Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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In this thesis the integral membrane protein diacylglycerol kinase (DAGK) from E.coli is investigated with solid-state NMR. The aim is to gain an insight into the enzyme’s mechanism through integration of kinetic, structural and dynamic data. The biological function of DAGK is the transfer of the γ-phosphate group from Mg*ATP to diacylglycerol (DAG) building phosphatidic acid (PA)[6] as port of the membrane-derived oligosaccharide cycle[31,34]. Surprisingly, DAGK does not share structural or sequential similarities with other kinases[12]. Typical sequence motives found in other kinases, which catalyze phosphoryl transfer reactions, are not found[13]. In its physiological form DAGK is a homo-trimer with nine transmembrane helices, three catalytic centers and a size of 39.6 kDa.
First, the set-up of a real-time 31P MAS NMR experiment is shown. This experiment allows measuring in real-time the simultaneous ATP hydrolysis in the aqueous phase and lipid substrate phos-phorylation in the membrane phase with atomic resolution under magic angle spinning[56]. After fast transfer of the sample into the NMR spectrometer the enzymatic reaction is started with a temperature jump. This approach of real-time MAS NMR in a dual-phase system was demonstrated for the lipid substrate analogs dioleoyl- (DOG) and dibutyrylglycerol (DBG), with a C8 and C4 aliphatic chain, respectively. The combination of 31P direct and cross polarization functions as a dynamic filter. In the 31P direct polarized experiment nuclei in both phases are detected, while in the 31P cross polar-ized experiment, only nuclei in the membrane phase are detected. Rates for substrate turnover, i.e. degradation of γP-, βP, αP-ATP and build-up of βP-, αP-ADP, free phosphate as side reaction, and PA are obtained, which reveal a Michaelis-Menten behavior with regard to Mg*ATP and DBG. Here Mg*ATP and DBG follow a random-equilibrium model, where every substrate can bind indepen-dently from the other substrate. Analyses of the peak integrals from educts and products of the enzymatic reaction, revealed the stoichiometry of the reaction: 1.5 ATP molecules are used to phos-phorylate one DBG molecule. The excess of ATP is attributed to the basal ATPase activity. Further-more, experiments with ATPγS, usually regarded as a non-hydrolysable ATP-analog, where carried out. Surprisingly, DAGK hydrolyzes ATPγS and also transfers the thio-phosphate group to the lipid acceptor DBG, which points to a certain degree of plasticity in the active center. A phosphorylated enzyme intermediate was not detected. These results suggest the building of a ternary complex of Mg*ATP, DBG and DAGK performing a direct-phosphoryl transfer reaction, without passing through a phosphorylated enzyme intermediate. Experiments with the transition state analog ortho-vanadate (Vi) showed a decoupling of the ATP hydrolysis activity from lipid substrate phosphorylation. This indicates a specific transfer site for the γ-phosphate group from ATP to DAG, which can be blocked by Vi.
A general disadvantage of NMR spectroscopy compared to other spectroscopic methods is its inherent low sensitivity. One possible starting point for the improvement of signal-to-noise per unit time is the reduction of the spin-lattice relaxation time of protons[209]. Usually 95 % of the experi-mental time is required for the relaxation of the 1H to equilibrium. The addition of paramagnetic species can be used to reduce the 1H T1[233]. In a comprehensive study four different paramagnetic agents were tested: Cu2+-EDTA, Cu2+-EDTA-tag, Gd3+-TTAHA and Gd3+-DOTA. The titration of these paramagnetic complexes showed the principle feasibility of this approach, but differences between the tested species exist. The most promising complex is Gd3+-DOTA which, at a concentration of 2 mM, causes a 10-time improvement of signal-to-noise ratio per unit time. This allowed measuring 2D 13C-13C correlation spectra of proteoliposomes in one tenth of the usual required experimental time (i.e. 10 hours vs. 4 days) with good signal-to-noise.
For the investigation of structural or dynamic changes in the protein upon substrate interaction with MAS NMR, the spectral properties CP efficiency and resolution of the DAGK in liposomes needed to be improved. The most critical step during sample preparation is the reconstitution of the membrane protein from detergent micelles into a membrane of synthetic lipids under detergent removal. For this procedure the important criteria are enzymatic activity, measured in a coupled ATPase assay[55], and homogeneity of the proteoliposomes, which was tested e.g. on a discontinuous sucrose step gradient. Therefore an extensive study was carried out, in which different detergents, lipids and lipid mixtures, techniques for detergent removal and different protein-to-lipid ratios were tested. A direct correlation between high ATPase activity and good resolution was not found. Moreover, active DAGK in a mixture of DMPC and cholesterol, which emulates the membrane features of a membrane containing DAG, showed the best CP efficiency and resolution.
The assignment of the protein backbone and amino acid side chains the first mandatory step towards the investigation of structural and dynamical features influencing and defining the enzymatic mechanism by MAS NMR. As the assignment procedure is very time consuming for a total protein, a special labeling scheme for DAGK was developed, which allows assigning most of the protein areas presumably involved in enzyme catalysis. The assignment of DAGK with solution NMR[132] was not transferable to the MAS NMR spectra. Most important for the assignment process were the unique pairs[335], two consecutive amino acids which only appear once in the amino acid sequence. These unique pairs served as anchor points. Five different multinuclear MAS NMR experiments (DARR, NCO, NCA, NCACX, NCOCX) were required for the sequential assignment. It was possible to assign 35 % of the total amino acid sequence with one sample and 8 experiments acquired at 850 MHz. The secondary structure analysis showed subtle differences to the DAGK assignment with solution NMR[132], which can be attributed to the different environment in lipid bilayers and detergent micelles.
Data about structural and dynamical changes under substrate interaction can reveal details about the enzymatic mechanism. Therefore changes in chemical shift in 2D heteronuclear correlation experiments in the apo-state and under substrate saturated conditions with the substrates Mg*AMP-PNP, a non-hydrolysable ATP-analog, DOG, a mixture of Mg*AMP-PNP and DOG as well as inhibited by Vi were recorded. The most significant peak changes were observed at the interface membrane-cytoplasm as well as the the N-terminal amphipathic helix. The residues revealing chemical shift perturbations correlate with conserved residues or such residues, for which importance for catalysis and/or folding could be shown in mutation studies[8]. Especially noticeable were the changes at the amino acids Asn 72, Lys 64, His 87, Tyr 86 and Asp 95.
Beside changes of the chemical shift, changes of line width or signal doubling were observable. These changes can point to a correlation with dynamic reorientations in the μs-ms time regime, which are most relevant for enzymatic processes. The protein backbone dynamics in the apo-state as well as saturated with the substrates or inhibited with Vi were investigated with a 15N-CODEX experiment, which is based on the reorientation of the CSA tensor upon dynamical changes[350]. Specific effects of the different substrates or analogs on the protein backbone dynamic were revealed complementing the structural data and the chemical shift perturbation experiments.
Die Brustdrüse (glandula mammaris) bietet ein einzigartiges Modellsystem zum Studium der adulten Stammzellen und der molekularen Signalwege, welche die Selbsterneuerung dieserZellen sowie die Proliferation und Differenzierung der Vorläuferzellen kontrollieren. Die Brustdrüse besteht aus dem Brustepithel und dem Stroma, das zum größten Teil aus dem Fettgewebe gebaut ist. Es enthält auch andere Zelltypen z. B. Fibroblasten und Makrophagen. Die Entwicklung der Brustdrüse findet hauptsächlich nach der Geburt, während der Pubertät, Schwangerschaft und Laktation statt. Ein funktionelles Brustepithel wird während der aufeinander folgenden Zyklen von Schwangerschaft, Laktation und Abstillen auf- und wieder abgebaut. Diese Regenerations-Kapazität kann für die Organrekonstitution genutzt werden. Die Transplantation der kleinen Anzahl von Brustepithelzellen oder des Drüsenfragments in das Fettgewebe einer Empfängermaus, deren eigenes Brustepithel entfernt wurde (cleared fat pad), führt zur vollständigen Epithelregeneration. Die zyklische Entwicklung und Regenerations-Fähigkeit des Epithelgewebes lässt auf die Existenz von Stammzellen schließen, die im Verbund der Epithelzellen überdauern. Diese gewebespezifischen Stammzellen sind in der Lage sich durch asymmetrische Zellteilung zu erneuern (self-renewal) und gleichzeitig die differenzierenden Vorläuferzellen zu bilden. Die während der Pubertät und Schwangerschaft erhöhten systemischen Hormone, lokalen Wachstumsfaktoren und Zytokine kontrollieren die Stammzellen-Proliferation und die Differenzierung der Vorläuferzellen in den verschiedenen Brustepithel-Zelllinien: Myoepithel-, Luminal- und Alveolarzellen. Aufgrund der Tatsache, dass die Entstehung von Brustkrebs mit aberranten Proliferations- und Differenzierungsprogrammen in malignanten Stamm-/ Vorläuferzellen (cancer stem cells) einhergeht, ist die Identifizierung der Signalwege, die diese Prozesse regulieren, für die Stammzellen- und Krebs-Forschung sehr bedeutend. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden im Rahmen des vorliegenden Projektes die Methoden zur genetischen Manipulation von nicht-angereicherten Brustdrüsen-Stammzellen entwickelt. Durch effiziente lentivirale Transduktion von adhärenten Primärzellen wurden nahezu 90% der Zellen, einschließlich der Stammzellen, transduziert. Diese Optimierung erfolgte durch 1) die Anwendung von konzentrierten Lentiviren mit hoher Qualität, 2) Passagierung der Primärzellen und Entfernung von Gewebeklumpen von den VIII Primärzellkulturen, und besonders 3) durch die Reduzierung der Zelldichte während der viralen Transduktion. Für Brust-Stammzellen sind keine spezifischen Oberflächen-Marker bekannt und daher ist ihre Isolierung deutlich erschwert. Man konnte sie bis jetzt nur anhand der moderaten Expression von CD24 (hitzestabilen Antigen) und hoher Expression von CD49f oder CD29 (α6- oder β1-Integrin) ungefähr 10-fach anreichern. Allerdings haben andere Studien gezeigt, dass die Transplantation der FACS-sortierten Stammzellen zu einer Schädigung der Stammzellen und folglich zu einer Reduktion der Repopulation-Frequenz führen kann. Aus diesem Grund wurden die genetisch modifizierten Stammzellen nicht sortiert. Durch die Transplantationen der transduzierten Primärzellen wurde ihr Stammzellen-Anteil in ihrer natürlichen Nische (cleared fat pad) selektiert. Die transplantierten Stammzellen sind in der Lage duktale Auswüchse zu entwickeln. Mit dieser Strategie konnten Transplantate mit homogener Expression von Fluoreszenz-Markergenen, wie z. B. GFP, erzielt werden. FACS Analysen der Zellen, die aus Transplantaten isoliert werden, haben gezeigt, dass alle drei Brustepithelzell-Populationen, nämlich Luminal-, Basal- und Stammzellen, transduziert waren und GFP exprimierten und daher aus transduzierten Zellen hervor gingen. Die Transplantationen einer Mischung der unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Stammzellen ergaben einzelne verzweigte Auswüchse, in denen jeweils nur ein Fluoreszenz-Markerprotein exprimiert wurde. Sie stammen sehr wahrscheinlich von einzelnen transduzierten Stammzellen ab und wachsen jeweils in einem begrenzten Bereich des Brustfettgewebes aus. Die Immun-Antwort der Empfängermäuse gegen Fluoreszenz- Markerproteine könnte das Auswachsen der Transplantate inhibieren. Brustepithelium-Rekonstitutionen waren daher in den Rag2-/-γc-/- Empfängermäusen mit geschwächtem Immunsystem besonders effiziert. Die lentivirale Manipulation von Stammzellen und deren Einsatz in Brustepithelium-Rekonstitutionen kann als alternative Methode zur gewebsspezifischen Knockout-Technik angesehen werden. Für die Etablierung dieser Methode wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zentraler Transkriptionsfaktor in der Brustentwicklung, signal transducer and activator of transcription 5 (Stat5), untersucht. (...)
Die allogene Stammzelltransplantation (SZT) nach Hochdosischemotherapie ist oft die einzige Therapieoption für pädiatrische Patienten, die an einer Hochrisikoleukämie erkrankt sind. Bei Patienten mit einer sehr schlechten Prognose und ohne Aussicht auf einen passenden Spender werden auch haploidente SZT durchgeführt, bei der meist die Eltern als Spender dienen. Aufgrund der HLA-(Human Leukocyte Antigen) Inkompatibilität zwischen Spender und Empfänger birgt die haploidente SZT jedoch einerseits das hohe Risiko einer Abstoßung des Transplantats sowie andererseits die Gefahr einer lebensbedrohlichen Spender-gegen-Wirt Reaktion (Graft-versus-Host Disease, GvHD). Das Risiko für die Entstehung einer GvHD kann durch die selektive Anreicherung von CD34 positiven Stammzellen deutlich verringert werden. Dabei werden unter anderem immunkompetente T-Zellen entfernt, die maßgeblich an der Entstehung einer GvHD beteiligt sind. Diese Zellen spielen aber auch bei der Immunrekonstitution und der Reaktivität gegen residuale leukämische Blasten (Graft-versus-Leukemia (GvL) Effekt) nach SZT eine wichtige Rolle. Aufgrund dessen ist die SZT mit CD34-selektionierten Präparaten häufig mit schweren Infektionen und einer erhöhten Rezidivrate verbunden. Des Weiteren wächst das Transplantat deutlich schlechter an. Immuntherapeutische Ansätze mit Spenderlymphozyten-Infusionen (Donor Lymphocyte Infusion - DLI) können das Anwachsen des Transplantates und den GvL-Effekt fördern, steigern jedoch gleichzeitig das Risiko einer GvHD. Um die Entstehung einer GvHD zu kontrollieren, ohne dabei auf den Nutzen einer DLI verzichten zu müssen, wurde bereits vor über 10 Jahren ein aussichtsreicher Ansatz entwickelt. Hierbei werden Spender-T-Zellen vor der Infusion in den Patienten genetisch so modifiziert, dass sie ein Selbstmordgen („suicide gene“) exprimieren. Im Falle einer aufkeimenden GvHD ermöglicht die Aktivierung des Suizidmechanismus eine gezielte Eliminierung der alloreaktiven Spender-T-Zellen. Das zurzeit am häufigsten verwendete Selbstmordgen leitet sich von der Thymidinkinase (TK) des Herpes Simplex Virus (HSV) ab. In einer Reihe von klinischen Studien mit erwachsenen Patienten konnte nach allogener SZT die prinzipielle Wirksamkeit dieses Sicherheitskonzeptes bereits gezeigt werden. Im Verlauf der klinischen Anwendung wurde allerdings eine Reihe von Nachteilen festgestellt. So führte zum Beispiel die Immunogenität der HSV-TK in immunkompetenten Patienten zur Abstoßung der modifizierten T-Zellen. Des Weiteren zeigte sich eine mangelnde Effizienz hinsichtlich des Abtötens der T-Zellen. Außerdem ist die für die T-Zell-Eliminierung benötigte Menge an Ganciclovir (10 mg/kg Körpergewicht pro Tag) stammzelltoxisch, wodurch die Immunrekonstitution nach SZT deutlich vermindert sein kann. Ferner wurde beobachtet, dass die ex vivo modifizierten und expandierten T-Zellen in ihrer biologischen Funktionalität deutlich eingeschränkt waren. Um den immuntherapeutischen Ansatz der DLI vor allem hinsichtlich der Sicherheit weiter zu verbessern, wurden in den vergangenen Jahren verschiedene Suizidstrategien entwickelt und die Bedingungen der ex vivo Modifikation optimiert. Eine aussichtsreiche Suizidstrategie verwendet das B-Zell-Oberflächenantigen CD20 in Kombination mit einem bereits für die Klinik zugelassenen, monoklonalen anti-CD20 Antikörper (Rituximab). Im Gegensatz zu TK-modifizierten Zellen, deren Beseitigung in vivo mehrere Tage in Anspruch nimmt, können CD20 positive B-Zellen innerhalb weniger Stunden eliminiert werden. Der tatsächliche Wirkmechanismus von Rituximab in vivo ist bisher noch nicht vollständig aufgeklärt, allerdings konnte in vitro bereits gezeigt werden, dass die Eliminierung CD20 positiver Zellen mittels eines komplement-abhängigen (CDC) und/oder eines antikörperabhängigen Zelltodes (ADCC) erfolgt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Optimierung eines CD20-abhängigen Suizid-Vektorsystems für die effiziente Transduktion von primären T-Zellen und deren selektive Eliminierung mittels Rituximab. Dazu mussten verschiedene Teilziele erreicht werden: (1) Da nur genetisch modifizierte T-Zellen, die in vivo abgeschaltet werden können, infundiert werden dürfen, ist eine ex vivo Anreicherung der CD20 positiven Zellen zwingend erforderlich. Dementsprechend sollte untersucht werden, inwieweit sich CD20 als Oberflächenmarker für eine MACS- (Magnetic Associated Cell Sorting) basierte Aufreinigung eignet und gegebenenfalls alternative Ansätze geprüft werden. (2) Weiterführend sollte ein Transduktionsprotokoll etabliert werden, welches hohe Transduktionseffizienzen ermöglicht und die Funktionalität der genetisch modifizierten T-Zellen weitestgehend erhält. (3) Bezüglich der Wirksamkeit des CD20-Rituximab-Systems liegen bisher nur veröffentlichte in vitro Daten vor. Daher sollte die Effektivität des neu entwickelten Suizidsystems in einem GvHD-ähnlichen Mausmodell in vivo charakterisiert werden. Zu Beginn dieser Arbeit wurde ein gammaretroviraler Vektor verwendet, welcher die Wildtypsequenz des CD20 Gens unter der Kontrolle eines vom Myeloproliferativen Sarcoma Virus (MPSV) abgeleiteten LTR (long terminal repeat) exprimiert (M71CD20). Mit diesem Vektor konnten mit Hilfe einer 3-Plasmid-Transfektion von 293T-Zellen lediglich Virusüberstände mit einem sehr niedrigen Titer hergestellt werden (<1 x 105/ml). Demzufolge war es zwar möglich die humane T-Zelllinie HuT 78 durch eine RetroNectin-assistierte Transduktion genetisch zu modifizieren, primäre T-Zellen hingegen konnten gar nicht transduziert werden. Aufgrund der schwachen Expression von CD20 an der Zelloberfläche zeigten die transduzierten HuT 78 Zellen nur eine geringe Empfindlichkeit gegenüber der Rituximab-vermittelten Lyse. Unter Verwendung von humanem Serum als Komplementquelle konnte eine maximale Lyse von 20% erreicht werden. Zusätzlich war die immunomagnetische Aufreinigung der CD20 positiven Zellen mit Hilfe des anti-CD20 MACS Systems durch eine geringe Ausbeute (<1%) und einen niedrigen Reinheitsgrad (<90%) geprägt. Um die Suizidgenstrategie für eine potentielle klinische Anwendung weiterzuentwickeln, wurde eine Codon-Optimierung des CD20 Transgens vorgenommen (CD20op). Die Optimierung zielte darauf ab, selten verwendete Basentripletts (Codons) innerhalb der CD20 cDNA mit von Säugetierzellen häufig genutzten zu ersetzen und somit die Translationsrate zu steigern. Ferner wurde der GC-Gehalt auf 60% erhöht und einige RNA-Instabilitätsmotive entfernt, um die Stabilität der mRNA zu verbessern. Aufgrund dieser Optimierungen wurde ein 35-facher Anstieg des Virustiters beobachtet. Dies ermöglichte die Transduktion von HuT 78 Zellen mittels einer standardmäßig durchgeführten Zentrifugationsmethode. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass die Oberflächenexpression der Codon-optimierten CD20 Variante im Vergleich zur Wildtypsequenz um ein Dreifaches gesteigert werden konnte. Die verbesserte Oberflächenexpression erhöhte die Rituximab-vermittelte Lyse deutlich. In vitro konnten so bis zu 80% der transduzierten HuT 78 Zellen eliminiert werden. Die geringe Ausbeute der immunomagnetischen anti-CD20-Selektion konnte allerdings nicht verbessert werden. Weiterführend wurde daher im Rahmen dieser Arbeit der CD20op Vektor mit einem zweiten Oberflächenmarker kombiniert, um eine effiziente Anreicherung der genetisch modifizierten Zellen zu gewährleisten. Da im klinischen Maßstab bereits ein System zur Aufreinigung von Stammzellen über den Oberflächenmarker CD34 etabliert ist, wurde eine C-terminal verkürzte Variante des CD34 Moleküls (tCD34) als Selektionsmarker gewählt. Für eine optimale Koexpression von CD20op und tCD34 wurde eine Fusionskassette unter Verwendung des 2A-Elementes des Thosea asigna Virus generiert (T2A). Dieses Element ermöglicht die effiziente Expression beider Transgene von einem Vektor. Im Verlauf der Translation kommt es innerhalb des T2A-Elementes zu einem ribosomalen Sprung und folglich zur Generierung von zwei voneinander unabhängigen Proteinen. Mit dem neu klonierten bicistronischen Vektor M71CD20opT2AtCD34 konnten gute Virustiter im Bereich von 2,3 ± 0,9 x 106/ml erzielt werden. Dies ermöglichte die Transduktion von HuT 78 Zellen durch Zentrifugation. Mittels Durchflusszytometrie und protein-biochemischer Methoden konnte gezeigt werden, dass CD20op und tCD34 korrekt in der Zelllinie exprimiert wurden. Die Anreicherung von CD20op/tCD34 positiven HuT 78 Zellen mit Hilfe immunomagnetischer anti-CD34-Selektion resultierte in einer deutlich verbesserten Ausbeute; ebenso konnte eine Reinheit von über 98% erreicht werden. In vergleichenden Analysen wurde gezeigt, dass die CD20op/tCD34 transduzierten Zellen eine ähnliche Sensitivität gegenüber Rituximab aufwiesen wie Zellen, die mit dem monocistronischen M71CD20op Vektor transduziert wurden. Nachdem die Effizienz des bicistronischen Vektors in der humanen T-Zelllinie HuT 78 nachgewiesen werden konnte, wurden weiterführende Versuche mit humanen primären T-Zellen initiiert. Für die genetische Modifikation von primären T-Zellen mit gammaretroviralen Vektoren ist die Aktivierung und eine damit einhergehende Proliferation der T-Zellen zwingend erforderlich. Deswegen wurden zunächst die Aktivierungs- und Kulturbedingungen für eine optimale Transduktion der T-Zellen bestimmt. In dieser Arbeit wurden die T-Zellen ausschließlich mit anti-CD3/anti-CD28 Antikörpern stimuliert, die auf paramagnetischen Partikeln immobilisiert wurden und dadurch eine dreidimensionale Aktivierung ermöglichten. Diese Art der Stimulation wird bereits in klinischen Studien verwendet und sollte im Gegensatz zu löslichen Antikörpern die biologische Funktionalität der T-Zellen weitestgehend erhalten. Primäre T-Zellen wurden mittels RetroNectin-beschichteter Platten an zwei aufeinander folgenden Tagen transduziert, dabei konnte eine durchschnittliche Transduktionseffizienz von 65% erzielt werden. Die korrekte Expression von CD20op und tCD34 konnte, wie bereits für HuT 78 Zellen beschrieben, ebenfalls in primären T-Zellen nachgewiesen werden. Mittels immunomagnetischer anti-CD34 Selektion von CD20op/tCD34 positiven primären T-Zellen wurde eine sehr gute Anreicherung mit 98%iger Reinheit und einer Ausbeute von 45% erreicht. Unter Verwendung von humanen natürlichen Killerzellen konnte eine Sensitivität der genetisch modifizierten Zellen gegenüber Rituximab-vermittelter zellulärer Toxizität (ADCC) nachgewiesen werden. Da die Funktionalität der T-Zellen aufgrund der benötigten Aktivierung und der Expansion ex vivo beeinträchtigt sein kann, wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit die T-Zellen phänotypisch und funktionell genauer charakterisiert. Es konnte durchflusszytometrisch gezeigt werden, dass die Mehrheit der naiven T-Zellen aufgrund der anti-CD3/anti-CD28 Aktivierung einen „central memory“ Phänotyp erworben hatte, welcher durch die Expression des „Homing“-Oberflächenmarkers CD62L (L-Selectin) und den Verlust des Markers CD45RA gekennzeichnet war. Es ist bekannt, dass dieser T-Zell-Phänotyp ein hohes alloreaktives Potential sowie eine lange Lebensdauer in vivo aufweist. Da für eine effektive Immunantwort CD4 positive Helferzellen und CD8 positive zytotoxische T-Zellen essentiell sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Transduktionseffizienz in beiden Subpopulationen bestimmt. CD4 positive und CD8 positive T-Zellen ließen sich gleichermaßen gut transduzieren und es konnte demonstriert werden, dass ein physiologisches CD4/CD8 Verhältnis von 1-2 erhalten blieb. Im Vergleich dazu wurde in veröffentlichten Studien häufig eine verstärkte Transduktion von CD8 positiven T-Zellen verzeichnet, was zu einer Verschiebung des CD4/CD8 Verhältnisses und somit zu einer beeinträchtigten Immunantwort führte. Des Weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit in vergleichenden Analysen das alloreaktive Potential der genetisch modifizierten Zellen bestimmt. Zur Charakterisierung der Alloreaktivität wurde eine „Mixed Lymphocyte Reaction“ (MLR) verwendet. Hierfür wurden die T-Zellen mit CFSE (Carboxy-Fluorescein Succinimidyl Ester) gefärbt und mit bestrahlten, allogenen mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) kultiviert. Das Maß der Alloreaktivität ließ sich durch die Verringerung des CFSE Signals bestimmen. In einer Reihe von Experimenten konnte gezeigt werden, dass der prozentuale Anteil an alloreaktiven, transduzierten T-Zellen vergleichbar zu frisch isolierten T-Zellen war. Auch wenn ein geringeres Proliferationspotential der genetisch modifizierten T-Zellen festgestellt wurde, deutet dieses Ergebnis dennoch auf einen teilweisen Erhalt der T-Zell-Funktionalität hin. Im letzten Drittel der vorliegenden Arbeit wurde neben der Langzeitexpression von CD20op und tCD34 ebenfalls die Effizienz des CD20op-Rituximab-Systems in vivo untersucht. Hierfür wurde ein Rag-1 defizientes Mausmodell verwendet. Aufgrund der vorliegenden Lymphopenie ermöglichte dieses Modell ein gutes Anwachsen der Spenderlymphozyten. Reife murine T-Zellen wurden an zwei aufeinander folgenden Tagen mit dem gammaretroviralen Vektor M71CD20opT2AtCD34 transduziert und vor der Transplantation mittels immunomagnetischer anti-CD34 Selektion angereichert (Reinheit: 98%). Fünf Wochen nach Transplantation wurde ein Teil der Mäuse mit 150 μg Rituximab pro Maus i.v. behandelt, als Negativkontrolle wurde Mäusen ein monoklonaler anti-HER2/neu Antikörper (Herceptin) gespritzt, der in diesem Zusammenhang nicht relevant war. Das Behandlungsschema wurde in zwei darauf folgenden Wochen wiederholt. Jeweils zwei Tage nach der Antikörperinjektion wurde der Anteil an transduzierten Spenderzellen im peripheren Blut durchflusszytometrisch bestimmt. Bereits nach der ersten Rituximab-Injektion konnte eine 95%ige Depletion der genetisch modifizierten T-Zellen gezeigt werden. Die beiden nachfolgenden Injektionen beeinflussten den Anteil der modifizierten T-Zellen im peripheren Blut nur noch geringfügig. In Herceptin behandelten Mäusen blieb der Anteil an genetisch modifizierten Zellen konstant. Am Ende der Untersuchungen (Woche 17) wurde in Rituximab behandelten Mäusen nur noch ein minimaler Prozentsatz an modifizierten Zellen nachgewiesen, welche durch eine geringe Oberflächenexpression von CD20op und tCD34 charakterisiert waren. Abschließend konnte die effektive Eliminierung der T-Zellen aus der Milz und den Lymphknoten sowohl durchflusszytometrisch als auch per quantitativer PCR nachgewiesen werden. Die erfolgreiche Depletion der T-Zellen wurde im weiteren Verlauf der Arbeit durch eine Zeitkinetik nach Rituximab Gabe genauer untersucht. Bereits zwei Stunden nach der Injektion des Antikörpers konnte im peripheren Blut nur noch ein kleiner Anteil an genetisch modifizierten Zellen nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis entspricht Daten aus klinischen Studien mit Rituximab und verdeutlicht das Sicherheitspotential des CD20-Rituximab-Systems, geprägt durch eine schnelle und effiziente Eliminierung von reaktiven T-Zellen. Der adaptive Transfer von Spender T-Zellen führte in den Empfängertieren zur Entwicklung einer massiven Kolitis, die durch Gewichtsabnahme und Durchfall charakterisiert war. In dieser Arbeit konnte dies durch die Rituximab-vermittelte Eliminierung der reaktiven Zellen verhindert werden; Rituximab behandelte Mäuse zeigten keine Kolitissymptome, wohingegen Herceptin behandelte Tiere stetig an Gewicht verloren. Diese Gewichtsabnahme konnte zu einem späteren Zeitpunkt auch in der Herceptin Gruppe nach Behandlung mit Rituximab gestoppt werden. Außerdem wurde daraufhin in diesen Tieren eine schnelle Gewichtszunahme von bis 34% beobachtet. Die erfolgreiche Depletion der CD20op/tCD34 positiven T-Zellen stellte in den Rag-1 defizienten Empfängertieren vorübergehend erneut eine Lymphopenie her. Dabei kam es aber auch zur Expansion nichttransduzierter T-Zellen, welche mit einem Anteil von 2% im CD34-selektionierten T-Zell-Transplantat vertreten waren. Da diese T-Zellen nicht durch Rituximab eliminiert werden konnten, entwickelten die Empfängertiere unweigerlich Kolitissymptome. Mittels quantitativer PCR wurde anschließend nachgewiesen, dass es sich bei den in vivo expandierten Zellen zum Großteil um nicht-transduzierte T-Zellen handelte, da keine proviralen Integrationen nachgewiesen werden konnten. Das in dieser Arbeit verwendete Mausmodell lieferte wichtige Informationen hinsichtlich der Langzeitexpression der beiden Transgene sowie der Effizienz des CD20-Rituximab-Suizidsystems. Auch wenn die in dem verwendeten Modell induzierte Kolitis als Äquivalent einer GvHD angesehen werden kann, sollte die Effizienz des entwickelten Systems in einem klassischen bzw. haploidenten GvHD Modell verifiziert werden. Darauf aufbauend könnten dann prä-klinische Studien zur Effektivität und Sicherheit des optimierten Suizidansatzes initiiert werden. Zusammenfassend bietet das neue, in dieser Arbeit stufenweise optimierte CD20-Rituximab-System eine vielversprechende Alternative zu dem HSV-TK System. Im Hinblick auf die derzeitigen Entwicklungen bezüglich der Funktionalität der genetisch modifizierten Zellen und der schnellen Beseitigung durch Rituximab wäre die Weiterentwicklung des CD20op/tCD34 Ansatzes zur effektiven Kontrolle einer GvHD nach DLI im Rahmen einer allogenen Stammzelltransplantation wünschenswert.
Acetaldehydaddukte an Hämoglobin werden als potentieller biochemischer Marker für Alkoholmissbrauch betrachtet, konnten aber bisher in vivo noch nicht eindeutig nachgewiesen werden. Es wurden Methoden entwickelt, um Acetaldehydmodifiziertes Hämoglobin sowohl nach Inkubation in vitro als auch in humanen Blutproben nachzuweisen. Verwendung fanden sowohl chromatographische als auch elektrophoretische Trennmethoden in Kombination mit unterschiedlichen Massenspektrometern zur Detektion. Es wurden unterschiedliche Patienten- und Probandenkollektive betrachtet. Aus Blutproben von Patienten aus Alkoholentzugskliniken, von Probanden eines kontrollierten Trinkversuches und Blutproben von Personen mit moderatem Alkoholkonsumverhalten wurde versucht, modifiziertes Hämoglobin mit Alkoholkonsum zu korrelieren. Desweiteren wurden Blutproben von Kindern untersucht, bei denen keine Alkoholexposition zu erwarten war, um eventuell vorhandenes endogenes modifiziertes Hämoglobin nachzuweisen. Zusätzlich zu den Untersuchungen in vitro und in vivo wurden auch post-mortale Proben analysiert, um modifiziertes Hämoglobin mit einem prämortalem Alkoholkonsum zu korrelieren und auf mögliche andere Einflüsse, insbesondere hinsichtlich post-mortaler Parameter zu untersuchen. Modifizierte Globinketten waren nach Synthese aus Hämoglobin und Acetaldehyd zugänglich und konnten in vitro nachgewiesen werden. Hierbei zeigte sich, dass Acetaldehyd auch mehrfach kovalent an beide Hämoglobinketten binden kann. Weder mehr- noch einfach modifizierte Hämoglobinketten konnten allerdings in authentischen humanen Blutproben nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit konnte jedoch nach proteolytischem Verdau so weit gesteigert werden, dass Acetaldehydmodifizierte Hämoglobinpeptide nicht nur nach Inkubation von Hämoglobin mit Acetaldehyd, sondern auch in authentischen Blutproben sämtlicher untersuchter Kollektive nachweisbar waren. Es wurde gezeigt, dass ein intermolekularer Austausch von Acetaldehyd nach proteolytischem Verdau zur Bildung eines Peptidadduktes am neu entstandenen N-Terminus des jeweiligen Peptides führen kann. Ein Hinweis auf andere mögliche Bindungsstellen ergab die Analyse des in vitro synthetisierten Peptides Hbα(17-31)2Ach mit zwei gebundenen Molekülen Acetaldehyd. Insgesamt konnten in authentischen Proben 10 Peptide mit Acetaldehydmodifikation, welche jeweils als chromatographisch trennbare Stereoisomere auftraten, nachgewiesen werden. Dies geht einher mit einer bereits vorgeschlagenen Bildung diastereomerer Imidazolidinonderivate. Acetaldehydmodifizierte Hämoglobinpeptide waren nicht nur in Proben von Patienten und Probanden mit nachweisbarem Blutalkohol vorhanden, sondern auch in Blutproben von Alkoholikern, Studenten und Kindern ohne akuten Alkoholkonsum. Der Nachweis dieser Addukte auch ohne exogene Alkohol- oder Acetaldehydexposition lässt darauf schliessen, dass diese posttranslationale Modifikation im menschlichen Körper abläuft, Acetaldehydaddukte also auch endogen gebildet werden. Ein erhöhtes Verhältnis von modifizierten Peptiden zu deren unmodifizierten Homologen zeigte sich konzentrationsabhängig nach Inkubation von Hämoglobin mit Acetaldehyd in vitro. Langfristiger zurückliegender Alkoholkonsum konnte in Studien mit Patienten einer Rehabilitationseinrichtung und mit Probanden mit moderatem Alkoholkonsum nicht mit Hämoglobinaddukten korreliert werden. Erhöhte Adduktverhältnisse im Vergleich mit Proben ohne Blutalkoholkonzentration des gleichen Kollektivs konnten bei Patienten einer Alkoholentzugsklinik, in post-mortalen Proben und im Rahmen eines kontrollierten Trinkversuches nachgewiesen werden. Die Kinetik der Bildung und Elimination Acetaldehydmodifizierten Hämoglobins wurde sowohl anhand von Blutproben von Patienten einer Alkoholentzugsklinik untersucht, erhöhte Adduktverhältnisse waren hier nur kürzer als 5 Tage nachweisbar. Diese schnelle Elimination wurde im Rahmen eines kontrollierten Trinkversuches bestätigt. Hierbei fand sich ein signifikanter Anstieg Acetaldehydmodifizierter Hämoglobinpeptide bereits nach einmaligem moderatem Alkoholkonsum, welcher bereits bei Blutalkoholkonzentrationen von durchschnittlich 0,12 g/L auftrat und noch mindestens 6 Stunden, aber nicht mehr 24 Stunden nach Trinkende anhielt. Daher liegt die mögliche Anwendung dieses empfindlichen Assays im Nachweis eines kurzfristigen Alkoholkonsums. Sämtliche Peptide wurden hinsichtlich Empfindlichkeit und Spezifität zur Identifizierung eines Alkoholkonsums sowohl in vivo als auch in post-mortalen Proben anhand unterschiedlicher Schwellenwerte untersucht. Desweiteren wurde für diese Peptide die analytische Präzision betrachtet. Als Markerpeptid eines kurzfristigen Alkoholkonsum sowohl in vivo als auch in post-mortalen Blutproben wird hierbei Hbα(32-40)Ach vorgeschlagen. Der mögliche Vorteil bei der Betrachtung dieses Peptids im Vergleich mit anderen bereits etablierten Markern zum Nachweis eines kurzfristigen Alkoholkonsums liegt in der für den Nachweis benötigten geringen Materialmenge, welche bei der Bestimmung mittels HPLC/TOF-MS 80μg Hämoglobin betrug, was etwa der Hämoglobinmenge entspricht, die in etwa 2,5 Millionen Erythrozyten, entsprechend 0,6 μl Blut enthalten ist. Denkbar ist dadurch die Bestimmung in Blutspuren, aus denen ansonsten kein Nachweis von Ethanol oder anderer Marker eines Alkoholkonsums möglich wäre, z.B. aus getrockneten Blutspuren.
Prion-Erkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch die Fehlfaltung des zellulären Prion Proteins (PrPC) in seine pathogene Isoform PrPSc verursacht werden. Welche zellulären Mechanismen an dieser Fehlfaltung oder der Pathogenese beteiligt sind, ist bis heute nur teilweise geklärt. Einerseits wird vermutet, dass z.B. eine toxische cytosolische Form des PrPC aufgrund einer Störung des Proteasoms akkumulieren könnte und spontan in PrPSc umgewandelt wird. Andererseits konnte gezeigt werden, dass viele Signalwege, wie die MAPK-Signalwege am Prozess der Neurodegeneration beteiligt sein könnten.
Ziel dieser Arbeit war daher zum einen die Untersuchung der morphologischen Veränderung einer Zelllinie, die cytosolisches PrP exprimiert, und zum anderen die Identifikation weiterer Signalwege, die an der Prionpathogenese beteiligt sein könnten, was mittels Analysen des (Phospho)proteoms Prion-infizierter Zellen und Mäusegehirne durchgeführt werden sollte.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden murine Neuroblastoma Zellen charakterisiert, die eine cytosolische Form des Prion Proteins (CyPrP) exprimierten. Diese Zellen zeigten zwar keine cytotoxischen Merkmale, jedoch wiesen sie dramatische morphologische Veränderungen auf. Weiterhin wurde herausgefunden, dass diese Zellen vermutlich eine Isoform des cytosolischen PrP (CyPrPmod) exprimierten, die sowohl glykosyliert als auch auf der Zelloberfläche verankert war und somit Eigenschaften des Volllängen-PrP aufwies. Die Glykosylierung des CyPrPs wurde in Western Blots nachgewiesen, während die Verankerung des CyPrPs in der Plasmamembran anhand der Durchflusszytometrie untersucht wurde. Der vermutete Zusammenhang zwischen der CyPrPmod-Expression und der morphologischen Veränderung der Zellen wurde mittels Herunterregulation von CyPrP untersucht. Jedoch resultierte dies nicht in der erwarteten Reversion der morphologischen Effekte. Die Wiederholung der stabilen Transfektion in den parentalen N2a Zellen und anderen Zelllinien führte außerdem weder zu einer veränderten Morphologie noch zur Expression von CyPrPmod. Somit sind diese Veränderungen auf unspezifische Prozesse während der ersten stabilen Transfektion der N2a Zellen mit CyPrP zurückzuführen.
Um neue Therapien oder Biomarker bei Prion-Erkrankungen zu entwickeln, ist die Untersuchung von Signalwegen, die die Prionpathogenese beeinflussen können, wichtig. Oft werden zelluläre Signalwege über die Phosphorylierung von Proteinen gesteuert, allerdings gab es bisher in der Prionenforschung keine Untersuchungen des Phosphoproteoms von Prion-infizierten Zellen in vivo oder in vitro. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher das Phosphoproteom eines Prionen-replizierenden Zellkultursystems näher untersucht. In einer SILAC-Analyse von nicht infizierten und Prion-infizierten Zellen wurden über 100 Phosphoproteine identifiziert und quantifiziert, von denen drei in Western Blots validiert wurden. Die Phosphorylierung von Stathmin und Cdc2 an spezifischen Phosphorylierungsstellen war in den Prion-infizerten Zellen vermindert, während Cofilin eine erhöhte Phosphorylierung aufwies. Diese Proteine sind an der Regulation des Zellzyklus und des Zytoskeletts beteiligt und könnten eine Rolle in der Prionpathogenese spielen. Außerdem wurde nach 2D-Analysen des Proteoms Prion-infizierter Mäusegehirne eine Hochregulation des antioxidativen Proteins Peroxiredoxin 6 (PRDX6) festgestellt. Auch im Prionen-replizierenden Zellkultursystem konnte dieses Protein in erhöhten Mengen nachgewiesen werden. Experimente zur Unterdrückung bzw. Überexpression von PRDX6 ergaben, dass seine Phospholipase A2-Aktivität Signalkaskaden beeinflussen könnte, die vermutlich die Expression von PrPC und somit die Prion-Replikation regulieren können. Weitere Untersuchungen der PRDX6-abhängigen Signalwege in der Prionpathogenese sowie Inokulationen PRDX6-defizienter Mäuse mit Prionen, könnten erste Ansätze für die Entwicklung neuer Therapien bei Prion-Erkrankungen sein.
Hauptanliegen der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Waldvegetation des Rothaargebirges sowie andererseits der Vergleich mit historischen Bearbeitungen zur Ermittlung von Vegetationsveränderungen. Die aktuelle Vegetation wurde mit Hilfe pflanzensoziologischer Methoden erfaßt und klassifiziert. Ergänzend erfolgte eine Kartierung vieler Waldvegetationseinheiten, welche in Verbreitungskarten dargestellt ist. Von großer Bedeutung im Bereich der Waldgesellschaften ist das Luzulo-Fagetum, welches in einer Reihe unterschiedlicher Ausbildungen vorkommt und im gesamten Gebiet verbreitet ist. Weitere Buchenwälder sind dem Galio odorati-Fagetum und in geringem Umfang dem Hordelymo-Fagetum zuzuordnen. Als Ersatzgesellschaften der Buchenwälder sind die große Flächen einnehmenden Fichtenforste, die überwiegend aus der Haubergswirtschaft entstandenen Wälder des Betulo-Quercetum und die wenigen dem Carpinion zugehörigen Bestände einzustufen. An feuchtere Standorte gebunden sind die Schluchtwälder des Fraxino-Aceretum pseudoplatani sowie Auenwälder, die durch das Carici remotae-Fraxinetum und das Stellario nemorum-Alnetum repräsentiert sind. Weiterhin kommen Bruchwälder des Betuletum carpaticae und des Sphagno-Alnetum vor, welche auf nassen Standorten siedeln. Ebenfalls pflanzensoziologisch dokumentiert wurden Gesellschaften, die im räumlichen Verbund der Wälder auftreten oder mit diesen in einem syndynamischen Zusammenhang stehen. Hierzu gehören insbesondere krautige Formationen der Schlagfluren sowie deren strauchige Folgegesellschaften. Des weiteren wurden Gesellschaften der Heiden, der Quellfluren, der Bachröhrichte und der Felsen erfaßt. Für eine Gegenüberstellung des Luzulo-Fagetum mit seinen forstlichen Ersatzgesellschaften erfolgte eine Betrachtung struktureller Parameter, floristischer Unterschiede sowie von Zeigerwerten. Sowohl Fichtenforst als auch Betulo-Quercetum weisen im Vergleich zum Luzulo-Fagetum eine geringere Anzahl an Varianten auf und Arten der Ordnung Fagetalia treten zurück. Im Fichtenforst häufiger sind Säurezeiger sowie Arten der Schlag- und Ruderalfluren, im Betulo-Quercetum vor allem Säure- und Magerkeitszeiger. Bezogen auf mittlere Zeigerwerte äußern sich die Unterschiede beider Gesellschaften zum Luzulo-Fagetumin höheren Werten für den Faktor Licht, während in bezug auf die Faktoren Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff lediglich das Betulo-Quercetum deutlich vom Luzulo-Fagetum abweicht, wobei die Werte jeweils deutlich geringer ausfallen. Die Relevanz dieser beobachteten Unterschiede offenbart sich an einer exemplarisch durchgeführten Darstellung des Bestockungswandels der Markenwaldungen Winterberg. Hier wurde für das 20. Jahrhundert ein deutlicher Anstieg der mit Fichten bewachsenen Flächen registriert, der auf Kosten des Buchenanteils geht. Zur ergänzenden Beurteilung der Waldvegetation wurden Analysen geringeren Umfangs angestellt. Hierunter fällt zum einen die Darstellung der Waldgesellschaften in einem Ökogramm anhand der mittleren Zeigerwerte für Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff. Bei der Betrachtung der Naturverjüngung in den einzelnen Waldgesellschaften erwiesen sich insbesondere Fagus sylvatica, Picea abies, Acer pseudoplatanus und Sorbus aucuparia als die sich am häufigsten verjüngenden Baumarten. Zur Beurteilung des Faktors Wild wurde die Verbißhäufigkeit an Waldpflanzen registriert. Danach gehören Athyrium filix-femina, Epilobium angustifolium, Dryopteris dilatata und Polygonatum verticillatum zu den beliebtesten Äsungspflanzen. Weiterhin wurde exemplarisch die Vegetation auf den im Rothaargebirge häufig anzutreffenden Meilerflächen dokumentiert. Im Bereich dieser Plätze werden nicht selten Arten der Ordnung Fagetalia sowie andere nährstoffliebende Taxa gefördert. Eine Gegenüberstellung der Aufnahmen von Fagion-Gesellschaften, Luzulo-Fagetum, Fichtenforst und Betulo-Quercetum mit vergleichbaren Aufnahmen historischer Bearbeitungen ergab eine Reihe von Unterschieden. Deutlich zeichnet sich eine Zunahme an stickstoffliebenden Arten ab, die pflanzensoziologisch überwiegend den Klassen Epilobietea angustifolii und Artemisietea vulgaris zuzuordnen sind. In den Fichtenforsten ist dieser Wandel besonders auffällig und spiegelt sich in erhöhten mittleren Zeigerwerten für Stickstoff und Bodenreaktion wider. Für die Fagion-Gesellschaften wurde zudem eine Abnahme an Arten der Ordnung Fagetalia registriert, so daß die Veränderungen der mittleren Zeigerwerte nur gering ausfallen, da diese Arten ebenfalls als Stickstoffzeiger einzustufen sind. Für das Luzulo-Fagetum fällt der Zuwachs an den betreffenden Arten zwar geringer als im Fichtenforst aus, zeigt sich aber in einzelnen Aufnahmen mit dominantem Auftreten der stickstoffzeigenden Arten. Im Betulo-Quercetum ist die Zunahme an Stickstoffzeigern am geringsten ausgeprägt und der Anstieg des entsprechenden mittleren Zeigerwertes beruht primär auf einem Rückgang an Säure- und Magerkeitszeigern. Letztere verzeichnen auch in den anderen Waldgesellschaften unterschiedlich stark ausgeprägte Verluste. Als Ursache für die Veränderungen werden insbesondere stickstoffreiche Immissionen diskutiert, sowie Kompensationskalkungen und Bestandsauflichtungen. Ergänzend sind Nutzungsänderungen in Erwägung zu ziehen, die sich vor allem bei den ehemals als Hauberg bewirtschafteten Beständen des Betulo-Quercetum auswirken. Die ermittelten Ergebnisse fügen sich in eine Reihe ähnlicher Untersuchungen ein und bestätigen damit auch die angewendete Methode des pflanzensoziologischen Typenvergleichs zum Monitoring von Vegetationsveränderungen. Weiterhin wurde in vorliegender Arbeit ein Blick auf die Situation des Wald-Naturschutzes im Rothaargebirge geworfen und Empfehlungen für eine weitere Entwicklung kurz angerissen. Als Beispiel für das Vorkommen gefährdeter Arten und deren Abhängigkeit von der Waldvegetation wurden Verbreitungskarten von Bärlapp-Arten angeführt.
The objective of this study is the avifauna of the North American Green River Formation. Five new Green River bird species as well as several new specimens of already known species are described. * Galliformes: Gallinuloides wyomingensis EASTMAN 1900 A second specimen of the galliform Gallinuloides wyomingensis could be identified. Gallinuloides wyomingensis resembles closely Paraortygoides MAYR 1999, which is known from Messel and the London Clay. The new specimen exhibits characters such as a cup-like cotyla scapularis of the coracoid that clearly indicate that Gallinuloides is a stem-group representative of galliforms. * Eurypygidae: Eoeurypyga olsoni gen. et sp. nov. Eoeurypyga is the only fossil representative of the Eurypygidae. Eoeurypyga and the modern sunbittern Eurypyga helias share the typical long bill, the caudally situated neck and the elongated vertebrae cervicales. Additional synapomorph characters were found. The new species indicates a North American origin for the Eurypygidae. * Messelornithidae: Messelornis nearctica HESSE 1992 The original description of Messelornis nearctica was based on a single specimen. Ten new specimens, described in this study, reveal additional information. Messelornis nearctica shows the same large intraspecific size range as Messelornis cristata HESSE 1988 from Messel, the type species of the genus. * Apodidae: Wyomingcypselus pohli gen. nov. sp. nov. Wyomingcypselus pohli is the first described fossil apodiform bird for North American. Due to characters of the wing, especially the position of the processus musculi extensor metacarpi radialis, Wyomingcypselus is referrred to the Apodidae. * Trogoniformes: unnamed species The Green River birds include a poorly preserved, but apparently heterodactyl specimen, which also resembles trogons in overall appearance. * Primobucconidae: Primobucco mcgrewi BRODKORB 1970 Originally, Primobucco mcgrewi was only known from a partial skeleton consisting of the right wing. Three new specimens could be referred to the species. Primobucco mcgrewi clearly exhibits an anisodactyl foot, which makes the assignment to the zygodactyl Bucconidae highly doubtful. Instead, Primobucco mcgrewi is referrred to the Coraciiformes s.s. Thus, Primobucconidae are the first New World representatives of stem-group Coraciiformes. * ?Leptosomidae: Plesiocathartes wyomingensis sp. nov. and Plesiocathartes major sp. nov. Plesiocathartes wyomingensis and Plesiocathartes major represent the first North American record for the genus. Both species exhibit the diagnostic characters for the Leptosomidae as listed by MAYR (2002a, b). * Primoscenidae: Eozygodactylus americanus gen. et sp. nov. and unnamed species Eozygodactylus americanus is the first North American member of this taxon. Both Eozygodactylus americanus and the unnamed species show the zygodactyl foot and the large processus intermetacarpalis of the carpometacarpus, which are typical for Primoscendiae. Due to differences mainly of the humerus, it was placed in a new genus. Besides the descriptionof new species, the avifauna of the Green River Formatin was studied and compared with the avifauna of Messel. The formations show a high concordance, more than 60 % of the Green River taxa also occur in Messel. Such a high concordance is also found for mammals. This is due to the existence of two landbridges, the Thule landbridge and the de Geer landbridge, between Europe and North America during the early Eocene.
Riboswitche – Vorbilder für die Konstruktion synthetischer RNA Schalter Riboswitche sind natürliche RNA Regulatorelemente. Sie sind in den nicht kodierenden Regionen von messenger RNAs (mRNAs) lokalisiert und beeinflussen die Expression nachfolgender Gene. Riboswitche bestehen aus zwei Domänen. Die Binde- oder Aptamerdomäne bildet eine Bindetasche, die einen Liganden ohne die Hilfe zusätzlicher Faktoren hoch spezifisch und affin binden kann. Die zweite Domäne, die sogenannte Expressionsplattform, interpretiert den Bindestatus der Aptamerdomäne und beeinflusst die Expression der nachfolgenden Gene. Liganden sind meist kleine, organische Moleküle wie Nukleotide, Aminosäuren oder Vitamine. Riboswitche regulieren Gene, die für die Synthese oder Verwertung ihres jeweiligen Liganden in der Zelle von Bedeutung sind. Kontrolliert wird die Genexpression meist durch Transkriptionstermination oder durch Maskierung der ribosomalen Bindestelle (SD = Shine Dalgarno Sequenz). Auch Eukaryoten nutzen das Prinzip der direkten RNA-Ligand-Interaktion zur Genregulation, wenn gleich in geringerem Ausmaß. In Pilzen und Pflanzen wird durch Ligandenbindung alternatives Spleißen von prä-mRNAs induziert, was entweder zur mRNA Degradation durch alternative Polyadenylierung oder der Repression der Translation durch alternative Leserahmen (uORFs) führt. Charakteristisch für eine Regulation über Riboswitche ist die direkte Wechselwirkung des niedermolekularen Liganden mit der RNA. In trans kodierte Proteinfaktoren sind aufgrund dieser direkten Bindung nicht notwendig. Dies macht natürliche Riboswitche zu geeigneten Vorbildern für die Entwicklung künstlicher RNA Schalter. Synthetische Riboswitche Aptamere sind kleine, synthetisch hergestellte, einzelsträngige RNA oder DNA Moleküle, die hochaffin und sehr spezifisch ein Zielmolekül binden können. Man kann Aptamere gegen nahezu jedes Molekül der Wahl über einen Prozess der in vitro Selektion gewinnen (SELEX = systematic evolution of ligands by exponential enrichment). Eine Eigenschaft der meisten Aptamere ist, dass sie ihre endgültige Struktur erst in Gegenwart des spezifischen Liganden ausbilden („induced fit“). Dies kann ausgenutzt werden, um RNA Aptamere als regulatorische Elemente einzusetzen. Hierzu inseriert man Aptamere in nicht translatierte Regionen einer mRNA. In Abwesenheit des Liganden bildet sich die Struktur nur teilweise aus und interferiert nicht mit zellulären Funktionen. Erst im Komplex mit einem Liganden kommt es zur effizienten Beeinflussung der Genexpression. Inseriert man ein regulatorisch aktives Aptamer in den 5’ nicht translatierten Bereich (5’UTR) einer eukaryotischen mRNA, erlaubt das Aptamer in der nicht ligandengebundenen Form die Translation nachfolgender Gene. Erst der Aptamer-Ligand-Komplex interferiert mit der Translationsinitiation. Ist das Aptamer nahe der cap-Struktur positioniert, behindert es die initiale Bindung des Ribosoms an die mRNA. Bei einer weiter stromabwärts gelegenen Insertion interferiert es mit dem Scannen der kleinen ribosomalen Untereinheit nach dem Startcodon. Die beste Regulationseffizienz wird hierbei bei einer Insertion direkt vor dem Startcodon erreicht. Es zeigte sich jedoch, dass nur eine sehr geringe Anzahl an Aptameren in der Lage ist, als RNA Schalter aktiv zu sein. Dies führte dazu, dass bis heute nahezu alle Systeme entweder auf dem Theophyllin oder dem Tetrazyklin Aptamer basieren. Ziele dieser Arbeit In dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum nur wenige Aptamere regulatorisch aktiv sind und was diese von inaktiven Varianten unterscheidet. Dafür wurden ein Tetrazyklin und ein Neomycin Aptamer detailliert charakterisiert. Desweiteren wurden neue RNA-basierte Regulationssysteme aufgebaut und ihr regulatorischer Mechanismus analysiert. Innerhalb dieser Arbeit wurde dabei ein System zur aptamerabhängigen Regulation des prä-mRNA Spleißens in Hefe etabliert. Außerdem konnte das bekannte Translationssystem für die Regulation essentieller Gene in Hefe weiter entwickelt werden. Folgende Ergebnisse wurden in dieser Arbeit erhalten: 1.Das Tetrazyklin Aptamer – In vitro Charakterisierung eines synthetischen Riboswitches. Das Tetrazyklin Aptamer ist 69 Nukleotide lang. Es besteht aus drei Stämmen (P1, P2 und P3) sowie drei einzelsträngigen Bereichen (J1/2, J2/3 und die Schleife L3; siehe Abbildung 1, links). Die Domäne oberhalb von P2 ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und kann ausgetauscht werden. Die Stämme P1-P3 sind bereits vor Ligandenbindung ausgebildet. Tetrazyklin wird über die drei einzelsträngigen Bereiche gebunden (siehe Abbildung 1, rechts). Durch fluorimetrische und kalorimetrische Methoden wurde eine Bindekonstante von Tetrazyklin an das Aptamer von 770 pM ermittelt. Diese Affinität ist außergewöhnlich hoch. Vergleichbare Aptamere und natürliche Riboswitche binden niedermolekulare Liganden 10- bis 1000-fach schlechter. Wir konnten zeigen, dass hohe Affinität eine Grundvoraussetzung für die regulatorische Aktivität ist, da Aptamermutanten mit verschlechterten Bindekonstanten keine in vivo Aktivität mehr aufweisen sind (Seiten 19-29). Durch Größenausschlußchromatographie konnte gezeigt werden, dass das Tetrazyklin Aptamer durch Ligandenbindung keine größeren globalen Konformationsänderungen erfährt. Dies weist auf eine weitgehende Vorformung der Bindetasche bereits ohne Tetrazyklin hin. Bei Ligandenbindung nimmt das Aptamer eine pseudoknotenähnliche Tertiärstruktur an, welche wahrscheinlich für die inhibitorische Wirkung auf das Ribosom verantwortlich ist (Seiten 19-29). Im Laufe dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur des Aptamers im Komplex mit Tetrazyklin in der Arbeitsgruppe von A. R. Ferré-D’Amaré gelöst. Die Struktur zeigt, dass die Stämme P1 und P3 aufeinander gestapelt sind (Abbildung 1, rechts). Stamm P2 bildet die Verlängerung einer irregulären Helix, die aus den einzelsträngigen Bereichen J1/2 und J2/3 gebildet wird. Nukleotide der Schleife L3 interagieren mit dieser irregulären Helix und bilden mit ihr zusammen die Bindetasche für Tetrazyklin. Diese hochauflösende Struktur diente uns in weiteren Arbeiten als Ausgangspunkt für die detaillierte Charakterisierung von ligandeninduzierten Änderungen (siehe 6.). 2. Das Tetrazyklin Aptamer ist in der Lage, prä-mRNA Spleißen in Hefe zu inhibieren. Der Aptamer-Tetrazyklin-Komplex kann nicht nur mit der Translationsinitiation, sondern auch mit dem Spleißen der prä-mRNA in Hefe interferieren (Seiten 31-37). Dazu wurde ein Hefe-Intron in den Leserahmen von GFP inseriert. Nur bei korrektem prä-mRNA Spleißen wird die reife mRNA aus dem Kern transportiert und GFP exprimiert. Für eine RNA-basierte Regulation des Spleißens wurde die Konsensussequenz der 5’ Spleißstelle in den Stamm P1 des Tetrazyklin Aptamers integriert. Dieser ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und seine Sequenz daher variabel. Es konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von Tetrazyklin das Intron vom Spleißosom erkannt und entfernt wird. Die Expression des Gens ist dann möglich. Durch die Zugabe von Tetrazyklin wird das Spleißen inhibiert und GFP nicht länger exprimiert. Biochemische Strukturkartierungen der RNA in An- und Abwesenheit von Tetrazyklin zeigten, dass der Stamm P1 durch Ligandenbindung verfestigt wird. Die Ligandenbindung beeinflusst also nicht nur die Struktur der Bindetasche, sondern wird auch auf angrenzende Stammbereiche übermittelt. Durch Stabilisierung des Stammes P1 wird die 5’ Spleißstelle für das Spleißosom maskiert. Somit konnten wir den Mechanismus für die Aptamer basierte Regulation des prä-mRNA Spleißens aufklären. 3. Die Tetrazyklin Aptamer basierte Inhibition der Translationsinitiation ermöglicht die Regulation essentieller Gene in Hefe. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Insertion mehrerer Aptamerkopien in den 5’UTR zu einem effizienten Abschalten der Genexpression führt. Dies wurde genutzt, um ein neuartiges System für die konditionale Expression essentieller Gene in Hefe zu etablieren. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. K.-D. Entian wurden Insertionskassetten für eine PCR-basierte chromosomale Integration von Tetrazyklin Aptameren unter Kontrolle verschieden starker Promotoren konstruiert. Dafür wurden 1-3 Kopien des Tetrazyklin Aptamers unter Kontrolle des hoch exprimierenden TDH3-Promoters und des etwas schwächeren ADH1-Promoters gestellt. Außerdem wurde eines HA-tag angefügt, um die Genexpression mittels Westernblot verfolgen zu können. Zur Überprüfung der chromosomalen Insertion diente eine Kanamycin-Resistenz. Das neue System wurde erfolgreich an von fünf essentiellen Genen getestet. Es zeigte sich, dass die Zugabe von Tetrazyklin zu einem schnellen und effizienten Abschalten aller getesteten Gene führt. Die Vorteile dieses neuartigen konditionalen Genexpressionssystems in Hefe liegen in der einfachen Handhabung und der Unabhängigkeit vom verwendeten Stamm. Es müssen keine in transkodierten Proteinfaktoren coexprimiert werden. Durch dieses System konnte zum ersten Mal die Aptamer-basierte Regulation endogener, essentieller Gene gezeigt werden (Seiten 49-57). 4. Die Kombination von in vitro Selektion und in vivo Screening ermöglicht die Identifikation neuer regulatorisch aktiver Aptamere – ein Neomycin Riboswitch. Nur wenige in vitro selektierte Aptamere sind als synthetischer Riboswitch aktiv. In unserer Arbeitsgruppe wurde daher ein in vivo Screeningsystem zur Identifizierung neuer Aptamere in Hefe entwickelt. Eine Bibliothek in vitro selektierter Aptamere wurde hierzu in den 5’UTR des GFP Gens kloniert und die Aktivität einzelner Kandidaten durch Vergleich der Fluoreszenz in An- und Abwesenheit des Liganden überprüft. Wir verwendeten eine Bibliothek aus Neomycin-bindenden Aptameren und analysierten 5000 Hefeklone. Hierbei konnten zehn Sequenzen isoliert werden, die abhängig von Neomycin die Initiation der Translation inhibieren. Das 33 Nukleotid lange Aptamer N1 zeigt eine 7,5-fache Regulation und wurde näher charakterisiert. Es besteht aus einer internen asymmetrischen und einer terminalen Schleife, die durch zwei GC Basenpaare getrennt sind. Enzymatische Strukturkartierung und Mutationsanalyse zeigten, dass beide einzelsträngigen Bereiche für die Ligandenbindung wichtig sind. Der abschließende Stamm ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und hat geringen Einfluss auf die regulatorische Aktivität. N1 kann außerdem gegen andere Aminoglykosidantibiotika diskriminieren (Seiten 39-47). Interessanterweise sind die regulatorisch aktiven Aptamere in der in vitro selektierten Bibliothek stark unterrepräsentiert und konnten durch zufälliges Sequenzieren nicht identifiziert werden. Dieses Beispiel verdeutlicht eindrucksvoll die Notwendigkeit eines Screenings in vivo. 5. Regulatorisch aktive Neomycin Aptamere unterscheiden sich von inaktiven durch eine größere thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung. Durch weitere Mutationsanalysen von N1 konnte ein aktivitätsvermittelndes Element im Neomycin Riboswitch identifiziert werden. Dazu wurde entweder die terminale oder die interne asymmetrische Schleife mutiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Sequenz der terminalen Schleife nur einen modulierenden Einfluss auf die Aktivität hat, wobei die Asymmetrie der internen Schleife (aber nicht deren exakte Sequenz) ausschlaggebend für die regulatorische Aktivität ist. Für weitere Analysen wurde N1 mit fünf mutierten Varianten und dem inaktiven Neomycin bindenden Aptamer R23 verglichen. Alle sieben Aptamer haben eine ähnliche Sekundärstruktur und Ligandenaffinität, zeigen aber unterschiedliche Aktivität in vivo. Durch Bestimmung des Schmelzpunktes der verschiedenen Aptamere in An- und Abwesenheit von Neomycin zeigte sich, dass aktive Aptamere thermisch deutlich mehr durch Ligandenbindung stabilisiert werden als inaktive. Dabei ist die thermische Stabilität der Aptamer-Neomycin-Komplexe ähnlich. Jedoch ist die Stabilität ohne Ligand bei aktiven Aptameren gegenüber inaktiven Varianten deutlich erniedrigt. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in Zusammenarbeit mit Prof. J. Wöhnert konnte bestätigt werden, dass aktive Aptamere weniger stark vorgeformt sind als inaktive. Das in den Mutationsanalysen identifizierte Element nimmt nicht an der Ligandenbindung teil, sondern dient als Schalter, der den freien Zustand das Aptamers destabilisiert. Damit sorgt es für den großen Unterschied in der thermischen Stabilität des freien und des gebundenen Zustandes aktiver Aptamere. Dies zeigt, dass Unterschiede in der Stabilität die regulatorische Aktivität vermitteln (Seiten 73-102). Laufende Arbeiten sollen nun klären, ob thermische Stabilisierung durch Ligandenbindung ein allgemeingültiger Vermittler von regulatorischer Aktivität ist. Dazu werden weitere Aptamere überprüft, welche in Abwesenheit des Liganden unterschiedlich stark strukturiert sind und eventuell durch Ligandenbindung unterschiedlich stabilisiert werden. Außerdem werden wir testen, ob es die gewonnen Erkenntnisse erlauben, durch rationelles Design synthetische Riboswitche zu verbessern oder inaktive Aptamere in aktive zu verwandeln. 6. Was macht ein Aptamer zu einem regulatorisch aktiven Riboswitch? Für das Tetrazyklin Aptamer konnten wir zeigen, dass zum einen eine extrem hohe Bindekonstante und zum anderen eine hoch komplexe Bindetasche für die regulatorische Aktivität entscheidend sind. Dabei ist die Bindetasche in Abwesenheit des Liganden stark vorstrukturiert und erfährt keine globalen strukturellen Änderungen (Seiten 19-29). In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wachtveitl untersuchen wir den Einfluss von Bindekinetik und Lebensdauer des Aptamer-Tetrazyklin-Komplexes auf die regulatorische Aktivität. Dafür vergleichen wir das Tetrazyklin Aptamer mit drei regulatorisch inaktiven Mutanten. Für die Messungen nutzen wir die Eigenfluoreszenz des Tetrazyklins. Diese ist in wässriger Lösung geqenched und steigt bei Bindung an die RNA deutlich an. Erste Ergebnisse zeigen große Unterschiede zwischen den Aptameren in der Geschwindigkeit der Ligandenbindung. Außerdem zeigen sich geringe Unterschiede in der Lebensdauer der verschiedenen Komplexe. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert können die Veränderungen einzelner Basen bei Ligandenbindung untersucht werden. Hierbei zeigen erste Messungen am Tetrazyklin Aptamer, unterschiedliches Verhalten einzelner an der Bindung beteiligter Nukleotide. Eine detaillierte Aufklärung der ligandeninduzierten Veränderungen gewährt uns weitere Einblicke, warum das Tetrazyklin Aptamer als Riboswitch aktiv ist. Die regulatorische Aktivität Neomycin abhängiger Riboswitche wird durch thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung vermittelt. Dabei zeigte sich, dass durch Neomycin neue Basenpaare und Basenstapelungen entstehen. Durch weiterführende strukturelle Untersuchungen sollen nun ligandeninduzierte Veränderungen in N1 detailliert geklärt werden. Größere globale Änderungen konnten bereits durch EPR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. T. F. Prisner ausgeschlossen werden. Hierzu wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. J. W. Engels spinmarkierte Neomycin Aptamere hergestellt und die Abstände der Sonden in An- und Abwesenheit von Neomycin bestimmt. Es zeigte sich, dass sich der Abstand der Spinmarkierungen durch Zugabe von Neomycin (oder anderen Aminoglykosiden) nicht ändert (Seiten 59-72). Dies weist auf eher lokale Änderungen in der Bindetasche hin. Durch NMR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert werden im Moment die Strukturen verschiedener N1-Aminoglykosid-Komplexe gelöst. Dabei zeigt sich, dass in vivo aktive und inaktive Liganden eine ähnliche Struktur im Aptamer induzieren. Was die einzelnen Komplexe unterscheidet und damit die verschiedene Aktivität begründet ist Ziel der Analyse. Insgesamt konnte in dieser Arbeit ein Regulationssystem für die Aptamer-basierte Kontrolle des prä-mRNA Spleißens in Hefe entwickelt und das bestehende Translationssystem für die Applikation auf essentielle Gene angewendet werden. Außerdem wurden wichtige Punkte, warum Aptamere als Riboswitch funktionieren aufgeklärt. Damit legt diese Arbeit einen wertvollen Grundstein für die Weiterentwicklung RNA-basierter Genregulationselemente für die Anwendung in der synthetischen Biologie.
Survivin wird in einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert, während es in normalem Gewebe bis auf einige Ausnahmen kaum detektierbar ist. In den Krebszellen vermittelt Survivin eine erhöhte Resistenz gegenüber der Apoptose-Induktion, was eine Therapie jedoch meist bezweckt. Durch sein differenzielles Expressionsprofil wird Survivin mittlerweile als ein interessanter Angriffspunkt in der Entwicklung einer neuen, zielgerichteten Behandlung von Krebs betrachtet. Aus diesem Grund wurde zu Beginn der vorliegenden Arbeit die Eignung des anti-apoptotischen und Zellzyklus-regulierenden Proteins Survivin als Zielstruktur für eine Krebstherapie im Vergleich zu den veröffentlichten Publikationen verifiziert. Die Analyse der Survivin-Expression in unterschiedlichen Zelllinien ergab, dass sich in Tumorzellen eine charakteristische Überexpression des Survivin-Proteins zeigte im Vergleich zu gesunden, nicht-transformierten Zelllinien. Eine Inhibition der Survivin-Proteinexpression wurde mittels der Methode der RNA-Interferenz erzielt, bei der die Zielzellen mit shRNA-kodierenden Lentiviren infiziert wurden, welche eine gegen die Survivin-mRNA gerichtete Sequenz beinhalteten. Während Survivin-positive Tumorzelllinien und gesunde Endothelzellen eine starke Reduktion in der Lebend-Zellzahl in vitro aufwiesen, waren die Survivin-negativen Kontrollzelllinien von einem Verlust der Survivin-Expression nicht beeinträchtigt. Anschließend erfolgten eine Analyse der Survivin-Abhängigkeit etablierter Tumorzelllinien und die Untersuchung eines Survivin-Verlusts auf die murine Brustdrüsenentwicklung in vivo. Bei einer Inhibition der Survivin-Expression in Krebszellen in einem Transplanationsmodell konnte ein deutlich verzögertes Tumorwachstum beobachtet werden. Dagegen hatte Survivin in der Entwicklung der murinen Brustdrüse keinen Einfluss auf die Rekonstitution des Gewebes und die Proliferation bzw. Differenzierung der Brustepithelzellen. Um einen direkten protein-basierenden Inhibitor des Survivin-Proteins zu entwickeln und das Repertoire an allgemeinen Survivin-Interventionsstrategien zu erweitern, wurde im zweiten Teil der Arbeit mittels des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems ein neues Survivin-bindendes Protein isoliert. Nach dem Optimierungsprozess bestehend aus einer Fusion mit einem Trägerprotein zur erleichterten Proteinexpression, der Mutagenese eines Cysteins gegen Serin und der Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne konnte das Protein rekombinant in Bakterien hergestellt und durch Affinitätschromatographie in monomerer Form aufgereinigt werden. Anschließend wurde der Einfluss des artifiziellen, rekombinanten Survivin-inhibierenden Proteins (rSip) auf die Funktionen von Survivin bestimmt. rSip zeigte eine Stabilität von bis zu 14 Stunden im Zellkulturmedium und konnte durch seine C-terminale Proteintransduktionsdomäne in das Zytoplasma der Zielzellen aufgenommen werden. In einer Co-Immunpäzipitation konnte die Bindung von rSip an endogenes Survivin bestätigt werden. In Brustkrebszellen führte rSip in einer Konzentration von 1,5 µM zu einem schnellen Verlust des Survivin-Proteins, was möglicherweise auf eine proteosomale Degradation von Survivin zurückzuführen war. Die Analyse der Konsequenzen einer rSip-Behandlung auf die Funktionen von Survivin in der Apoptose-Inhibition und der Zellzyklus-Progression wurde im letzten Abschnitt der Arbeit durchgeführt. Eine viertägige Inkubation mit 1,5 µM rSip bewirkte eine deutliche Reduktion der Lebend-Zellzahl von bis zu 50% im Falle der Survivin-abhängigen Krebszelllinien. Bei den Survivin-negativen Zelllinien trat dagegen kein veränderter Phänotyp auf. Durch einen TUNEL-Test in Brustkrebszellen konnte gezeigt werden, dass die Ursache für die Abnahme der Zellzahl die Apoptose-Induktion durch rSip ist. In den Zellzyklus-Profilen von rSip-behandelten Krebszellen konnte ebenfalls ein starker Anstieg in der apoptotischen Zell-Population beobachtet werden. Abschließend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Arbeit neben der Methode der lentiviralen Applikation von Survivin-spezifischen shRNA-Sequenzen eine neue Möglichkeit der Interferenz mit der Survivin-Funktion in Krebszellen vorgestellt wurde. Die Entwicklung des Survivin-inhibierenden Proteins rSip steht zugegebenermaßen erst am Anfang. Die ersten hier präsentierten Ergebnisse zeigen jedoch klar ein Potential dieses vielversprechenden direkten Survivin-Inhibitors als ergänzende Wirkstoffklasse auf dem Gebiet der therapeutischen Proteine zu den bereits existierenden niedermolekularen Substanzen bzw. antisense-Oligonukleotiden, die auf Ebene der Transkription bzw. der Translation von Survivin wirken.
Das extrem thermophile Eubakterium Thermus thermophilus ist in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen geworden und verdankt seinen Statuszum Teil seiner hohe Wachstumsrate, den guten Zellerträgen und der konstitutivenExpression eines natürlichen Kompetenzapparates, der seine genetische Manipulation ermöglicht. Die Verfügbarkeit von kompatiblen Plasmiden und bis zu vier thermostabilen Antibiotikaresistenzmarkern konnten den Wert des Organismus in Hinblick auf biotechnologische Anwendungen noch weiter steigern und tatsächlich besteht nach wie vor ein ungebrochenes Interesse an der Struktur- und Funktionsaufklärung thermophiler Proteine. Der Focus der hier vorliegenden Arbeit richtete sich auf eine der insgesamt zwei terminalen Oxidasen der Atmungskette von T. thermophilus, die Cytochrom ba3 Oxidase. Es wurden verschiedene rekombinante Varianten des Proteins, die sich hinsichtlich der Position und Länge des verwendeten Histidin-Tags unterschieden, kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Das Einfügen eines internen His12-Tags in einen periplasmatischen Loop zwischen den Transmembranhelices IV und V führte zu einer rekombinanten Version der Oxidase, die in ihren Eigenschaften dem nativen Wildtyp entsprach und sich durch die in dieser Arbeit etablierte Aufreinigungsstrategie relativ schnell, in guten Ausbeuten und hoher Reinheit aufreinigen ließ. Weiterhin konnten verschiedene Punktmutationen von möglicherweise am Elektronentransfer beteiligten Aminosäureresten generiert und die resultierenden Proteine aufgereinigt und über ihre enzymatische Aktivität charakterisiert werden. Eine weiterführende Charakterisierung der Mutanten erfolgte im Rahmen einer Kooperation und ist bisher noch nicht abgeschlossen. Das Herzstück dieser Arbeit machte jedoch die Definition der Transkriptionseinheit der Cytochrom ba3 Oxidase und die sich daraus ergebenden Fragestellungen aus. So konnte gezeigt werden, dass das ba3 Operon zusätzlich zu den Strukturgenen der dort kodierten Untereinheiten noch mindestens ein, höchst wahrscheinlich jedoch zwei zusätzliche Gene enthält: cbaX und cbaY. Bioinformatische Charakterisierungen ordneten CbaY der diversen Gruppe von sekundären Transportern zu, und es konnte experimentell gezeigt werden, dass seine Anwesenheit für die Expression der Cytochrom ba3 Oxidase förderlich ist. CbaX hingegen konnte über die durchgeführte Homologiesuche keine Funktion zugeordnet werden; uncharakterisierte Homologe waren einzig in der Thermaceae Gruppe zu finden. Durch Deletions- und Komplementationsstudien konnte dem Protein eine entscheidende Rolle in der Assemblierung der ba3 Oxidase bescheinigt werden. CbaX scheint eine zentrale Aufgabe bei der Häm a Insertion in Untereinheit I zu spielen und könnte, ohne Sequenzhomologie aufzuweisen, die Rolle des Surf1-Proteins übernehmen, welches in den sequenzierten Organismen der Thermaceae Gruppe nicht konserviert ist. Die homologe Expression und Aufreinigung von CbaX führte nicht zur erwarteten Ausbeute und Reinheit des Proteins, konnte aber durch immunologische Experimente eine potentielle Interaktion von CbaX und der Cytochrom ba3 Oxidase nachweisen.