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Paria Asadi Atoi

• RNAs are key players in life as they connect the genetic code (DNA) with all cellular processes dominated by proteins. The dynamics study of RNA modifications has become an important part of epitranscriptomics field, as they are reversible and dynamically regulated far more than originally thought. Several evidences portrait a catalog of RNA modifications and their links to neurological disorders, cancers, and other diseases. Therefore, a deeper investigation of RNA modifications dynamics including their specific profile, biosynthesis, maturation and degradation is required for pioneering disease diagnostics and potential therapeutics development. Mammalian tissues reveal diverse physiology and functions, despite sharing identical genomes and overlapping transcription profiles. So far, most research on this diversity were referred to variable transcriptomic processing among tissues and differential post-translational modifications that tune the activity of ubiquitous proteins to each tissue’s needs. However, study of epitranscriptome dynamics relevance to tissues’ functions is not yet revealed. There are a few reports on mouse RNA modification profiles, which are focused on only one type of RNA and limited types of modifications. The first part of my dissertation aims to generate a comprehensive tissue-specific as well as RNA species-specific investigation of all existing RNA modifications, as well as investigating potential codon as an effector of translation diversity among tissues. Using isotope dilution mass spectrometry, I created a library including absolute quantification of 24 tRNA modifications, and up to 22 rRNA modifications. I find an almost identical pattern of modifications in 28S- and 18S-rRNA subunits, but different levels of most modifications in 5.8S-rRNA or tRNA among highly metabolic active organs to e.g. heart or spleen. The findings suggest a high degree of similarity between quantities of modifications between presented data to all previous literature, confirming that it is a suitable model to study the tissue-based RNA modification patterns. The most noticeable difference exhibited was tRNA modifications, which suggests a discerning tRNA engagement in translation between different organs. This can be a good start for investigation of codon bias in enriched genes of specific tRNA modifications among different tissues that may cause differential translation pattern, causing organs diversity. Moreover, 5.8S rRNA data showed an organ-specific pattern, which proposes functional diversity of this rRNA subunit among different organs. Future studies must investigate the possible implications of organ-specific 5.8S rRNA modifications functions, to elucidate the core of the observed variations. Abundance of RNA modifications is carefully regulated in cells. Part of this regulation is achieved by activity of enzymes removing RNA modifications, named RNA erasers. Literature has provided proof of demethylation activity of AlkBH family on different types of RNA. For instance, AlkBH5 is known to remove m6A in mRNA, and both AlkBH3 and AlkBH1 are reported to demethylate m1A and m3C in tRNA. So far, RNA erasers are mainly studied in vitro and direct in vivo studies are missing. Mass spectrometry is a promising approach in the identification and quantification of many RNA modifications. However, mass spectrometric analysis by nature, offers only a static view of nucleic acid modifications, and fails to account for their cellular dynamics. Nucleic Acid Isotope Labeling coupled Mass Spectrometry (NAIL-MS) was developed as a powerful technique which differentiates among remaining, co-transcriptional and post-transcriptional incorporation of a target RNA modification. This temporal resolution captures the dynamic nature of RNA modifications, and offers absolute and relative quantification of all existing nucleosides in any given RNA sequence, including different isotopologues and isotopomers. The objective of this study was to uncover the first “direct” iv vivo data on AlkBH1, 3 and 5 activities in demethylating each of their specific substrates. I investigated the RNA modification changes through pulse-chase experiments in collaboration with my colleagues Dr. Kayla Borland and Dr. Felix Hagelskamp. A remarkable observation was that AlkBH3 protein -but not AlkBH1- was overexpressed under methylating reagent treatment in vivo. These findings suggest that AlkBH3 -but not AlkBH1- is a methylation damage induced enzyme, that potentially triggers ASCC-AlkBH3 alkylation repair complex after aberrant methylation damage by MMS treatment. However, using NAIL-MS method, we could not detect any significant effect on demethylation activity of the enzymes in tRNA, rRNA or mRNA towards the possible substrates m6A, m1A, m3C, m5C and m7G in vivo. These distinct outcomes can be partially explained by probable existence of other unidentified demethylases that compensate for AlkBHs demethylation activity; or more probably, demethylation may still arise by remaining active AlkBHs to restore the original levels of the observed RNA modifications, since a stronger KD or a complete knockout of AlkBHs genes was not possible. Further research on fully knocked out AlkBHs genes can provide stronger evidence on unidentified demethylation activities in HEK cells.
• RNAs spielen eine Schlüsselrolle im Leben, da sie den genetischen Code (DNA) mit allen zellulären Prozessen verbinden, die von Proteinen beherrscht werden. Die Untersuchung der Dynamik von RNA-Modifikationen ist zu einem wichtigen Teil der Epitranskriptomik geworden, da sie reversibel sind und weitaus stärker dynamisch reguliert werden als ursprünglich angenommen. Es gibt zahlreiche Belege für eine Vielzahl von RNA-Modifikationen und ihre Verbindung zu neurologischen Störungen, Krebs und anderen Krankheiten. Daher ist eine genauere Untersuchung der Dynamik von RNA-Modifikationen, einschließlich ihres spezifischen Profils, ihrer Biosynthese, Reifung und ihres Abbaus, für eine innovative Krankheitsdiagnostik und die Entwicklung potenzieller Therapeutika erforderlich. Gewebe von Säugetieren weisen trotz identischer Genome und überlappender Transkriptions-profile unterschiedliche Physiologie und Funktionen auf. Die meisten Forschungsarbeiten zu dieser Diversität bezogen sich bisher auf die unterschiedliche transkriptomische Verarbeitung in den verschiedenen Geweben und auf unterschiedliche posttranslationale Modifikationen. Die Untersuchung der Epitranskriptomdynamik, die für die Funktionen der Gewebe relevant ist, ist jedoch noch nicht bekannt. Der erste Teil meiner Dissertation zielt darauf ab, eine umfassende gewebespezifische sowie RNA-Spezies-spezifische Untersuchung aller vorhandenen RNA Modifikationen zu erstellen. Zudem, soll ein potenzieller Codon-bias als Ursache für Translations-unterschiede zwischen den Geweben untersucht werden Mit Hilfe der Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrie habe ich eine Bibliothek (Datenbank) erstellt, die die absolute Quantifizierung von 24 tRNA-Modifikationen und bis zu 22 rRNA-Modifikationen umfasst. Es zeigt sich ein fast identisches Muster von Modifikationen in den 28S- und 18S-rRNA-Untereinheiten, aber unterschiedliche Niveaus in 5,8S-rRNA oder tRNA in hochgradig stoff-wechselaktiven Organen, z. B. Herz oder Milz. Die Ergebnisse deuten auf eine große Die Ergebnisse deuten auf eine große Übereinstimmung zwischen den Modifikationsmengen der präsentierten Daten und der gesamten bisherigen Literatur hin, was bestätigt, dass es sich um ein geeignetes Modell zur Untersuchung der gewebebasierten RNA-Modifikationsmuster handelt. Die auffälligsten Unterschiede waren in tRNAs zu finden, was ein guter Ausgangspunkt für die Untersuchung, ob tRNA-Mods über Interaktionen mit dem Codon-Usage-Bias verschiedener Gene zu unterschiedlichen Translationsmuster führen können. Darüber hinaus zeigten die 5.8S rRNA-Daten ein organspezifisches Muster, was auf eine funktionelle Vielfalt dieser rRNA-Untereinheit in verschiedenen Organen hindeutet. Die Menge der RNA-Modifikationen wird in Zellen sorgfältig reguliert. Ein Teil dieser Regulierung wird durch die Aktivität von Enzymen erreicht, die RNA-Modifikationen entfernen, die RNA-demethylierenden Enzyme (Erasers). In der Literatur wurde die Aktivität der RNA- Erasers der AlkBH-Familie bei verschiedenen RNA-Typen nachgewiesen. Bislang wurden RNA-Eraser hauptsächlich in vitro untersucht, und es fehlen direkte In-vivo Studien. Die Massenspektrometrie ist ein vielversprechender Ansatz für die Identifizierung und Quantifizierung vieler RNA-Modifikationen. Allerdings bietet die massenspektrometrische Analyse naturgemäß nur eine statische Sicht auf die Nukleinsäuremodifikationen und berücksichtigt nicht deren zelluläre Dynamik. Die Nucleic Acid Isotope Labeling coupled Mass Spectrometry (NAIL-MS) wurde als leistungsfähige Technik entwickelt, die zwischen verbleibender, kotranskriptioneller und posttranskriptioneller Inkorporation einer Ziel-RNA-Modifikation differenziert. Diese zeitliche Auflösung erfasst die dynamische Natur von RNA-Modifikationen und bietet eine absolute und relative Quantifizierung aller vorhandenen Nukleoside in einer beliebigen RNA-Sequenz, einschließlich verschiedener Isotopologe und Isotopomere. Ziel dieser Studie war es, die ersten "direkten" iv-vivo-Daten über die Aktivitäten von AlkBH1, 3 und 5 bei der Demethylierung ihrer spezifischen Substrate zu ermitteln. In Zusammenarbeit mit meiner Kollegien Dr. Kayla Borland und meinem Kollegen Dr. Felix Hagelskamp untersuchte ich die Veränderungen der RNA-Modifikation durch Puls-Chase-Experimente. Eine bemerkenswerte Beobachtung war, dass AlkBH3 – nicht aber AlkBH1 – unter der Behandlung mit dem Methylierungsreagenz in vivo überexprimiert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass AlkBH3 ein Enzym ist, das durch Methylierungsschäden induziert wird und möglicherweise den ASCC-AlkBH3-Alkylierungsreparaturkomplex nach eines externen-eingeführten Methyl-ierungsschadens durch MMS-Behandlung auslöst. Mit der NAIL-MS-Methode konnten wir jedoch keine signifikanten Auswirkungen auf die Demethylierungsaktivität auf tRNA, rRNA oder mRNA gegenüber den möglichen Enzymsubstraten m6A, m1A, m3C, m5C und m7G in vivo feststellen. Angeregt durch eine aktuelle Studie von Wollen et al. über das Zusammenspiel von AlkBH3 mit ASCC3 bei der Demethylierung von MMS-induziertem m1A und m3C aus mRNA wollte ich außerdem in Zusammen mit Dr. Marie Luise Winz (JGU Mainz) den Zusammenhang zwischen der In-vivo-Demethylierungsaktivität von AlkBH3 und Methylierungsstress, der den ASCC-AlkBH3-Alkylierungsreparaturkomplex in menschlichen HEK-Zellen auslöst, unter-suchen. Die Ergebnisse deuten auf einen Zusammenhang zwischen MMS-Stress und dem Anstieg der Mengen von m1A und m3C hin. Außerdem deuten meine Daten darauf hin, dass die Methylierungsreparatur von KD-AlkBHs-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen keine Rolle spielt, und sprechen daher für die Existenz anderer, noch nicht identifizierter Demethyl-ierungswege oder für die Aktivität der verbleibenden AlkBHs bei der Wiederherstellung der ursprünglichen Mengen der Substratmodifikationen. Weitere Untersuchungen an vollständig ausgeschalteten AlkBHs-Genen könnten weitere Beweise für nicht identifizierte Demethyl-ierungsaktivitäten in HEK-Zellen liefern.