Open Access

Frank Imkamp

• Aus Fruktose-gezogenen Zellen von A. woodii, die in Gegenwart von Caffeat als Elektronenakzeptor gewachsen waren, wurde durch Behandlung mit Lysozym und anschliessendem French-Press-Aufschluß bei niedrigem Druck ein zellfreier Rohextrakt unter strikt anaeroben Bedingungen hergestellt. Dieser katalysierte eine H2-abhängige Caffeatreduktion mit Raten von 8,7 – 18,7 nmol/min x mg Protein. Die Aktivität war strikt ATP-abhängig. Nach einer Auftrennung des Rohextraktes in Cytoplasma- und Membranfraktion war die H2-abhängige Caffeatreduktion ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert. Die Zugabe von Membranen führte zu keiner Stimulierung der Aktivität. Die Membranfraktion selbst wies keine Caffeatreduktionsaktivität auf. Verschiedene Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, als artifizielle Elektronendonatoren für die Caffeatreduktion zu fungieren. TMPD, 1,5-Diphenylcarbazid und reduziertes Methylviologen konnten Caffeat nicht reduzieren. In Gegenwart von Phenylendiamin wurde in zellfreiem Rohextrakt und in der Cytoplasmafraktion Caffeatreduktionsaktivität beobachtet. In der Membranfraktion wurde dagegen keine Reduktion von Caffeat mit Phenylendiamin als Elektronendonor nachgewiesen. NADH + H+ konnte als physiologischer Elektronendonor für die Reduktion von Caffeat fungieren. Die NADH-abhängige Caffeatreduktion war ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert und strikt abhängig von ATP. Die Beobachtung, dass NADH + H+ als Elektronendonor für die Caffeareduktion fungieren kann, führte zu der Frage, wie im Zuge H2-abhängiger Caffeatreduktion NADH + H+ gebildet wird und welche Enzyme daran beteiligt sein könnten. NAD+-abhängige Hydrogenaseaktivität wurde an Membranen und im Cytoplasma nachgewiesen. Rund 70% der Aktivität waren in der löslichen Fraktion lokalisiert. Die Gegenwart einer Elektronendonor:NAD+-Oxidoreduktase in A. woodii wurde untersucht. Gewaschene Membranen vermittelten die Oxidation von NADH + H+ mit Kaliumhexacyanoferrat oder Benzylviologen als Elektronenakzeptor. Diese Beobachtung wurde als Hinweis auf eine NAD+-Reduktase gewertet, da solche Enzyme in der Regel reversibel sind. Eine Hydrogenase konnte hierfür ausgeschlossen werden, da die NADH-oxidierende Aktivität Sauerstoff-unempfindlich war. Die Aktivität des NADH-oxidierenden Enzyms konnte durch zugesetztes Na+ nicht stimuliert werden. In Analogie zu Na+-translozierenden NADH:Chinon-Reduktasen wurde die NADH-oxidierende Aktivität an gewaschenen Membranen aber durch Ag+ oder Cu2+ in mikromolaren Konzentrationen vollständig inhibiert. Membranen von A. woodii vermittelten die Reduktion von NAD+ mit reduzierten Ferredoxin als Elektronendonor. Ob diese Aktivität durch das gleiche membranständige Enzyme katalysiert wurde, das auch die NADH-Oxidation bewerkstelligte, konnte nicht geklärt werden. Die Ferredoxin-abhängige NAD+-Reduktion wurde durch micromolare Konzentrationen Ag+ vollständig inhibiert. Die Inihibition war aber wahrscheinlich unspezifischer Natur. Mittels vergleichender 2D-Gelelektrophorese wurden zwei Caffeat-induzierte Proteine identifiziert. Ein Vergleich der Peptidsequenzen, die durch ESI-MS/MS-Analyse der Proteine erhalten wurden, mit in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen, ergab eine große Übereinstimmung zu der großen alpha- bzw. kleinen beta-Untereinheit von heterodimeren Elektronentransfer-Flavoproteinen (ETFP). Die Proteine wurden mit EtfA und EtfB bezeichnet. Anhand der Peptidsequenzen von EtfA und EtfB wurden degenerierte Oligonukleotide abgeleitet, die zur Amplifikation von Fragmenten der kodierenden Gene herangezogen wurden. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der erhaltenen PCR-Produkte untermauerte die Zuordnung von EtfA und EtfB als Untereinheiten eines ETFP. Die Fähigkeit zur Caffeatreduktion ist in A. woodii nicht konstitutiv vorhanden, sondern wird in erst durch Gegenwart des Phenylacrylats induziert. Die Spezifität dieser Induktion wurde untersucht. Suspensionen ruhender Zellen, die aus Caffeat-induzierten Zellen hergestellt worden waren, reduzierten neben Caffeat auch die Phenylacrylate Ferulat oder p-Cumarsäure mit H2 als Elektronendonor. Analoge Beoabachtungen wurden mit Ferulat-induzierten und p-Cumarsäure-induzierten Zellsuspensionen gemacht. Die Ergebnisse legen den Schluß nahe, dass in A. woodii die Reduktion von Phenylacrylaten durch ein induzierbares enzymatisches System bewerkstelligt wird. EtfA und EtfB wurden als MalE-Fusionsproteine dargestellt und gereinigt. Dagegen wurden Antiseren hergestellt. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass die Produktion von EtfA und EtfB durch Gegenwart verschiedener Phenylacrylate induziert wird. Die Induktion war unabhängig vom Wachstumssubstrat. In Gegenwart von zu Phenylacrylaten ähnlichen Verbindungen erfolgte keine Induktion. Für EtfA und EtfB wurde eine Funktion als universeller Elektronenüberträger des Phenylacrylat-Reduktionssystems in A. woodii postuliert. Für die H2-abhängige Reduktion von Caffeat und anderer Phenylacrylate wurde die folgende Reaktionssequenz postuliert: die Oxidation des Elektronendonors H2 durch eine Hydrogenase geht einher mit der Bildung von reduziertem Ferredoxin. Dieses wird durch eine membranständige Ferredoxin-NAD+-Oxidoreduktase oxidiert, die den Transfer der Elektronen auf NAD+ mit der Translokation von Na+ koppelt. Ein aus EtfA und EtfB gebildetes ETFP fungiert dann als Elektronenüberträger zwischen NADH + H+ und einer löslichen Phenylacrylatreduktase.
• Acetobacterium woodii was grown with fructose in the presence of caffeate as electron acceptor. Cells were treated with lysozyme and broken up applying low preassure by passage through a „French Press“ cell yielding cell-free extract. All manipulations were performed under strictly anaerobic conditions. This cell-free extract mediated H2-dependent caffeate reduction with rates between 8.7 and 18.7 nmol/min x mg protein. The activity was strictly dependent on the presence of ATP. After separating cell-free extract into the cytoplasmic and the membraneous fraction H2-dependent caffeate reduction was exclusively located in the cytoplasm. The addition of membranes lead to no stimulation of the activity. No activity was found in the membraneous fraction. Various compounds were tested to act as artficial electron donors for caffeate reduction. Tetramethyl phenylendiamine, 1,5-diphenylcarbazide and reduced methyl viologen did not mediate caffeate reduction. In the presence of phenylenediamine caffeate reduction was observed in cell-free extract and the cytoplasmic fraction. In the membraneous fraction no reduction of caffeate was observed with phenylenediamine serving as electron donor. NADH acted as a physiological electron donor for the reduction of caffeate. NADH-dependent caffeate reduction was exclusively located in the cytoplasmic fraction and was strictly dependent on the presence of ATP. The observation that NADH acts as an electron donor for caffeate reduction raised the question how NADH is generated during H2-dependent caffeate reduction and which enzymes could be involved. NAD+-dependent hydrogenase activity was identified in the membraneous and the cytoplasmic fraction. About 70% of the activity was located in the soluble fraction. The presence of an electron donor:NAD+-oxidoreductase in A. woodii was investigated. Washed membranes mediated the oxidation of NADH with ferricyanide or benzyl viologen serving as electron acceptors. This observation was taken as a hint for the presence of a NAD+-reductase, since these enzymes are usually reversible. A hydrogenase could be excluded to mediate this activity since the NADH-oxidizing activity was insensitive towards oxygen. The activity of the NADH-oxidizing enzyme could not be stimulated by Na+. In analogy to Na+-translocating NADH:quinone-reductases the NADH-oxidizing activity located at washed membranes was completly inhibited by micro-molar concentrations of Ag+ or Cu2+. Washed membranes of A. woodii mediated the reduction of NAD+ with reduced ferredoxin serving as electron donor. It could not be clarified, whether this activity was mediated by the membrane-bound NADH-oxidizing enzyme. Ferredoxin-dependent NAD+-reduction was completely inhibited by micro-molar concentrations of Ag+. This inihibition was most likely unspecific. Using 2D gel electrophoresis two caffeate-induced proteins were identified that were subsequently subjected to ESI-MS/MS. A comparision of the obtained peptide sequences with protein sequences from data bases revealed great identities to the large alpha-subunit and the small beta-subunit respectively of heterodimeric electron transfer flavorproteins (ETFP). The caffeate-induced proteins were designated EtfA and EtfB respectively. Based on the peptide sequences degenerated oligonucleotides were deduced and gene fragements coding for EtfA and EtfB were amplified. Analysis of the amino acid sequences deduced from the PCR products confirmed that EtfA and EtfB are subunits of an ETFP. The ability to reduce caffeate is not a constitutive feature of A. woodii but is induced in the presence of the phenyl acrylate. The specificity of this induction was investigated. Suspensions of resting cells prepared from caffeate-induced cells reduced besides caffeate other phenyl acrylates like ferulate or p-coumarate with H2 serving as electron donor. This observation implies that the reduction of phenyl acrylates in A. woodii is accomplished by one single induceable enzymatic system. EtfA and EtfB were heterologously overproduced as MalE-fusion proteins and were purified. Antibodies were generated against MalE-EtfA and MalE-EtfB. Western blot analysis revealed that the production of EtfA and EtfB is induced by various phenyl acrylates. This induction was independent of the growth substrate. In the presence of compounds structurally similar to phenyl acrylates no induction was observed. Thus, it is postulated that EtfA/EtfB act as the universal electron mediator of the phenyl acrylate reducing system in A. woodii. The following reaction sequence was postulated for the reduction of caffeate and other phenyl acrylates: the oxidation of the electron donor H2 is accompanied by the generation of reduced ferredoxin. The latter is oxidized by a membrane-bound ferredoxin-NAD+-oxidoreductase that couples electron transfer to NAD+ with the translocation of Na+. An ETFP consisting of EtfA and EtfB mediates the electron transfer between NADH and a soluble phenyl acrylate reductase.