Open Access

Mattson Jones

• Patients harboring mutations in the gene DEPDC5 often display variations of neurological diseases including epilepsy, autism spectrum disorders (ASD) and other neuro-architectural alterations. DEPDC5 protein has been identified as an amino acid sensor responsible for negatively regulating the mechanistic target of rapamycin (mTOR), a central regulator in cell growth and cell homeostasis. Often, mutations of the DEPDC5 protein result in mTOR hyperactivity leading to abnormal neuronal phenotypes and the generation of excitatory/inhibitory imbalances in animal models. Complete knockout (KO) of DEPDC5 results in death shortly after birth, while inhibition of mTOR activity recovers postnatal death (Marsan et al. 2016). However, heterozygous DEPDC5-KOs in animals have been variable in their disease phenotypes during adulthood indicating developmental differences between subspecies and early development mechanisms which could be impactful on the outcome of the diseases. To understand the mechanisms underlying DEPDC5 mutations during early development, a novel primary human neural progenitor cell line extracted from fetal tissue was characterized during proliferation and differentiation. CRISPR-Cas9 induced mutations of the DEPDC5 gene resulted in hyperphosphorylation of mTOR signaling processes and rapid expansion of the neuronal population during differentiation. Analysis of transcriptome data identified deregulation amongst p53 signaling, ribosome biogenesis, nucleotide and lipid synthesis as well as protein degradation pathways due to loss of DEPDC5. Disease gene datasets identified a correlation between Tuberous Sclerosis mutations as being more closely associated with DEPDC5 mutations while also finding overlap with some ASD and epilepsy genes. By using the mTOR inhibitor rapamycin, a substantial amount of the deregulated gene network was recovered while also reversing rapid neuronal differentiation caused by loss of DEPDC5. Though we saw increased dendritic arborization and subsequent decreases in dendrite lengths and soma sizes, rapamycin failed to recover these effects suggesting mTOR independent processes produced by DEPDC5-KO. This study provides new insights on the relationship between mutations in DEPDC5 and the functional, genomic and deregulatory networks it intertwines in humans and highlights that the DEPDC5 associated pathomechanisms are not fully related to mTOR hyperactivation, but include independent processes. This also sheds light on the question why rapamycin treatment only partially restores DEPDC5 related phenotypes and gives insight on treatments for DEPDC5 patients.
• Epilepsie ist eine neurologische Erkrankung, der eine abnorme Hirnaktivität zugrunde liegt, welche Krampfanfälle und weitgreifende pathologische Probleme verursacht, sodass es zu Schwierigkeiten kommen kann, normale Aufgaben zu erfüllen und Betroffene in ihrer Lebensführung eingeschränkt sind. Epilepsie ist durch generalisierte (im gesamten Gehirn) oder fokale Anfälle (in einem einzelnen Gehirnbereich) gekennzeichnet (Devinsky et al. 2018). Derzeit wird bei 50 Millionen Menschen weltweit eine Epilepsie diagnostiziert (Epilepsie 2019). Neben Krebs, Infektionskrankheiten oder traumatischen Hirnverletzungen als Ursache für Epilepsie, haben einige Menschen eine genetische Prädisposition bzw. Mutationen, die Epilepsie auslösen können. Mehr als 977 Gene wurden bisher mit Epilepsie in Verbindung gebracht, und in genetischen Studien werden immer wieder neue Varianten bzw. Gene entdeckt (Wang et al. 2017). Häufig treten genetische Anomalien bei Epilepsie in Verbindung mit anderen Krankheiten auf. Insbesondere bei der Autismus-Spektrum-Störung (ASS) tritt Epilepsie in 8-21,5% der Fälle als Komorbidität auf und umgekehrt zeigen auch 5-40% der Personen mit Epilepsie eine komorbide ASSDiagnose (Besag et al. 2018). ASS ist durch Beeinträchtigungen in der sozialen Kommunikation und repetitive Verhaltensweisen gekennzeichnet (DSM-5; American Psychiatric Association, 2013). Derzeit ist weltweit 1 von 44 Personen betroffen (Maenner et al. 2021). In großen genetischen Studien wurden ebenso mehrere Hundert Risikogene identifiziert, die der Ätiologie von ASS zugrunde liegen können, welche stark mit Epilepsiegenen überlappen (De Rubeis et al. 2014; ILAE, 2018; Iossifov et al. 2014; Wang et al. 2017). In den letzten zehn Jahren gab es vermehrt Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen Epilepsie und ASS mit dem DEP-domain-containing-5 (DEPDC5)-Protein, wobei Personen, die Mutationen in diesem Gen aufweisen, häufig eine Komorbidität mit ASS und Epilepsie zeigen. DEPDC5 wurde als Aminosäuresensor des mTOR-Signalwegs identifiziert, der zelluläre Signale zur Aufrechterhaltung von Wachstum und Homöostase reguliert. mTOR selbst ist eine Kinase, die an der Proteintranslation, Ribosomenbiogenese, Lipidsynthese, aeroben Glykolyse, Nukleotidsynthese, Autophagie und Lysosomenbiogenese beteiligt ist. Der Funktionsverlust von DEPDC5 führt hierbei zu einer Hyperaktivität von mTOR und damit zu einem Ungleichgewicht der Aufrechterhaltung zellulärer Signale. Der komplette Verlust von mTOR oder DEPDC5 im Tiermodell führt häufig zu einem vorzeitigen Tod, was seine Notwendigkeit für eine normale Zellfunktion unterstreicht. Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen des Verlusts von DEPDC5 zu verstehen und die assoziierten Genexpressionsmuster sowie morphologischen Auswirkungen im humanen Zellmodell zu charakterisieren, um so den Wirkungsmechanismus besser zu verstehen. Methoden Humane neurale Vorläuferzellen (hNPCs), die aus fötalem Kortex gewonnen wurden, wurden charakterisiert und anschließend einen Monat lang zu Neuronen differenziert. Mittels CRISPR-Cas9-gesteuertem Gen-Editing wurde DEPDC5 ausgeschaltet (knock-out/KO), indem im Exon 2 ein frühzeitiges Stopp-Codon erzeugt wurde. Die hNPCs mit DEPDC5-Funktionsverlust wurden anschließend auf eine erhöhte mTOR-Aktivität untersucht. Um die zugrundeliegenden Veränderungen in der Genexpression zu verstehen, wurde eine Transkriptomanalyse durchgeführt und auf mögliche Veränderungen in den Signalwegen im Vergleich zu den Kontrollen untersucht. Ein mTOR-Inhibitor, Rapamycin, wurde ebenfalls eingesetzt, um die durch die erhöhte mTOR-Aktivität verursachten Effekte umzukehren. Die differenziell exprimierten Gene wurden mit Hilfe von bioinformatischen Tools und der “Gene Ontology”-Datenbank sowie des KEGG-Pfad-Tools untersucht um biologische Prozesse zu identifizieren, die durch den Verlust von DEPDC5 gestört werden. Eine weitere Analyse wurde mit Hilfe der "gewichteten Gen-Koexpressions-Netzwerkanalyse" (WGCNA) durchgeführt, um Gene auf der Grundlage ihrer Koexpression zu gruppieren und so biologisch ko-regulierte Module zu identifizieren, mit welchen DEPDC5 assoziiert ist. Durch den Vergleich mit veröffentlichten großen ASS- und Epilepsie-Gendatensätzen wurde zudem versucht zu verstehen, ob der DEPDC5-KO besonders assoziierte Krankheitsgene beeinflusst, oder ob dessen Genexpressionsmuster spezifisch ist. Schließlich wurde untersucht, ob differenziell regulierte Gene mit Gennetzwerken assoziiert sind, welche die Gehirnentwicklung steuern, um so zu verstehen wann und wo während der Gehirnentwicklung die betroffenen Gene aktiv sind. Mit Hilfe der Laser Scanning Mikroskopie wurden die verwendeten Zelllinien auf morphologische Veränderungen hinsichtlich Zellgröße, Dendritenlänge, Anzahl der Dendriten und Anzahl der neuronalen Subtypen untersucht.