Konstruktion und funktionelle Charakterisierung löslicher Fragmente des Cytochrom c1 aus Paracoccus denitrificans

  • Der bc1-Komplex ist eine Komponente der Atmungskette und damit essentiell für den Energiestoffwechsel vieler Organismen, die zum aeroben Wachstum befähigt sind. Im Vergleich zu mitochondrialen bc1-Komplexen, die bis zu elf unterschiedliche Untereinheiten besitzen, ist das Enzym aus Paracoccus denitrificans mit nur drei Untereinheiten einfach aufgebaut. Vergleicht man die Sequenz des P. denitrificans Cytochrom c1 Genproduktes mit denen anderer prokaryotischer und mitochondrialer Cytochrom c1 Untereinheiten, so fällt auf, dass dieses prokaryotische Protein eine für Paracoccus charakteristische zusätzliche N-terminale Domäne von ca. 150 Aminosäuren trägt, die zudem eine sehr auffällige Zusammensetzung besitzt (40% saure Reste, 40% Alanine, keine einzige positiv geladene Aminosäure). Diese saure Domäne wird in anderen Organismen durch zusätzliche Untereinheiten innerhalb des bc1-Komplexes dargestellt, die in direkter Assoziation mit dem Cytochrom c1 vorliegen. Bis dato konnte für Paracoccus jedoch noch kein eindeutiger Beweis für eine Beteiligung dieser sauren Domäne an der Wechselwirkung zwischen bc1 und den Substraten des Komplexes geführt werden. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu konstruieren und in E. coli heterolog zu exprimieren. Durch zielgerichtete Mutagenese am Cytochrom c1 und anschließende kinetische Charakterisierung der Produkte sollte die funktionelle Bedeutung einzelner Aminosäurereste dargestellt werden. Es ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu exprimieren. Für das saure Fragment (SF) wurde lediglich der Membrananker deletiert, während das Kernfragment (KF) durch die zusätzliche Deletion der sauren Domäne als eine Art minimalisiertes Cytochrom c1 anzusehen ist. Beide Fragmente konnten nach erfolgreicher Aufreinigung durch pre-steady-state-Kinetiken in ihrer Wechselwirkung mit dem homologen Reaktionspartner Cytochrom c552 sowie mit drei weiteren c-Typ Cytochromen funktionell charakterisiert werden. Des weiteren wurden zahlreiche Mutanten von KF hergestellt und ebenfalls hinsichtlich ihrer Wechselwirkung mit Cytochrom c552 getestet. Die Untersuchungen zur Ionenstärkeabhängigkeit des Cytochrom c1 zeigten, dass das saure Fragment unter den gewählten Versuchsbedingungen im Vergleich zu KF keine erhöhte Spezifität gegenüber Cytochrom c552 besitzt. Es konnte jedoch eindeutig gezeigt werden, dass die Interaktion der beiden untersuchten Elektronentransportpartner von der Wechselwirkung geladener Aminosäureseitenketten auf beiden Proteinen abhängt und somit elektrostatischer Natur ist. Dieser Sachverhalt wird zusätzlich durch die Ergebnisse bestätigt, die mit der Negativkontrolle (Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa) erzielt wurden. Dieses negativ geladene Protein zeigte nur eine schwach affine Wechselwirkung mit dem ebenfalls stark negativ geladenen Cytochrom c1 aus P. denitrificans. Zusätzliche kinetische Untersuchungen mit weiteren Cytochromen im Bereich mittlerer Ionenstärke zeigten, dass die beiden löslichen Fragmente SF und KF keine erhöhte Spezifität gegenüber homologen Elektronenakzeptoren (Cyt c552 und Cyt c550 aus P. denitrificans) im Vergleich zu dem nicht-homologen Reaktionspartner (Pferdeherz Cyt c) besitzen. Bei diesen drei Cytochromen handelt es sich um Proteine, die eine basische Interaktionsfläche aufweisen. In Hinblick auf die Ergebnisse zur Wechselwirkung von KF und SF mit dem löslichen Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa wird jedoch deutlich, dass die Spezifität des Cytochrom c1 gegenüber möglicher Substrate alleinig durch das Kriterium des Oberflächenpotentials bedingt ist. Keine der eingeführten Punktmutationen führte zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des Proteins. Vielmehr zeigten die meisten Mutanten eine im Vergleich zum Wildtyp leicht herabgesetzte Geschwindigkeitskonstante der Elektronentransport-Reaktion. Der deutlichste Effekt wurde für die Mutanten E243K (36 % der WT-Aktivität) und E243Q (78 % der WT-Aktivität) bestimmt. Dieser Rest ist am oberen, dem Periplasma zugewandten Rand der Hämspalte positioniert, wodurch eine direkte Interaktion mit dem Cytochrom c552 während der Elektronentransport-Reaktion sehr gut möglich ist. Die im Rahmen dieser Arbeit bestimmten Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion zwischen Cytochrom c1 und Cytochrom c552 lassen eindeutig auf einen diffusionskontrollierten Prozess schließen. Ein solches Verhalten schließt eine spezifische Oberflächen-Wechselwirkung der beiden Proteine nicht aus Die Ergebnisse der Mutagenesestudie verdeutlichen jedoch, dass die Substratspezifität nicht primär durch definierte gegensätzliche Ladungspaare auf der Oberfläche von Cytochrom c1 und Cytochrom c552 definiert wird.

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Metadaten
Author:Anna Carina Eichhorn
URN:urn:nbn:de:hebis:30-32281
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Bernd Ludwig, Werner Mäntele
Advisor:Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2006/10/30
Year of first Publication:2003
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2003/05/12
Release Date:2006/10/30
GND Keyword:Paracoccus denitrificans ; Cytochrom c1
Page Number:159
First Page:1
Last Page:150
HeBIS-PPN:188081704
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht