Open Access

Sandra Lazaroski

• Biglycan is a member of the small leucine-rich proteoglycan (SLRP) family and is involved in the assembly of extracellular matrix components. In macrophages soluble biglycan acts as an endogenous ligand of the innate immunity receptors TLR2 and TLR4. Data addressing the role of biglycan in renal pathology are surprisingly limited. In a normal kidney, biglycan is expressed mainly in the tubulointerstitium; however, in the course of various renal diseases its expression may be altered. The biological role and mechanisms of biglycan action in the pathology of renal diseases, especially those affecting glomeruli, remain poorly understood. Albuminuria is the first detectable clinical abnormality in diabetic nephropathy. In this study we detected increased biglycan mRNA expression in glomeruli of renal biopsies of patients with incipient diabetic nephropathy, with predominant localization in podocytes. This novel finding raised the question about the role and mechanisms of biglycan action in diabetic podocyte injury and whether the mechanisms of biglycan signaling causing podocyte injury and albuminuria could be extrapolated to other glomerular diseases. To investigate the role of biglycan in the cause of diabetic podocyte injury and albuminuria we used the murine model of STZ-induced diabetic nephropathy and wild type (Bgn+/0) and biglycan deficient (Bgn-/0) mice. We observed that biglycan was expressed on mRNA and protein levels in podocytes of diabetic Bgn+/0 mice and that diabetic Bgn+/0 mice also had significantly higher albuminuria compared to non-diabetic mice 6 and 12 weeks after disease induction. Biglycan deficiency was shown to be an important factor in albuminuria development. Namely, we observed that diabetic Bgn-/0 mice had significantly lower levels of urinary albumin compared to diabetic Bgn+/0 mice. We showed that less severe podocyte loss in the urine of diabetic Bgn-/0 mice was associated with significantly higher nephrin and podocin glomerular expression compared to diabetic Bgn+/0 mice. Our data suggested that biglycan deficiency was protective against podocyte loss into urine and might be beneficial against development of albuminuria in diabetes. Biglycan contributed to podocyte actin rearrangement due to increased phosphorylation of Rac1 in vitro. Furthermore, biglycan induced caspase-3 activity and production of reactive oxygen species (ROS), thus enhancing apoptosis in cultured podocytes. Biglycan-induced ROS generation was TLR2/TLR4-dependent. Overexpression of soluble biglycan in wild type mice induced albuminuria under normal conditions and significantly increased albuminuria under pathological conditions (murine model of LPS-induced albuminuria). Inhibition of Rac1 activity in vivo decreased the albuminuria induced by biglycan overexpression. In patients with glomerular diseases, biglycan was detected in urine and was associated with nephrin appearance in the urine of these patients and with increased albuminuria. Collectively, our results elucidate a novel mechanism for biglycan-induced TLR2- and TLR4-dependent, Rac1- and ROS-mediated podocytopathy leading to podocyturia, albuminuria development and progression of glomerular diseases. Interfering with biglycan actions and blocking its signaling via TLR2 and TLR4 might be a potential therapeutic strategy against these diseases. To achieve this goal, the specific mechanisms for binding of biglycan to TLR2 and TLR4 must be elucidated and effective ways of preventing this binding must be developed. Nevertheless, biglycan remains the “danger signal” that activates innate immune receptors in non-immune cells and triggers the deleterious mechanisms leading to aggravation of renal injury.
• Biglycan ist ein Molekül der extrazellulären Matrix (ECM) und gehört zu der Familie der kleinen leuzinreichen Proteoglykane (SLRP). Biglycan kann, neben seiner strukturellen Funktion bei der Assemblierung anderer ECM-Komponenten, als „danger signal“ agieren und die kooperative Aktivierung von Rezeptoren der angeborenen Immunität induzieren. Biglycan ist ein endogener Ligand von TLR2 und 4 in Makrophagen und stimuliert so über Aktivierung von p38, ERK und NF-Kappa B die Expression von TNF-alpha und MIP-2. Es gibt stetig mehr Daten bezüglich der Rolle von Biglycan für die renale Pathologie, tiefere Untersuchungen zum genauen Wirkungsmechanismus von Biglycan sind hierbei jedoch überraschend limitiert. In der gesunden Niere wird Biglycan hauptsächlich im Tubulointerstitium exprimiert, im Verlauf verschiedener Nierenkrankheiten kann sich diese Expression jedoch ändern. In vorherigen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass es in der human diabetischen Nephropathie zu einer Überexpression von Biglycan im Tubulointerstitium sowie den Glomeruli kommt. Zudem konnte kürzlich in dem murinen Modell der Lupus Nephritis ein erhöhter Spiegel von Biglycan in Plasma- sowie Nierenproben gefunden werden, welcher mit dem Schweregrad der Krankheit korreliert. Trotzdem ist sowohl die biologische Rolle von Biglycan als auch dessen Wirkungsmechanismus in der Pathologie von glomerulären Nierenkrankheiten bis dato wenig verstanden. Albuminurie ist die erste detektierbare klinische Abnormalität in der diabetischen Nephropathie. Die Reduktion der Anzahl und/oder Dichte der Podozyten mit Fußfortsatz sind die Anzeichen der diabetischen Podozytopathie, welche sich klinisch in Albuminurie manifestiert. Der Verlust von Proteoglykanen in der glomerulären Basalmembran (GBM) wurde bereits als mögliche Ursache für die Entstehung von Albuminurie diskutiert. Podozytopathie und Albumninurie sind neben der diabetischen Nephropathie auch charakteristische klinische Parameter für fokal segmentale Glomerulosklerose, Minimal-Change-Glomerulonephritis sowie membranöse Glomerulonephropathie. Daher wurde in dieser Arbeit der Fokus auf die Podozyten als zentrales Ziel in der Entwicklung und Fortschreiten von Albuminurie gelegt. In dieser Studie konnte eine erhöhte glomeruläre Biglycan mRNA Expression in den Nierenbiopsien von Patienten mit beginnender, manifestierter sowie fortgeschrittener diabetischen Nephropathie gefunden werden, welche vorwiegend in Podozyten lokalisiert war. In Betracht dessen sollte die Rolle und die Mechanismen der Wirkungsweise von Biglycan auf den diabetischen Podozytenschaden untersucht werden sowie analysiert werden, ob diese zu Podozytenschäden und Albuminurie führenden Wirkungsmechanismen auch auf andere glomeruläre Krankheiten übertragbar sind. Hierfür wurde das Mausmodell der STZ-induzierten diabetischen Nephropathie in Wild Typ (Bgn+/0) und Biglycan-defizienten (Bgn-/0) Mäusen eingesetzt. In diabetischen Bgn+/0-Mäusen konnte drei Wochen nach Induktion der Diabetes eine Überexpression von Biglycan mRNA und Protein in Glomeruli, vorwiegend in Podozyten, beobachtet werden, was die Relevanz von Biglycan für die podozytären Veränderungen in den frühen Stadien der diabetischen Nephropathie verdeutlicht. Zudem zeigten diabetische Bgn+/0 Mäuse 6 und 12 Wochen nach Krankheitsinduktion signifikant höhere Albuminurie als nicht diabetische Tiere, was darauf hinweist, dass die Überexpression von Biglycan dem Auftreten von Albuminurie vorausgeht. In diabetischen Bgn-/0 Mäusen konnten signifikant erniedrigte Spiegel von Harnalbumin im Vergleich zu diabetischen Bgn+/0 Mäusen aufgefunden werden. In experimenteller diabetischer Nephropathie lösen sich Podozyten von der GBM ab und gelangen in den Harnraum. In diesem Zusammenhang wurden Harnsedimente von diabetischen und nicht-diabetischen Bgn+/0 sowie Bgn-/0 Mäusen auf die Podozytenmarker Nephrin, Synaptopodin und Podocin untersucht. Nephrin und Podocin waren lediglich in Harnsedimenten von diabetischen Bgn+/0 Mäusen detektierbar, Synaptopodin hingegen war in allen experimentellen Tiergruppen zu finden, jedoch ebenfalls am stärksten in diabetischen Bgn+/0 Mäusen. Diese Daten weisen darauf hin, dass sich eine Biglycan-Defizienz schützend gegen Podozytenverlust sowie gegen die Entstehung von Albuminurie in Diabetes auswirkt. Es konnte gezeigt werden, dass der geringere Verlust von Podozyten in diabetischen Bgn-/0 Mäusen mit einem signifikant erhöhten glomerulären Proteinvorkommen von Nephrin und Podocin im Vergleich zu diabetischen Bgn+/0 Mäusen verbunden war. Podozytenschäden können teilweise durch Zerstörung des Aktinzytoskeletts entstehen. Es gibt vereinzelnd Hinweise in der Literatur darauf, dass Matrix Proteine an der Regulation von Aktinfasern beteiligt sind. Biglycan und Decorin können beispielsweise morphologische und zytoskelettale Veränderungen von Fibroblasten verursachen, während Fibronektin in proteinurischen Erkrankungen über den Signalweg via Dystroglycan die Auslöschung von Fußfortsätzen induzieren kann. Die mögliche Rolle dieser Moleküle auf das Zytoskelett und Podozytenmorphologie wurde jedoch nie mit der Aktivierung der kleinen GTPase Rac1, einem bekannten Aktin Regulator, in Zusammenhang gebracht. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Biglycan in kultivierten humanen Podozyten Veränderungen im Aktinzytoskelett hervorrufen kann, welche zur Ausbildung von Lamellopodien und kortikalen Ringen führen kann. Es konnte gezeigt werden, dass Biglycan die Aktinzytoskelettanordnung Rac1-abhängig beeinflusst, indem es spezifisch die Rac1 Phosphorilierung zeitabhängig erhöht. Die Biglycan-induzierte Aktivierung von Rac1 wurde komplett durch den spezifischen Rac1 Inhibitor NSC23766 aufgehoben. Podozytärer Schaden erfolgt in der frühen Phase der diabetischen Nephropathie und könnte, wie in vitro gezeigt, durch Biglycan-induzierte Aktin Veränderungen zur Podozytenauslöschung führen. Ein weiterer Mechanismus der zum Podozytenverlust führt ist die Apoptose von abgelösten Podozyten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Podozyten in vitro nach Biglycan Stimulation apoptotisch werden und der Einsatz des Rac1 Inhibitors die Anzahl der apoptotischen Podozyten nach Biglycan Stimulation reduzieren konnte. Stimulation mit Biglycan führte zu einer erhöhten Aktivierung von Caspase-3, korrelierend mit der erhöhten Anzahl apoptotischer Zellen. Die Zugabe von Rac1 Inhibitor vor dem Biglycan Stimulus konnte die aktive Caspase-3 jedoch nicht vollständig hemmen, was auf einen zusätzlichen, noch nicht untersuchten Mechanismus der Biglycan-induzierten Aktivierung von Caspase-3 schließen lässt. In der diabetischen Nephropathie ist die Aktivierung von Caspase-3 ein wichtiger Faktor für die Auslösung von Apoptose, aber auch andere proapoptotische Faktoren werden im Verlauf der Krankheit hochreguliert. Oxidativer Stress (eine erhöhte Menge reaktiver Sauerstoffspezies) beispielsweise verstärkt Apoptose und kann zu Podozytenverlust führen. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind verbunden mit einer erhöhten Aktivität von Rac1 in der Membran. Untersuchung der ROS Produktion in Biglycan stimulieren Podozyten zeigte eine zeitabhängige Induktion von ROS durch Biglycan, welche erheblich durch die Zugabe des Rac1 Inhibitors gehemmt werden konnte. Zudem zeigten aus Tlr2-/-, Tlr4-/- and Tlr2-/-/Tlr4-m Mäusen isolierte primäre Podozyten eine signifikant niedrigere ROS Produktion als Podozyten aus Bgn+/0 Mäusen, was die Relevanz dieser Rezeptoren für die Biglycan-induzierte ROS Produktion verdeutlicht. Bei Stress oder Gewebsverletzungen kann Biglycan von der ECM freigesetzt werden und als löslicher Ligand verschiedene Zellantworten beeinflussen. Die Überexpression von löslichem humanen Biglycan mittels des pLIVE-Expressionsvektors ermöglicht es einen solchen pathologischen Zustand nachzuahmen. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob Biglycan in der Lage einen Podozytenverlust zu induzieren. In der Tat konnte durch die Überexpression von löslichem Biglycan eine Verstärkung der Albuminurie sowie des Podozytenverlustes im Modell der LPS-induzierten Albuminurie beobachtet werden. Lösliches Biglycan erhöhte die Albuminurie in vivo sowohl allein als auch synergistisch mit LPS. Zudem konnte in Mäusen mit Überexpression des solublen Biglycans durch Hemmung der Rac1 Aktivität Abuminurie sowie Podozytenverlust vermindert werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Biglycan Podozytopathie sowie Albuminurie TLR/Rac1/ROS-abhängig induziert. In Patienten mit glomerulären Krankheiten wie diabetischer Nephropathie, fokal segmentaler Glomerulosklerose und Minimal-Change-Glomerulonephritis konnte gezeigt werden, dass die Detektion von Biglycan im Urin mit Podozytenverlust assoziiert ist. Diese Befunde untermauern die Hinweise, dass Biglycan ein wichtiger Faktor des glomerulären Schadens in humanen glomerulären Krankheiten ist. Die Beeinträchtigung der Funktionen von Biglycan oder die Blockierung des Signalweges über TLR2/4 und Rac1 könnte einen potenziellen Therapieansatz für diese Krankheiten darstellen. Um dies zu erreichen muss die Bindung von Biglycan an TLR2 und 4 präzise untersucht werden und ein effektiver Weg zur Unterdrückung dieser Bindung entwickelt werden.