Institute
Filtern
Erscheinungsjahr
Dokumenttyp
- Dissertation (311)
- Wissenschaftlicher Artikel (282)
- Preprint (38)
- Beitrag zu einer (nichtwissenschaftlichen) Zeitung oder Zeitschrift (25)
- Buch (Monographie) (18)
- Bericht (2)
Sprache
- Englisch (521)
- Deutsch (154)
- Mehrsprachig (1)
Volltext vorhanden
- ja (676)
Gehört zur Bibliographie
- nein (676)
Schlagworte
- RNA (12)
- SARS-CoV-2 (10)
- NMR spectroscopy (9)
- inflammation (9)
- photochemistry (9)
- NMR (8)
- Biochemistry (7)
- Cell biology (7)
- E2 enzyme (6)
- TRACT (6)
Institut
- Biochemie, Chemie und Pharmazie (676)
- Präsidium (43)
- Medizin (35)
- Buchmann Institut für Molekulare Lebenswissenschaften (BMLS) (31)
- Zentrum für Biomolekulare Magnetische Resonanz (BMRZ) (30)
- Biowissenschaften (23)
- MPI für Biophysik (15)
- Physik (12)
- Zentrum für Arzneimittelforschung, Entwicklung und Sicherheit (ZAFES) (5)
- Geowissenschaften / Geographie (4)
Upon antibiotic stress Gram-negative pathogens deploy resistance-nodulation-cell division-type tripartite efflux pumps. These include a H+/drug antiporter module that recognizes structurally diverse substances, including antibiotics. Here, we show the 3.5 Å structure of subunit AdeB from the Acinetobacter baumannii AdeABC efflux pump solved by single-particle cryo-electron microscopy. The AdeB trimer adopts mainly a resting state with all protomers in a conformation devoid of transport channels or antibiotic binding sites. However, 10% of the protomers adopt a state where three transport channels lead to the closed substrate (deep) binding pocket. A comparison between drug binding of AdeB and Escherichia coli AcrB is made via activity analysis of 20 AdeB variants, selected on basis of side chain interactions with antibiotics observed in the AcrB periplasmic domain X-ray co-structures with fusidic acid (2.3 Å), doxycycline (2.1 Å) and levofloxacin (2.7 Å). AdeABC, compared to AcrAB-TolC, confers higher resistance to E. coli towards polyaromatic compounds and lower resistance towards antibiotic compounds.
The health status of every nucleated cell in the human body is monitored through peptides presented by major histocompatibility complex class I (MHC I) to T-cell receptors of CD8+ T-cells. Thereby, the adaptive immune system ensures the recognition and elimination of infected or cancerous cells. MHC I molecules comprise the polymorphic heavy chain (hc) and the light chain β2-microglobulin (β2m). More than 13,000 allomorphs of the MHC I hc have been identified. All MHC I hcs associate with β2m but differ in their binding preferences for peptides, ensuring the presentation of a large peptide pool. After maturation of MHC I hc/β2m heterodimers in the endoplasmic reticulum (ER), most of the peptide-deficient MHC I molecules are recruited to the peptide-loading complex (PLC). There, they go through peptide loading and editing before they are released as stable peptide-MHC I (pMHC I) complexes and traffic to the cell surface for antigen presentation.
During the stringent quality control of MHC I peptide loading and editing within the PLC, the chaperone tapasin in conjunction with the oxidoreductase ERp57 stabilizes peptide-receptive MHC I molecules and alters the peptide cargo for high immunogenicity by catalyzing peptide-exchange. The tapasin-homologue TAP-binding protein related (TAPBPR) is involved in downstream quality control, editing the peptide repertoire of MHC I molecules that slipped through peptide proofreading by tapasin. Both chaperones were shown to adopt similar binding-modes for MHC I, suggesting related mechanisms of peptide editing. Nevertheless, the MHC I specific chaperones operate in different subcellular locations with differing assistance. While TAPBPR mediates peptide-exchange solely in the peptide-poor environment of the cis-Golgi and ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC), tapasin functions mainly within the PLC together with ERp57 and the lectin-like chaperone calreticulin. Calreticulin with its lectin-, arm- and C-terminal domain contacts the MHC I heterodimer, ERp57 and the C-terminal domain of tapasin, respectively. Notably, the interaction site between calreticulin and tapasin has not yet been elucidated experimentally at molecular detail. The depletion of tapasin leads to a compromised immune response and a change in the pool of peptide cargo. The numerous MHC I allomorphs vary in their plasticity and their dependence on tapasin for the loading of optimal peptides. Moreover, the conformational plasticity of MHC I correlates with their dependence on tapasin. However, the molecular basis on how tapasin edits the various MHC I allomorphs and the structural features that are essential for peptide exchange catalysis at atomic resolution remained elusive.
In the first part of this thesis, the trimeric complex of tapasin–ERp57/calreticulin was analyzed. To this end, laser induced liquid bead ionization mass spectrometry (LILBID-MS) was performed as part of a collaboration and revealed the trimeric assembly for tapasin–ERp57 and calreticulin. Furthermore, additional to a wildtype construct of calreticulin, a second construct, lacking the acidic helix of calreticulin that was found to come to close contact with tapasin, was utilized for isothermal titration calorimetry (ITC). A micromolar affinity of wildtype calreticulin to tapasin–ERp57 was determined. Previous biochemical and NMR studies utilizing the P-domain of calreticulin and solely ERp57 provided a micromolar affinity for the complex of calreticulin and ERp57. In this study, no interaction of calreticulin lacking the acidic helix with tapasin–ERp57 could be measured by ITC. However, these results undergo with findings that calreticulin lacking the acidic helix impairs the function of the PLC. Most likely, the negatively charged acidic helix is located in a groove of tapasin, carrying a more positive charge. Taken together, the functional data demonstrates the importance of the acidic helix of calreticulin for assembly of the trimeric subunit of calreticulin/tapasin–ERp57.
In the main part of this study an MHC I–tapasin–ERp57 complex was structurally analyzed. Therefore, a photo-triggered approach was chosen to assemble the transient complex of MHC I–tapasin–ERp57. Various allomorphs were screened for complex formation with the tapasin–ERp57 heterodimer after photocleavage by size exclusion chromatography (SEC), resulting in mouse MHC I H2-Db as the suited allomorph. Microseed matrix screening was performed. Crystals diffracting X-rays to a resolution of 2.7 Å were obtained showing one tetrameric tapasin–ERp57–MHC I complex per asymmetric unit.
The MHC I-chaperone structure shows molecular rearrangements upon MHC I engagement and unveils structural features of tapasin, involved in peptide-exchange catalysis...
The covalent conjugation of ubiquitin-fold modifier 1 (UFM1) to proteins generates a signal that regulates transcription, response to cell stress, and differentiation. Ufmylation is initiated by ubiquitin-like modifier activating enzyme 5 (UBA5), which activates and transfers UFM1 to ubiquitin-fold modifier-conjugating enzyme 1 (UFC1). The details of the interaction between UFM1 and UBA5 required for UFM1 activation and its downstream transfer are however unclear. In this study, we described and characterized a combined linear LC3-interacting region/UFM1-interacting motif (LIR/UFIM) within the C terminus of UBA5. This single motif ensures that UBA5 binds both UFM1 and light chain 3/γ-aminobutyric acid receptor-associated proteins (LC3/GABARAP), two ubiquitin (Ub)-like proteins. We demonstrated that LIR/UFIM is required for the full biological activity of UBA5 and for the effective transfer of UFM1 onto UFC1 and a downstream protein substrate both in vitro and in cells. Taken together, our study provides important structural and functional insights into the interaction between UBA5 and Ub-like modifiers, improving the understanding of the biology of the ufmylation pathway.
Candida boidinii NAD+-dependent formate dehydrogenase (CbFDH) has gained significant attention for its potential applications in the production of biofuels and various industrial chemicals from inorganic carbon dioxide. The present study reports the atomic X-ray crystal structures of the wild-type CbFDH at cryogenic and ambient temperatures as well as Val120Thr mutant at cryogenic temperature determined at the Turkish Light Source "Turkish DeLight". The structures reveal new hydrogen bonds between Thr120 and water molecules in the mutant CbFDH's active site, suggesting increased stability of the active site and more efficient electron transfer during the reaction. Further experimental data is needed to test these hypotheses. Collectively, our findings provide invaluable insights into future protein engineering efforts that could potentially enhance the efficiency and effectiveness of CbFDH.
Candida boidinii NAD+-dependent formate dehydrogenase (CbFDH) has gained significant attention for its potential applications in the production of biofuels and various industrial chemicals from inorganic carbon dioxide. The present study reports the atomic X-ray crystal structures of the wild-type CbFDH at cryogenic and ambient temperatures as well as Val120Thr mutant at cryogenic temperature determined at the Turkish Light Source "Turkish DeLight". The structures reveal new hydrogen bonds between Thr120 and water molecules in the mutant CbFDH's active site, suggesting increased stability of the active site and more efficient electron transfer during the reaction. Further experimental data is needed to test these hypotheses. Collectively, our findings provide invaluable insights into future protein engineering efforts that could potentially enhance the efficiency and effectiveness of CbFDH.
In this report, we perform structure validation of recently reported RNA phosphorothioate (PT) modifications, a new set of epitranscriptome marks found in bacteria and eukaryotes including humans. By comparing synthetic PT-containing diribonucleotides with native species in RNA hydrolysates by high-resolution mass spectrometry (MS), metabolic stable isotope labeling, and PT-specific iodine-desulfurization, we disprove the existence of PTs in RNA from E. coli, S. cerevisiae, human cell lines, and mouse brain. Furthermore, we discuss how an MS artifact led to the initial misidentification of 2′-O-methylated diribonucleotides as RNA phosphorothioates. To aid structure validation of new nucleic acid modifications, we present a detailed guideline for MS analysis of RNA hydrolysates, emphasizing how the chosen RNA hydrolysis protocol can be a decisive factor in discovering and quantifying RNA modifications in biological samples.
Im Rahmen dieser vorliegenden Thesis wurden verschiedene photosensitive Systeme anhand statischer und zeitaufgelöster optischer Spektroskopiemethoden charakterisiert. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag in der Entwicklung und Untersuchung neuer Quantenpunkt-basierter Hybridsysteme. Es war möglich die optischen Eigenschaften der Quantenpunkte über Optimierung der Syntheseschritte zu variieren und so auf geplante Projekte anzupassen.
Im Projekt „Quantenpunkte als Zwei-Photonen Antenne“ sollten die hohen Zwei-Photonen Einfangquerschnitte von Quantenpunkten ausgenutzt werden um in Kombination mit einer photolabilen Schutzgruppe, ein Uncaging im NIR-Bereich zu realisieren. Es wurden ZnSe/ZnS Partikel synthetisiert, die eine starke Emission im Bereich der Absorption der Schutzgruppe zeigen. Anhand von zeitaufgelösten transienten Absorptionsexperimenten mit einer Anregungswellenlänge bei 775 nm wurde eine Zwei-Photonen Absorption der Partikel nachgewiesen. Jedoch wurden starke Emissionsbeiträge aus Fallenzuständen und eine geringe Stabilität beobachtet. Die Synthese von CdS/ZnS Quantenpunkten lieferte stabile Partikel mit geringer trap state Emission. Diese Partikel wurden in einem Modellhybridsystem als Energiedonoren eingesetzt. Als Akzeptor wurde der Farbstoff Cumarin343 gewählt. In statischen Absorptions- und Emissionsmessungen, zeitkorrelierten Einzelphotonenmessungen sowie in fs-zeitaufgelösten transiente Absorptionsmessungen konnte ein ultraschneller Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung des Hybridsystems beobachtet werden. Über TPiF Messungen wurde die Zwei-Photonen Absorption der Quantenpunkte detektiert. Ein Energietransfer nach Zwei-Photonen Anregung der Quantenpunkte wurde beobachtet. Schließlich wurde ein Hybridsystem aus CdS/ZnS und der photolabilen Schutzgruppe Az-NDBF (Synthese im AK Heckel, Goethe Universität, Frankfurt a. M.) untersucht. Auch in diesem System wurde ein Energietransfer von Quantenpunkt auf die Schutzgruppe nach Ein- und Zwei-Photonen Anregung beobachtet. Anhand von TA Experimenten wurde eine Zeitkonstante von <100 ps für den Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung ermittelt. Es konnte anhand der vorgestellten Resultate gezeigt werden, dass sich Quantenpunkte, aufgrund der guten Anpassung ihrer optischen Eigenschaften generell sehr gut als Antennen für organische Verbindungen eigenen.
Des Weiteren wurde ein Hybridsystem aus CdSe/ZnS Quantenpunkten und einer Dyade (Verbindung eines DTE Photoschalters und BODIPY Derivats), entworfen und charakterisiert. Ein ultraschneller EET von BODIPY auf den geschlossenen DTE Schalter wurde in vorangegangenen Studien beobachtet. Dieser EET führte zur Löschung der BODIPY-Emission. Sobald der Photoschalter im offenen Zustand vorliegt, findet aufgrund des fehlenden spektralen Überlapps kein EET statt und es wird die BODIPY-Emission detektiert. Die Erweiterung der Dyade um einen Quantenpunkt zeigte nach Anregung des Quantenpunkts dessen Fluoreszenzlöschung. Da die Emissionsbande der Quantenpunkte im Absorptionsbereich des BODIPY Farbstoffes liegt, konnte über statische und zeitaufgelöste Experimente ein ultraschneller EET von CdS/ZnS auf den Farbstoff ermittelt werden. Dies führte zu der Erweiterung des Anregungsspektrums des BODIPY Farbstoffs. Die Kopplung der Dyade an die Quantenpunktoberfläche lieferte eine Verbindung mit dem breiten Anregungsspekrum des Quantenpunkts und der schaltbaren Fluoreszenz der Dyade.
Das Hybridsystem aus CdSe Quantenpunkten und PDI zeigte vom Verhältnis der Quantenpunkte zu gekoppelten PDI Molekülen abhängige Fluoreszenzsignale. In TA Experimenten wurde ein ultraschneller EET ermittelt. Für hohe PDI Konzentrationen wurde ein weiterer EET von höher angeregten Elektronen auf das PDI identifiziert. Neben der EET Charakterisierung konnte ein zusätzlicher Prozess innerhalb des Hybridsystems mit hoher PDI Konzentration beobachtet werden. Auf den EET von Quantenpunkt auf PDI folgt ein ET aus dem Valenzband des Quantenpunkts in das HOMO des PDI*. In vorangegangene Arbeiten zu Hybridsystemen aus CdSe/ZnS und PDI wurde kein ET beobachtet. In dem beschriebenen Projekt konnte der Einfluss einer passivierenden Schale auf die elektronischen Eigenschaften von CdSe Quantenpunkten gezeigt werden.
Im letzten Teil dieser Thesis wurde die spektroskopische Charakterisierung einer NVOC und zweier NDBF Schutzgruppen beschrieben. Es konnten anhand statischer Absorptionsmessungen eine Freisetzungsquantenausbeute für NVOC-Adenin von 1,1 % ermittelt werden. Die Charakterisierung der Schutzgruppen mit einer NDBF Grundstruktur (DMA-NDBF und Az-NDBF) ergab eine Abhängigkeit der Freisetzungs- und Fluoreszenzausbeute von der Polarität des Lösungsmittels. In polarer Umgebung reduzierten sich die Quantenausbeuten deutlich...
Die Steuerung biochemischer Prozesse oder die Verbesserung von Materialien erfordert zunächst ein tiefgründiges Verständnis über die zugrundeliegenden Systeme. Zur Untersuchung eignet sich Licht als ideales Werkzeug, da hiermit nützliche Informationen über die chemische Struktur, ihre Eigenschaften sowie den zusammenhängenden, schnellen Reaktionsabläufen erhalten werden können. Um die Aufklärung zu erleichtern können kleine, chemische Verbindungen eingeführt werden, welche beispielsweise ein Fluoreszenzmarker, eine photolabile Schutzgruppe oder eine photoschaltbare Verbindung sein können. Von jeweils einem Vertreter dieser Moleküle wurden unterschiedliche Studien durchgeführt, dessen Ergebnisse in dieser Arbeit in insgesamt drei Projekten zusammengefasst werden.
Zunächst wurde die Funktionalität der Helikase RhlB untersucht, die der Familie der DEAD-Box Proteine zugeordnet wird, und RNA-Duplexe in ihre Einzelstränge entwindet. Als RNA-Modellduplex diente JM2h, an dem ein RNA-Einzelstrang fluoreszenzmarkiert war (M2AP6). Die Einführung dieses Markers ermöglichte die Durchführung von statischen Fluoreszenzmessungen sowie von Mischexperimenten, die mit Hilfe der stopped-flow-Technik durchgeführt wurden. In den einleitenden Studien wurde die Helikase weggelassen, wodurch der Fokus auf den Fluoreszenzeigenschaften der RNA gelegt wurde. Die Ergebnisse hierzu zeigten, dass die Fluoreszenzintensität des Einzelstrangs durch Zugabe des komplementären Strangs deutlich abnimmt, wobei das Minimum bei einem äquimolaren Verhältnis erreicht wird. Die dazugehörigen stopped-flow-Messungen zeigten eine Beschleunigung der Hybridisierungsreaktion, wenn höhere Konzentrationen des Gegenstrangs in der Lösung vorhanden waren. Nach anschließender Zugabe der Helikase zur Lösung wurde ein Anstieg der Fluoreszenzintensität erwartet, der vom separierten Einzelstrang M2AP6 herrühren sollte. Dieser Anstieg wurde jedoch erst nach weiterer Zugabe von ATP beobachtet, der auf eine ATP-Abhängigkeit der Entwindungsreaktion von RhlB hindeutet. Diese Abhängigkeit wurde auch bereits für andere Helikasen der DEAD-Box Familie entdeckt. Die korrekte Funktionalität sowie die ATP-Abhängigkeit wurden in stopped-flow-Messungen verfiziert, bei denen der Fluoreszenzanstieg auch zeitaufgelöst betrachtet werden konnte. Für die spektralen Korrekturen der Fluoreszenzspektren wurde ein selbstgeschriebenes MATLAB-Programm namens FluCY verwendet (engl.: Fluorescence Correction & Quantum yield), welches eine schnelle und fehlerfreie Verarbeitung des Datensatzes ermöglichte.
Die zwei im folgenden beschriebenen Projekte handeln von photoaktivierbaren Molekülen. Zum einen photolabile Verbindungen, welche die Funktion z.B. eines Biomoleküls durch eine chemische Modifikation deaktivieren können. Durch eine lichtinduzierte Reaktion kommt es zur Abspaltung der Modifikation und die Funktion ist wiederhergestellt. In dieser Arbeit wurden verschiedene photolabile Schutzgruppen untersucht, die denselben Chromophor BIST (BIsStyryl-Thiophen) tragen. Durch die Einführung dieses Chromophors absorbierten sämtliche untersuchte Verbindungen sehr effizient sichtbares Licht (epsilon(445)=55.700 M^(-1) cm^(-1)), wodurch der photoinduzierte Bindungsbruch mit Wellenlängen durchgeführt werden, die bei einer biologischen Anwendungen keinen Schaden an der Zelle anrichten würden. Hieraufhin wurden in statischen und zeitaufgelösten Absorptionsmessungen Teilschritte der Freisetzungsreaktion untersucht, indem nach Photoanregung die Absorptionsänderungen auf verschiedenen Zeitskalen analysiert wurden. Die ultraschnelle Dynamik im Piko- bis Nanosekundenbereich (10^(-12)-10^(-9) s) wird durch eine spektral breite, positive Absorptionsänderng dominiert. Diese impliziert, dass die Deaktivierung über den Triplettpfad abläuft, der die vergleichsweise niedrigen Freisetzungsausbeuten erklärt (phi(u) < 5). Aufgrund des hohen Extinktionskoeffizienten reichen dennoch bereits niedrige Strahlungsdosen aus, um eine Freisetzung zu initiieren. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt dieser Reaktion ist dem Zerfall des aci-nitro Intermediats zugeordnet. Für ein sekundäres Amin, welches mit BIST geschützt wurde, ist eine Lebensdauer des Intermediats von 71 µs gefunden worden.
In einigen Fällen ist es erwünscht, eine vorliegende Aktivität nicht nur ein-, sondern auch ausschalten zu können, wofür photochrome Verbindungen (oder Photoschalter) verwendet werden. Die in dieser Arbeit untersuchte Verbindung ceCAM ist ein Alken-Photoschalter und vollführt bei Bestrahlung mit Licht eine cis/trans-Isomerisierung. ceCAM ist das Cyanoester-Derivat (ce) von Cumarin-substituierten Allylidenmalonat, von denen beide Konformere sehr effizient sichtbares Licht absorbieren trans: epsilon(489)=50.300 M^(-1) cm^(-1); cis: epsilon(437)=18.600 M^(-1) cm^(-1)). Andere photophysikalische Eigenschaften umfassen u.a. hohe thermische und photochemische Stabilität. Letztere wurde über ein Experiment nachgewiesen, bei dem die lichtinduzierte Isomerisierung alternierend durchgeführt wurde und selbst bei über 250 Zyklen keine signifikate Abnahme der Absorption beobachtet werden konnte. Des Weiteren konnte die Reaktion mit Quantenausbeuten von 39% (trans) und 42% (cis) induziert werden, wobei im photostationären Gleichgewicht auch hohe Isomerenverhältnisse mit bis zu 80% (trans) und 96% (cis) akkumuliert werden konnten. Die Geschwindigkeit der Reaktion wurde mit Hilfe der Ultakurzzeit-Spektroskopie untersucht. Die Dynamik im Zeitbereich von ps-ns zeigte, dass die trans/cis-Isomerisierung unterhalb von 0,5 ns und die umgekehrte Reaktion noch viel schneller (wenige ps) abgeschlossen ist. Durch die Untersuchungen in dieser Arbeit an den BIST-Verbindungen und ceCAM sind viele vorteilhafte, photophysikalische Eigenschaften charakterisiert worden, wodurch sie als verbesserte Alternative zu den bisher bekannten photolabilen Schutzgruppen oder Photoschaltern anzusehen sind.
Ein Hauptziel dieser Arbeit war die spektroskopische Charakterisierung einer neuartigen photolabilen Schutzgruppe (Photocage). Diese besteht aus dem weitverbreiteten (7-Diethylaminocumarin)methyl (DEACM), welches zusätzlich mit einer Art Antenne (ATTO 390) ausgestattet ist. Letztere soll die Zwei-Photonen-Absorption (2PA) erleichtern, was neben dem Energietransfer von der Antenne zur photolabilen Schutzgruppe sowie die Freisetzungsreaktion eines gebundenen Effektormoleküls untersucht wurde. Der Nachweis der erhöhten 2PA wurde durch Zwei-Photonen-induzierte Fluoreszenz erbracht, welche die Bestimmung des Zwei-Photonen-Einfangquerschnitts ermöglicht. Die 2PA wurde durch Messungen mit variierender Anregungsenergie an Rhodamin B und dem neuartigen Antennen-Photocage-System bestätigt, welche eine fast perfekte quadratische Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität nach vorangegangener 2PA widerspiegelten. Die Werte des Zwei-Photonen-Einfangquerschnitts der neuartigen photolabilen Schutzgruppe sind über alle Wellenlängen hinweg größer als die von DEACM-OH. Der Beweis eines intramolekularen Energietransfers von der Antenne zu DEACM erfolgte durch transiente Absorptionsspektroskopie. Hierfür wurde der Photocage mit 365nm angeregt, was überwiegend die Antenne adressiert. Ein intramolekularer Energietransfer konnte mit einer Zeitkonstante von 20 ps beobachtet werden, welcher wahrscheinlich von einem nachgelagerten Ladungstransfer von DEACM auf ATTO 390 begleitet wurde. Die Funktionalität des neuartigen Photocages wurde durch Aufnahme von Absorptionsspektren im IR-Bereich während kontinuierlicher Belichtung bei 365 nm untersucht. Hierbei konnte die Entstehung der intensiven Absorption von Kohlendioxid aufgrund der Photodecarboxylierung detektiert werden. Absorptionsänderungen während kontinuierlicher Belichtung wurden ebenfalls im UV/Vis-Bereich detektiert, in welchen eine hypsochrome Verschiebung der langwelligen Absorptionsbande sowie ein Anstieg der Absorption festgestellt wurden. Hieraus konnte eine Quantenausbeute der Freisetzungsreaktion von 1,5% ermittelt werden. Die Ergebnisse zum Antennen-Photocage-System zeigen auf, dass durch Anbringen einer Antenne die 2PA verbessert werden kann, ohne die Funktionalität des Freisetzungsprozesses negativ zu beeinflussen. In einem nächsten Schritt zielen Verbesserungen des untersuchten Photocages darauf ab, den Ladungstransfer zu unterdrücken. Die Validierung dieses Ansatzes sollte die Einführung anderer Antennen mit erhöhten Zwei-Photonen-Einfangquerschnitten, wie z.B. Quantenpunkte, weiter motivieren. Der zweite Ergebnisteil dieser Arbeit konzentriert sich auf drei verschiedene Photosysteme, die sich durch eine sehr kurzlebige Fluoreszenz auszeichnen, welche mit einem Kerrschalter aufgenommen wurde. Das erste der drei untersuchten Systeme umfasst eine kooperative BODIPY-DTE-Dyade(Bordipyrromethen-Dithienylethen), die einen hocheffizienten photochromen Förster-Resonanzenergietransfer aufweist. Dieser wurde durch verkürzte Lebenszeiten der Differenzsignale im transienten Absorptionsspektrum der Dyade im photostationären Zustand abgeleitet. In diesem stellt BODIPY-DTE eine hochkonjugierte Einheit dar, welches durch die geschlossene Form des photochromen DTEs einen Energietransfer vom photoangeregten BODIPY zum DTE ermöglicht. Bei diesem Prozess wird die Fluoreszenz des Donors um einige Größenordnungen reduziert. Die Ergebnisse der transienten Absorptionsmessung wurde durch ein zeitaufgelöstes Fluoreszenzexperimentbestätigt. Die detektierte Fluoreszenztransiente zerfällt mit einer Zeitkonstante von etwa 15 ps und weist somit sehr hohe Ähnlichkeit mit dem Signal des Grundzustandsbleichens (GSB) aus dem transienten Absorptionsexperiment auf. Des Weiteren wurde die photochrome Ringschlussreaktion eines wasserlöslichen Indolylfulgimids spektroskopisch charakterisiert. Transiente Absorptionsmessungen geben einen direkten Einblick in den Mechanismus der Reaktion, in welcher, nach Photoanregung, die Relaxation aus dem Franck-Condon Bereich und die schnelle biphasische Relaxation des Moleküls über die konische Durchschneidung abgeleitet werden kann. Zusätzlich wurden zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen mit Hilfe des Kerrschalters durchgeführt, da die stimulierte Emission (SE) in transienten Absorptionsmessungen durch die Überlagerung mehrerer Signale nicht vollständig zu erkennen war. Die globale Lebensdaueranalyse der mit dem Kerrschalter aufgenommenen Breitband-Fluoreszenz lieferte drei Zeitkonstanten, welche wesentliche Übereinstimmung mit den Zeitkonstanten aus der globalen Lebensdaueranalyse der transienten Absorptionsmessungen aufweisen. Schlussendlich wurde die Deaktivierung des elektronisch angeregten Zustands des flavinbindenden Dodecins aus Mycobacterium tuberculosis mit Hilfe von unterschiedlichen spektroskopischen Methoden charakterisiert. Stationäre Fluoreszenzmessungen bei unterschiedlichen pH-Werten zeigten bei pH 5 eine im Vergleich zu nahezu physiologischen Bedingungen (pH 7,5)reduzierte Fluoreszenz auf. Auffällig ist, dass diese Beobachtungen durch transiente Absorptionsmessungen nicht bestätigt werden konnten, da diese eine große Ähnlichkeit bezüglich der Dynamik und der spektralen Signatur zueinander besaßen. Ein negatives Signal, hervorgerufen durch die SE, wurde hierbei nicht gefunden. Allerdings konnte in den zerfallsassoziierten Spektren eine spektrale Signatur beobachtet werden, die auf eine SE hindeutete, welche allerdings mit größeren positiven Signalen überlagert ist. Dieser Aspekt wurde in einer Kerrschalter-Messung untersucht, in der eine schwache Emission bei pH 7,5 festgestellt werden konnte. Zusätzlich wies die Zerfallsdynamik der Emission Übereinstimmung mit dem GSB-Signal aus den transienten Absorptionsmessungen auf.
The potential of a protein-engineered His tag to immobilize macromolecules in a predictable orientation at metal-chelating lipid interfaces was investigated using recombinant 20 S proteasomes His-tagged in various positions. Electron micrographs demonstrated that the orientation of proteasomes bound to chelating lipid films could be controlled via the location of their His tags: proteasomes His-tagged at their sides displayed exclusively side-on views, while proteasomes His-tagged at their ends displayed exclusively end-on views. The activity of proteasomes immobilized at chelating lipid interfaces was well preserved. In solution, His-tagged proteasomes hydrolyzed casein at rates comparable with wild-type proteasomes, unless the His tags were located in the vicinity of the N termini of α-subunits. The N termini of α-subunits might partly occlude the entrance channel in α-rings through which substrates enter the proteasome for subsequent degradation. A combination of electron micrographs and atomic force microscope topographs revealed a propensity of vertically oriented proteasomes to crystallize in two dimensions on fluid lipid films. The oriented immobilization of His-tagged proteins at biocompatible lipid interfaces will assist structural studies as well as the investigation of biomolecular interaction via a wide variety of surface-sensitive techniques including single-molecule analysis.