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Maria Johanna Grötzinger

• Membrane proteins are a diverse group of proteins that serve a multitude of purposes with one of the most important ones being transport. All kinds of substrates are shuffled over biological membranes with the help of dedicated proteins enabling the transport along and against a concentration gradient. Within the group of actively transporting proteins a diverse set of proteins that rely on an electrochemical gradient to facilitate transport of a substrate against its concentration gradient can be found. Those so-called secondary active transporters are a group on integral membrane proteins ubiquitous to all cells. They allow the transport of all kinds of substrates like nutrients, ions, other metabolites and drugs over the hydrophobic barrier created by the cellular and organellar membrane. The gradients that provide the main driving force for most of the transporters are either sodium ions or protons, although transporters utilizing other ions or organic compounds are found as well. In case of exchangers two very similar substrates are transported in opposing direction over the membrane, one against its electrochemical gradient driven by the other. Along with a structural diversity of the transporters concerning overall shape, oligomerization and number of transmembrane elements comes a mechanistic variety though still following the principle of alternating access. In humans the malfunction of secondary active transporters can lead to a physiological disorders such as epilepsy, depression or obesity. The focus of this thesis was the structural and functional characterization of the secondary active transporter SeCitS from Salmonella enterica, a symporter of the 2-hydroxycarboxylate family. The transport of citrate as a bivalent ion is facilitated by the flux of sodium ions that have an inward-facing gradient over the inner membrane of Salmonella enterica. Transport experiments showed that the transport ratio is two sodium ions per citrate molecule, netting in an electroneutral transport. Compared to other members of the family the specificity of the transporter towards its main substrate is very high. Structural information on the protein was initially obtained through 2D electron crystallography, which allowed the identification of the oval shaped dimer and a first hint towards a significant conformational change that the protein undergoes during its transport cycle. Using 3D crystallography, the X-ray structure of the transporter was solved. The protein crystalizes as a stable, but conformationally asymmetric dimer. As bound citrate can be readily identified in both protomers they can be assigned into an outward- and an inward-facing conformation, with the main citrate binding site in the outward-facing conformation. One interesting feature of the crystal structure was the large surface available for multimerization, providing a platform for tight dimerization of the two protomers. On the other hand, SeCitS did not show a true cooperativity of transport. With those two aspects taken into account the question arose if any potential crosstalk between the monomers within the dimer takes place and influences transport (negative cooperativity) or the conformational distribution within the dimer (stabilization of the protein within the membrane). The functional approach in answering this question was the use of mutated variants of the protein for cross-linking within one monomer. Two residues were chosen respectively to lock one of either conformation to be able to test for transport activity in the remaining protomer. The suitability of the residues was derived from the crystal structure (D112 – R205 to lock the inward-facing conformation and L337 – S412 for the outward-facing conformation). After initial promising results the final variants were not stable enough to be analyzed in transport assays. To analyze the distribution of relative conformations within the dimer the protein was reconstituted into native-like lipid environment such as nanodiscs or saposin nanoparticles to be analyzed by cryo-electron microscopy. The first images were recorded and did yield promising 2D classes where the general features of the transporter were identified. Yet, an improved preparation is required to obtain a high resolution structure. The key functional aspects of a transporter are its ability to bind and transport its substrates. In a set of experiments those features were investigated by a radioligand transport assay and by isothermal titration calorimetry (ITC). The transport properties of the protein were assessed in a filter assay using a radioactively labeled citrate as a read-out. The protein was reconstituted into proteoliposomes and subjected to different substrate conditions. Different ions were tested in its ability to drive or inhibit transport, but only sodium ions were able to drive transport and also not hindered by the presence of other ions...
• Membranproteine sind eine vielfältige Gruppe von Proteinen, zu deren wichtigsten Funktionen der Transport verschiedener Substrate über die biologische Membran zählt. Innerhalb der aktiv transportierenden Proteine gibt es sekundär-aktive Transporter, die einen elektro-chemischen Gradienten ausnutzen um den Transport ihres Hauptsubstrats gegen dessen Konzentrationsgradienten zu ermöglichen. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der strukturellen und funktionellen Charakterisierung des sekundär aktiven Transporters SeCitS aus Salmonella enterica, einem Symporter der 2-Hydoxycarboxylat-Familie. Der Transport von Citrat wird durch den elektroneutralen Cotransport mit zwei Natrium-Ionen ermöglicht. Im Vergleich zu anderen Mitgliedern der Familie gibt es eine sehr hohe Spezifität des Transporters gegenüber Citrat. Als Grundlage diente die Kristallstruktur des Transporters, welches als asymmetrisches Dimer kristallisierte. In beiden Protomeren kann gebundenes Citrat leicht identifiziert werden. Es lassen sie sich in eine nach außen und eine nach innen gerichtete Konformation anhand der Zugänglichkeit der Citrate zuordnen. Zunächst wurde untersucht, ob eine mögliche gegenseitige Beeinflussung zwischen den Monomeren innerhalb des Dimers stattfindet und den Transport oder die Konformationsverteilung innerhalb des Dimers beeinflusst, da zwar eine stabile Dimerisierung der beiden Protomere in der Struktur und der biochemischen Analyse zu beobachten ist, aber SeCitS aber keine echte Kooperativität beim Transport seiner Substrate zeigt. Da der Ansatz von mutierten Varianten zur Quervernetzung aufgrund von Proteininstabilität nicht ausreichend zu zur Beantwortung dieser Frage genügte wurde die Verteilung der relativen Konformationen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie untersucht, bei dem die allgemeinen Merkmale des Transporters schon in 2D-Klassen identifiziert werden konnten. Die wichtigsten funktionellen Aspekte eines Transporters sind seine Fähigkeit, seine Substrate zunächst zu binden und anschließend zu transportieren. In einer Reihe von Experimenten wurden diese Eigenschaften durch einen Radioliganden-Transporttest und durch isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) untersucht. Das Protein wurde dazu in Proteoliposomen rekonstituiert und der Test bei verschiedensten Substratbedingungen durchgeführt. Tests von verschiedenen Ionen ergaben, dass nur ein Gradient von Natrium-Ionen in der Lage war, den Transport zu energetisieren. Die Ergebnisse eines Kompetitionsexperiments mit anderen potentiellen Substraten zeigten, dass Isocitrat, und Malat in geringerem Maße, den Transport von Citrat hemmen konnte. Die Quantifizierung der Bindung von Substraten an das Protein durch thermodynamische Parameter wurde mit der isothermalen Titrationskalorimetrie durchgeführt. Citrat bindet an die Hauptbindungsstelle des Transporters in einer exothermen Reaktion mit einer insgesamt geringen Änderung der Wärme im System und einer Stöchiometrie von unter einem Citrat pro Dimer. Die Bindungsaffinität wurde im einstellig mikromolaren Bereich gemessen. Die Bindungsaffinität von Citrat selbst wurde nicht durch den pH-Wert beeinflusst, jedoch wurde eine Enthalpie-Entropieänderungskompensation bei steigenden pH-Werten identifiziert. Isocitrat als alternatives Substrat führte zu keiner messbaren Bindung. Die größte Herausforderung bei den Messungen war die insgesamt niedrige Signalintensität aufgrund der niedrigen Bindungsenthalpien. Bei der Untersuchung der Bindung von Natriumionen an den Transporter konnte trotz einer insgesamt geringen Signalintensität ein exothermes Bindungsereignis nachgewiesen werden. Die Bindungsaffinität der Natriumionen konnte bis in den einstellig millimolaren Bereich abgeschätzt werden. Eine Titration mit Natrium in Gegenwart von Citrat zeigte eine Bindungskurve, die neben der Natriumbindung einen zusätzlichen Beitrag an Bindungsenergie durch das Binden von Citrat an das Protein hinweist. Für ein besseres Verständnis der Rolle von Aminosäuren in der Bindungsstelle, wurde ein Mutageneseansatz gewählt, bei dem das Wildtyp- und das mutierte SeCitS in ihrer Bindung, ihrem Transport und ihrer Struktur zu vergleichen wurden. Bei den mutierten Resten handelte es sich unter anderem um zwei Arginine in der Nähe der Citrat-Bindungsstelle und um Reste innerhalb der Helix-Hairpins. Die Transportaktivität aller gemessenen Mutanten lag unter dem Wildtyp-Niveau, wobei die meisten der Arginin-Mutanten einen fast vollständigen Verlust der Transportaktivität aufwiesen. In ITC-Experimenten zeigte sich, dass für keine der Varianten eine Bindung von Citrat innerhalb des messbaren höheraffinen Bereichs nachweisbar war. Die Varianten von SeCitS wurden zur Kristallisation verwendet und zeigten Unterschiede in ihrer Kristallform und -packung, wobei am häufigsten die Raumgruppe analog zu der Packung des Wildtyp-Selenomethionins SeCitS (P2) zu finden war...