Open Access

Annika Eby Pfeiffer

• The impact of the Covid-19 pandemic called for rapid responses in face of unprecedented challenges. In this context, earning more about the causative agent SARS-CoV-2 becomes imperative. Therefore, clinical virus isolates were studied with focus on infectivity, replication kinetic, and caspase activity. Firstly, clinical specimens collected from patients were tested for infectivity in cell culture. Combined with polymerase chain reaction results, a formula predicting infectivity in cell culture based on abundance of viral RNA was developed. Additionally, analysis of different specimen types, sources, and material, elucidate the question of infectivity. Here, infectivity was demonstrated in specimens derived from different parts of the respiratory tract, including specimens collected from deceased persons. A protocol for virus isolation on human airway epithelium in air-liquid interface culture was established. Secondly, replication kinetics of 20 clinical isolates were compared, including a subset of seven sequenced isolates. All isolates replicated in the colon epithelial cell culture model. Within the subset, differences between isolates carrying the D614G amino acid exchange and with original spike protein were observed. Lastly, elevated caspase activity was demonstrated in two cell culture models including human airway epithelium in air-liquid interface culture. Subsequently, caspase inhibition by small-molecule compound Emricasan and its effects on the cytopathic effect observed in cell culture were studied. Here, increased cell survival in a colon epithelial cell line was shown with unimpaired virus replication. Elevated caspase activity was identified as early marker of infection and validated by testing across 20 clinical virus isolates. This study offers information on infectivity that can help shape the understanding of transmission risk. As such, parts of the data collected here were used for validation of rapid antigen tests. The insights gained by studying caspase activity contributed in part to the development of a drug screening method by Bojkova et al.,41 thus aiding routine laboratory workflow. It was demonstrated that Emricasan exhibits no antiviral effect, while the finding of increased cell survival in cell culture could give rise to further research on prevention of tissue damage.
• Die Auswirkungen der Covid-19-Pandemie erforderten rasche Reaktionen angesichts neuer Herausforderungen. In diesem Zusammenhang wurde es unabdingbar, mehr über den Erreger SARS-CoV-2 zu erfahren. Daher wurden klinische Virusisolate mit Schwerpunkt auf Infektiosität, Replikationskinetik und Caspasenaktivität untersucht. Zunächst wurden klinische Proben von Patienten in Zellkultur auf Infektiosität getestet. Zusammen mit viralem RNA-Vorkommen untersucht in der Polymerase-Kettenreaktion, wurde aus diesen Ergebnissen eine Formel zur Vorhersage der Infektiosität in Zellkultur entwickelt. Zusätzlich wurde die Frage der Infektiosität durch die Analyse verschiedener Probentypen, Quellen und Materialien beleuchtet. Hier wurde Infektiosität von Proben aus verschiedenen Teilen des Respirationstrakts nachgewiesen, darunter auch Proben, die von Verstorbenen stammen. Es wurde ein Protokoll für die Virusisolierung auf menschlichem Atemwegsepithelzellen in Luft-Flüssigkeits-Interface-Kultur erstellt. Zweitens wurde die Replikationskinetik von 20 klinischen Isolaten verglichen, einschließlich einer Untergruppe von sieben sequenzierten Isolaten. Alle Isolate konnten in dem Zellkulturmodell aus Kolonepithel replizieren. Innerhalb der Untergruppe wurden Unterschiede zwischen Isolaten beobachtet, die den D614G-Aminosäureaustausch tragen im Vergleich zu denen mit originalem Spike-Protein. Schließlich wurde eine erhöhte Caspasenaktivität in zwei Zellkulturmodellen nachgewiesen, darunter menschliche Atemwegsepithelzellen in Luft-Flüssigkeits-Interface-Kultur. Anschließend wurde Caspaseninhibition durch die niedermolekulare Verbindung Emricasan und ihre Auswirkungen auf den in der Zellkultur beobachteten zytopathischen Effekt untersucht. Dabei wurde eine erhöhte Zellüberlebensrate in einer Kolonepithelzelllinie bei ungestörter Virusreplikation nachgewiesen. Erhöhte Caspasenaktivität wurde als früher Marker für eine Infektion identifiziert und durch Tests mit 20 klinischen Virusisolaten validiert. Diese Studie liefert Informationen zur Infektiosität, die zum Verständnis des Übertragungsrisikos beitragen können. So wurden Teile der hier gesammelten Daten für die Validierung von Antigen-Schnelltests verwendet. Die durch die Untersuchung der Caspasenaktivität gewonnenen Erkenntnisse trugen zum Teil zur Entwicklung einer Arzneimittel-Screening-Methode durch Bojkova et al.41 bei und können so Arbeitsroutinen im Labor erleichtern. Es konnte gezeigt werden, dass Emricasan keine antivirale Wirkung hat, während die Feststellung einer erhöhten Zellüberlebensrate in Zellkulturen Anlass zu weiterer Forschung zur Prävention von Gewebeschäden geben könnte.