Funktionelle und strukturelle Untersuchungen an Matrix-Proteinen aus Retroviren

  • The N-terminal domain (matrix protein or MA) of a retroviral Gag polyprotein precursor plays a critical role in several stages of the retrovirus life cycle. MA is involved in the effective membrane targeting, assembly and release of the immature viral particles from the infected cell. In order to understand the structural basis of these functions, the full length MA from Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) was purified and the solution structure of the MA MoMuLV was determined by means of heteronuclear high-resolution NMR spectroscopy and compared with that of the X-ray diffraction analysis as well as with the structures of several MA proteins from geterologous viruses. Structural features were also obtained from CD spectroscopy, dynamic light scattering, sedimentation velocity, differential scanning calorimetry and other methods. It was found that the MA MoMuLV globular core (residues 8-98) is comprised of 7 well-defined helices (five alpha-helices and two 310 helices), with the general fold typical for MA proteins from other retroviral species. The N-terminus (residues Met1-Leu7) and the C-terminal proline-rich part (residues Pro103-Tyr131) are not structured in solution. Although MA MoMuLV has a low sequence identity compared with other matrix proteins for which the three-dimensional structure is known, it was shown that its overall topology and pattern of secondary structural units is similar to other retroviral matrix proteins. The monomeric state is observed for the correctly folded MA MoMuLV in a variety of external conditions and protein concentrations, indicating that virion assembly starts with the plasma membrane targeting of the nascent Gag precursor. The denaturation of MA MoMuLV is irreversible and is connected with protein aggregation. For Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) a proteolytic processing of the R-peptide (last 16 amino acids from the C-terminus of the Envelope protein (Env)) has been described as a second mode of fusion and activation preceding the receptor contact between the viral particle and the cellular membrane. An interaction between the R-peptide and MA MoMuLV has been proposed, since the R-peptide and MA are localized at the inner part of the membrane. Therefore the interaction between 15N labelled purified MA MoMuLV and synthesized R-peptide has been investigated using high-resolution NMR. It was found that in water solution MA MoMuLV and R-peptide do not form a tight complex, but in a mature virion in the presence of membranes or other protein factors it might be possible. In the case of HIV-1 the cytoplasmic part (EnvC) of the Env protein is much longer than in other retroviruses and again as for MoMuLV little is known about the interaction between EnvC and HIV MA. Hence, the full length HIV MA, and the last 150 amino acids from HIV Env have been subcloned with suitable expression vectors, purified and analysed by native gel electrophoresis, a pull down assay and by high resolution NMR for the purpose to detect the complex formation of EnvC and HIV MA. Finally, after all those experiments, it was found that a stable complex is not formed, but a weak interaction between the two proteins can not be excluded.
  • Die N-terminale Domäne (Matrix Protein oder MA) eines retroviralen Gag Polyproteins spielt eine essentielle Rolle in mehreren Phasen des retroviralen Lebenszykluses. Die retroviralen MA Proteine sind dabei essentiell für die Assemblierung und die Abschnürung der viralen Partikel von der Zellmembran. Das virale env Gen codiert das Hüllprotein (engl.: envelope), das während der Partikelreifung ebenfalls prozessiert wird. Dabei wird das Vorläufer-Hüllprotein in die beiden Bestandteile SU (engl.: surface unit), welches glycosyliert vorliegt, und TM (engl.: transmembrane unit) gespalten. Das cytoplasmatische "tail" (von 150 Aminosäuren bei HIV-1 und SIV bis zu weniger als 50 Aminosäuren in MoMuLV reicht), welches distal vom membran-durchspannenden Segment des TM angeordnet ist, verbleibt dabei im Inneren der viralen Partikel. In einigen Vertretern der Retroviren, beispielsweise MoMuLV und M-PMV, findet zusätzlich eine weitere Prozessierung, die zur Verkürzung des cytoplasmatischen Teils führt während oder direkt im Anschluss an die Abschnürung der viralen Partikel statt. Die dabei entfernte, kurze Aminosäure-Sequenz wird im Falle des MoMuLV als R-Peptid bezeichnet. Obwohl die cytoplasmatischen Anteile des Hüllproteins und des MA an der Innenseite der Membran lokalisiert sind, ist über die Wechselwirkungen des C-Terminus des Hüllproteins mit dem MA Protein wenig bekannt. Diese Wechselwirkungen könnten in den verschiedenen Stufen des viralen Replikationszyklus eine Rolle spielen. Der Vergleich der MA Proteinstrukturen der divergenten Klassen der Retroviren könnte jedoch Strukturelemente und Aminosäurereste mit Schlüsselfunktionen hervorbringen, die die Funktion der retroviralen MA Proteine unterstützen. Aus diesem Grund wurde das MA Protein des MoMuLV (Retrovirus Typ G) mittels eines bakteriellen Expressionsystems dargestellt, mit stabilen Isotopen markiert und zur Strukturanalyse mit Hilfe der NMR verwendet. Die Daten der NMR Experimente wurden mittels speziell optimierter Reaktions-Bedingungen ermittelt, die mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung, des Circulardichroismus, der differentiellen Scanning-Kalorimetrie, von 1D NMR Spektren und der Ausschluss-Chromatographie verifiziert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass das MA Protein unter den gegebenen Bedingungen in nativer und monomerer Form gelöst wird und dass Sekundär- und Tertiärstruktur der physiologischen Struktur des Proteins gleichen. Die Zuordnung der 1H, 15N and 13C Resonanzen wurden mittels multidimensionaler NMR-Spektroskopie durchgeführt. Die vollständige Zuordnung der Resonanzen des MA MoMuLV Proteins kann bei der BioMagResBank (unter http://www.bmrb.wisc.edu) mit Hilfe der Zugangsnummer BMRB-5263 (Noskova, et.al. 2003) abgerufen werden. Es wurde gefunden, dass die Kernstruktur des MA MoMuLV (Aminosäuren 8 bis 98) aus 5 gut definierten alpha-Helices, und zwei 310 Helices besteht, die in einer für die MA Protein-Familie typischen Faltung organisiert sind. Das N-terminale Ende (Met1 – Leu7) und das C-termiale prolinreiche Teil der Aminosäuresequenz (Pro103 – Tyr131) weisen in Lösung keine Struktur auf. Obwohl das MA MoMuLV Protein eine geringe Sequenzidentität, verglichen mit anderen Matrix Proteinen, für die die dreidimensionale Struktur bekannt ist, hat, weisen sowohl die Tertiärstruktur, wie auch typische Elemente der Sekundärstruktur des MA MoMuLV eine große Ähnlichkeit mit der anderer retroviralen Matrix Proteine auf. Um die Wechselwirkungen zwischen dem R-Peptid, das die C-terminalen 16 Aminosäurereste des Hüllproteins des MoMuLV umfasst und dem MA Protein des MoMuLV näher zu untersuchen, wurden ebenfalls NMR-spektroskopische Methoden angewendet. NMR-Experimente bei denen 15N-markierten MA MoMuLV Reste mit unmarkiertem, synthetisierten R-Peptid bei gleichzeitiger Beobachtung der 1H, 15N - HSQC Spektren titriert wurden zeigten, dass die Resonanzen des MA (und des R-Peptids) durch die vermutete Komplexbildung nicht beeinflusst wurden. Dieses Ergebnis ist von besonderer Bedeutung, da zum ersten Mal direkte Hinweise auf das Fehlen jeglicher Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Proteinen in wässriger Lösung erhalten wurde. Dennoch ist nicht auszuschließen, dass andere Faktoren (z.B. zelluläre Membran, weitere Proteine, etc) für die Wechselwirkungen zwischen dem MA Protein und dem R-Peptid benötigt werden. Um die Wechselwirkungen zwischen dem MA Protein von HIV-1 und dem C-terminalen Anteil des HIV-1 Hüllproteins zu untersuchen, wurden beide Proteine kloniert, exprimiert, mit stabilen Isotopen markiert und aufgereinigt. Um eine Komplexbildung zwischen dem Hüllprotein und den HIV MA nachzuweisen wurden hochauflösende NMR-Experimente, pull-down-assays und native Gelelektrophorese durchgeführt. Keine der Methoden konnte die Komplexbildung zwischen den beiden Proteinen nachweisen. Die NMR-Spektroskopie lieferte jedoch Hinweise auf die Existenz einer schwachen Wechselwirkung.

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Metadaten
Author:Veronika Nikolaevna Noskova
URN:urn:nbn:de:hebis:30-31564
Publisher:Univ.-Bibliothek
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Heinz Rüterjans, Bernd Ludwig
Advisor:Heinz Rüterjans
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2006/09/26
Year of first Publication:2005
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2005/09/15
Release Date:2006/09/26
GND Keyword:Retroviren ; Matrixproteine
Page Number:129
First Page:1
Last Page:124
Note:
Diese Dissertation steht leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext im WWW zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:349892563
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
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