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Thorsten Strube

• Die vorliegende Arbeit befasst sich im Wesentlichen mit zwei Zielen. Zum einen sollte durch den selektiven Einbau von modifizierten Nukleosiden der UUCG-Tetraloop untersucht werden, um seine ungewöhnlich hohe Stabilität besser zu verstehen. In einem zweiten Projekt stand die Entwicklung einer neuen Methode für das Spin-Labeling von Oligonukleotiden für die ESR-Spektroskopie im Mittelpunkt. Die einzigartige hohe Stabilität des UUCG-Tetraloops beruht auf der Ausnutzung der drei stabilisierenden Faktoren: Wasserstoffbrücken, Basenstapelung und Solvatation. Für die Untersuchung des UUCG-Tetraloops wurden 2´-Fluorpyrimidine 22a/b, 23a/b und 27a/b, 2´- Desoxyuridin 26a/b sowie ein dem Uridin isosterer Baustein 28a/b eingesetzt (Abb. 10.1). Während die Bausteine 27a/b und 28a/b vorlagen, sind die Bausteine 22a/b, 23a/b und 26a/b synthetisiert worden. 2´-Fluorpyrimidine können durch die fehlende 2´-OH-Funktion nicht als Wasserstoffbrückendonor dienen. Weiterhin verschiebt die Fluorierung in ribo- bzw. arabino- Stellung das C3´-endo/C2´-endo Gleichgewicht. Im Vergleich mit dem Einbau von 2´- Desoxyuridin lassen sich Aussagen über Vorzugskonformation und Beteiligung an Wasserstoffbrücken einzelner Nukleotide im Loop machen. Ein Schlüsselmolekül für die Synthese der 2´-Fluor modifizierten Bausteine 22a/b und 23a/b ist 2,2´-Anhydro-1-( -D-arabinofuranosyl)uracil 19 welches durch die Umsetzung von Uridin 18 mit Diphenylcarbonat und Natriumhydrogencarbonat in HMPT erhalten werden kann. Dieses ermöglicht die selektive Einführung eines Fluor-Atoms. Die 2´-Fluornukleoside wurden nach Standardbedingungen in Phosphoramidite überführt. Die Darstellung des Cytidinbausteins 23a/b gelang durch direkte Umsetzung der Verbindung 22a/b mit 1,2,4-Triazol und POCl3. Diese Reaktion erspart einen gesonderten mehrstufigen Syntheseweg für die Verbindung 23a/b ausgehend vom Cytidin. Die Bausteine wurden selektiv an verschiedenen Positionen im Loop- und Stembereich der UUCG-Haarnadelschlaufe mittels der Phosphoramiditmethode an einem Syntheseautomaten eingebaut. Die Aufreinigung der erhaltenen RNA-Stränge erfolgte durch Anionenaustausch-HPLC. Nach der Charakterisierung durch MALDI-TOF Massenspektrometrie wurden die Stränge mittels UV- und CD-Spektroskopie untersucht. Neben den Tm-Werten wurden auch die thermodynamischen Parameter bestimmt. Aus den gemessenen Daten konnten im Wesentlichen folgende Ergebnisse erzielt werden: * Der Einbau aller Bausteine im Loopbereich führte zu einer Destabilisierung im Vergleich zum nativen Loop. Die Inkorporation von UF im Stembereich hatte eine beachtliche Stabilisierung der Struktur zur Folge, im Fall des Stranges HP19 von 8°C (siehe Tab. 7.1, Seite 79) * Der Einbau von UF an der Position U4 führte erwartungsgemäß zu einer Destabilisierung, da die durch NMR-Daten belegte Wasserstoffbrücke zu G7 nicht ausgebildet wird. * An der Position U4 liegt bevorzugt eine C2´-endo Konformation vor. * Von besonderer Bedeutung für die Stabilität des Loops ist die Position C6. Die Inkorporation von CF hat eine besonders deutliche Destabilisierung zur Folge, woraus auf eine bevorzugte C2´-endo Konformation geschlossen werden kann. Zum anderen spielen hier Solvatationseffekte eine Rolle, da die 2´-OH-Funktion des nativen Loops Kontakt zum Lösungsmittel hat. * Der Einbau des isosteren Bausteins 28a/b führte an keiner Position zu einer Stabilisierung, obwohl durch das ausgeprägte -System eine bessere Basenstapelung zu erwarten wäre. Im Gegenteil wir durch die modifizierte Base der Tetraloop nachhaltig destabilisiert (12°C). * Auffällig ist eine Abflachung der erhaltenen Schmelzkurven, die auf eine Abnahme der Kooperativität oder das Vorhandensein verschiedener Zwischenstufen schließen lässt. Auch NMR-Ergebnisse belegen, dass der Tetraloop ein hohes Maß an Flexibilität zeigt. Die erhaltenen Daten sind in Übereinstimmung mit einer auf NMR-Daten beruhenden simulierten Struktur, die Williams et al, 2001 vorgeschlagen haben. * Die Mehrfacheinbauten zeigen, dass die stabilisierenden Kräfte dieses Tetraloops synergetisch scheinbar optimal zusammenwirken und nur schwer getrennt voneinander betrachtet werden können. Im zweiten Projekt sollten Oligonukleotide durch das Anbringen von Spin-Labeln für die ESR-Spektroskopie zugänglich gemacht werden. Zunächst ist der durch seine Starrheit geeignete Label 29 in einer 8-stufigen Synthese ausgehend von 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-4-on 41 synthetisiert worden. Nach der Bromierung in und ´-Position wird durch eine Favorskii-Umlagerung der Fünfring aufgebaut. Die Oxidation des Amins wurde mit H2O2/Natriumwolframat durchgeführt. Nach der basischen Hydrolyse wird die Seitenkette über ein Weinrebamid zum Aldehyd reduziert. Eine direkte Reduktion war nicht möglich. Das terminale Alkin des Labels 29 wir durch Seitenkettenverlängerung durch eine Wittig- Reaktion mit anschließender Dehydrochlorierung erhalten. Ein alternativer Syntheseweg, der die Oxidation des Amins zum Nitroxid auf einer späteren Stufe vorsieht, war nicht erfolgreich. Da die Ankupplung des Labels an die 5-Position eines Uridin- oder Desoxyuridin- Bausteins während der Festphasensynthese am Syntheseautomaten erfolgen soll, ist der entsprechende 5-Ioduridinphosphoramidit- bzw. 2´-Desoxy-5-Ioduridinphosphoramidit- baustein synthetisiert worden. Nach der Schützung der freien Hydroxylgruppen mit der Acetylschutzgruppe ist die Iodierung der 5-Position mit Iod und Cerammoniumnitrat durchgeführt worden. Nach der Entschützung der Hydroxylgruppen wurden die Phosphoramidite nach Standardmethoden synthetisiert. Im Gegensatz zu bisherigen Arbeiten, die ein gelabletes Phosphoramidit am Synthesizer eingebaut haben, wurde die Kupplung des Labels in dieser Arbeit während der Festphasensynthese durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass im Gegensatz zu dem gelabelten Amidit pro Kupplung nur geringe Mengen des Spin-Labels verbraucht werden. An der zu markierenden Position wird ein 5-Ioduridin oder 2´-Desoxy-5-ioduridinbaustein eingebaut und danach die Säule vom Synthesizer entfernt. Nun wird mit Hilfe von Spritzen eine Mischung des Labels, des Palladium(0)-Katalysators und CuI in DMF/Triethylamin auf die Säule aufgegeben. Nach der erfolgten Kupplung wird die Säule wieder am Synthesizer installiert und die Synthese fortgesetzt. Es hat sich aus Gründen der einfacheren Handhabbarkeit als günstiger erwiesen, als Katalysator nicht Tetrakis-(triphenylophosphin)-palladium(0) 66 sondern Bis- (triphenylphospin)-palladium(II)-dichlorid 68 einzusetzen. Die Kupplungsausbeuten des Labels lagen nach HPLC-Daten bei über 90% für die Stränge SG1 bis SG4 (siehe Tab. 9.2, Seite 132). Die Ausbeuten lagen damit genauso hoch wie die Kupplung des als Vergleichsverbindung eingesetzten Hexins. Während die HPLC-Aufreinigung bei den kurzen Strängen erfolgreich war, waren bei den längeren Strängen SG7 bis SG9 die Unterschiede in den Retentionszeiten geringer, sodass es bei noch längeren Strängen nötig werden könnte, die Stränge mittels Gelelektrophorese aufzureinigen. Die Analytik erfolgte durch ESR-Spektroskopie, enzymatischen Verdau und Massenspektrometrie. Jedoch habe sich sowohl die MALDI-TOF als auch die ESI- Massenspektrometrie als problematisch erwiesen. Die Spektren waren oft nicht aussagekräftig und wenig reproduzierbar. Als Ausblick für zukünftige Arbeiten ausgehend von dieser Arbeit werden folgende Untersuchungen angeregt: * Die Untersuchung, ob FPLC oder Gelelektrophorese geeignete Methoden darstellen, um längere gelabelte Stränge aufzureinigen. * Darstellung von iodierten Purinnukleosiden, um beliebige Positionen innerhalb eines Oligonukleotids mit einem Spin-Label markieren zu können. * Den Mehrfacheinbau von Spin-Labeln um Abstände in kleinen RNA-Strukturen, z.B. Ribozymen zu bestimmen. Hier können auch Wechselwirkungen mit anderen paramagnetischen Sonden wie Manganionen ausgenutzt werden.