Open Access

Vanessa Ehrenfeld

• Acute lymphoblastic leukemia (ALL), a neoplastic disorder of blood cells of the lymphoid lineage, is the most frequent childhood cancer. In spite of increasing survival rates, the outcome for adults, infants or relapsed patients is still less favorable, highlighting the need for novel treatment options. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules that are involved in a variety of cellular pathways. As high ROS levels lead to oxidative stress and irreversible oxidation of cellular macromolecules, the production and elimination of ROS is tightly controlled. Therefore, cells express several antioxidant molecules and enzymes, including glutathione, catalase and the thioredoxin (Trx) system, to balance ROS levels. As cancer cells were found to have increased ROS levels that could contribute to tumor progression and metastasis, they rely strongly on these antioxidant systems to prevent oxidative damage, making cancer cells especially vulnerable to ROS-inducing treatments. ROS and oxidative stress have been shown to induce programmed cell death via different pathways, however the exact mechanisms that couples oxidative signaling and cell death is not completely understood. As a disturbance of the cellular redox homeostasis was reported during leukemia development and progression, we wanted to determine the potential of Trx inhibitors for ALL therapy. Additionally, we aimed to further understand the role of ROS and subsequent protein oxidation in the induction and execution of programmed cell death. First, we demonstrated that the Trx1 inhibitor PX-12 induced cell death in three ALL cell lines. Further analysis of the events leading to PX-12-induced cell death in FADD-deficient (FD) Jurkat cells revealed an increase in ROS levels and oxidation-mediated dimer formation of peroxiredoxin 3 (PRDX3). Interestingly cell death was inhibited by the thiol-containing antioxidant N-acetylcysteine (NAC), but not by non-thiol-containing ROS scavengers. PX-12 treatment further induced cleavage of caspase-9 and -3 and activation of the pro-apoptotic BCL-2 protein BAK, leading us to the conclusion that mitochondria-dependent apoptosis was induced. Interestingly, we could demonstrate an important role for the BH3-only protein NOXA in the mediation of PX-12-induced apoptosis as knock-down of NOXA prevented cell death induction and BAK activation. Our findings give novel insights into the mechanism of PX-12-induced cell death in ALL cell lines and underscores the potential of PX-12 for the treatment of ALL. To further understand the processes leading to cell death upon inhibition of the Trx system, we analyzed global protein oxidation in Jurkat FD cells upon treatment with the Trx reductase inhibitor Auranofin. In line with previous results, Auranofin induced intrinsic apoptosis that was dependent on BAK and accompanied by increased ROS levels. Using a BIAM Switch Assay followed by mass spectrometry, we demonstrated that Auranofin treatment induced oxidation of over 200 proteins. We identified several proteins whose oxidation upon Auranofin treatment was expected, like Trx1, Trx2 and several peroxiredoxins. Additionally, we verified oxidation of APAF1-interacting protein (APIP) and protein arginine N-methyltransferase (PRMT1) that are both implicated in the regulation of apoptosis. With this analysis we were able to demonstrate that Auranofin treatment leads to changes in global protein oxidation. Whether oxidation of the determined proteins changes their functionality and contributes to apoptosis induction remains to be elucidated. As we identified BAK as an important player in PX-12- and Auranofin-induced cell death in the previous parts of this study, we wanted to further understand its involvement in ROS-mediated cell death. First analyses in wild-type (WT) and BAK-/- murine embryonic fibroblasts (MEFs) revealed that BAK was essential for Auranofin-induced cell death and that this cell death was caspase-independent in MEFs. Interestingly, BAK oxidation was induced upon treatment with Auranofin, but not upon stimulation with the apoptosis-inducing compound Etoposide. Expression of mutated BAK, with either one or both oxidation-sensitive cysteines mutated to oxidation-insensitive serines, revealed that mutating already one cysteine protected cells from Auranofin , but not Etoposide-induced cell death. Of note, mutation of the BAK BH3 domain rescued MEFs from both, Auranofin- and Etoposide-mediated cell death. The presence of cysteine residues also altered BAK interactions as observed by a mass spectrometric analysis of Auranofin-treated MEFs expressing either WT or cysteine-less BAK. We identified interactions of WT BAK with proteins involved in mitochondrial fission and vesicle transport upon Auranofin treatment. Of note, interaction with proteins involved in apoptosis, like BAX or BCL-XL, was not changed between WT and cysteine-less BAK. Our results demonstrate a critical role for BAK oxidation in Auranofin-induced cell death. Furthermore, we identified novel oxidation-dependent BAK interaction partners. To conclude, this study highlights the potential of ROS-inducing treatments for ALL therapy and provides novel insights into the redox regulation of programmed cell death.
• Die akute lymphoblastische Leukämie, eine Neoplasie der lymphoiden Blutzelllinie, ist die häufigste Krebserkrankung im Kindesalter. Trotz steigender Überlebensraten sind die Aussichten für Erwachsene, Kleinkinder und Patienten, die einen Rückfall erleiden, immer noch schlecht. Deswegen werden neue Therapieoptionen benötigt. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind wichtige Signalmoleküle die in einer Vielzahl von Signalwegen involviert sind. Da hohe ROS-Level oxidativen Stress verursachen und zur irreversiblen Oxidation von zellulären Makromoleküle führen können, ist die Bildung und die Beseitigung von ROS stark kontrolliert. Daher exprimieren Zellen verschiedene antioxidative Moleküle und Enzyme um die ROS-Level im Gleichgewicht zu halten. Diese sind beispielsweise Glutathion, Katalase und das Thioredoxin- (Trx-) System. Bei Krebszellen wurden erhöhte ROS-Level gefunden, die zum Fortschreiten der Krebserkrankung und zur Metastasierung beitragen können. Um sich vor oxidativer Schädigung zu schützen sind Krebszellen daher stark von antioxidativen Systemen abhängig. Dies macht Krebszellen besonders anfällig für Behandlungen die ROS induzieren. Weiterhin können ROS und oxidativer Stress programmierten Zelltod durch verschiedenen Signalwege auslösen. Jedoch ist der genaue Mechanismus, der oxidative Signalwirkung und Zelltod verbindet, nicht vollständig bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, das Potential von Inhibitoren des Trx Systems für die Therapie der ALL zu untersuchen, da eine Störung der zellulären Redox-Homöostase während der Entwicklung und dem Verlauf der Leukämie berichtet wurde. Zusätzlich wollten wir die Rolle von ROS und der dadurch verursachten Proteinoxidation bei der Induktion und der Ausführung des programmierten Zelltodes besser verstehen. Im ersten Teil dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass der Trx1-Inhibitor PX-12 Zelltod in drei ALL Zelllinien verursacht. Weitere Analysen in FADD-defizienten (FD) Jurkat Zellen ergaben, dass die PX 12-Behandlung einen Anstieg von ROS und der durch Oxidation ausgelösten Dimerbildung von Peroxiredoxin-3 zur Folge hatte. Interessanterweise konnte Zelltod durch die Vorbehandlung mit dem Thiol-enthaltenden Antioxidans N-Acetylcysteine, aber nicht mit Thiol-freien Antioxidantien, inhibiert werden. Weiterhin führte die Behandlung mit PX-12 zur Spaltung von Caspase-3 und -9 und zur Aktivierung des pro-apoptotischen BCL-2 Proteins BAK. Wir schlussfolgerten deshalb, dass die PX-12-Behandlung zur Aktivierung der intrinsischen Apoptose führte. Außerdem konnten wir eine wichtige Rolle des BH3-only Proteins NOXA in der von PX-12 ausgelösten Apoptose zeigen, da ein Knock-down von NOXA Zelltod und die Aktivierung von BAK verhinderte. Diese Ergebnisse geben neue Erkenntnisse über den Mechanismus des PX-12-abhängigen Zelltods in ALL Zelllinien und unterstreichen das Potential von PX-12 für die Behandlung der ALL. Um die weiteren Vorgänge, die zum durch Trx-Inhibition induzierten Zelltod führen besser zu verstehen, untersuchten wir als nächstes Änderungen in der globalen Proteinoxidation in Jurkat FD Zellen, die durch die Behandlung mit dem Thioredoxin-Reduktase-Inhibitor Auranofin ausgelöst wurden. Passend zu vorherigen Ergebnissen löste die Behandlung mit Auranofin intrinsische Apoptose und eine Erhöhung der ROS-Level aus. Durch die Verwendung eines BIAM-Switch-Assays gefolgt von Massenspektrometrie konnten wir zeigen, dass die Auranofin-Behandlung die Oxidation von über 200 Proteinen induzierte. Wie erwartet, konnten wir Oxidation von Trx1, Trx2 und verschiedenen Peroxiredoxinen zeigen. Außerdem konnten wir die Oxidation von APAF1-interacting protein (APIP) und Protein arginine N methyltransferase (PRMT1) darlegen, die beide mit der Regulation von Apoptose in Verbindung stehen. Mit dieser Untersuchung konnten wir zeigen, dass die Behandlung mit Auranofin zu Veränderungen der globalen Proteinoxidation beiträgt. Ob die Funktionalität der beschriebenen Proteine durch Oxidation verändert wird und dies zur Induktion der Apoptose beiträgt muss weiter untersucht werden. Da wir BAK als wichtiges Protein beim PX-12- und Auranofin-induzierten Zelltod identifiziert haben, wollten wir die Beteiligung von BAK im ROS-vermittelten Zelltod weiter untersuchen. Erste Analysen in Wildtyp (WT) und BAK-/- murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) zeigten, dass BAK essentiell für den von Auranofin-induzierten Zelltod in MEFs war. Interessanterweise war dieser Zelltod in MEFs unabhängig von Caspasen. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass die Behandlung mit Auranofin, aber nicht mit der Apoptose-auslösenden Substanz Etoposid, die Oxidation von BAK auslöste. Weiterhin konnten wir zeigen, dass die Expression von BAK-Mutanten, bei denen mindestens ein Cystein zu Serin mutiert wurde, MEFs vor Auranofin-induziertem Zelltod schützte. Wir konnten feststellen, dass sich die Interaktionspartner von WT BAK und Cystein-freiem BAK unterschieden. So interagierte WT BAK nach Auranofin-Behandlung mit Proteinen, die in der Fission von Mitochondrien und im Vesikeltransport involviert sind. Interessanterweise unterschied sich die Interaktion mit Proteinen, die eine Rolle in der Apoptose spielen, nicht zwischen WT und Cystein-freiem BAK. Unsere Ergebnisse weisen auf eine wichtige Rolle der Oxidation von BAK im Auranofin-induzierten Zelltod hin. Weiterhin konnten wir neue oxidationsabhängige Interaktionspartner von BAK identifizieren. Zusammenfassend unterstreicht diese Arbeit das Potential von ROS-induzierenden Behandlungen für die Therapie der ALL und zeigt neue Erkenntnisse für die Redox-Regulation des programmierten Zelltods auf.