Neurotransmitter NA aus sympathischen Nervenendigungen angetrieben. NA bindet an adrenerge Rezeptoren in der Pinealozytenmembran und aktiviert den cAMP-Signaltransduktionsweg, der zur CRE-vermittelten gesteigerten Aanat Expression führt. In der Promoterregion von Aanat ist auch ein E-box Promoterelement vorhanden, das durch Uhrenproteine angesteuert werden kann. Bislang jedoch war die Rolle des molekularen Uhrwerkes für die Expression von Aanat noch unklar. Um zu untersuchen, wie sich eine Schwächung des negativen Regulatorkomplexes auf die Expression von Aanat im Pinealorgan und in anderen Geweben auswirkt, wurden Mäuse mit gezielter Deletion des Per1 Gen (Per1 KO) untersucht. Die Expression von Aanat im Pinealorgan von Per1 KO Mäusen, die in der Standardphotoperiode gehalten wurden, zeigte einen circadianen Rhythmus mit ähnlicher Dynamik, aber erhöhter Amplitude im Vergleich zum WT. AANAT Enzymaktivität und Melatoninkonzentration folgen dem gleichen Profil. Eine Verkürzung der Photoperiode hat bei Per1 KO Mäusen starke Auswirkungen auf dieendogene Periodenlänge der Aanat Expression, die sich gegenüber dem WT drastisch verlängert. Bei einer Verlängerung der Photoperiode kommt es zu einer Verzögerung im Rhythmus der Aanat Expression von ca. 8 h gegenüber dem WT. Dies zeigt, dass das molekulare Uhrwerk je nach Photoperiode Amplitude, Periodenlänge und Phasenlage modulieren kann. Um zu untersuchen, ob es sich dabei um Pinealorgan-intrinsische Effekte handelt, wurden in vitro Experimente durchgeführt. Im WT-Pinealorgan gibt es zum Zeitpunkt CT18 ein Sensitivitätsfenster für die NA-induzierte Aanat Expression. Überraschenderweise steigt die Aanat Expression im unstimulierten Per1 KO Pinealorgan in der Nacht signifikant gegenüber dem subjektiven Tag an. Eine weitere Induktion durch NA ist nicht möglich. Dies deutet darauf hin, dass ein abgeschwächter negativer Regulator Komplex (NRC), welcher über das E-box Element wirkt, dieselben Auswirkungen in der Per1 KO Maus hat, wie eine NA-Stimulation im WT. Im WT wird der inhibitorische Effekt des NRC offenbar durch die NA-abhängige Aktivierung von CRE überwunden. Untersuchung zur ektopischen Expression von Aanat zeigten, dass dieses Gen in der Hypophyse einen cicadianen Rhythmus aufweist, der unabhängig von einem intakten molekularen Uhrwerk abläuft. Im Gegensatz dazu findet sich in der Milz von Per1 KO Mäusen eine verstärkte Aanat Expression am subjektiven Tag im Vergleich zum WT. Offenbar hat das molekulare Uhrwerk auch einen Einfluss auf die Gewebespezifität der Aanat Expression. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des molekularen Uhrwerkes im SCN von Melatoninrezeptor1 und 2 defizienten (MT1,2 -/-) Mäusen untersucht. Im Gegensatz zu Mäusen mit intakten Melatoninrezeptoren, zeigen diese Mäuse im Fötalstadium noch keinen Rhythmus in der Anzahl mPER1- und mPER2-Ir Zellen. In diesem Stadium sind die einzelnen SCN-Neurone noch kaum durch Synapsen miteinander gekoppelt. Dies deutet darauf hin, dass das mütterliche Melatonin die rhythmischen Uhrengenexpression in den einzelnen fötalen SCN-Zellen synchronisiert. Erst im juvenilen SCN ist ein Rhythmus der Uhrenproteine identisch mit dem adulten Tier. Zu diesem Stadium sind die intrasuprachiasmatischen Kontakte vermutlich schon soweit ausgebildet, dass kein rhythmisches Eingangssignal für die Synchronisation der SCN-Zellen notwendig ist.
Untersuchungen zur Funktion von Koaktivatoren in der JAK-STAT-vermittelten Transkriptionsaktivierung
(2002)
STAT-Proteine sind latente Transkriptionsfaktoren, die durch Stimulation mit Zytokinen aktiviert werden. STAT5 vermittelt beispielsweise die durch Prolaktin-Stimulation induzierte Bildung von Milchproteinen während der Schwangerschaft. STAT6 wird durch die Zytokine IL-4 und IL-13 aktiviert, die die humorale Immunität regulieren. STAT-Proteine schalten die Transkription ihrer Zielgene an, indem sie bestimmte Koaktivatorkomplexe, die p300/CBP enthalten, an den Promotor rekrutieren. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der NCoA-Koaktivatorfamilie (p160/SRC) für die Transkriptionsaktivierung durch STAT5a, STAT5b und STAT6 untersucht. In transienten Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, daß NCoA-1, jedoch nicht die beiden anderen Vertreter NCoA-2 und NCoA-3, als essentieller Koaktivator dieser STAT-Proteine wirkt. Obwohl NCoA-l von den Transaktivierungsdomänen der drei STAT-Proteine gleichermaßen rekrutiert wird, wird die Bindung über verschiedene Kontaktstellen vermittelt: STAT5 bildet einen Komplex mit NCoA-1 in Zellen, wobei die Interaktion vermutlich durch sekundäre Modifikationen in NCoA-l reguliert ist. Dagegen bindet STAT6 direkt an die aminoterminale Region von NCoA-l in vitro und in vivo. Die Bindungsregion wurde auf einen Bereich von AS 257-420 von NCoA-l kartiert. Somit wurde eine neue Interaktionsdomäne von NCoA-l identifiziert. Die Rekrutierung von NCoA-l wird durch ein LXXLL-Motiv innerhalb der Interaktionsdomäne von STAT6 (AS 792-847) vermittelt, das spezifisch für STAT6 ist. Das LXXLL-Motiv ist essentiell für die Funktion von STAT6, z. B. bei der Expression des endogenen Zielgens Eotaxin-3. Die STAT6/NCoA-l-Interaktion kann kompetitiv durch Peptide bzw. Polypeptide, die von den interagierenden Domänen abgeleitet wurden, und durch spezifische Antikörper inhibiert werden. Diese Inhibitoren haben keinen Effekt auf die Interaktion von nukleären Hormonrezeptoren mit NCoA-l, die ebenfalls durch LXXLL-Motive vermittelt wird. Die Blockierung der STAT6/NCoA-l-Interaktion führt zu einer verminderten Expression des endogenen STAT6-Zielgens Lipoxygenase. In dieser Arbeit wurde erstmals demonstriert, daß über die gezielte Blockierung von Kontaktstellen zwischen Transkriptionsfaktoren und ihren Koaktivatoren endogene Signalwege inhibiert werden können. Somit ergeben sich neuartige Möglichkeiten für die therapeutische Interferenz von Signalwegen, z. B. bei asthmatischen Erkrankungen.
Gephyrin ist ein Protein mit strukturellen und enzymatischen Eigenschaften. Ein Aspekt der strukturellen Funktion ist die synaptische Verankerung inhibitorischer Rezeptoren an das Zytoskelett. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass ein Interaktionspartner von Gephyrin, Collybistin, die Organistion des Aktin-Zytoskeletts reguliert. Die enzymatische Funktion von Gephyrin besteht in der Synthese eines Kofaktors, welcher für die Aktivität von Molybdoenzymen notwendig ist. Das gezielte Ausschalten des für Gephyrin kodierenden Gens weist im Mausmodell einen letalen Phänotyp auf. Als Ursache hierfür kommen die fehlende synaptische Aggregation von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren in neuronalem Gewebe, sowie die fehlende Aktivität von Molybdoenzymen in peripheren Organen in Frage. Da sowohl Molybdän-Kofaktor-Defizienzen beim Menschen, wie auch bestimmte Mutationen von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren bei Mäusen letal sind, kann der beobachtete Phänotyp nicht eindeutig zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit verfolgt zwei Ziele. Das erste ist eine Einengung der Binderegion von Collybistin an Gephyrin. Dabei konnte diese durch immunzytochemische und biochemische Methoden auf wenige Aminosäuren genau beschrieben werden. Verschiedene Strukturvorhersageprogramme weisen auf eine helikale Struktur für diesen Sequenzabschnitt hin. Der Austausch der Aminosäuren R107, D108, R111 und E117 mit Alanin führt über den Verlust ionischer Ladungen zum Verlust der Bindungseigenschaft. Das zweite verfolgte Ziel ist die Einführung eines transgenen Konstrukts, welches nur die Molybdän-Kofaktor-Synthesefunktion wiederherstellen soll, in den genetischen Hintergrund der Gephyrin-„knock-out“ Maus. Ziel dieser Analyse ist die Herstellung eines Phänotyps, bei dem die inhibitorische Transmission in einer Weise gestört ist, welche Symptome der Molybdän-Kofaktor-Insufizienz ausschließt. So sollte die Ursache für die Letalität der Gephyrin-Mutation zugeordnet werden können. Dazu wurde das pflanzliche Gephyrin-Homolog Cnx1 in ein Expressionskonstrukt kloniert, und nach biochemischer, immunzytochemischer und funktioneller Analyse in heterologen Zellen in eine Wildtyp-Mauslinie injiziert. Diese wurde mit Geph-/--Mäusen gekreuzt und die daraus resultierenden homozygoten, transgenen Tiere analysiert. Diese Tiere sterben ebenso wie die Geph-/--Mäuse am Tag der Geburt. mRNA des Transgens konnte in Hirn und Leber nachgewiesen werden, das Protein allerdings nur in Hirnextrakten. Dementsprechend lag die Aktivität des für die Lebensfähigkeit von Säugetieren wichtigsten Molybdoenzyms, der Sulfitoxidase, in Leberextrakten nur bei 30%. Eine morphologische Untersuchung von Gehirnschnitten ergab keine Auffälligkeiten. Eine Immunhistochemische Analyse von Rückenmarkschnitten zeigte in Übereinstimmung mit Beobachtungen an Gephyrin-„knock out“-Mäusen diffus verteilte Glyzin-Rezeptoren. Somit wurde eine Maus mit beeinträchtigter inhibitorischer synaptischer Transmission und partiell wiederhergestellter Molybdän-Kofaktor Biosynthese hergestellt. Aufgrund der großen Schwankungsbreite der Aktivität der Sulfitoxidase in Leberextrakten verschiedener Geph-/- + cnx Tiere wäre ein Unterschied in der Lebenserwartung verschiedener Tiere zu erwarten gewesen, wenn die Defizienz dieses Molybdoenzyms die Ursache für den letalen Phänoyp gewesen wäre. Da die transgenen Tiere aber wie die Geph-/- Mäuse wenige Stunden nach der Geburt sterben, ist davon auszugehen, dass der beschriebene Phänotyp auf das Fehlen der strukturellen Eigenschaften von Gephyrin zurückzuführen ist, und nicht von einer durch Beeinträchtigung des Schwefelstoffwechsels hervorgerufene progressive Schädigung des ZNS.
In der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2 ist neben Patientenschulung, Fewichtsreduktion und körperlicher Aktivität die Therapie mit oralen Antidiabetika von besonderer Bedeutung, um langfristig die Blutzuckereinstellung zu verbessern und kardiovaskuläre wie andere Folgeerkrankungen zu minimieren. Allerdings sinkt im Verlauf die Effizienz dieser Therapie, so dass die dauerhafte Gabe von Insulin notwendig wird. Dabei können jedoch auch schwerwiegende Nebenwirkungen, wie z.B. Hypoglykämien und eine wiederrum mit einem erhöhten Risiko an kardiovaskulären Erkrankungen verbundene ausgeprägte Gewichtszunahme auftreten. Demgegenüber führte der GLP-1 Rezeptor-Agonist Exenatide in jüngsten Studien zu einer Verbesserung der Blutzuckereinstellung und Reduktion des Körpergewichts und kann somit als eine neuartige Therapiealternative zum bisher verwendeten Insulin angesehen werden. In der hier vorliegenden prospektiven Studie wurde Exenatide mit Insulin bei Typ 2-Diabetes Patienten mit einer unzureichenden Stoffwechseleinstellung unter Metformin in Bezug auf deren Blutzuckereinstellung und das Hypoglykämie-Risiko verglichen. In dieser 26-wöchigen, multizentrischen, kontrollierten, randomisierten und zweiarmigen Phase IIIb-Studie wurden insgesamt 494 Patienten aus ganz Deutschland untersucht. Die Patienten mit einer unzureichenden Metformin- (Primärkollektiv) oder Kombinationstherapie (exploratives Kollektiv: Metformin plus Sulfonylharnstoff) wurden im Verhältnis 3:1 auf zweimal täglich Exenatide oder zweimal täglich Mischinsulin Aspart 30/70 randomisiert. In einem hierarchischen Modell wurde zunächst die Nichtunterlegenheit von Exenatide gegenüber dem Mischinsulin im Hinblick auf das primäre Endziel der Blutzuckereinstellung (in Form des HbA1c-Wertes) untersucht und anschließend die Überlegenheit von Exenatide in Hinblick auf ein geringeres Hypoglykämie-Risiko. Sekundäre Studienziele waren die Häufigkeit von schweren und von nächtlichen Hypoglykämien, die Veränderung des Körpergewichts sowie des Body Mass Index. Ferner wurden 7-Punkt-Blutzuckertagesprofile und Patientenfragebögen in die Auswertung einbezogen. Bei der insgesamt in acht Visiten unterteilten Studie erfolgte nach zwei Wochen die Randomisierung auf die beiden Therapie-Arme. Während die Dosierung des Mischinsulins im Verlauf der gesamten Studiendauer vom Arzt individuell titriert werden konnte, wurde die Dosis von Exenatide nach vier Wochen von 2 x 5 μg/Tag auf 2 x 10 μg/Tag verdoppelt und bis zum Ende der Studie nicht verändert. Die hier vorliegende Arbeit ist die erste Studie, die das Hypoglykämie-Risiko unter Exenatide und Mischinsulin als primären Endpunkt prospektiv und konfirmatorisch vergleichend untersucht. Im Primärkollektiv konnte die Nicht-Unterlegenheit von Exenatide zum Mischinsulin in Bezug auf den HbA1c-Wert festgestellt werden. Bei der Vermeidung von Hypoglykämien war Exenatide dem Mischinsulin statistisch signifikant überlegen. Zusätzlich konnte unter der Exenatide-Behandlung ein signifikanter Gewichtsverlust festgestellt werden, wohingegen die Patienten im Mischinsulin-Arm signifikant an Gewicht zunahmen. Die gleichzeitige Erreichung dieser Therapieziele (HbA1c<7,0%, keine Gewichtszunahme und keine Hypoglykämien) wurde als Triple-Endpoint definiert und im Exenatide-Arm signifikant häufiger als unter der Mischinsulin-Therapie beobachtet. In den 7-Punkt-Blutzuckertagesprofilen konnte neben einer allgemeinen Blutzuckersenkung in beiden Therapiearmen eine zusätzliche postprandiale Senkung zu den Zeiten der morgendlichen und abendlichen Exenatide-Injektion beobachtet werden. Demgegenüber waren die präprandialen Blutzuckerwerte im Mischinsulin-Arm niedriger, so dass insgesamt eine vergleichbare Verbesserung des Flächenintegrals in den Blutzuckertageskurven erzielt wurde, was die vergleichbare HbA1c-Verbesserung erklärt. Entsprechend zum Gewicht nahmen auch BMI und Hüftumfang der Patienten unter Exenatide ab und unter Insulin zu. Das Gesamtcholesterin und die Triglyceride sanken unter beiden Therapien leicht ab, HDL-Cholesterin stieg leicht an, wohingegen nur unter Exenatide das LDL-Cholesterin abnahm. Ebenfalls sanken nur im Exenatide-Arm der systolische und diastolische Blutdruck. Die häufigsten unerwünschten Ereignisse unter Exenatide waren Übelkeit, Erbrechen, Verdauungsstörungen, Durchfall, Kopfschmerzen und Erkältungen, wobei Durchfall, Kopfschmerzen und Erkältungen auch unter Insulin zu beobachten waren. Bei der in den Patientenfragebögen DTSQ und SF-12 dokumentierten subjektiven Empfindung der Nebenwirkungen zeigten sich allerdings eine Kompensation der deutlicheren Nebenwirkungen von Exenatide durch dessen Vorteile, u.a. im Hinblick auf seine einfachere Dosierung und der als angenehm empfundenen Gewichtsreduktion. Insgesamt war in beiden Therapie-Armen eine ausreichende Patientenzufriedenheit festzustellen. Unter denjenigen Patienten, bei denen Antikörper gegen Exenatide festgestellt wurden, nahm die Prävalenz einer Antikörperbildung gegen Exenatide bis zum Ende der Studie ab. Die Ergebnisse der hier vorgelegten Studie lassen die Schlussforderung zu, dass der GLP-1 Agonist Exenatide eine therapeutische Alternative zum Mischinsulin in der Behandlung des Diabetes Mellitus Typ 2 darstellt. Da eine Restfunktion der pankreatischen ß-Zellen eine Voraussetzung für den Therapieerfolg darstellt, sollte Exenatide möglichst früh bei nachlassender Wirkung des oralen Antidiabetikums Metformin eingesetzt werden. Hier wirkt Exenatide durch eine Verbesserung der Blutzuckereinstellung, die zudem mit einem verminderten Hypoglykämie-Risiko und einer Gewichtsreduktion verbunden ist. Die Kombination dieser drei bedeutenden Effekte hat den klinisch relevanten Vorteil, das Risiko an kardiovaskulären Spätfolgen und somit die Morbidität und Mortalität von Typ 2-Diabetikern langfristig zu senken. Dieses sollte in einer prospektiven Langzeitstudie untermauert werden.
Das Epsilon-Proteobakterium Wolinella succinogenes wächst unter anaeroben Bedingungen durch Nitrit-Atmung. Als Elektronendonoren werden Formiat oder Wasserstoff verwendet. Die terminale Reduktase der Elektronentransportkette von Formiat zu Nitrit ist der Cytochrom C-Nitrit-Reduktase-Komplex (NrfHA), welcher die Reduktion von Nitrit zu Ammonium katalysiert. Menachinon dient als Redoxmediator. Die katalytische Untereinheit NrfA ist ein Pentahäm Cytochrom c, dessen Struktur bekannt ist. Die Häm c-Gruppe im aktiven Zentrum von NrfA wird über ein ungewöhnliches CXXCK-Motiv kovalent gebunden, während die übrigen vier Häm c-Gruppen über konventionelle CXXCH-Motive gebunden werden. Der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs ist der axiale Ligand des Häm-Eisens der Häm-Gruppe im katalytischen Zentrum. Die Untereinheit NrfH ist ein membranständiges Tetcahäm-Cytochrom C, das den Elektronentransport von Menachinol zu NrfA katalysiert. Im Nitrit-Reduktase-Operon nrfHAIJ wird das Nrfl-Protein kodiert, das ähnlich zu verschiedenen Cytochrom c-Biogenese Proteinen (Ccsl und CcsA) anderer Organismen ist. Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion und Charakterisierung von Mutanten, in denen der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs (K134) von NrfA ausgetauscht wurde oder konservierte Aminosäure-Reste am katalytischen des NrfAProteins ausgetauscht wurden. Weiterhin wurden Mutanten konstruiert und charakterisiert, in denen das nrfl-Gen inaktiviert wurde. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Es wurde eine Mutante konstruiert (W. succinogenes K134H), in der das CXXCK-Motiv im aktiven Zentrum von NrfA in ein konventionelles CXXCH-Motiv gewandelt wurde. Die spezifische Nitrit-Reduktase-Aktivität, gemessen mit reduziertem Benzylviologen als Elektronendonor, betrug maximal 40% der Aktivität des Wildstammes. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug 6% der Aktivität des Wildstamms. Durch MALDI-Massenspektroskopie wurde gezeigt, dass das NrfA-Protein aus dieser Mutante, ebenso wie das Protein aus dem Wildstamm, fünf Häm-Gruppen enthielt. In W. succinogenes Mutanten, in denen der Lysin-Rest 134 gegen Leucin oder Glutamin ausgetauscht wurde, ließ sich das Nrf-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht mehr nachweisen. 2. In W. succinogenes R114L, Y21 8F, H277L wurden konservierte Aminosäure-Reste in NrfA ausgetauscht, die nach dem postulierten Mechanismus der Nitrit-Reduktion an der heterolytischen Spaltung der ersten N-O-Bindung des Nitrits beteiligt sind. Alle diese Mutanten wachsen nicht durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes H277L und R114L besitzen keine Nitrit-Reduktase-Aktivität, obwohl das NrfA-Protein in allen Mutanten nachweisbar war. Die Elektronentransport-Akivität von Formiat zu Nitrit in W. succinogenes Y218F betrug 6% im Vergleich zum Wildstamm und die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug 14% gegenüber dem Wildstamm. Aus der Struktur von W. succinogenes NrfA ist ersichtlich, dass der Glutamin-Rest 276 Teil eines Substrat-Kanals ist, der von der Oberfläche des NrfA-Proteins zur Häm-Gruppe im aktiven Zentrum führt (Einsle et al. 2000). in W. succinogenes Q276E wurde der Glutamin-Rest gegen einen negativ geladenen Glutamat-Rest ausgetauscht. W. succinogenes Q276E wächst nicht durch Nitrit-Atmung. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug in dieser Mutante 6% im Vergleich zum Wildstamm. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität war gegenüber dem Wildstamm um 90% erniedrigt. 3. In der Mutante W. succinogenes stopl wurde das nrfl-Gen durch Einführen von zwei Stop-Codons an den Positionen 47 und 48 inaktiviert. Diese Mutante wächst nicht durch Nitrit-Atmung und besitzt keine Nitrit-Reduktase-Aktivität. Im NrfA-Protein aus W.succinogenes stopl fehlte die über das CXXCK-Motiv ligandierte Häm-Gruppe im aktiven Zentrum, während die übrigen über konventionelle CXXCH-Motive ligandierten Häm-Gruppen vorhanden waren. 4. Die Mutante W. succinogenes Kl34H/stopl, in der das stopl-Gen inaktiviert war und das CXXCK-Motiv in ein fünftes CXXCH-Motiv geändert wurde, entsprach in ihren Eigenschaften dem Stamm W. succinogenes K134H. Daraus ist zu folgern, dass das Nrfl-Protein speziell am Einbau der Häm-Gruppe am CXXCK-Motiv in NrfA beteiligt ist, während Nrfl für den Einbau an CXXCH-Motiven entbehrlich ist. Nrfl ist vermutlich eine spezielle Häm-Lyase, die den Lysin-Rest des CXXCK-Motivs erkennt. 5. Campylobacter jejuni kodiert ein NrfA-Protein, das fünf CXXCH-Motive anstelle von einem CXXCK-Motiv und vier CXXCH-Motiven enthält. In C. jejuni wird die vermutliche Häm-Gruppe des aktiven Zentrums von einem CMNCH-Motiv ligandiert, während in W. succinogenes die Bindung an einem CWTCK-Motiv erfolgt. In den Mutanten W. succinogenes CMNCK und W. succinogenes CMNCH wurde das Häm-Bindemotiv im aktiven Zentrum von NrfA dem von C. jejuni angeglichen. Keine der beiden Mutanten wuchs durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes CMNCK katalysierte den Elektronentransport von Formiat zu Nitrit mit 6% der Aktivität des Wildstamms. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug unter 3% im Vergleich zum Wildstamm. In W. succinogenes CMNCH war das NrfA-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht nachzuweisen. 6. Um die Präparation des NrfA-Proteins und des NrfHA-Komplexes zu erleichtern und um die Präparation der Untereinheit NrfH zu ermögiichen, wurden W, succinogenes Mutanten konstruiert, die einen Hexa-Histidin-Tag an NrfA oder einen Strep-Tag II am N- oder C-terminus von NrfH tragen. Es war aber nicht möglich, den Nitrit-Reduktase-Komplex oder einzelne Untereinheiten durch entsprechende Affinitätschromatographien anzureichern.
Das Volumen von tierischen Zellen ist durch äußere und innere Einflüsse Veränderungen unterworfen. Um die zelluläre Homöostase zu gewährleisten und bedrohliche Volumenänderungen zu verhindern, verfügen die meisten Zellen daher über regulatorische Mechanismen zur Verringerung (regulatory volume decrease, RVD) oder Erhöhung (regulatory volume increase, RVI) des Zellvolumens. Darüber hinaus finden diese Mechanismen auch im Rahmen physiologischer Prozesse, wie z. B. der Zellbewegung oder der Proliferation Verwendung. Der RVD erfordert einen Sensor-Mechanismus, der die Veränderung des Zellvolumens registriert. Die nachfolgende Signaltransduktion führt zur Aktivierung von Transportmechanismen, die v. a. dem Export von K+- und Cl--Ionen, aber auch organischen Osmolyten, dienen und zum Ausstrom von Wasser aus der Zelle führen, bis das Sollvolumen erreicht ist. Bisher ist noch nicht sicher, welcher Mechanismus den RVD einleitet; in verschiedenen Geweben wurden Hinweise auf mehrere mögliche Kandidaten gefunden. In dieser Arbeit wurde der RVD von HaCaT-Zellen, einer humanen Keratinozyten-Zelllinie hinsichtlich der Beteiligung des Aktin-Zytoskeletts mit mikroskopischen, pharmakologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. HaCaT-Zellen schwellen in hypotonem Medium schnell an (30 s) und führen einen RVD durch, der nach ca. 5 min das Ausgangsvolumen wieder herstellt. Der RVD von HaCaT-Zellen ist vom Einstrom extrazellulärer Ca2+-Ionen abhängig. Dieser Einstrom erfolgt durch einen Kanal, der durch die Inhibitoren von stretch activated channels (SAC) Gd3+ und GsMTx-4, sowie den spezifischen Inhibitor des transient receptor potential vaniloid 4 (TRPV4), Rutheniumrot, gehemmt werden kann. TRPV4 wird in HaCaT-Zellen exprimiert. Der RVD und der damit verbundene Einstrom von Ca2+-Ionen, nicht aber das Anschwellen der Zellen werden durch den Abbau des Aktin-Zytoskeletts durch 2 μM Cytochalasin D (CD) gehemmt. Die Hemmung durch CD ist reversibel; nach dem Entfernen von CD bildet sich innerhalb von 30 min erneut ein Netzwerk von Aktinfilamenten aus. Ein zwei-stufiges Absenken der Osmolarität (jeweils ca. 20%), zunächst in Anwesenheit von CD führt zu einer Volumenzunahme, löst aber keinen RVD aus. Auch nach dem Entzug von CD bleibt das Volumen konstant erhöht. Erst das zweite Absenken löst eine Volumenregulation aus, allerdings nur bis zu dem Volumen, das nach dem Entfernen von CD etabliert war. Die mikroskopische Struktur des Aktin-Zytoskeletts von HaCaT-Zellen ändert sich während des RVD kaum. Durch die Messung der Fluoreszenz von gebundenem Rhodamin-Phalloidin konnte ein vorübergehender Anstieg der Menge von Aktinfilamenten (F-Aktin) während des RVD gezeigt werden. Ein quantitativer biochemischer Ansatz zeigt, dass die relative Menge des Triton- X-100-löslichen Anteils des Aktin-Zytoskeletts im gleichen Zeitraum zunimmt. Der RVD von HaCaT-Zellen hängt ebenfalls von der Geschwindigkeit der Osmolaritätsänderung ab; die langsame Verringerung der Osmolarität (≤ 5 mosM/min) führte zum Anschwellen, nicht aber zum RVD. Auf Basis der erzielten Ergebnisse wird ein Modell für den RVD von HaCaTZellen vorgeschlagen, bei dem der Anstieg des Zellvolumens zu einer Zunahme der mechanischen Spannung im kortikalen Zytoskelett führt. Dadurch wird – indirekt, etwa durch Phospholipase A2, oder direkt - TRPV4 aktiviert. Dies führt zu einem Einstrom von extrazellulären Ca2+-Ionen und über Ca2+-abhängige Aktin-bindende Proteine (z. B. Gelsolin) zu einer Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts (Gel-Sol-Übergang) und verbunden damit zu einer Abnahme der mechanischen Spannung. Ca2+-Ionen und kurze Aktinfilamente aktivieren Transportmechanismen, die zum Ausstrom von K+- und Cl-- Ionen und einer Abnahme des Zellvolumens führen.
Maligne Gliome sind die häufigsten Neoplasien des Zentralen Nervensystems. Sie zählen zu den hypoxischsten Tumoren und entwickeln u.a. durch die Adaption an niedrige Sauerstoffbedingungen Apoptose-resistente Phänotypen. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch schnelle Proliferation und ein diffuses, infiltratives Wachstum in das umliegende Neuropil aus, was eine vollständige Tumor-Resektion unmöglich macht. Entsprechend liegt die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose trotz chirurgischen Eingriffs bei anaplastischen Astrozytomen (WHO Grad III) zwischen 18 und 20 Monaten und bei Glioblastomen (WHO Grad IV) zwischen 12 und 15 Monaten. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden 17 Gliomzelllinien in einem in vitro-Anoxiemodell auf ihre Hypoxie-Sensitivität hin untersucht. Dabei wurde eine hohe Variabilität hinsichtlich der Hypoxie-Toleranz festgestellt, sowie die Tendenz zu einer ausgeprägter Anpassung an niedrige Sauerstoffverhältnisse, begleitet von der Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential (delta psi m) aufrecht zu erhalten. Der durch Hypoxie induzierte Zelltod wurde als Caspase-unabhängig und Nekrose-ähnlich charakterisiert. Apoptose wurde hingegen auch in den Hypoxie-sensitiven Zelllinien nach 48 stündigem Sauerstoffentzug nur in sehr geringem Ausmaß beobachtet. Funktionelle Analysen mit den synthetischen BH3-Mimetika HA14-1 und BH3I 2’, die selektiv Bcl-2 bzw. Bcl xL/Bcl-2 inhibieren, lassen darauf schließen, dass die für Gliomzellen typische Bcl-2- und Bcl xL-Überexpression eine Blockade des mitochondrialen Signalwegs verursacht und so entscheidend zur Apoptose-Resistenz der Zellen beiträgt. Der Todesligand TRAIL, der selektiv in Tumorzellen Zelltod aktiviert, ist ein vielversprechender Kandidat für neue Apoptose-induzierende Krebstherapien. Da jedoch einige Krebszelltypen einschließlich maligner Gliome weitgehend gegen TRAIL resistent sind, richtet sich das Interesse verstärkt auf kombinatorische Therapieansätze, die Tumorzellen für TRAIL resensitivieren sollen. Nur zwei von sechs untersuchten Gliomzelllinien reagierten auf die Behandlung mit TRAIL, wobei eine Korrelation zwischen Hypoxie- und TRAIL-Resistenz deutlich wurde und die Hypothese einer ausgeprägten Kreuzresistenz stärkt. Ein Zusammenhang zwischen TRAIL-Sensitivität und TRAIL-Todes- bzw. –Decoy-Rezeptor-Expression konnte indes nicht hergestellt werden. Der Vergleich von konventionellen Therapienansätzen (Gamma-Bestrahlung) mit neuartigen Wirkstoffklassen (BH3-Mimetika und Proteasomeninhibitoren) zeigte, dass Gamma-Bestrahlung lediglich in TRAIL-sensitiven Zellen synergistisch mit TRAIL wirkte, während die BH3-Mimetika den TRAIL-induzierten Zelltod sowohl in TRAIL-sensitiven als auch –resistenten Zellen signifikant erhöhten. Diese Befunde legen nahe, dass die hohen Bcl-2- und Bcl xL-Proteinlevel verschiedene Signalwege hemmen, die an den Mitochondrien konvergieren und dadurch die Apoptose- bzw. Therapie-Resistenz maligner Gliome steigern. Der Einsatz der Proteasomeninhibitoren MG132 und Epoxomicin erwies sich vergleichsweise als am effizientesten: Beide Substanzen vervielfachten p53-unabhängig den TRAIL-induzierten Zelltod in TRAIL-sensitiven Gliomzellen und reaktivierten darüber hinaus potent die TRAIL-induzierte Apoptose in den TRAIL-resistenten Zelllinien. Microarray- und semi-quantitative RT-PCR-Analysen ergaben eine potente transkriptionelle Aktivierung des TRAIL-Rezeptors DR5 und der Stress-induzierten Transkriptionsfaktoren CHOP und c-Jun. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und RNA-Interferenz zeigten, dass die CHOP-unabhängige, JNK/c-Jun-Signalwegs-vermittelte Aktivierung von DR5 eine maßgebliche Rolle bei der Proteasomeninhibitor-induzierten Sensitivierung von Gliomzellen für TRAIL spielt. Zusammengenommen legen die vorgelegten Befunde nahe, dass neue Ansätze basierend auf TRAIL oder agonistischen TRAIL-Rezeptor-Antikörpern in Kombination mit Proteasomeninhibitoren oder BH3-Mimetika vielversprechende Strategien zur Überwindung der Therapieresistenz maligner Gliome darstellen.
Einige Teilergebnisse dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Mahnke K., Schönfeld K., Fondel S. et al (2007), Int. J. Cancer 120; 2723-2733 Depletion of CD4+CD25+ human regulatory T cells in vivo: Kinetics of Treg depletion and alterations in immune functions in vivo and in vitro Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Treg depletierende Wirkung von ONTAK, einem Fusionsprotein aus Interleukin-2 und Diphterietoxin, untersucht. Hierzu wurde ONTAK in Zellkultur auf humanen Lymphozyten getestet und anschließend Melanomapatienten verabreicht. ONTAK konnte sowohl in vitro als auch in vivo eine Depletion von Tregs induzieren, wenngleich der in vivo Effekt nicht vollständig war. Des Weiteren wurde der immunologische Effekt, der auf die Reduktion der Tregs zurückzuführen ist, untersucht. Hierzu wurden die Patienten mit DCP behandelt, welches normalerweise zu einer schwachen Entzündungsreaktion führt. Nach Treg Depletion wurden starke Kontaktekzeme in den Patienten induziert. Aufgrund dieser verstärkten Immunantwort erfolgte eine Applikation der Tumorpeptide MART1 und gp100 in das Kontaktekzem. Anschließend konnten peptidspezifische CD8 T-Zell Populationen detektiert werden, die sowohl INF-γ sekretierten, als auch zytotoxisch aktiv waren. Solche starken Immunantworten wurden bisher nur unter zu Hilfenahme starker Adjuvanzien induziert. ONATK führt bereits nach einmaliger Applikation zu einer Depletion regulatorischer T-Zellen in vivo. Dabei wird der Gehalt von 4 % regulatorischen T-Zellen im Blut auf einen Gehalt von 1 % gesenkt. Diese Depletion der Tregs verstärkt eine Immunisierung mit Peptiden, die eine starke CD8 T-Zell vermittelte Immunantwort induziert. Allerdings kam es zu keiner vollständigen Depletion der Tregs, was durch die geringe in vivo Halbwertszeit von ONTAK, sowie durch unbekannte Mechanismen der Treg Homöostase erklärt werden könnte. Die Wirkweise von ONTAK konnte nur im Blut, aber nicht in anderen Organen wie z.B. Lymphknoten erforscht werden, daher besteht die Möglichkeit, einer unvollständigen Depletion der Zellen in peripheren Organen. In wieweit Tregs im Blut mit anderen Zellen wechselwirken ist weitgehenst unerforscht. Die meisten Untersuchungen zeigen Zell-Zell Interaktionen in den Lymphknoten und im entzündeten Gewebe. Der Ort, an dem die Tregs aber wirklich ihr suppressives Potential auf andere Zellen entfalten, ist noch unbekannt. Hiermit beschäftigt sich der zweite Teil dieser Arbeit. Zur Beantwortung dieser Frage sollten Tregs in vivo in Mäusen in die Haut oder den Lymphknoten geleitet werden. Um das Vorhaben auszuführen, wurden die Zytokinrezeptoren CCR7, CCR9 und CCR10 sowie die Adhäsionsmoleküle PSGL-1, ESL-1 und CD103 kloniert und in zwei Expressionssystemen getestet. Ein lentivirales System zeigte eine schlechte Transduktionseffizienz, so dass ein zweites System mit einer Elektroporationstechnik, der Nucleofection gewählt wurde. Dieses führte zu Expressionseffizienzen von ca. 40 %. Zuerst wurde die Funktionalität der klonierten Moleküle in vitro in der murinen T-Zellline EL-4 in Transwell- und Flowchamberversuchen demonstriert, anschließend wurden murine in vitro expandierte Tregs nucleofiziert. Eine umfassende Analyse der nucleofizierten Zellen zeigte eine Heraufregulation von CD69 und eine Herunteregulation von CD62L, was auf eine Aktivierung der Zellen deutet. Mit einhergehender Aktivierung nahm auch die Apoptoserate der Zellen zu, diese konnte auch durch Modifikationen der Nucleofections- sowie der Kulturbedingungen nicht verringert werden. Nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden nach der Nucleofection ließen sich noch adhäsive Eigenschaften der exprimierten Moleküle in der Flowchamber nachweisen. Im Suppressionstest, in dem die Zellen über einen Zeitraum von drei Tagen inkubiert wurden, waren die Zellen jedoch nicht mehr suppressiv. Daher wären die in vivo Versuche, die den suppressiven Einfluß der Tregs auf die Ohrschwellung in Abhängigkeit ihrer Lokalisation untersuchen sollten, erfolglos geblieben. Mit der Induktion der Apoptose stießen die hier verwendeten Methoden an ihre Grenzen. Zur Realisierung des Projekts müssten andere Transduktionssysteme oder Tregs aus knock out Mäusen verwendet werden. Regulatorische T-Zellen nehmen eine Schlüsselrolle bei der Suppression von anti-Tumor Immunantworten aber auch bei dem Schutz vor Autoimmunerkrankungen ein. Eine erfolgreiche Manipulation dieser Zellen in vivo oder in vitro bildet eine solide Basis für neuartige Immuntherapien gegen entsprechende Krankheiten. ONTAK ist ein wirkungsvolles Medikament, um die Anzahl der regulatorischen Zellen in vvo zu reduzieren. Es trägt dadurch zu einer verstärkten Immunantwort bei. Eine einmalige Gabe von ONTAK ist sicherlich nicht ausreichend, um Tumore zu bekämpfen, es kann aber Immuntherapien unterstützen. Eine Manipulation von Tregs, durch die Expression von Transgenen um ihr Migrationsverhalten in vivo zu beeinflussen und damit die Suppression von Autoimmunerkrankungen zu bedingen, ist noch nicht ausgereift und bedarf noch weiterer Forschung.
In der vorliegenden Arbeit wurden Tauben daraufhin trainiert, in einer Außenvoliere verstecktes Futter zu finden. Nachdem die Tauben diese Aufgabe erlernt hatten, fand keine weitere Verbesserung des Wiederfindeverhaltens statt. Die komplexe Aufgabe, drei aus 48 möglichen Bechern auszuwählen, wurde mit einer überraschend hohen Präzision von den Tauben gelöst. Zudem erwies sich das Ortsgedächtnis als zeitlich äußerst stabil. Die Ergebnisse meiner Arbeit belegen zum ersten mal, dass Brieftauben (Columba livia) in der Lage sind, sich über einen Zeitraum von mindestens 5 Jahren einmal erlernte Orte zu merken, ohne dabei vermehrt Fehler zu machen. Unterschiedliche Fehlerquoten konnten infolge der unterschiedlichen Anordnung der Futterverstecke gefunden werden. Dabei war es für Tauben offensichtlich schwieriger, Futterverstecke in einer flächigen Anordnung aufzusuchen. Die Taubengruppen, deren Zielbecher in einer Reihe angeordnet waren, zeigten eine stärkere Reihenfolgepräferenz beim Aufsuchen der Futterverstecke. Diese Reihenfolgepräferenz führte zu einer geringeren Fehlerquote. Der Sonnenkompass scheint beim Aufsuchen der Futterverstecke für die Brieftauben eine wichtige Rolle zu spielen. Alle vier untersuchten Taubengruppen reagierten auf eine Verstellung der inneren Uhr mit einer Abweichung ihrer Richtungspräferenzen in die erwartete Richtung. Dabei sind Unterschiede in der Stärke dieser Abweichung zwischen den Gruppen und zwischen einzelnen Individuen feststellbar. Diese Abweichung ging wieder zurück, sobald die innere Uhr der Tiere wieder dem natürlichen Tagesrhythmus angepasst war. Diese Beobachtung kann als weiterer Beleg für das Nutzen des Sonnenkompasses in der Voliere zum Auffinden von Futterorten gewertet werden. Aber auch die Landmarken in der Umgebung der Versuchsvoliere werden als Orientierungsparameter von den Tauben genutzt. So erhöhte sich die Fehleranzahl deutlich, wenn die Voliere nach außen hin abgeschirmt wurde. Dieser Effekt verstärkt sich, wenn zusätzlich zur Abschirmung bei bedecktem Himmel die Sonne nicht mehr sichtbar ist. Offensichtlich nutzen die Tauben zur Orientierung im extremen Nahbereich, genau wie in der Fernorientierung, ein multifaktorielles System. Fällt einer der Faktoren aus, wie beispielsweise die Sonne, kann auf ein anderes System zurückgegriffen werden. Die Tauben waren auch bei der Manipulation zweier Orientierungssysteme, wie dies bei der Abschirmung der Voliere von den äußeren Landmarken bei gleichzeitigem bedecktem Himmel der Fall war, immer noch in der Lage, Futterorte zu finden. Dies spricht für das Vorhandensein weiterer Orientierungsfaktoren. Welcher Art diese Faktoren sind, könnte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein weit verbreitetes Humanpathogen, welches den menschlichen Magen besiedelt und zu schwerwiegenden entzündlichen Erkrankungen des gastralen Traktes führen kann. Bereits 1994 wurde das Bakterium als ein Klasse 1 Karzinogen deklariert, da H. pylori im erwiesenen Maße mit der Entstehung von hochinvasivem Magenkrebs in Verbindung gebracht wird. In vitro induziert H. pylori eine starke Migration der infizierten Epithelzellen, die unter anderem mit der Auflösung der Zellkontakte einhergeht. Die zugrunde liegenden molekularen Zusammenhänge konnten bisher noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Die Mechanismen der Auflösung der Zelladhäsion wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht, um einen tieferen Einblick in die H. pylori vermittelten Virulenz zu erhalten. So konnte eine H. pylori-induzierte Dissoziation des E-Cadherin Komplexes, bestehend aus p120, 􀄮- und 􀈕-Catenin beobachtet werden, der in einem Verlust der Zelladhäsion resultierte. Es konnte darüber hinaus eine Spaltung der extrazellulären Domäne von ECadherin detektiert werden, die wahrscheinlich zu einer Destabilisierung und somit zur Auflösung des gesamten E-Cadherin Komplexes führte. Durch den Zerfall der Adhärenzverbindungen wurden Catenine in den zytoplasmatischen Pool freigegeben, von denen p120 in den Zellkern translozierte und die Transaktivierung von Zielgenen auslöste, die in diesem Zusammenhang mit Hilfe von Reportergenanalysen quantifiziert wurden. Diese Prozesse zeigten sich von dem Pathogenitätsfaktor CagA (cytotoxin associated gene A) unabhängig, der über das bakterielle Typ IV Sekretionssystem in die Wirtszellen transloziert wird und krebsassoziierte Signaltransduktionswege aktivieren kann. In weiteren Untersuchungen wurden deshalb die Auswirkungen löslicher H. pylori Faktoren auf die Spaltung von E-Cadherin und folglich auf die Zellmotilität und Morphologie epithelialer Zellen analysiert. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden in weiteren Experimenten proteolytische Aktivitäten von H. pylori untersucht. Dabei konnte erstmalig die hypothetische Protease HtrA (high temperature requirement protein A) von H. pylori durch massenspektrometrischen Analysen als eine caseinolytisch aktive Protease gefunden werden. Nach der Klonierung und Aufreinigung von HtrA konnte darüber hinaus auch E-Cadherin als spezifisches biologisches Substrat der Wirtszellen für HtrA identifiziert werden. Diese selektive Fragmentierung von E-Cadherin durch HtrA fügt sich als ein neues Element in das Modell der H. pylori Pathogenese, die einen initialen Schritt in der frühen Phase der Infektion darstellen könnte.
Humanpharmaka stellen eine permanente Belastung von Gewässern dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gemäß dem von der Europäischen Arzneimittelagentur EMEA entwickelten Konzept zur Durchführung von Umweltrisikobewertungen von Humanpharmaka mit mehreren ausgewählten Substanzen Umweltrisikobewertungen durchgeführt. Die hierfür ausgewählten Pharmaka sind das Antiepileptikum Carbamazepin (CBZ), das Antibiotikum Sulfamethoxazol (SMX) und das synthetische Östrogen 17a-Ethinylöstradiol (EE2). Als Vertreter der Inhaltsstoffe von Körperpflegeprodukten wurde der polyzyklische Moschusduftstoff Tonalid (AHTN) in die Untersuchungen mit einbezogen. Mit Hilfe von Literaturrecherchen wurde die Datengrundlage für Expositions- und Wirkungsabschätzungen bereitgestellt. Der vorhandene recherchierte Datensatz wurde mit entsprechenden Kurz- und Langzeitstudien ergänzt. Die mit den Ergebnissen der Expositions- und Wirkungsabschätzungen vorgenommenen Umweltrisikobewertungen ergaben im ersten Schritt basierend auf Kurzzeitstudien unter den ausgewählten Substanzen lediglich für den Moschusduftstoff AHTN ein erhöhtes Umweltrisiko für Oberflächengewässer. Basierend auf weiterführenden Langzeitstudien konnte das zunächst erkannte, durch AHTN indizierte Umweltrisiko entkräftet werden, jedoch ergaben die Risikocharakterisierungen für EE2 und SMX ein erhöhtes Risiko für das aquatische Kompartiment. Auf Grund der erhöhten Adsorptionspotenziale von CBZ, EE2 und AHTN wurden für diese Substanzen kompartimentspezifische Umweltrisikocharakterisierungen durchgeführt. Dabei wurde ein erhöhtes Umweltrisiko durch CBZ für das Kompartiment Sediment angezeigt. Basierend auf den Ergebnissen einer Sediment-Bioakkumulationsstudie mit dem endobenthischen Oligochaeten Lumbriculus variegatus, welche in einen unerwartet hohen Akkumulationsfaktor resultierte, und aus der Literatur verfügbaren Fisch-Biokonzentrationsfaktoren wurde anhand der Nahrungskette Wasser-Sediment-Wurm-Fisch die Möglichkeit des ‚secondary poisonings’ durch EE2 bei wurmfressenden Fischen unter natürlichen Bedingungen aufgezeigt. Zur Verwendung dieses Ergebnisses in einer Umweltrisikobewertung zum Zwecke der Zulassung von Pharmaka sollten weitergehende Untersuchungen zur Bestätigung durchgeführt werden. Bezugnehmend auf die Resultate der eigenen Studien und auf die besonderen Eigenschaften von Humanpharmaka wurde der EMEA-Richtlinienentwurf diskutiert und Verbesserungsvorschläge erarbeitet. Bis auf wenige Anpassungen geht das EMEA-Bewertungsschema nicht auf die Besonderheiten und spezifischen Eigenschaften von Humanpharmaka ein. Hauptkritikpunkte bezogen sich auf (1) die Anwendung eines konzentrationsabhängigen Schwellenwertes als Entscheidungsgrundlage zur Durchführung einer Risikocharakterisierung, (2) das stufenweise Vorgehen bei der Wirkungsabschätzung mit zuerst ausschließlich auf Kurzzeitstudien basierenden Effektdaten, und (3) unzureichende Angaben zu Vorgehensweisen in der höheren Stufe des Bewertungsschemas, vor allem bei Substanzen mit außergewöhnlichem ökotoxikologischen Potenzial. Trotz der zur Zeit intensiven internationalen Diskussion über mögliche Auswirkungen durch endokrine Disruptoren auf Mensch und Umwelt sieht der EMEA-Richtlinienentwurf nicht ausdrücklich vor, die Umweltgefährdung durch potenziell endokrin wirksame Substanzen mit spezifischen Testmethoden festzustellen und zu bewerten. Die Erkenntnis, dass spezifische Wirkmechanismen bei Chemikalien, speziell bei Arzneimitteln und Bioziden, auch in sehr niedrigen Konzentrationen zu Wirkungen in der Umwelt führen können, bleibt im EMEA-Richtlinienentwurf auf Grund der Einführung eines expositionsbezogenen Schwellenwertes und der Wirkungsabschätzung mittels Akutstudien nur unzureichend berücksichtigt. Zur Schließung dieser Lücke, die durch Untersuchungen zu endokrinen Wirkungen in der Umwelt offensichtlich wurde, müssen neue und bessere ökotoxikologische Instrumente entwickelt werden und das Umweltrisikobewertungsschema entsprechend erweitert und angepasst werden.
RNA hat neben der Rolle als Informationsüberträger wichtige Aufgaben in regulatorischen Prozessen. Sie kann komplexe Strukturen ausbilden und ähnlich wie Proteine Liganden binden oder enzymatische Reaktionen katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollten zwei Beispiele von RNA-Liganden-Interaktionen untersucht werden. Im ersten Abschnitt wurde die Interaktion des TetR-bindenden Aptamers 12-1 mit dem Tetracyclin-Repressorprotein (TetR) biochemisch charakterisiert. Über Gelverzögerungs- experimente wurde gezeigt, dass das Aptamer 12-1K delta A TetR mit hoher Affinität und Spezifität bindet. Es wurde ein KD von 22 nM bestimmt. Die Bindung ist dabei ebenso stark wie die Bindung von TetR an die Operatorsequenz tetO. In Anwesenheit von Tetracyclin (Tc) nimmt die Affinität des TetR/Aptamer-Komplexes um das sechsfache ab. Des Weiteren konnten die Bindeepitope des Aptamers durch eine Analyse von verschiedenen TetR-Mutanten im DNA-Bindebereich bestimmt werden. Die Aminosäuren T27, N47 und K48 sind dabei essentiell für die RNA-Bindung und führen bei einem Austausch zum Verlust der RNA-Bindung. Der Bindebereich des Aptamers überlappt mit Aminosäureresten, die für die tetO-Bindung essentiell sind. Die Stöchiometrie der TetR/Aptamer-Bindung wurde durch LILBID-Messungen auf eine molare Verteilung von 2:1 festgelegt. Ein TetR-Dimer bindet dabei ein Aptamermolekül. Durch die umfassende biochemische Analyse der TetR/Aptamer-Bindung kann das Aptamer 12-1 nun als Expressionssonde für RNAs in bakteriellen Zellen genutzt werden. Des Weiteren kann das Aptamer als alternativer, artifizieller Transkriptionsregulator im tet on / tet off-System verwendet werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollten miRNAs identifiziert werden, die an der posttrans- kriptionellen Regulation der 5-Lipoxygenase (5-LO) und der Cyclooxygenase-2 (COX-2) beteiligt sind. Mit bioinformatischen Vorhersageprogrammen wurden die 3’-UTR- Bereiche von 5-LO und COX-2 nach putativen Bindestellen abgesucht. Im Fall der 5-LO wurden durch eine zusätzliche Microarray-Expressionsanalyse miRNAs ausgewählt, welche in 5-LO positiven Zellen hoch exprimiert sind und Bindestellen im 3’-UTR aufweisen. Es konnten verschiedene miRNAs detektiert werden, jedoch keine Regulation der 5-LO Aktivität beobachtet werden. Für COX-2 wurde neben der Suche nach putativen miRNA-Bindestellen zudem die Stabilität des 3’-UTR untersucht. Mit Hilfe des auf Perl basierenden Programms SignificanceScoreAssignment (Florian Groher, Diplomarbeit 2011) konnte der 3’-UTR von COX-2 als generell destabilisierend analysiert werden. In Colonkarzinom- spezifischen HT-29-Zellen wurden miRNAs untersucht, welche Bindestellen im 3’-UTR von COX-2 aufweisen. In diesem Kontext sollte der Einfluss einer Interaktion von HT- 29-Zellen mit aktivierten Thrombozyten sowie daraus isolierten Bestandteilen wie Mikropartikeln und PDGF analysiert werden. MiR-16, miR-26b, miR-199a und miR- 199a* konnten in HT-29-Zellen nachgewiesen werden. Bei einer Stimulation von HT-29- Zellen mit PDGF-BB werden miR-16 und miR-26b konzentrationsabhängig stärker exprimiert, während die Expression von miR-199a und miR-199a* signifikant abnimmt. Eine direkte Regulation von COX-2 durch die untersuchten miRNAs konnte durch Überexpressions- und Reportergenanalysen jedoch nicht festgestellt werden. Die Analysen der 5-LO- und COX-2-Regulation durch miRNAs stellen Vorarbeiten dar. Die etablierten Methoden können nun für eine detaillierte Betrachtung weiterer miRNAs verwendet werden.
Die Onkogenese geht mit einer Deregulation des Zellzyklus einher. Dabei spielt unter anderem die Regulation verschiedener krebsrelevanter Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle. Ein Interaktionspartner und Regulator vieler dieser Faktoren ist das LIM-only Protein FHL2. Es ist bereits bekannt, dass sich der FHL2-Status zwischen normalen und entarteten Zellen in allen bisher untersuchten Geweben unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass dies auch im Brustgewebe der Fall ist. FHL2 wird in fast allen aggressiven Mammakarzinomen überexprimiert, nicht aber im Normalgewebe und nur schwach in nicht-invasiven "DCIS". Dies weist darauf hin, dass die FHL2-Menge mit der Aggressivität des Tumors korreliert. Weiterhin konnte hier zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass FHL2 in die Zellzyklusregulation involviert ist. Am G1/S-Übergang kann FHL2 die Cyclin D1-Expression induzieren, was letztendlich zu einer Phosphorylierung des RB-Proteins und zum Eintreten der Zelle in die S-Phase führt. Wichtiger aber ist die hier gezeigte FHL2-abhängige Induktion von p21CIP/WAF, ein Zellzyklusinhibitor, der unter anderem auch in der G2/M-Kontrollpunkregulation involviert ist und normalerweise über p53 reguliert wird. Diese Induktion resultiert dort in einem verlangsamten Kontrollpunktübergang, wogegen eine Reduktion des FHL2-Gehalts einen beschleunigten G2/M-Übergang zur Folge hat. Zusätzlich zeigten Expressionsanalysen mit synchronisierten Brustkrebszellextrakten dass FHL2 zellzyklusabhängig exprimiert wird, mit einem Maximum am G2/M-Kontrollpunkt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die p21-Expression in den hier verwendeten Brustkrebszelllinien p53-unabhängig ist und ausschließlich von FHL2 abhängt. Hierbei wird die FHL2-abhängige p21 Expression wahrscheinlich über die Aktivierung des c-jun-Transkriptionsfaktors im MAPK-Signaltransduktionsweg induziert. In vivo und in vitro Interaktionsstudien haben eine Interaktion von FHL2 mit c-jun gezeigt, wobei die Interaktion über die ersten beiden LIM-Domänen vermittelt wird. Der FHL2-c-jun-Komplex bindet an die AP-1-Sequenz innerhalb des p21-Promotors und induziert dadurch p21. Dies führt zu einer Inhibition verschiedener CDE/CHR-regulierter Proteine wie CDC25C oder Plk1 und zu einer verzögerten Zellzyklusprogression. In diesem Zusammenhang konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die FHL2-Expression nicht nur zu einer verlangsamten Proliferation führt, sondern auch zur Fähigkeit der Zelle zum zellmatrixunabhängigen Wachstum beisteuert. Es scheint auf den ersten Blick widersprüchlich, dass FHL2 für einen intakten G2/M-Kontrollpunkt und eine geringere Proliferationsrate sorgt, gleichzeitig aber zur Tumorentwicklung beiträgt. Es ist allerdings bekannt, dass Tumore ihr Wachstum verlangsamen bevor sie metastasieren. Auch führt ein erhöhter p21-Gehalt im Cytosol zu einer Inhibition der Apoptose, einer weiteren Eigenschaft von Tumoren. FHL2 ist daher ein signifikanter Faktor in der Onkogenese des Mammakarzinoms und aufgrund der differentiellen Expression in vielen Tumoren ein interessantes Ziel für Krebstherapien.